Summary
In dit protocol een methode om intracellulair eiwit hervouwing te meten na de heat shock wordt beschreven. Deze methode kan gebruikt worden om foldases zoals moleculaire chaperonnes en hun co-factoren of verbindingen in staat om hun activiteiten van invloed te bestuderen. Vuurvlieg luciferase activiteit wordt gebruikt als reporter voor chaperonne hervouwing activiteit te meten.
Abstract
Dit protocol beschrijft een methode om de enzymatische activiteit van moleculaire chaperonnes te meten in een cel-gebaseerd systeem en de mogelijke effecten van verbindingen met remmende / stimulerende activiteit. Moleculaire chaperones zijn eiwitten die betrokken zijn bij de regulatie van het vouwen van eiwitten 1 en hebben een cruciale rol bij het bevorderen van overleving van de cel op stress-beledigingen als heat shock 2, voedingsstoffen honger en blootstelling aan chemicaliën / gifstoffen 3. Om deze reden chaperones blijken te zijn betrokken bij evenementen zoals de ontwikkeling van tumoren, chemioresistance van kankercellen 4 en 5 neurodegeneratie. Ontwerp van kleine moleculen kunnen remmen of stimuleren van de activiteit van deze enzymen is dan ook een van de meest bestudeerde strategieën voor kankertherapie 7 en neurodegeneratieve aandoeningen 9. De test hier beschreven biedt de mogelijkheid om de hervouwing activiteit van een specifieke moleculaire chaperonne te meten en het effect van de comp studieounds op zijn activiteit. In deze methode het gen van de onderzochte moleculaire chaperone samen getransfecteerd met een expressievector codering voor de vuurvlieg luciferase-gen. Het is al beschreven dat gedenatureerd vuurvlieg luciferase kan worden opnieuw gevouwen door moleculaire chaperonnes 10,11. Als het normaliseren van transfectie controle is een vector die codeert voor de renilla luciferase-gen getransfecteerde. Alle transfecties beschreven in dit protocol zijn uitgevoerd met X-treme Gene 11 (Roche) in HEK-293 cellen. In de eerste stap wordt de eiwitsynthese geremd door het behandelen van de cellen met cycloheximide. Daarna eiwitten ontvouwen wordt veroorzaakt door warmte shock bij 45 ° C gedurende 30 minuten. Na herstel bij 37 ° C, worden eiwitten opnieuw gevouwen in hun actieve conformatie en de activiteit van de vuurvlieg luciferase wordt gebruikt als read-out: hoe meer licht zal worden geproduceerd, de meer eiwitten zal opnieuw kreeg de oorspronkelijke conformatie. Niet-warmte geschokt cellen zijn ingesteld als referentie (100% van hervouwenluciferase).
Protocol
1. Zaaien van de cellen
- Voordat u begint, warm-up de cultuur medium, de PBS 1X en de trypsine in een waterbad bij 37 ˚ C
- Neem de cellen uit de incubator en zuig het medium.
- Voorzichtig toe te passen 5 ml PBS 1X op de cellen om ze te wassen.
- Zuig het PBS 1X en breng 1 ml trypsine bevat 0,025% EDTA.
- Voorzichtig draaien de plaat een gelijkmatige verdeling van het trypsine te hebben.
- Plaats de cellen in de incubator bij 37 ˚ C gedurende 5-10 minuten (afhankelijk van het celtype). Van tijd tot tijd te controleren of cellen worden losgemaakt door schudden van de plaat.
- Resuspendeer de cellen in 10-20 ml medium en verzamel ze in een 50 ml Falcon buis.
- Tel de cellen met behulp van een Beekman teller. Het aantal cellen moet voldoende zijn om een samenloop van ongeveer 60-70% te garanderen.
- Het bord van de cellen en laat ze zaad voor 6-8 uur.
2. TransFection
- Voorafgaand aan transfectie, warm-up een portie van serum-vrij medium in een waterbad van 37 ˚ C.
- Breng de X-treme Gene 9 tot kamertemperatuur.
- Pipet het serum vrij medium in 2 eppendorf tubes (1 tube = 1 transfectie).
- Pipet de X-treme Gene 9 in het serum vrij medium opletten dat de tip niet de plastic wand van de Eppendorf en incubeer gevoel voor 5 minuten. In de tussentijd bereiden twee DNA-mixen: in de ene buis mix samen de plasmiden voor renilla, vuurvlieg en een lege vector controle, in een andere buis renilla, vuurvlieg en de moleculaire chaperonne.
- Voeg de DNA-mix om elk eppendorf serum bevat dat vrij medium + X-treme Gene 9, vortex en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten.
- Voeg druppelsgewijs elke mix op elk bord en incubeer gedurende 24 uur bij 37 ° C en 5% CO 2
3. Het splitsen van de cellen
- 24 uur na transfectie, trypsinize de cellen, zoals beschreven in 1,4 tot 1,6 en verdun ze tot een definitieve confluentie van 60-70% in een 6-wells plaat.
- Bereid een plaat voor de niet-geschokt-controle en evenveel platen als de hersteltijd punten die moeten worden geanalyseerd, zoals bleek in Fig. 2.
4. Heat shock
- Voor warmte shock, pre-warm serum bevattend medium in een waterbad van 37 ˚ C.
- Voor te bereiden 'heat shock buffer' door verdunning in serum bevattend medium cycloheximide tot een uiteindelijke concentratie van 20 pg / ml en MOPS tot 20 mm.
- Nu nemen de platen uit de incubator en zuig het medium.
- Voeg toe aan elk putje 1 mL van 'Heat shock buffer', en gedurende 30 minuten bij 37 incubeer ˚ C en 5% van de CO 2 (onder meer ook de verwijzing plaat in deze behandeling). Dit zal de novo eiwitsynthese te stoppen.
- In de tussentijd schakelaar op een waterbad en zet de temperature bij 45 ˚ C.
- Na de incubatie zegel het deksel van de platen met Parafilm eerder gesneden in strepen. De referentie-plaat (100% van refolfed vuurvliegje) is nog in de couveuse.
- Incubeer de platen bij 45 ˚ C gedurende 30 minuten.
- Verwijder de platen uit het waterbad, verwijder de parafilm en weer de platen om de couveuse naar herstel mogelijk te maken.
- Op elk tijdstip de oogst van de cellen en was ze in PBS 1x door centrifugeren bij 2000Xg gedurende 1 minuut bij 4 ˚ C.
5. Cellysis en luciferase assay
- Voor een efficiënte cellysis, snap bevriezen van de cel pellet in vloeibare stikstof.
- Voeg 200 ul van passieve lysis buffer verdund 1:05 in dubbel gedistilleerd water in een glazen buis.
- Voeg 30 ul van de cel lysaat in een 96 wells plaat. Elk monster wordt gepipetteerd in drievoud.
- Alleen de 'niet geschrokken' referentiemonsters worden gebruikt omLees de renilla luciferase-activiteit, omdat deze stap wordt gebruikt om gelijk transfectie-efficiëntie te controleren.
- Bereid de oplossingen voor de test. Voor de luciferine oplossing verdunnen luciferine tot een uiteindelijke concentratie van 0,2 mM in Gly Gly-buffer. Voor de reactie buffer verdunnen DTT en ATP 1 mM uiteindelijke concentratie in Gly-Gly buffer. Voor coelenterazine reactiebuffer, verdunnen coelenterazine tot een uiteindelijke concentratie van 0,2 uM in coelenterazine buffer. Houd luciferine oplossing en coelenterazine reactiebuffer licht beschermd.
- Plaats nu de 96-wells plaat in de luminometer en start het programma 'Wallac 1420 Workstation'.
- Breng de Pump1 in de valk buis die de coelenterazine oplossing. Sluit het deksel zodat er geen licht kan in contact komen met de buis.
- Kies uit het menu de optie 'Dispenser onderhoud' en vink Pump1.
- Selecteer de optie 'Fill'.
- Voor het bewerken van de plaat lay-out kiezen voor de optie 'Explore-protocol en de resultaten' op het menu. Selecteer het protocol en dubbelklik erop. Selecteer nu de putten te lezen.
- Ga terug naar 'Wallac Manager' en klik op 'Start'. De reactie tussen de renilla luciferase en het substraat coelenterazine straalt licht uit met een piek golflengte van 482 nm.
- Na de lezing, ga op 'Dispenser onderhoud' en selecteer 'Empty' en Pump1 om alle resterende oplossing terug vrij te geven aan de buis.
- Nu schuif de tube naar een falcon buis met water en vink 'Flush'.
- Na het spoelen stap, leeg de buis door het selecteren van 'Empty'.
- Plaats de buis van Pump1 in de reactiebuffer valk buis en die van Pump2 in de luciferine falcon buis.
- Verander de plaat lay-out.
- Selecteer 'Fill' voor Pump1 en Pump2 van de 'DiSpenser Onderhoud 'menu.
- Selecteer het protocol en start de lezing. De reactie tussen de Firefly luciferase en het substraat luciferine straalt licht uit met een piek golflengte van 560 nm.
- Aan het eind van de lezing te herhalen van de procedure Empty-Flush-Lege voor Pump1 en Pump2.
- De resultaten zijn nu beschikbaar in de 'Wallac 1420 Explorer'.
- Elk experiment is gekoppeld aan een test nummer, gebruikersnaam, begin-en einddatum.
- De resultaten kunnen nu worden geëxporteerd als een Excel-bestand.
- Voor berekeningen, worden de cellen verdeeld in drie groepen: 1. niet-geschokt referentiemonsters (ingesteld als 100% van de hervouwen vuurvlieg luciferase), 2. cellen zonder moleculaire chaperonne en warmte geschokt, 3. cellen met moleculaire chaperone en warmte geschokt.
6. Representatieve resultaten
Eiwit hervouwing is direct gerelateerd aan de tijd van het herstel dan ook om te testen of het systeem werkt pro Perly, een test moet worden uitgevoerd verzamelen van de cellen op verschillende tijdstippen. Een directe correlatie tijd / percentage van de hervouwing geeft aan dat het experiment goed is uitgevoerd en vormt derhalve een beperkende factor. Het moet echter altijd worden beschouwd dat de hervouwing na heat shock is een verzadigende gebeurtenis en daarom een goede tijdsverloop analyse moeten worden uitgevoerd voordat u begint met een experiment.
Figuur 1. Overzicht van het experiment. In vivo hervouwing-test vereist 3 tot 4 dagen in te vullen. Op dag 1 cellen worden gezaaid en getransfecteerd. De volgende dag cellen worden gesplitst in een kleiner formaat en op dag drie zijn ze warmte geschokt. Op dit punt is het mogelijk om de luciferase assay uit te voeren direct na het oogsten van de cellen of naar de cel pellet op te slaan bij -80 ° C en voer de test in een ander moment
Figuur 2. Cel splitsen. Op dag 2 cellen worden gesplitst in een 6-wells plaat. Elke transfectie zal worden verdund in een goed in om alle transfectie op dezelfde plaat te hebben. Elke plaat komt overeen met een bepaalde hersteltijd plus een niet-geschokt referentie plaat.
Figuur 3. Vertegenwoordiger goed resultaat. A. Percentage van hervouwing rechtstreeks door vuurvlieg luciferase activiteit. Elke staaf grafiek geeft het percentage van de hervouwing in afwezigheid (zwarte balken) en in aanwezigheid van (rode balken) van een moleculaire chaperonne op verschillende hersteltijd punten. B. Correlatie tussen tijd en hervouwing in afwezigheid (zwarte lijn) en in aanwezigheid van (rode lijn) van de chaperonne. De r kwadraat waarden geven een goede correlatie.
In Fig.3A wordt een representatieve resultaten waar de cellen werden verzameld 15, 30, 45, 60 en 120 minuten na de heat shock in afwezigheid (zwarte balken) en in aanwezigheid van (rode balken) van moleculaire chaperonne. Percentage van de luciferase stijgt hervouwen met een langere hersteltijd en met de transfectie van de moleculaire chaperonne. De correlatie tussen hervouwing en tijd voor de controle (Fig. 3B, zwarte lijn) en de moleculaire chaperone-getransfecteerde cellen (Fig. 3B, rode lijn) wordt weergegeven.
Figuur 4. Vertegenwoordiger slecht resultaat. A. Percentage van hervouwing rechtstreeks door luciferase activiteit. Elke staaf grafiek geeft het percentage van de hervouwing in afwezigheid (zwarte balken) en in aanwezigheid van (rode balken) van een moleculaire chaperonne op verschillende hersteltijd punten. B. Correlatie tussen tijd en hervouwing in afwezigheid en in aanwezigheid (rood line) van chaperonne. De r kwadraat waarden geven slechte correlatie.
Figuur 4A. Toont een representatief resultaat van een experiment niet correct is uitgevoerd. Zowel de controle (zwarte balken) en de moleculaire chaperone-getransfecteerde cellen (rode balken) vertoonden geen een toename van de eiwit-hervouwing met de tijd. Bovendien heeft transfectie van de moleculaire chaperone niet resulteren in een toename van de hervouwing. Deze arme correlatie wordt bevestigd in Fig. 4B toont een r kwadraat waarde van 0,6619 en 0,1882 respectievelijk voor de controle (zwarte lijn) en de moleculaire chaperone-getransfecteerde cellen (rode lijn).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit werk een protocol om intracellulaire hervouwing activiteit van moleculaire chaperonnes maatregel is gepresenteerd. De hele test kan worden uitgevoerd in 3 tot 4 dagen zoals blijkt uit het overzicht in Fig. 1.
De robuustheid en de lineariteit van het lichtsignaal door de vuurvlieg en de renilla luciferase vormen een solide basis voor de reproduceerbaarheid van het protocol.
De kritische stap van de test is de keuze van een efficiënte transfectie reagens aan de overexpressie van de moleculaire chaperonne en de vuurvlieg luciferase te verzekeren. Reportergenen kunnen ook geleverd worden met andere methoden, zoals adenovirale infectie 12 of elektroporatie. Een andere mogelijkheid is het gebruik van een transgene cel lijn waar de uitdrukking van de chaperonne is chemisch induceerbaar (bv een tetracycline-responsieve promoter) 13, terwijl het gen van de vuurvlieg luciferase is stabiel getransfecteerde. Dit brede scala van optimaalons maakt het dus mogelijk de toepassing van de test naar verschillende cellijnen, inclusief primaire cellen.
Bovendien, als een cellijn is bijzonder gevoelig voor cycloheximide behandeling kon vuurvlieg luciferase eiwit vertaling gearresteerd worden door het gebruik een repressible / induceerbaar systeem.
Omdat hervouwing activiteit kan variëren tussen de moleculaire chaperonnes, moet een titratie van het bedrag van chaperone te worden getransfecteerd altijd worden gedaan. Eenmaal gevestigd in een bepaalde cel lijn, kan de techniek gebruikt worden om te onderzoeken hoe kleine moleculen en / of gentic manipulaties kunnen chaperonne-activiteit beïnvloeden. De test kan ook worden uitgevoerd in een kleiner formaat, zoals een 6 - of zelfs een 12-well plaat.
Een van de meest aantrekkelijke toepassingen is de mogelijkheid om hele bibliotheken van verbindingen die chaperonne-activiteit kunnen beïnvloeden te testen. In dit specifieke geval, cellijnen stabiel getransfecteerd met het reporter-gen als de laperone worden bij voorkeur gebruikt om schommelingen als gevolg van transfectie-efficiëntie te minimaliseren.
Deze test kan ook gebruikt worden om de rol van co-activatoren of co-repressor van de moleculaire chaperonnes aan proteïne hervouwing of hoe ze invloed hervouwing op verschillende stress-prikkels (warmte, oxidatieve stress, ontvouwen eiwitten respons) te onderzoeken.
Zelfs als uit een cel op basis van experiment is het mogelijk om een meer fysiologische uitlezing van het effect van de verbindingen en / of eiwitten op de activiteit van een bepaald chaperonne, is het niet mogelijk om de chaperone activiteit te kwantificeren met de assay hier gepresenteerd. In dit geval zou meer geschikt zijn een celvrij assay, zoals in vitro assay hervouwing van vuurvlieg luciferase of β-galactosidase.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Danilo Maddalo is een ontvanger van een onderzoeks-fellowship als Young Investigator Group (Yig) van het Karlsruhe Institute of Technology.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
For this experiment a Luminometer form Perkin Elmer '1420 Luminescence Counter' Vector Light′ was used |
|||
Programs for the Luminometer: |
|||
Renilla: Pump 1, 100 μl injection |
|||
Reaction Buffer: Pump1, 70 μl injection |
|||
Luciferin: Pump2, 30μl injection |
|||
For the buffers prepare these stock solutions in double distilled water: |
|||
|
|||
GLY-GLY-buffer: |
|||
|
|||
For 1 liter use 3,3g of Glycylglycin, 15ml of a 1M MgSO4 solution and 8ml of a 0,5M EGTA solution. Solve in water, adjust the pH to 7,8 and bring to a total volume of 1 liter. |
|||
Reaction buffer for Renilla/C–lenterazine buffer: |
|||
|
|||
For 1 liter use 13,4ml of a 1M KH2PO4 solution, 86,6ml of a 1M K2HPO4 solution, 100ml of a 5M NaCl solution and 2ml of a 0,5M EDTA solution. |
|||
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium 1X) | GIBCO | 41966029 | |
| Fetal Bovine Serum Gold | PAA | A15-151 | |
| X-treme Gene 9 DNA Transfection Reagent | Roche | 06365809001 | |
| PBS Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X | GIBCO | 14190-094 | |
| MOPS 3-(N-Morpholino)Propanesulfonic acid | SIGMA-ALDRICH | M1254 | |
| Cycloheximide | SIGMA-ALDRICH | C7698 | |
| Passive Lysis Buffer 5X | Promega | E194A | |
Glycylglycin EGTA MgSO4 (MgSO4*7H2O) |
SIGMA-ALDRICH Roth Roth | G7278 3054.2 P027.1 | |
KH2PO4 K2HPO4 (K2HPO4*3H2O) NaCl EDTA |
Roth Roth Roth Roth | 3904.1 6878.2 3957.1 8043.1 | |
| Luciferin Firefly | Biosynth | L8200 | |
| C–lenterazine | Biosynth | C7000 | |
| DTT (Dithiothreitol) | Roth | 6908.2 | |
| ATP (Adenosine Triphosphate) | Roche | 10519987001 | |
References
- Bukau, B., Weissman, J., Horwich, A. Molecular chaperones and protein quality control. Cell. 125, 443-443 (2006).
- Ritossa, F.
- Hendrick, J. P., Hartl, F. U. Molecular chaperone functions of heat-shock proteins. Annu. Rev. Biochem. 62, 349-349 (1993).
- Fuqua, S. A. Heat shock proteins and drug resistance. Breast. Cancer. Res. Treat. 32, 67-67 (1994).
- Guzhova, I., Margulis, B. Hsp70 chaperone as a survival factor in cell pathology. Int. Rev. Cytol. 254, 101-101 (2006).
- Whitesell, L., Lindquist, S. L.
- Konstantinopoulos, P. A., Papavassiliou, A. G.
- Galluzzi, L., Giordanetto, F., Kroemer, G. Targeting HSP70 for cancer therapy. Mol. Cell. 36, 176-176 (2009).
- Ozacmak, V. H., Barut, F., Ozacmak, H. S. Melatonin provides neuroprotection by reducing oxidative stress and HSP70 expression during chronic cerebral hypoperfusion in ovariectomized rats. J. Pineal. Res. 47, 156-156 (2009).
- Schroder, H., Langer, T., Hartl, F. U., Bukau, B. DnaK, DnaJ and GrpE form a cellular chaperone machinery capable of repairing heat-induced protein damage. EMBO. J. 12, 4137-41 (1993).
- Thulasiraman, V., Matts, R. L. Effect of geldanamycin on the kinetics of chaperone-mediated renaturation of firefly luciferase in rabbit reticulocyte lysate. Biochemistry. 35, 13443-13443 (1996).
- Howarth, J. L. Hsp40 molecules that target to the ubiquitin-proteasome system decrease inclusion formation in models of polyglutamine disease. Mol. Ther. 15, 1110-1110 (2007).
- Nollen, E. A. Bag1 functions in vivo as a negative regulator of Hsp70 chaperone activity. Mol. Cell. Biol. 20, 1083-1083 (2000).
