Kerevit Bacak ekstansör kas Yüksek ve Düşük Çıkış NMJs Fizyolojik Kayıtlar

Summary

Bu makale, sinaptik yanıtları elektrofizyolojik kayıtlar yapmak bir kerevit yürüyüş bacak ekstansör kas ve sinir terminalleri, yüksek ve düşük çıkış sinir terminallerine brüt morfolojik farklılıklar göstermektedir görselleştirildiği nasıl gösteriyor.

Abstract

Biz nasıl bir kerevit yürüme bacak ekstansör kas innerve yüksek (fazik) ve düşük (tonik) çıkış motor nöronların sinaptik yanıtları elektrofizyolojik kayıtlar teşhir etmek ve yürütmek için ayrıntılı olarak açıklayınız. Fazik ve tonik sinir terminalleri fizyolojisi ve morfolojisi belirgin farklılıklar mevcuttur. Tonik akson hayati bir fazik akson göre daha yoğun leke almak sağlayarak, çok daha fazla mitokondri içerir. Tonik terminalleri varisler ve fazik terminali filiform. Tonik terminalleri sinaptik etkinliği düşük, ancak dramatik kolaylaştırdı tepkiler gösterir. Buna karşılık, fazik terminalleri quantal etkinliği yüksek ama yüksek frekanslı stimülasyon ile sinaptik depresyon. Quantal çıkış görüntülenmiştir sinir terminalleri üzerinden doğrudan yerleştirilen bir odak macropatch elektrot ile ölçülür. Hem fazik ve tonik terminalleri nöronlar morfolojik ve fizyolojik farklılaşması için içsel farklılıklar yerine, kas diferansiyel retrograd geribildirim, hesap anlaşılacağı aynı kas lifleri innerve.

Protocol

1) Giriş

Motor nöronlar, topluca bir nöromüsküler bileşke (NMJ) olarak adlandırılır sinapsların bir kas lifi ile iletişim kurarlar. NMJs en kerevit kas hazırlıkları kolayca ulaşılabilir. Birçok kerevit NMJs postsinaptik dendritler, omurgalı NMJs belirtildiği memeli MSS veya eşik altı tepkiler içinde üretilen kademeli elektrik sinyallerine benzer olmayan spike eksitatör postsinaptik potansiyeller (EPSP) göstermektedir (Wiersma ve Van Harreveld, 1938; Katz & Kuffler, 1946) . Kerevit NMJs sinaptik iletim ve sinaptik farklılaşması içine genel bir anlayış sağlamak için temel sinaptik model olarak hizmet edebilir.

Genelde, motor üniteleri aracılığıyla hayvan davranışları, kasların NMJs ve özellikleri sinaptik iletişim türü yönlerini düzenler. Yengeç ve kerevit yakın kas (Lucas, 1907, 1917) "hızlı" ve "yavaş" kas kasılmaları ilk gözlemlerinden bu yana, benzer kas kasılma farklılaşma gibi karın fleksör (Kennedy ve Takeda, 1965a gibi diğer kerevit kas tipleri tarif edilmiştir , b) ve ekstremite ekstansörleri (Van Harreveld & Wiersma, 1936). "Hızlı" kasılmalar hızlı tepkiler başlatır. Örneğin, kerevit kuyruk çevirme hızlı bir davranıştır. "Yavaş" kasılmaları yavaş hareketleri korumak ve duruş (Bradacs ve ark, 1997) korumaya yardımcı olmak. , "Hızlı" ve "yavaş" kas kasılmaları karşılık gelen "yüksek / fazik çıkışı" ve "tonik / düşük çıktı" geniş motor nöronların tanımlamak için kullanılır. Kas kasılma hızı ve zamanlama farkı sinaptik yapısı ve sinaptik gücü presinaptik farklılıklar (King ve ark, 1996) ile ilgili bölümünde. Myofibrillar protein izoform ifade, kontraktil farklılıkları da önemlidir, ancak belirli bir fiber iki tür motor nöronlar tarafından innerve olduğu bacak ekstansör kas, bu gibi hazırlıklar, odak noktası terminalleri sinaptik farklar üzerinden terminallere payı beri aynı hedef hücre (Mykles ve ark, 2002). Daha önceki bir çalışmada bacak ekstansör iki eksitatör motor aksonlar incelemiş ve fazik ve tonik fenotipleri açıklanan (Bradacs ve ark, 1997). Bu raporda, diğerleri ise bu sinir terminalleri sinaptik farklılaşma özelliklerini incelemek, böylece diseksiyon ve kayıtları nasıl elde göstermektedir.

İzlenenler transmisyon elektron mikroskobu, kerevit bacak ekstansör kas tonik ve fazik terminalleri elde edilen bölümleri çeşitli dizi tonik terminalleri RRP veziküller fazik terminalleri daha fazla içerdiğini ortaya mitokondri tonik nöronlar daha yaygındır ve fazik terminallerinde sinaps daha düşük çıktı sinaps daha karmaşık, çeşitli aralığı (Miller ve ark, 2002; Johnstone ve ark, 2008; King ve ark, 1996;. Bradacs ve ark, 1997) ile birden fazla aktif bölgeleri içerir. Düşük çıkış tonik terminalleri de fazik terminalleri (Cooper ve ark, 2003) göre artırılması nöromodülatör serotonin (5-HT) sinaptik iletim daha duyarlı.

Tonik ve fazik NMJ aynı kas lifi mevcut olduğu gerçeği daha kolay verilen bir kas lifi presinaptik farklılıkları değerlendirmek ve kas yorgunluğu, sinaptik depresyon ve sinaptik çapraz tartışma soruları yanıtlamak için yapar. Çeşitli sorular, tonik ve fazik terminalleri için postsinaptik hedefler postsinaptik reseptör yoğunluğu ve glutamat reseptör alt tiplerinin farklılıklar olup olmadığını, bu hazırlık ele alınacak kalır, ama daha iyi bir anlayış, bu anatomisi ve fizyolojisi temel farklılıklar iki motor üniteleri, daha derin bir bilgi tabanı oluşturmaya yardımcı olacaktır. Umut Bu sinaptik hazırlanmasında öğrenilen temel ilkeleri, çeşitli hazırlıklar diğer sinaps için geçerli olacak ve kerevit Bu sinaptik modeli gelecekteki araştırmalar artıracaktır.

2) Yöntemler

1. Orta ölçekli kerevit (Procambarus clarkii) ilk veya ikinci yürüyüş ayakları üzerinde tüm deneyler yapılmaktadır. Hayvanlar tek tek oxygenized su ile plastik kaplarda muhafaza edilir. Hayvan oda sıcaklığı 13 ° C-16 ° C aralığında Hayvanlar haftalık bazda değiştirilen kuru balık yiyecek ve su ile beslenir.
   
   
   Şekil 1: Şematik bir kerevit yürüyüş, bacak ve altı distal .
2. Bir kerevit yürüyen bacağın distal anatomik altı kesimleri (Şekil 1) ayrılmıştır. Bacak ekstansör meropodite bulunan ve izole edilecektir sinir demeti meropodite ischiopodite ortak yakındır. Tonik veya fazik akson n seçici olarak teşvik edilebilirmaruz sonra fizyolojik amaçlı eeded.
3. Olduğu gibi, Cooper ve Cooper (2009) meropodite bölge içinde açacağı motor nöron excitor sergilemek için yöntemler de dahil olmak üzere ilk diseksiyon bazı yönlerini açıklanan, ancak bunların açıklaması ekstansör kas hasardan korumak için gerekli bakım sağlamaz açıcı kas hazırlık adresine gerekli değildir. Ekstansör korumak için, ilk ya da ikinci yürüyüş bacak bacak zorla pinching otomatikleştiren hayvan uyararak, vücut uzunluğu 6-10 cm (Atchafalaya Biyolojik Supply Co, Raceland, LA) ölçüm, kerevit kaldırılır kırık düzlemi ischiopodite segmentinde distal. Bacak lateral (dış tarafa) görüntüleyici karşı karşıya diseksiyonu plaka üzerine yerleştirilir. Izleyici genellikle kemerli bir tarafı ile dış (lateral tarafı) (Şekil 2), diseksiyon plaka üzerine kadar karşı karşıya emin olabilirsiniz kadar bacak döndü. Bir parça kağıt mendil bacak yerleştirilmesi, bu indirimler yaparken daha kolay hazırlanması açmak için yapar.
   
   
   Şekil 2: genellikle meropodite yan tarafında, kemerli yan diseksiyon plaka üzerinde karşı karşıya.
4. Bir neşter bıçak kesici ve tutucu ile, keskin bir jilet, meropodite segment için Şekil 3'te gösterildiği deseni ile kesme kadar manikür dağlamadan için kullanılır. Bakım meropodite carpopodite eklem dorsal ventral kesmek için çok uzak distal kesmek için alınır.
   
   
   Şekil 3: manikür, pencereden dışarı gravür için önerilen bir desen olarak hatları ile meropodite segment.
   
   
   Hazırlık tuzlu su konur. Diseksiyonu çanak alt Sylgard (Dow Corning) kaplama (1cm kalınlığında) olmalıdır. Sylgard böcek pimleri hala hazırlık tutmak için içine sıkışmış olabilir kullanılır. Bu noktada, bir iğne carpopodite segmentinin orta ve ischiopodite segment (Şekil 4) dorsal sıkışmış. Disseke hazırlıkları, standart kerevit salin yıkanmış 205 NaCl ile yapılır Van Harreveld s çözümü (1936), değiştirilmiş; 5.3KCl; 13.5 CaCl _2; 2H ₂ O; 2.45 MgCl _2; 6H ₂ O 5 Hepes ve ayarlanabilir pH 7.4 (mM).
   
   
   
   Şekil 4: kesim pencere meropodite segment kaldırdı. Diseksiyon pimleri konumunu not edin.
5. Manikür distal bölgede hafifçe kaldırdı ve kas lifleri bacak tabanına doğru vuruş yaparak manikür uzak kesilir. Manikür kaldırdı olabilir.
6. Apodeme (tendon) meropodite-carpopodite ortak kesilir. Bir pin kesim yapılabilir (Şekil 5) nerede göstermek için fleksör tendon iç yüzeyine yerleştirilir. Cımbız ve kaudal yönde (Şekil 6), kaldırma, ana bacak sinir ve ekstansör kas açığa çıkardı fleksör kas ile kesildi tendon sonra sıkışmak.
   
   
   Şekil 5: fleksör kas apodeme bir iğne ile fleksör yerinden vurgulanır.
   
   
   
   Şekil 6: ana bacak sinir hasarı olarak fleksör kas apodeme kesim ve bakım ile temizlenebilir.
7. Ana bacak sinir meropodite carpopodite eklem kesilmiş ve ekstansör kas üzerinde dikkatli bir şekilde geri çekti. Bu çalışmada kas medial yüzeyi boyunca kullanılır. Ana bacak sinir ekstansör kas sinir ayrılması hazırlık tarafında ana bacak sinir distal güdük hafifçe çekerek artabilir. Ekstansör kas üzerinde geri ana bacak sinir soyma, akson küçük dalları kesilmiş olması gerekir. Bu inhibitör motor nöron ekstansör kas dalları. Meropodite proksimal sonuna yakın ana bacak sinir dallanma büyük bir paket, ilgi, küçük bir sinir demetidir.
   
   
   Şekil 7: ana bacak sinir proksimal yönde kesilmiş ve geri çekilir.
   
   
   Metilen mavisi boyama (Şekil 8) Bu sinir demeti ya da görülebileceği 4-Di-2-ASP floresan leke (Şekil 9).
   
   
   
   Şekil 8: ekstansör kas metilen mavisi ile boyandı. Akson dallanma ve sinir içinde iki kolayca görülebilir aksonlar unutmayın. Kırmızı oklar Demark sinir parça.
   
   
   
   Şekil 9: 4-Di-2-ASP ile motor sinir boyanan aksonlar. Tonik akson artan mitokondrial içerik nedeniyle daha parlak görünür.
   
   
   Şekil 10A: 4-Di-2-ASP ile boyanmış fazik ve tonik nöronların bireysel terminalleri. Tonik fazik terminalleri terminalleri ve ince yapısı varisler unutmayın.
   
   
   
   Şekil 10B-Tonik kaydetti
   
   
   
   Şekil 10C-Fazik kaydetti

3) Fizyolojik Profilleri

1. Kas hücre içi potansiyelleri izlenir tonik veya fazik nöronların eksitatör postsinaptik potansiyeller (EPSPS) gözlemlemek için, bir sinir demeti izole akson (Johnstone Çim stimülatörü bağlı bir emme elektrot (Şekil 11) tarafından uyarılır. ve ark, 2008). 70 Hz uyarılması düşük çıkış NMJs için kolaylaştırılmış bir yanıt teşvik etmek amacıyla tonik akson uygulanır, ya da tek bir darbe (1 Hz), yüksek çıkış büyük EPSPS elde etmek için fazik akson uygulanır gösterildiği gibi NMJs Şekil 12. EPSPS PowerLab/4s arabirimi üzerinden bir bilgisayara kaydedilir.
   
   
   Şekil 11: Uyarıcı elektrot sinir demeti içinde tek bir akson üzerine yerleştirilir. Not 2 ana aksonlar özetleyen yeşil hat.
   
   
   
   Şekil 12: intrasellüler kayıtları elde tonik veya fazik nöronların postsinaptik potansiyelleri (EPSPS).
2. Sinaptik kolaylaştırma ve sinaptik depresyon doğası soruşturma düşük ve yüksek çıkış NMJs çeşitli deneysel paradigmalar tarafından yaklaştı olabilir. Düşük çıktı NMJs Kolaylaştırılması yaklaşık 20 uyaranlara (Şekil 13) 20, 40 ve 60 Hz bakliyat gösterildiği gibi, frekans bağlıdır.
   
   
   Şekil 13: stimülasyon bakliyat üç farklı frekans 20, 40 ve 60 Hz normal kerevit salin verilen bir tren yanıt EPSPS.
3. Stimülasyon frekans sinaptik depresyon oranı da yüksek çıktı NMJs ile ilgili. Şekil 14, 30 dakika boyunca NMJ karartıcı stimülasyon sürekli bir 5 Hz gösterir. Yüksek stimülasyon frekansı ile, hazırlık (Bradacs ve ark, 1997) daha hızlı düşmesine neden olacaktır.
   
   
   Şekil 14: depresyon ikna etmek için 5 Hz stimülasyon sırasında fazik yanıt EPSP genlik.

4) Quantal Yanıtları

1. Kerevit (Cooper ve Cooper, 2009) açacağı kas açıklanan benzer bir prosedür hazırlanmasında kullanılır. Sinir terminal tanımlanabilir bölgeler üzerinde doğrudan quantal EPSPS lümen sinaptik varisler bir makro-yama kayıt elektrot yerleştirerek tarafından kaydedilen 4-Di-2-Asp (5 mcM, 5 dakikalık tedavi, Cooper ve hayati boya ile görüntülendi diğerleri, 1995; Magrassi ve ark, 1987). Spontan uyarılmış quantal yanıtları yanı sıra sinir terminalleri boyunca kaydedilebilir. Uyarılmış ve spontan sinaptik potansiyeller makro-yama elektrot (Dudel, 1981; Wojtowicz ve ark, 1991; Mallart, 1993) ile kaydedilir. Kimax cam (dış çap: 1.5 mm), 10 ila 20 mikron (Şekil 15) arasında değişen iç çaplarda yama ipuçları üretmek için çekti ve yangın cilalı oldu.
   
   
   Şekil 15: Bir makro-yama kayıt elektrot lümen.
   
   
   Elektrot lümen banyo orta ile doludur. Amplifikatör, yukarıda belirtilen hücre içi kayıtları için kullanılan aynı. Elektrot ve sızdırmazlık direnci test akımı elektrot ile bakliyat geçerek tespit edilebilir. Deneylerde, mühür dirençleri, 0.3 ile 1.0 MOhm arasında değişmekteydi ve elektrot direnci, 0.5 ile 1.0 MOhm arasında değişmekteydi. Seal direnç kayıt boyunca izlenebilir.
2. Quantal olaylar doğrudan sayım düşük stimülasyon frekansları ile mümkündür. Her uyarılmış yanıt için, quantal olayların sayısı düşük çıkış terminalleri (Şekil 16) kolaylıkla belirlenir. Bu doğrudan sayıları ortalama quantal içerik (Cooper ve ark, 1995 Del Castillo & Katz, 1954) tahmin yardımcı olabilir. Uyarılmış yüksek çıkış NMJs çok quantal uyarılmış olaylar, spontan olaylar ortalama pik amplitüd ya da bölge ile birlikte sapmaların ortalama genlik ya da bölge ürettiklerinden, uygun kullanılabilirximate ortalama quantal içerik (Cooper ve ark, 1995).
   
   
   Şekil 16 Odak izleri fazik ve bir tonik NMJ kaydetti.
   
   
   Şekil 17

Discussion

Biz bu raporda nasıl incelemek için, kayıt ve yüksek ve düşük-çıkış terminalleri aynı kas lifi innerve olan eşsiz bir kerevit nöromüsküler hazırlık sinaptik tepkileri ölçmek göstermiştir. Kerevit nöromüsküler hazırlıkları sadece birkaç eksitatör motor nöronlar kas innerve için gerekli olduğundan, omurgalı nöromüsküler kavşak üzerinden pek çok avantajı sunuyoruz ve nöronlar hazırlık hazırlık (Atwood, 1976) için tanımlanabilir. Buna ek olarak, eksitatör nörotransmitter glutamat ve eksitatör postsinaptik potansiyelleri (EPSP) sınıflandırılır; böylece, kademeli olayların biyofiziksel özellikleri omurgalıların merkezi sinir sistemi içinde nöronların dendrit benzer. Ancak, quantal akımları, doğrudan postsinaptik siteleri (Cooper ve ark, 1995) izlenebilir.

Fazik sinir tekrarlayan 5 Hz stimülasyon büyük EPSPS, birkaç dakika sonra büyük ölçüde depresyona yol açmaktadır. Eklembacaklıların fazik nöromüsküler kavşaklar (Atwood ve Cooper, 1996) Bu tür depresyon yaygındır. Fazik terminalleri yanı sıra tonik terminalleri varlığı bir postsinaptik hedef fazik motor nöron depresyon sırasında ve sonrasında büyük ölçüde değiştirilmiş olup olmadığını değerlendirmek için sağlar. (Desai-Şah ve Cooper, 2009. Desai Shah ve ark, 2008) Buna ek olarak, düşük çıkış terminalleri sinaptik kolaylaştırma altında yatan mekanizmaları araştırmak için güzel bir hazırlık sağlar

Sinaptik depresyon ve kurtarma işlemi oranı yüksek çıkış terminalleri modülasyon araştırmak için bir oyun alanı sağlar. Erişilebilir ve uygulanabilir hazırlıklar sinaptik depresyon altında yatan mekanizmaları deşifre yardımcı olacaktır. Bu kerevit bacak ekstansör hazırlanması, serotonin dışsal uygulama sinaptik depresyon ve sinaptik vezikül havuzları harekete soruşturma ileriye potansiyel bir araç kurtarma araştırmak için başka bir araçtır. Bu preparat, tek tek kas lifleri fazik ve tonik hem de motor nöronlar tarafından innerve beri, çeşitli deneysel avantajları sağlar.

Serotonin uyarılmış stimülasyonu ile yayımlanan veziküller sayısını artırır ve depresyon sırasında kurtarma teşvik beri, serotonin varken füzyon olasılığını artırmak için vezikül havuzlarının bazı modülasyonu olduğu açıktır yılından bu yana (Johnstone ve ark, 2008 Logsdon ve ark, 2006; ark Sparks, 2004). Depresif bir devlete karşı düşük frekanslı stimülasyon, sırasında presinaptik sinir terminali içinde vezikül havuzları dinamiklerini açıklamak modeller de bu hazırlık ile mümkün olan çeşitli deneysel protokolleri arasında dikkate alınması gereken.

Tsien ve ark; vezikül havuzu yaklaşık% 30 geri dönüşümlü veziküllerin geri kalanı endoplazmik retikulum (Harata ve ark, 2001 ile geleneksel bir yavaş geri dönüşüm yolu ise, hızlı bir geri dönüşüm geçirdiği diğer sistemlerde not edilmiştir. , 2001). Bu tür çift yollar da bu sistem mevcut olabilir. ATP daha sonra presinaptik terminal depresif durumda eksik yerleştirme ve çıkarma ise gerçekleşmesi mümkün olmayabilir, bu yüzden çok fazla boş veziküller sinaptik yüzeyinde kalacaktır. Terminalleri 5 HT maruz kaldığında daha veziküller hızla serbest olduğundan, daha kolay açıklanmaması havuzu (RRV) içinde yer alan olduğunu uygulanabilir. Ancak, depresif durum, azalmış ATP, yerleştirme ve çıkarma 5 HT, sinaptik yüzey tekrar boş veziküller bırakır varlığında bile bloke olabilir. Ön verilere daha veziküller 5 HT uzun süreli maruz kalma ve stimülasyon, hızlı ve yavaş geri dönüşüm yolları yeniden serbest bırakılması için yetkili veziküller (Johnstone ve ark çarpık olabilir vezikül havuzu dağılımı zaman içinde piyasaya olduğunu göstermektedir beri . , 2008; değerlendirmeleri-Desai-Şah ve ark, 2008; Desai-Şah ve Cooper, 2009)

Postsinaptik akımlar ve motor sinir terminali tanımlanan bölgelerde tek quanta önlemlerin odak macropatch kayıtları teknikleri ile bir sinaptik depresyon, serbest bırakıldıktan az veziküller bir sonucu olarak veya işlev değişiklikleri nedeniyle oluşup oluşmadığını belirlemek için soru sorabilirsiniz postsinaptik reseptörler. Veziküller eşit kalsiyum pozlama için bu hazırlık fazik NMJ füzyon daha duyarlı olduğunu göstermiştir (Miller ve ark, 2005), daha yüksek olasılıkla hesapları fazik terminalleri (Msghina ve ark quantal içerik anlamına gelir. , 1998, 1999). Buna ek olarak, kalsiyum bağlayıcı protein frequenin farklılıklar (Jeromin ve ark, 1999) ve ultrastrüktür (King ve ark, 1996), diferansiyel sinaptik etkinliği (Cooper katkıdave ark, 2003).

(Cooper ve ark, 2003. Bradacs ve ark, 1997) öncesinde bazı çalışmalar, ekstansör kas liflerinin kas fenotip incelemiş bulunuyoruz . Karma fiber türleri kerevit tamamen tonik ve fazik elyaf türleri için kas farklılaşma düzenleme karşılaştırıldığında, usulüne innerve bacak ekstansör gibi kas fenotip ifade ve düzenleme (LaFramboise ve ark, 2000 için ipuçları sağlayabilir. Sohn ve ark. diğerleri, 2000; Griffis ve ark, 2001; Mykles ve ark, 2002).

Birçok temel sorular nörobiyoloji ele alınması gerekliliği devam etmektedir ve bu hazırlık bazıları mücadelede yardımcı olabilir. Bacak ekstansör ile yaklaştı olabilir alanında faiz bugün Birkaç konular şunlardır: 1) (depresyon Ca2 bir azalma nedeniyle yüksek çıkış terminalleri içinde sinaptik depresyon altında yatan hücresel mekanizmaları belirlenmesi + giriş, yetkili bir eksikliği kolayca açıklanmaması vezikül (RRV) havuz, ve / veya değiştirilmiş postsinaptik alıcılığı?) 2) sinaptik depresyon indüksiyon sonrası, hızlı iyileşme ve 3 teşvik etmek için uygulanan 5-HT mekanistik rolünün belirlenmesi) belirlenmesi olmadığını quantal şekilleri uyarıcı fazik terminalleri ortaya çıkan akımlar depresyon indüksiyon sırasında sinaptik depresyon pre-ve post-sinaptik bileşenleri adresine değişmiş edilmektedir.

Bu NMJ serbest bırakılması sitelerine doğrudan ölçülen sinaptik performans ast mekanizmaları adresleri ilgili bilgi almak için bize olanak verdiğinden, sürekli araştırma ve gelecekteki araştırmacılar için önemli. Bu alandaki güncel araştırma sinaptik depresyon modülasyon 5-HT ve vezikül havuzları dinamikleri hakkında bilgi vermektedir. Böyle bir konu, sinaptik iletim, tüm sinir sistemleri ile ilgili temel temelleri ile ilgili.

Materials

Crayfish (Procambarus clarkii). Atchafalaya Biological Supply Co., Raceland, LA., USA. Standard crayfish saline: Modified from Van Harreveld's solution (1936). (in mM) 205 NaCl; 5.3 KCl; 13.5 CaCl22H2O; 2.45 MgCl26H2O; 5 HEPES and adjusted to pH 7.4 Dissection tools: Fine #5 tweezers, fine scissors, knife blade holder, #26002-20 insect pins (all obtained from Fine Science Tools (USA), Inc., 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139) Sylgard coated dissection dish, a recording dish either constructed with suction electrode or use a suction electrode and anther manipulator to hold a suction electrode. Dissecting microscope with zoom function for intracellular recordings. For focal recording on visualized terminals a compound microscope with upright objectives (4 x and 20X) is used. One needs a Hg light source. Standard intracellular amplifier and A/D board for on line recording to a computer. Electrical signals are recorded on line to a PowerLab/4s interface (ADInstruments, Australia). We use standard software from ADInstruments named Chart or Scope. Chemicals: We use a vital fluorescent dye, 4 [4 (diethylamino) styryl] N methylpyridinium iodide (4 Di 2 Asp; Molecular Probes, Eugene, OR), to visualize the varicosities (Marigassi et al., 1987; Cooper et al., 1995a). All saline chemicals were obtained from Sigma chemical company (St. Louis, MO). For intracellular recordings we use glass capillary tubing (catalogue # 30-31-0 from FHC, Brunswick, ME, 04011, USA) and for focal macropatch electrodes we use Kimax-51, Kimble Products Art. No. 34502, ID 0.8-1.1mm, length 100mm. The intracellular electrode should have a resistance of 20 to 30 mOhm. The macropatch electrode is constructed by breaking off the tip of the glass after a fine tip was made from an electrode puller. The broken off tip needs to be a clean perpendicular break about 20μM in diameter. The tip is then heat polished to about 10μM inner diameter. The shaft of the electrode is then run over a heating element to cause it to bend about 45 degrees with a gradual bend. This produces a flat or perpendicular electrode lumen over the nerve terminal as the angle with the micro-manipulator will produce about another 45 degrees to the preparation.