Abstract
Descreve-se o uso de um microscópio ótico padrão para realizar medidas quantitativas de massa, volume e densidade em amostras celulares através de uma combinação de campo brilhante e diferencial interferência imagens de contraste. Duas abordagens principais são apresentados: microscopia de fase quantitativa noninterferometric (NIQPM), para realizar medições de massa total de células e distribuição da densidade subcelular, e Hilbert transformar microscopia de contraste de interferência diferencial (HTDIC) para determinar volume. NIQPM baseia-se um modelo simplificado de propagação da onda, denominado aproximação paraxial, com três suposições: baixa abertura numérica (NA) de iluminação, a dispersão fraca, e fraca absorção de luz pela amostra. Felizmente, as amostras celulares não coradas satisfazer estes pressupostos e baixa iluminação NA é facilmente alcançada em microscópios comerciais. HTDIC é usado para obter informações volumétrica a partir de imagens através de foco DIC sob alta ilumin NAcondições ation. Iluminação elevada NA permite melhor corte da amostra ao longo do eixo óptico. Transformada de Hilbert da transformação na imagem DIC empilha aumenta muito algoritmos de detecção de borda para a localização das fronteiras de amostras em três dimensões, separando os valores de cinzento da intensidade espécime das do fundo. As principais vantagens do NIQPM e HTDIC estava em sua acessibilidade tecnológica utilizando microscópios "off-the-shelf". Existem duas limitações básicas destes métodos: z-stack tempo de aquisição lenta em âmbitos comerciais ab-roga atualmente a investigação dos fenômenos mais rápido do que um frame / minuto, e em segundo lugar, os efeitos de difração de restringir a utilidade da NIQPM e HTDIC a objetos de 0,2 até 10 (NIQPM) e 20 (HTDIC) um de diâmetro, respectivamente. Assim, os espécimes e o seu tempo associado dinâmica de interesse deve satisfazer certos restrições de tamanho e temporais, para permitir o uso de tais métodos. Empolgante, a cellula mais fixor espécimes são prontamente investigadas com estes métodos.
Introduction
O uso de microscopia óptica é agora onipresente na investigação de organismos celulares. Devido ao seu baixo de absorção e de espalhamento fraco propriedades endógenas mais visível do espectro óptico, as células não afetam fortemente a amplitude de ondas ópticas atravessando-los e, assim, aparecer semitransparente quando fotografada com microscópios de campo brilhante padrão. Amostras celulares, no entanto, diminuir ondas ópticas viajam através deles de uma forma que é linearmente relacionada com a quantidade de densidade de massa local em uma determinada região do espaço através do qual a luz viaja. A utilização desse intervalo de tempo heterogêneo ou perfil "fase" de ondas ópticas transmitidos através espécimes microscópicas foi descrita pela primeira vez em 1935 por Frits Zernike 1 e experimentalmente realizado por Zernikein 1942 2. Zernike foi agraciado com o prêmio Nobel em 1953 por essa conquista. Zeiss comercializado esta modalidade em 1945 3. Em 1955, Smith e NomarskGostaria de apresentar o seu trabalho inicial sobre o uso de 4 e 5 de teoria de interferência diferencial contraste (DIC) de microscopia, uma modalidade que utiliza o gradiente espacial de fase como um mecanismo de contraste. DIC foi comercializado por Zeiss em 1965in estreita colaboração com Nomarski 6. Em 1981, dois laboratórios demonstraram a primeira célula viva imagens DIC registada com a incorporação de câmaras de vídeo para o trem óptica do microscópio DIC 7, 8. A era das imagens de células vivas nasceu.
Desde essa altura, a execução de ambos de contraste de fase e DIC em microscópios comerciais tem sido largamente inalterada. Estes métodos são utilizados principalmente por biólogos para produzir imagens de células para fins qualitativos: o monitoramento da morfologia, rastreamento de estruturas subcelulares e investigações de dinâmica da membrana 9. Estas técnicas são qualitativa na sua configuração de "off-the-shelf" tanto como fase e DIImagens c são funções arbitrárias da intensidade da fonte de luz, as configurações óptica iluminação, e ganho da câmera CCD, gama e configurações de exposição.
Uma pequena legião de físicos e engenheiros ópticos tem se esforçado para fazer exames de imagem comerciais quantitativa. Entre os primeiros esforços foram duas cartas à natureza em 1952 e 1953, em que o médico que virou biofísico Robert Barer demonstrado o uso de microscopia de fase para determinar a massa seca celular das células estimando mudanças de fase através destes tipos de células utilizando um microscópio de fase disponível comercialmente 10, 11. O campo tem desenvolvido uma infinidade de técnicas ao longo dos anos seguintes com base em torno de três mecanismos básicos de contraste sem rótulo: microscopia de fase 10,11, microscopia DIC 12-17, 18-22 e brilhante campo para determinar óptico caminho de comprimento, fase em massa densidade, índice de refração, e volume celular.
No Parállel, uma grande coleção de instrumentos ópticos personalizados também têm sido desenvolvidos desde os anos 1950, e fizeram de longo alcance medições ópticas que vão desde aplicações em crescimento do parasita 23, para documentar o ciclo celular 24 para investigar a dinâmica da membrana das células vermelhas do sangue 25. Em particular, nos últimos dez anos tem visto uma riqueza de microscopia quantitativa sem rótulo na forma de microscopia de fase difração de 26, microscopia tomográfica fase 27, microscopia holográfica digital 28, sensível microscopia de coerência óptica fase 29, microscopia de interferência de luz espacial 30, Hilbert fase microscopia 31, e microscopia de fase quantitativa 32. Apesar de seus sucessos coletivos, estes instrumentos não tenham sido divulgadas ao maior campo de pesquisadores biológicos, devido, principalmente, à sua instrumentação complexa e requisitos computacionais.
Aqui nós describe o uso de um microscópio óptico padrão para realizar medidas quantitativas de massa, volume e densidade em amostras celulares através de uma combinação de campo claro e imagens DIC. Duas abordagens principais são apresentados: microscopia de fase quantitativa noninterferometric (NIQPM), para realizar medições de massa total de células e distribuição da densidade subcelular, e Hilbert transformar microscopia de contraste de interferência diferencial (HTDIC), para determinar o volume. As principais vantagens do NIQPM e HTDIC estava em sua acessibilidade tecnológica. As condições de imagem necessários para a sua realização bem sucedida estão dentro do âmbito do funcionamento normal da maioria dos microscópios disponíveis comercialmente. Além disso, os algoritmos de pós-processamento são estáveis, rápido e robusto - tendo sido implementado em MATLAB usando transformada de Fourier rápida algoritmos (FFT) com base, sempre que possível.
NIQPM é um método para reconstruir fase e a densidade de massa integrada axialmente de celespécimes intracelular de imagens de campo claro. Soma desta densidade de massa integrada axialmente ao longo da área da amostra dá o teor de matéria seca total da amostra. O protocolo NIQPM baseia-se nas bases experimentais definidas por Paganin Nugent e 18, 19 - em que foi demonstrado que o perfil de fase de uma célula pode ser reconstruído a partir das imagens da amostra através do foco de campo brilhante - e o trabalho teórico de Frank , Altmeyer e Wernicke 20 - na resolução dos modelos de ondas paraxiais de forma eficiente com base em FFT. A ligação da fase com a densidade de massa seca é baseado no trabalho por Barer 10, 11 e Popescu 33.
Informações volumétrica podem ser obtidas a partir de imagens por meio de DIC-focagem sob condições de iluminação elevados de NA que permitem o corte óptico da amostra ao longo do eixo óptico. Hilbert transformar processamento nas pilhas de imagens DIC aumenta muitoalgoritmos de detecção de borda para a localização das fronteiras de amostras em três dimensões, separando os valores de cinzento da intensidade espécime das do fundo. Isto origina trabalho com Arinson et al. Embora 34 foram introduzidos os dois métodos de filtragem de Fourier para aumentar o contraste e um método de detecção de borda à base de Sobel para análise volumétrica automatizada de amostra. Temos também validado HTDIC anteriormente em esferas de poliestireno que variam em tamanho desde o limite de difração de até 20 m de diâmetro 36.
Embora ambos NIQPM e HTDIC são tecnologicamente acessíveis devido ao seu desenvolvimento em microscópios comerciais, os métodos são fundamentalmente limitada pela configuração das próprias microscópios de hardware. As limitações primárias de estas técnicas são duas vertentes: z-stack tempo de aquisição lenta em âmbitos comerciais, devido à tradução de todo o estágio da amostra ao invés de apenas a lente objetiva, Limita actualmente a investigação de fenómenos mais rápidos do que cerca de um quadro / minuto, e, por outro, os efeitos de difracção de restringir a utilidade de NIQPM e HTDIC para objectos que variam em tamanho desde 0,2 até 10 e 20 um de diâmetro, respectivamente. Assim, a amostra e sua dinâmica de tempo associados de interesse deve atender determinado tamanho e restrições temporais para permitir a utilização destes métodos em instrumentos típicos "off-the-shelf". Empolgante, a maioria das amostras celulares fixos são prontamente investigadas com estes métodos.
Uma visão geral do NIQPM e protocolos HTDIC são apresentados na Figura 1. Na Figura 2 ilustramos imagem ideal e de qualidade inferior por meio de foco em condições de baixa e alta iluminação NA tanto para campo claro e imagens DIC. Figuras 3 e 4 demonstram a dependência de parâmetros do algoritmo NIQPM destacando implementações bem sucedidas e mal sucedidas.
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Protocol
1. Microscópio Especificações
Para a realização de imagens na forma correta o microscópio deve ter as seguintes especificações:
- Possuir tanto contraste de interferência diferencial (DIC) e de campo claro (BF) de contraste.
- Já movimento do eixo z controlados por computador.
- Possui uma paragem de abertura ajustável para variar a abertura numérica da lente de condensador. Uma abertura com uma regra graduada ou leitura eletrônica é necessária para saber o valor da abertura numérica. A abertura numérica que varia de 0,1 para NIQPM até 0.9 (ou superior) para HTDIC.
- O microscópio deve ter um filtro de cor estreita faixa a ser utilizado para brilhante imagem de campo. Este filtro é necessário para corrigir o incremento de refração, uma facture dependente do comprimento de onda utilizado para converter fase de densidade de massa para NIQP.
2. Contraste de interferência diferencial (DIC) Aquisição Z-stack
- Abra o software de um Slidebookª criar um novo slide para a coleta de imagem.
- Em seguida, abra a janela Focus. Na seção Conjunto de Filtros, selecione DIC. Na guia Escopo, na seção do condensador, ajuste o controle deslizante de abertura para o mais distante posição correta (aberto todo o caminho). Isto proporciona uma iluminação elevada abertura numérica e de corte aumenta óptica da amostra.
- Concentre-se na amostra usando uma objetiva DIC. Ajuste a intensidade da lâmpada de halogéneo até que a amostra é facilmente visível. Para garantir que a câmera não está sendo saturado, selecione a aba Camera na Janela Foco e verifique se o histograma de intensidades de pixel está dentro da faixa dinâmica da câmera.
- Abra a janela de Captura de Imagem. Na seção Tipo de captura, marque a caixa 3D. Na seção de captura 3D, selecione o intervalo em torno do centro e voltar para o local atual
- Na seção Conjunto de Filtros da janela de Captura de Imagem, marque a caixa DIC e especifique o tempo de exposição. Na seção Informações da Imagem, o nome da imagem (opcional), e selecione Iniciar para iniciar a imagem.
3. Campo Bright (BF) Aquisição Z-stack
- Uma vez que o microscópio foi concluída a coleta do Z-stack da amostra DIC, abra a janela de foco e selecione Abrir na seção Set Filter. Ajuste a barra deslizante de abertura para o mais distante posição esquerda (fechado todo o caminho) para fornecer iluminação baixa NA.
- Mude o filtro microscópio de luz caminho para verde. Ajustar a intensidade de luz de halogéneo, até a amostra é visível. Certifique-se de que não há saturação da câmera selecionando o
- Abra a janela de Captura de Imagem. As configurações de captura 3D a partir da aquisição Z-stack DIC será exibida.
- Na seção Conjunto de Filtros da janela de Captura de Imagem, marque a caixa aberta e especifique o tempo de exposição. Na seção Informações da Imagem, o nome da imagem (opcional), e selecione Iniciar para iniciar a aquisição de imagens Z-stack.
4. Exportando Z-stack Images
- Abra uma captura Z-stack. Alterar a vista para 100%. Ajustar o histograma dos valores de pixel a serem exibidas entre 0 e o valor de pixel máximo da câmara (4,095 para 12 câmaras de bits, 65.535 para 16 bits.).
- Selecione Exibir> Export> Série TIFF. Isto irá exportar o Z-stack como uma série de imagens TIFF(Um para cada plano Z). Salve a série TIFF em uma pasta separada com um nome que tem um sublinhado no final (ou seja, "DIC Stack 1_"). Repita este procedimento com cada Z-stack DIC ou BF.
5. Desconto Medidas
- Abra o programa HTDIC MATLAB intitulado "JoVE_HTDIC_v1.m".
- Nos termos do artigo 0 do programa HTDIC, atualize a variável diretório dependências. Copie e cole o diretório que contém o hilbert_transform_dic.m e arquivos sobel_edge_detect.m do explorador (PC) entre as aspas simples seguinte "dependencies_directory =". ExecuteSection 0 do programa JoVE_HTDIC_v1.m.
- Na Seção 1, atualize o "images_directory". Mais uma vez, copie e cole o diretório que contém as imagens através de foco na forma tif. Entre as aspas simples. Só correr SEÇÃO 1 VEZ.
- Alinhamento e rotação de imagens para Hilbert transformar Run Seção 2 do código. A caixa de diálogo intitulada "Definir parâmetros HTDIC" irá aparecer. Cinco numbers são exigido do usuário: o número de plano focal onde a imagem DIC da amostra está em foco, resolução lateral (mm / pixel na imagem), a resolução axial (isto é 0,1 para aquisição de imagem em 0,1 mM passos axiais), o ângulo da imagem DIC rotação necessária para realizar a transformada de Hilbert, os valores típicos são de 45 e -135. Por fim, entram na região de tamanho interesse, este parâmetro define o comprimento de um lado de uma caixa, que em seguida aparecem - valor típico é de 400. Clique em OK.
- Uma imagem do plano focal DIC especificada pelo número de plano focal irá aparecer com uma caixa azul. Posicione a caixa sobre a característica de interesse, por exemplo, uma célula. A caixa não precisa ser quadrado. Uma vez que a caixa foi posicionada sobre a região desejada, clique duas vezes dentro da caixa.
- Outra figura aparecerá agora: esta figura contém uma imagem recortada e rodado da região de interesse selecionada na etapa anterior. O contraste da imagem deve ser talcaracterísticas que escuras aparecem na esquerda, enquanto características brilhantes aparecem na direita. Arraste a caixa azul sobre a região de interesse, reformular, se necessário.
- Seção 3 gera uma máscara para o cubo z pilha. Existem dois tipos de máscaras disponíveis: uma máscara retangular para criar um retângulo ao redor da célula e uma ferramenta à mão livre para delinear a célula de interesse com a mão.
- Para gerar uma máscara retangular, linha 167 e descomente comentário linha 170 (comentário de uma linha para fora, colocando um "%" no início da linha). Executar Seção 3 do programa. Clique na imagem e arraste o mouse para começar a definir a máscara retangular. Dê um clique duplo na caixa de aceitá-lo.
- Para gerar uma máscara desenhada à mão, o comentário linha 167 e linha 170 descomente e executar Seção 3. Clique e tirar a máscara desejada com o mouse. Dê um duplo clique sobre a máscara para aceitá-la.
- Seção Execute 4to construir o Hilbert transformado pilha de DIC e os correspondentes imagem Pilha da área de interesse DIC.A máscara construída na Seção 3 serão aplicadas ao Hilbert transformar pilha DIC ea pilha DIC regular quando "maskon" está definido para 1 na linha 179. Definição "maskon" para 0 irá construir pilhas de imagens sem aplicar a máscara.
- Execute Seção 5 para otimizar a segmentação das imagens seccionais xz transversais da região de interesse. Figura 500, produzido pelo programa, é exibida com três tipos diferentes de contraste. O sucesso do algoritmo para encontrar os limites da célula é dependente de uma combinação de a máscara usado e o valor de "limiar", na linha 229 de programa. Comece com um valor de 0,5. Ajuste o valor de limiar e execute novamente esta seção do programa até o delineamento adequado é alcançado em uma das colunas.
- Se o delineamento foi o melhor na coluna 1, use a Seção 6 para determinar o volume usando uma imagem segmentação DIC. Se a coluna 2 deu os melhores resultados, execute Seção 7 para determinar o volume da célula a partir de imagens DIC Hilbert-transformada. Se a coluna 3 gave os melhores resultados, executar Section 8 para determinar o volume usando Fourier filtrada imagens DIC Hilbert-transformada.
- O volume medido da amostra, relatado em mM cúbico (fl) é apresentado no título da Figura 600, 700, ou 800 produzido pelo programa, dependendo de qual a medição de volume é escolhido.
6. Medidas de Massa
- Abra o programa NIQPM MATLAB intitulado "JoVE_NIQPM_v1.m".
- Nos termos do artigo 0 do programa NIQPM, atualizar o local de três diretórios necessários para executar o programa. Estes são o "dependencies_directory," o "brightfield_directory," e o "dic_directory."
- Em seguida, execute Seção 1. Esta seção do código gera um campo brilhante imagem Cubo do campo cheio de todo o conjunto de imagens. Só correr SEÇÃO 1 VEZ.
- Em seguida, execute Seção 2. A caixa de diálogo intitulada "Definir parâmetros NIQPM" irá aparecer. Quatro números são exigido do usuário: o número de plano focal onde a imagem de campo claro daamostra está em foco, resolução lateral (mm / pixel na imagem), a resolução axial (isto é 0,1 para a aquisição de imagem em 0,1 mM passos axiais), e a região de tamanho interesse, este parâmetro define o comprimento de um lado de um caixa que vai aparecer posteriormente - um valor típico é 200. Clique em OK.
- Uma imagem do plano focal de campo claro especificada pelo número de plano focal irá aparecer com uma caixa azul.
- Se a imagem não está em foco, clique duas vezes na caixa azul e reprise Seção 2, certifique-se de ajustar o número de plano focal na caixa de diálogo.
- Se a imagem está em foco, arraste a caixa azul ao redor da imagem e redimensioná-lo, selecionando os nós da caixa e arrastando-os quando necessário. Posicione a caixa em torno da característica de interesse, por exemplo, uma célula. A caixa não precisa ser quadrado. Clique duas vezes dentro da caixa para aceitá-la.
- Em seguida, executar o ponto 3 para a construção de uma pilha de imagens de campo brilhante foi colhido para a região de emjuro.
- Para gerar a imagem DIC pseudo mapa de fase, e as comparações com a imagem DIC verdadeira imagem e campo claro, correr Seção 4.
- Com o pseudo DIC e imagens verdadeiras DIC tão semelhantes quanto possível, o mapa de densidade de massa, a massa total, e um histograma da densidade celular pode ser determinada através da execução secção 5a ou 5b. Seção 5a realiza detecção boarder automatizada do campo - otimizar "limite" na linha 300 - valores típicos variam entre 0,1-1. Execute novamente nesta seção, conforme necessário para otimizar o valor do limite. Seção 5b realiza a determinação da massa, etc depois que o usuário define a célula de interesse.
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Representative Results
Iluminação amostra correta durante a aquisição de imagem através de foco é fundamental para o sucesso da implementação do NIQPM um nd algoritmos HTDIC. Na Figura 2 ilustramos baixa e alta iluminação NA sob tanto DIC e brilhante contraste campo para uma esfera de poliestireno ea linha de células de adenocarcinoma colorretal humano SW620. Figuras 2A, 2C, 2I e 2K demonstrar imagem ideal para NIQPM. Figuras 2F, 2H, 2N, e 2P demonstrar imagiologia óptima para HTDIC.
As figuras 3 e 4 demonstram a dependência de parâmetros do algoritmo NIQPM destacando implementações tanto bem e mal sucedidas. Na Figura 3, explorar o perfil de fase de uma esfera de poliestireno de 4,8 um de diâmetro - o perfil esperado teoricamente é conhecido e pode, assim, ser comparados directamente para a reconstrução NIQPM.
Amostras celulares, cujas propriedades de fase não são conhecidos à priori, podem ser reconstruídos com NIQPM em conjunção com um procedimento de comparação de uma imagem de "pseudo DIC" - calculada a partir da fase reconstruída - de uma imagem real de DIC, determinada a partir de uma medição óptica directa, da célula. NIQPM tem um parâmetro livre - o avião no campo imagem pilha brilhante em que o cálculo é centrado. Este plano focal central deve ser ajustada até que a pseudo DIC e verdadeiras imagens DIC olhar mais semelhante possível. Figuras 4E-G demonstrar um pseudo fora-de-foco da imagem DIC, uma imagem DIC pseudo ideal, eo correspondinimagem g DIC da célula feita com uma iluminação de NA de 0,9. Curiosamente, a imagem DIC pseudo correspondente o melhor mapa de fase e não necessariamente correspondem a uma imagem de campo claro foco em, viz. Figuras 1A e 1B.
Por fim, a Figura 5 ilustra os passos envolvidos no algoritmo de processamento de imagem HTDIC. Desde o DIC imagens através de foco sob NA = 0,9 iluminação, Figuras 5A e 5D, a transformada de Hilbert é pré-formado para remover o baixo-relevo das imagens DIC, Figuras 5B e 5E. Isto vem com alguma desfocagem ao longo do eixo óptico, que pode ser removido a partir de filtragem de Fourier de passagem alta, as Figuras 5C e 5F. Estas imagens finais são facilmente segmentado para determinar a área de cada plano de corte transversal da amostra para inferir o volume total celular.
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Figura 1. NIQPM e HTDIC Workflow. (1). Espécimes microscópicos, como as células devem ser montadas em lâminas de microscópio com tampa de vidro afixada sobre a amostra usando Fluoromount G. (2). Imagens através de foco adquiridos mediante tanto DIC e contraste campo brilhante com um padrão "fora-do-prateleira" microscópio formam a entrada para os algoritmos de processamento de imagem. (3.) Pós-processamento de imagens em MATLAB para determinar o volume da célula de DIC e distribuição de massa celular a partir de imagens de campo claro. (4). Métricas endpoint quantitativos:. Mapas de calor e gráficos de barras Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 2. Através do foco DIC e imagens de campo claro de esferas de poliestireno e linhas de células SW620. As condições de imagem ideais para NIQPM são campo contraste brilhante com 0,1 NA iluminação. Para HTDIC DIC, 0,9 NA iluminação é ótima. (A, B) En enfrentar imagens de campo claro de 4,8 mM diâmetro esfera de poliestireno sujeitas a 0,1 e 0,9 NA NA iluminação, respectivamente. (C, D) imagens de campo claro transversal de 4,8 um de diâmetro esfera de poliestireno sujeitas a 0,1 e 0,9 NA NA iluminação, respectivamente. (E, F) En rosto DIC imagery de 4,8 mM diâmetro esfera de poliestireno sujeitas a 0,1 e 0,9 NA NA iluminação, respectivamente. (G, H) imagens DIC transversal de 4,8 um de diâmetro poliestireno esfera sem prejuízo de 0,1 e 0,9 NA NA iluminação, respectivamente. (I, J) En enfrentar imagens de campo claro de SW620 linhagem de células de câncer colorretal sujeitas a 0,1 e 0,9 NA iluminação, respectivamente. (K, L) imagens de corte transversal de campo claro de SW620 assunto célula para 0,1 e 0,9 NA iluminação, respectivamente. (M, N) En rosto DIC imagens de SW620 células sujeitas a 0,1 e 0,9 NA NA iluminação, respectivamente. (O, P) Cruz de imagens DIC corte de SW620 células sujeitas a 0,1 e 0,9 NA NA iluminação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Ótimos e subótimos reconstruções fase:. 4,8 mM diâmetro esfera de poliestireno Cada linha investiga a dependência plano focal da casa enfrentam brilhante intensidade de campo (primeira coluna) e do perfil de fase reconstruído como o plano focal começa no ponto central através da esfera, z = 0 , e se move para além deste plano em 1 mM passos. (A, E, I, F) E n enfrentam intensidade de campo claro, (B, F, J, N) correspondente reconstrução de fase, (C, G, K, S) comparação do perfil de fase reconstruída ao longo da diagonal da fase mapa, círculos azuis, perfil teórico fase, em vermelho, e tolerância de erro do fabricante, as linhas pretas, e (D, H, L, P) porcentagem (%) de erro do reconstruído phase no que diz respeito ao perfil fase teórica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Ótimos e subótimos reconstruções fase:. Células SW620 As duas colunas comparar campo brilhante imagem aviões abaixo do ideal e ótimas (A, B) a partir do z-stack para o centro do cálculo de fase. As reconstruções de fase correspondentes (C, D) são usados para gerar uma imagem de pseudo DIC (E, F). Estes são comparados com a imagem verdadeira DIC, NA = 0,9 iluminação, em (L). A imagem de pseudo DIC melhor combinam a imagem DIC determina as imagens de entrada corretas do campo brilhante image pilha para usar na fase de reconstrução. Finalmente, a fase é mapeado para a densidade de massa projetada (H, I). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. Realce de contraste DIC Optimal usando HTDIC: esferas de poliestireno e células SW620. Imagem HTDIC (A) imagens transversal DIC de uma esfera de 4,8 poliestireno, (B) correspondente (C) Fourier filtrada imagem HTDIC. A dimensão axial das imagens esfera foram escalados para dar conta de refração incompatibilidade índice da amostra (1.597) e os meios de comunicação de montagem (1.4). (DF) demonstrar o mesmo tipo de imagem para uma célula SW620, no entanto, sem i refraçãondex correção incompatibilidade devido ao fraco índice de contraste da amostra. No limiar foi realizada em essas imagens. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Em geral, NIQPM é uma técnica de difração limitada validado no caminho comprimentos ópticos que vão ,25-44,7. Validação foi realizada em n = 1,596 esferas de poliestireno que variam em diâmetro 0,11-9,8 mM suspenso em Fluoromount G (dados não mostrados). As células possuem comprimentos de caminho óptico que variam de cerca de 0-7.
Ao medir a distribuição da densidade de uma amostra pode-se achar que a imagem do pseudo DIC parece bem, enquanto o mapa de densidade possui indesejados contribuições de fundo. Isto é devido ao ruído nas imagens de campo claro da amostra utilizada como entrada para o algoritmo NIQPM. Duas possíveis modificações no método NIQPM pode ser utilizado para eliminar os indesejáveis contribuições fundo: por um lado, pode-se utilizar tempos de exposição mais longos para aumentar a relação sinal-ruído nas imagens de campo brilhante. Isto é especialmente crítico quando imagiologia amostras opticamente finas. Alternativamente, pode-se reduzir o espaçamento axial do acquisit z pilhaíon 0,1-0,05 mM e médios 2-3 aviões juntos antes de inseri-las no algoritmo NIQPM.
Determinação do volume baseado HTDIC foi validado em esferas de poliestireno que variam de diâmetro 1-20 mM e tem sido validadas com microscopia de fluorescência confocal 35. A técnica superestima o volume de objetos abaixo do limite de difração do sistema devido aos efeitos de difração associados com a função de ponto de difusão da óptica.
Solução de problemas da determinação do volume HTDIC talvez necessária para amostras pequenas ou finas. A principal fonte de erro vem de segmentação de imagens usando a detecção de borda baseado em Sobel embutido MATLAB usado para determinar os limites da célula nas imagens das secções transversais. O valor de "limite" na seção 4 do programa HTDIC é fundamental para a obtenção do melhor segmentação. Os resultados tendem a variar de forma não-linear - com pequenas alterações na drasticall "limiar"y alterar a área fechada que resulta da detecção de borda. O programa atual apresenta ao usuário opções para executar a segmentação de imagens a partir de qualquer z-stack DIC, o z-stack HTDIC, ou z-stack F-HTDIC.
Sozinho DIC é muitas vezes melhor para grandes espécimes enquanto HTDIC e de trabalho F-HTDIC para amostras pequenas (<5 m de diâmetro).
A máscara pode aumentar a capacidade do método de segmentação da imagem. Seção 2 permite que o utilizador possa determinar uma máscara para aplicar ao cubo imagem. Recomenda-se o uso de uma máscara rectangular que trunca o horizontal (x-extensão) do cubo, preservando a vertical (y-extensão) do cubo.
Em resumo, NIQPM e HTDIC são modalidades de imagem quantitativos tecnologicamente acessíveis que podem ser executadas em padrão microscópios ópticos "off-the-shelf", em contraste com a maioria dos métodos existentes. Central para estas técnicas é a imagem através do foco da amostra sob a aproxcondições opriate imagem: baixa iluminação NA para NIQPM e alta iluminação NA para HTDIC. Os métodos aqui apresentados podem ser generalizados para o uso em diferentes dos demonstrados aqui sistemas. Os principais critérios necessários para estes procedimentos é um microscópio para que o usuário tem controle sobre o z-movimento do palco e a capacidade de adquirir imagens como a posição focal da lente objetiva é variada. Os métodos apresentados são adequados para imagiologia de células fixadas ou movendo-se lentamente as amostras biológicas.
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Disclosures
Os autores não têm interesses financeiros no trabalho apresentado.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado por subvenções dos Institutos Nacionais de Saúde (U54CA143906 a KGP, OJTM e R01HL101972 para OJTM) e uma Fundação de Pesquisa de Oregon Medical Cedo Clínica Investigator Award (KGP). OJTM é um Investigador Fundada American Heart Association (13EIA12630000). Agradecemos ao Dr. Eric Anderson, do Instituto do Câncer Knight para preparação de amostras de células utilizadas neste trabalho.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zeiss Axio Imager 2 microscope | Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany | Axio Imager D2 | Microscope |
| Green filter (λ = 540 ± 25 nm) | Chroma Technology Corp., Bellows Falls, Vermont | D540/25x | Green filter |
| SlideBook 5.5 software | Intelligent Imaging Innovations, Denver, Colorado | Image acquistion software | |
| Polystyrene microspheres | Bangs Laboratory, Inc., Fishers, IN | PS06N | Polystyrene spheres |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech, Birmingham, Alabama | 0100-01 | Mounting media |
References
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