Summary
تعميم الخلايا السرطانية (التدرجي) هي النذير في العديد من أنواع السرطان النقيلي. يصف هذا المخطوط الذهب نظام موحد CellSearch (CSS) منصة التعداد لجنة مكافحة الإرهاب ويسلط الضوء على الأخطاء الشائعة الخطأ في التصنيف. بالإضافة إلى ذلك، يتم وصف بروتوكولين تكييفها لتوصيف علامة المعرفة من قبل المستخدم من التدرجي وCTC التعداد في نماذج الماوس قبل السريرية لورم خبيث باستخدام هذه التكنولوجيا.
Abstract
غالبية الوفيات المرتبطة بالسرطان تحدث لاحقة لتطوير المرض المنتشر. ويرتبط هذا مرحلة المرض قاتلة للغاية مع وجود تعميم الخلايا السرطانية (التدرجي). وقد أثبتت هذه الخلايا النادرة لتكون ذات أهمية سريرية في الثدي النقيلي والبروستات، وسرطان القولون والمستقيم. معيار الذهب الحالية في الكشف السريري جنة مكافحة الإرهاب والتعداد هو نظام CellSearch ادارة الاغذية والعقاقير تطهيرها (CSS). يحدد هذا المخطوط بروتوكول قياسي يستخدم بها هذه المنصة فضلا عن اثنين من البروتوكولات الإضافية تكييفها التي تصف عملية مفصلة من المعرفة الأمثل لتوصيف البروتين علامة من التدرجي المريض وبروتوكول مشابه لالتقاط لجنة مكافحة الإرهاب في أحجام منخفضة جدا من الدم، وذلك باستخدام معيار الكواشف CSS، للدراسة في نماذج الماوس قبل السريرية المجراة من ورم خبيث. بالإضافة إلى ذلك، ارتفعت فروق في نوعية جنة مكافحة الإرهاب بين الدم المانحة صحية مع الخلايا من نسيج الثقافة مقابل مريض عصيدة الدمويسلط الضوء ليه. أخيرا، وترد عدة بنود خلافات شيوعا التي يمكن أن تؤدي إلى أخطاء سوء تصنيف لجنة مكافحة الإرهاب. أخذت معا، فإن هذه البروتوكولات توفر مصدرا مفيدا للمستخدمين من هذا المنبر المهتمين في مجال البحوث قبل السريرية والسريرية المتعلقة ورم خبيث والتدرجي.
Introduction
في عام 2013 يقدر أن 580350 الأفراد سوف يموت من السرطان وسيتم تشخيص الحالات الجديدة التي 1660290 من هذا المرض في الولايات المتحدة وحدها 1. غالبية هذه الوفيات تحدث لاحقة لتطوير المرض المنتشر 2. النقص الحالي من العلاجات الفعالة في علاج الانبثاث وفهم محدود من تتالي النقيلي يجعل هذه المرحلة من المرض فتاك بدرجة عالية. وقد ثبت وجود الخلايا السرطانية المنتشرة (التدرجي) داخل مجرى الدم لربط مع المرض المنتشر 3. هذه الخلايا هي نادرة للغاية والكشف عنها يدل على البقاء على قيد الحياة عموما في الثدي النقيلي 4، 5 البروستاتا، والقولون والمستقيم سرطان 6. في هؤلاء المرضى، فإن وجود ≥ 5 (الثدي والبروستات) أو ≥ 3 (القولون والمستقيم) التدرجي في 7.5 مل من الدم يدل على التكهن الأكثر فقرا مقارنة مع هؤلاء المرضى أقل أو أي التدرجي كشفها في سامحجم البريد الدم. بالإضافة إلى ذلك، وقد تجلى التغيير في عدد CTC أثناء أو بعد التدخل العلاجي لتكون مفيدة باعتبارها مؤشرا من الاستجابة للعلاج، وغالبا في وقت أقرب مما التقنيات المستخدمة حاليا 7-10.
وتشير التقديرات إلى أنه في مرضى السرطان النقيلي، التدرجي تحدث على تردد ما يقرب من 1 CTC في 10 5 -10 7 خلايا الدم وحيدات النوى والمرضى الذين يعانون من مرض في المترجمة، قد يكون هذا التردد حتى أقل (~ 1 في 10 8). طبيعة نادرة من هذه الخلايا يمكن أن تجعل من الصعب دقيق وموثوق كشف وتحليل التدرجي 11. عدة طرق (مراجعة سابقا 12-14) وقد استخدمت لإثراء وكشف هذه الخلايا من خلال استغلال الخصائص التي تميزهم عن مكونات الدم المحيطة. بشكل عام، CTC التعداد هو عملية جزئين الذي يتطلب على حد سواء خطوة التخصيب وخطوة الكشف. تقليديا، خطوات تخصيب تعتمد على الاختلافات في فيزخصائص كال من التدرجي (حجم الخلية، والكثافة، التشوه) أو على البروتين علامة التعبير (أي جزيء التصاق الخلايا الظهارية [EpCAM]، cytokeratin [CK]). بعد تخصيب، والكشف عن لجنة مكافحة الإرهاب لا يمكن أن يؤديها في عدد من الطرق المختلفة، والأكثر شيوعا منها فحوصات الحمض النووي القائم و / أو النهج cytometric. كل من هذه الاستراتيجيات هي فريدة من نوعها، وجود مزايا وعيوب واضحة، إلا أنها تفتقر إلى توحيد جميع؛ ضرورة للدخول في الإعداد السريرية. لذا تم تطوير نظام CellSearch (CSS) لتوفير وسيلة موحدة للكشف وتعداد التدرجي نادر في الدم البشري باستخدام المجهر مضان والتقنيات المعتمدة على الأجسام المضادة 4-6. وتعتبر هذه المنصة حاليا معيار الذهب في لجنة مكافحة الإرهاب والتعداد هو الأسلوب الوحيد المعتمد من قبل هيئة الغذاء والدواء الأمريكية (FDA) لاستخدامها في العيادة 15.
المغلق هو منصة اثنين مكون consistinز من، (1) نظام CellTracks AutoPrep (يشار إليها فيما الصك الإعداد)، التي بأتمتة إعداد عينات دم الإنسان، و (2) CellTracks محلل الثاني (يشار إليها كأداة تحليل)، الذي يمسح هذه العينات التالية التحضير. للتمييز التدرجي من تلويث الكريات البيض الصك إعداد توظف الأجسام المضادة بوساطة، والنهج القائم على الفصل المغناطيسي ferrofluid ومضان الفرق تلطيخ. في البداية، ونظام العلامات التدرجي باستخدام الأجسام المضادة للEpCAM مترافق إلى النانوية الحديد. ثم يتم تحضين العينة في مجال مغناطيسي، ويستنشق كل الخلايا غير المسماة. ومعلق الخلايا السرطانية المحدد، وحضنت في مضان وصمة عار الفرق، تتكون الأجسام المضادة من fluorescently المسمى وكاشف تلطيخ النووية. أخيرا، يتم نقل العينة إلى خرطوشة المغناطيسي، ودعا MagNest (المشار إليها فيما يلي باسم الجهاز المغناطيسي)، والشوريanned باستخدام أداة التحليل.
يتم استخدام أداة تحليل لمسح عينات استعداد باستخدام مرشحات مضان مختلفة، كل الأمثل لجسيمات الفلورسنت المناسب، وذلك باستخدام عدسة 10X الهدف. ويتم تحديد التدرجي كما الخلايا التي يتم ملزمة لمكافحة EpCAM، ومكافحة عموم CK-فيكوإيريترين (PE) (CK8، 18، و 19)، وصمة عار النووية 4 '،6-diamidino-2-phenylindole (دابي). على العكس، ويتم تحديد الكريات البيض كما تلويث الخلايا التي يتم ملزمة لمكافحة CD45-allophycocyanin (APC) ودابي. بعد المسح الضوئي، يتم عرض الخلايا السرطانية المحتملة المعرفة الكمبيوتر للمستخدم. من هذه الصور، يجب على المستخدم استخدام التحليل النوعي باستخدام معايير محددة والتفضيلية تلطيخ نوقشت أعلاه لتحديد أي الأحداث التدرجي.
بالإضافة إلى توفير طريقة موحدة لمكافحة الإرهاب التعداد، المغلق يسمح للالتوصيف الجزيئي للالتدرجي على أساس علامات البروتين من الفائدة. هذا الاستجواب جعلى أن يؤديها على مستوى خلية واحدة، وذلك باستخدام ثيوسيانات فلوريسئين (FITC) قناة مضان ليس مطلوبا لتحديد لجنة مكافحة الإرهاب 16. على الرغم من هذا المنبر يوفر القدرة على التوصيف الجزيئي، لم يتم تعريف جيدا عملية مفصلة للتنمية بروتوكول والتحسين. وقد وضعت ثلاث علامات المتاحة تجاريا من قبل الشركة المصنعة للاستخدام مع CSS، بما في ذلك عامل نمو البشرة مستقبلات (EGFR)، نمو البشرة الإنسان مستقبلات عامل 2 (HER2)، والذي يشبه الانسولين عامل النمو 1 مستقبلات (IGF-1R). تحليل HER2، في تركيبة مع CSS، وقد تم استخدامها من قبل عدة مجموعات لتوضيح المحتملة لجنة مكافحة الإرهاب توصيف لإبلاغ صنع القرار السريري ويحتمل أن تكون المبادئ التوجيهية لتغيير العلاج الحالية. على سبيل المثال، Fehm وآخرون 17 أثبتت أن حوالي ثلث مرضى سرطان الثدي HER2 مع الأورام الأولية زيارتها HER2 + التدرجي. بالإضافة إلى ذلك، ليو وآخرون.18 ذكرت مؤخرا أن ما يصل إلى 50٪ من المرضى الذين يعانون من HER + سرطان الثدي النقيلي لم يكن لديهم HER2 + التدرجي. هيرسيبتين، ومستقبلات HER2 التدخل الأضداد وحيدة النسيلة أثبتت أن تستفيد كثيرا المرضى الذين الأورام مستويات كافية من التعبير عن HER2، هو علاج تستخدم عادة لمرضى الأورام الأولية HER2 + 19-21. ومع ذلك، تشير هذه الدراسات إلى أن هيرسيبتين قد يجري استخدامها على النحو الأمثل ودون أن CTC توصيف قد تساعد في التنبؤ الاستجابة للعلاج. في نهاية المطاف، قد يكون توصيف CTC القدرة على تحسين الرعاية الشخصية.
البحث CTC هي فريدة من نوعها من حيث أنها قد تستغل إلى حد كبير نهج السرير إلى الفوق. هذا الأسلوب، على عكس الفوق-إلى السرير الأبحاث، والتي يمكن في كثير من الأحيان يستغرق سنوات للتأثير رعاية المرضى، وقد سمح التدرجي دخول سريع في الإعداد السريرية. ومع ذلك، والأطباء يترددون في استخدام نتائج التحليل من رابع كلوريد الكربون في علاج المريض القرار ماكجي بسبب عدم فهم البيولوجيا الكامنة وراءها. لذا نماذج الماوس قبل السريرية المناسبة من تقنيات ورم خبيث وتحليل CTC التكميلية يجب أن تستخدم من أجل التحقيق في هذه المسائل العالقة. بشكل عام، هناك نوعان من النماذج قبل السريرية تستخدم لدراسة تتالي النقيلي، (1) نماذج الانبثاث عفوية، والتي تسمح لدراسة جميع الخطوات في تتالي النقيلي، و (2) النماذج التجريبية ورم خبيث، والتي تسمح فقط ل دراسة خطوات لاحقة في عملية المنتشر مثل التسرب وتشكيل الورم الثانوية 22. نماذج الانبثاث عفوية، تنطوي على حقن الخلايا السرطانية في مواقع مثلي المناسبة (مثل حقن خلايا سرطان البروستاتا في غدة البروستاتا لدراسة سرطان البروستاتا). ثم يتم إعطاء الوقت لتشكيل خلايا الأورام الابتدائية وتنتشر تلقائيا إلى مواقع ثانوية مثل العظام والرئة والغدد الليمفاوية. فيالنقيض من ذلك، النماذج التجريبية ورم خبيث تشمل الحقن المباشر للخلايا الورم في مجرى الدم (على سبيل المثال عن طريق الوريد الذيل أو حقن داخل القلب لاستهداف الخلايا لمواقع محددة)، وبالتالي تخطي الخطوات الأولي لدخول الوعاء وتعميمها على الأجهزة الثانوية 22. حتى الآن تم تنفيذ غالبية تحليل رابع كلوريد الكربون في الجسم الحي في نظم النموذج باستخدام إما على أساس الخلوي 23 أو تكييفها تقنيات مكافحة الإرهاب القائمة على الإنسان (على سبيل المثال AdnaTest) 24. على الرغم من المفيد، فإن أيا من هذه التقنيات تعكس على نحو كاف CTC التعداد باستخدام معيار الذهب CSS. بناء على موافقة السريرية، والطبيعة موحدة، واستخدام واسع النطاق للCSS، فإن وضع التقاط وكشف تقنية رابع كلوريد الكربون لفي الجسم الحي النمذجة التي تستخدم إعداد العينات ما يعادلها، تجهيز، ومعايير تحديد الهوية كما يكون من المفيد النتائج ستكون مماثلة لتلك التي تم الحصول عليها من عينات المرضى. ومع ذلك، ونظرا لحجم مساuirements من إعداد الصك أنه ليس من الممكن لمعالجة كميات صغيرة من الدم باستخدام هذه المنصة الآلي. بالإضافة إلى ذلك، وقد أثبتت الأعمال السابقة من قبل إليان 25 آخرون بأن تلوث العينات مع الخلايا الظهارية الماوس (والتي تفي أيضا بتعريف CTC القياسية [EpCAM + CK + + CD45 دابي -]). يمكن أن يؤدي إلى سوء تصنيف الماوس الخلايا الظهارية الحرشفية كما التدرجي. لمعالجة هذه القضايا وتكييفها التقنية التي تسمح تم تطوير استخدام الكواشف عدة CSS جنة مكافحة الإرهاب جنبا إلى جنب مع إجراء العزل اليدوي. إضافة لFITC المسمى مستضد الكريات البيض البشرية (HLA) الأجسام المضادة لفحص الخلايا السرطانية يسمح الإنسان لتمييزها عن الماوس الخلايا الظهارية الحرشفية.
يصف هذا المخطوط المعيار، وضعت تجاريا وبروتوكول CSS الأمثل لمعالجة عينات الدم المريض والمخاطر المشتركة التي يمكن مواجهتها، بما في ذلك discrepanر العناصر التي يمكن أن تؤدي إلى أخطاء سوء تصنيف لجنة مكافحة الإرهاب. بالإضافة إلى ذلك، يتم وصف التخصيص للمقايسة CSS لدراسة خصائص البروتين المعرفة من قبل المستخدم من التقاطها التدرجي ومقارنة تقنية CSS تكييفها التي تسمح لتخصيب اليورانيوم والكشف عن التدرجي من كميات صغيرة من الدم في نماذج الماوس قبل السريرية لورم خبيث.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
أجريت جميع الدراسات الإنسانية وصفها في هذه المخطوطة في إطار البروتوكولات التي وافق عليها مجلس أخلاقيات البحوث البشرية بجامعة الغربية. أجريت جميع الدراسات الحيوانية وفقا لتوصيات المجلس الكندي للرعاية الحيوان، في إطار البروتوكولات التي وافقت عليها جامعة ويسترن الفرعية استخدام الحيوان.
1. معيار لجنة مكافحة الإرهاب تعداد من عينات الدم للمريض باستخدام CSS
1. الدم البشري جمع العينات والتحضير لتجهيز على إعداد الصك
- باستخدام تقنيات العقيم الفصد القياسية، ووضع حد أدنى من 8.0 مل من الدم البشري إلى CellSave أنبوب 10 مل (المشار إليها فيما يلي باسم حافظة أنبوب CTC)، الذي يحتوي على حمض الإثيلين diaminetetraacetic (EDTA) وحافظة الخلوية الملكية. عكس 5X أنبوب لمنع الدم من التخثر. قد تتم معالجتها على الفور عينات أو تخزينها في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى 96 ساعة.
- ازالتهاالكواشف الإلكترونية CSS من الثلاجة والسماح لهم لتسخين إلى درجة حرارة الغرفة قبل استخدام.
- باستخدام المتاح ماصة 10 مل وpipettor الآلي، وجمع 7.5 مل من الدم من الأنبوب حافظة لجنة مكافحة الإرهاب والاستغناء ببطء الدم إلى إعداد وصفت بشكل مناسب أداة أنبوب المعالجة.
- إضافة 6.5 مل من العازلة التخفيف إلى كل عينة. مزيج من قبل قلب عينة 5X. عينة الطرد المركزي في 800 x ج لمدة 10 دقيقة مع الفرامل في موقف ال "اوف". اتبع التعليمات التي تظهر على الشاشة على الصك تمهيدا لتحميل جميع العينات المريض على نظام للمعالجة. يجب أن تتم معالجة العينات في غضون 1 ساعة من التحضير.
2. إعداد التحكم لتجهيز على إعداد الصك
- دوامة بلطف القارورة الرقابة وعكس 5X إلى المزيج.
- إزالة بعناية الغطاء من القارورة السيطرة ووضع مقلوب إعداد صك أنبوب تجهيز على رأس القنينة لم يسبق لهم اللعب. في اقتراح واحد سريع، عكسالسيطرة على القارورة، وتصب محتويات في أنبوب المعالجة. بينما مقلوب، ونفض الغبار برفق على جانبي القارورة السيطرة الإفراج عن أي محتويات المتبقية.
- إزالة بعناية السيطرة القارورة مقلوب من أنبوب تجهيز، وضمان أن لا يضيع السائل ووضع جانبا. باستخدام ماصة ميكرولتر 1،000، وجمع أي محتويات المتبقية من القارورة والغطاء وماصة بلطف في أنبوب المعالجة.
- اتبع التعليمات التي تظهر على الشاشة على الصك تمهيدا لتحميل عنصر التحكم على نظام للمعالجة.
3. عينة المسح على الصك تحليل
- اتبع التعليمات التي تظهر على الشاشة على الصك تمهيدا لتفريغ جميع العينات من النظام. فضفاضة سقف كل خرطوشة الجهاز المغناطيسي والاستفادة من الجهاز المغناطيسي باستخدام اليدين أو مختبر مقاعد البدلاء الإفراج عن أي فقاعات التي تمسك حواف خرطوشة. بمجرد إزالة كافة الفقاعات، وكأب بحزم خرطوشة، وضع الجهاز المغناطيسي مسطح، وأناncubate في الظلام لمدة لا تقل عن 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. يجب أن تفحص العينات في غضون 24 ساعة من التحضير.
- بدوره على أداة تحليل وتهيئة المصباح. مرة واحدة الدفء (~ 15 دقيقة)، تحميل خرطوشة التحقق النظام على أداة تحليل وحدد علامة التبويب اختبار مراقبة الجودة. اتبع التعليمات التي تظهر على الشاشة لإجراء ما يلزم من التدابير لمراقبة الجودة.
- تحميل العينة على أداة تحليل وحدد علامة التبويب اختبار المريض. سيتم عرض جميع المعلومات المحفوظة من إعداد الصك. انقر فوق ابدأ لتهيئة مسح العينة. سيقوم النظام بإجراء التركيز الخشنة والكشف عن الحافة على خرطوشة الجهاز المغناطيسي.
- ضبط جميع الحواف عند الضرورة باستخدام مفاتيح الاتجاه. حدد قبول. سيقوم النظام بإجراء التركيز غرامة وتبدأ مسح العينة.
- وينبغي التحقق من صحة التالية السيطرة مسح النتائج باستخدام معايير محددة للخلايا ارتفعت في عالية (CK + DAPI + CD45 - APC +) ومنخفضة (CK + + دابي CD45 - FITC +) التركيزات. ينبغي إعادة النظر في نموذج التالي المريض مسح نتائج التدرجي استولت باستخدام معايير محددة CTC (CK + + CD45 دابي -).
2. CTC توصيف للعلامات معرف من قبل المستخدم باستخدام CSS
1. إعداد علامات معرف من قبل المستخدم وأداة التهيئة
- تمييع الضد من الاهتمام باستخدام بوند الابتدائية جسم مخفف إلى التركيز المطلوب في كوب علامة كاشف باستخدام الصيغة التالية، حيث تركيز العمل هو تركيز الأجسام المضادة بعد بالإضافة إلى العينة وتركيز المخزون هو تركيز الأجسام المضادة في كاشف الكأس. لعينات متعددة، وضبط كميات الأجسام المضادة كما هو موضح في الجدول رقم 1. وضع كاشف كوب علامة في الموضع 1 في خرطوشة كاشف ولOAD خرطوشة على CSS.
الأسهم تركيز = (تركيز العمل س 850 ميكرولتر) / 150 ميكرولتر - جمع الدم، وإعداد العينات، وتحميل أداة إعداد كما هو موضح في معيار أعلاه CTC تعداد من عينات الدم للمريض باستخدام بروتوكول CSS. لتمكين العرف بالإضافة إلى ذلك علامة، حدد تعريف العضو الفحص عند المطالبة من قبل أداة الإعداد. إدخال اسم علامة وحدد حفظ. كما يتم تحميل العينات على الصك، سوف تتم مطالبة الشبكة للإشارة التي يجب أن تتلقى علامة مخصصة عن طريق تحديد نعم أو لا حسب الضرورة.
2. المسح عينة من علامات معرفة من قبل المستخدم على تحليل الصك
- بدوره على أداة التحليل، وتهيئة مصباح، وأداء مراقبة الجودة ونظام التحقق كما هو موضح في القسم 3.2 من لجنة مكافحة الإرهاب تعداد قياسي من عينات الدم للمريض باستخدام CSS
- تحميل العينة على أداة تحليل وحدد علامة التبويب الإعداد. تهيئة قناة FITC، حدد CellSearch CTC باسم معرف كيت تحت قسم اختبار البروتوكولات. من هذه القائمة، حدد البحوث CTC، انقر فوق الزر تحرير وضبط الوقت التعرض كما تريد. فمن المستحسن أن وقت التعرض لل 1.0 ثانية لا يمكن تجاوز عند استخدام عدة CSS جنة مكافحة الإرهاب لأن هذا يمكن أن تزيد من النزف من خلال قنوات في الفلورسنت الأخرى المستخدمة لتحديد جنة مكافحة الإرهاب.
3. التكيف من CSSProtocol القياسية لاستخدامها في ما قبل السريرية ماوس نماذج
** مقتبس من Veridex ماوس / فأر CellCapture كيت (لم تعد متوفرة تجاريا)
1. الماوس جمع الدم والتخزين
- قبل جمع الدم، تشغيل ~ 30 ميكرولتر من 0.5 M EDTA ذهابا وإيابا من خلال 22 G الإبرة، وترك كمية صغيرة من EDTA في المركز.
- جمع ما لا يقل عن 50 ميكرولتر من الدم الماوس من الفئران المحقونة سابقا مع الخلايا السرطانية البشرية عبر طرق مثلي، والذيل الوريد أو داخل القلب. جمع الدم من الوريد الصافن (لتحليل المسلسل CTC) أو عن طريق ثقب في القلب (لتحليل CTC محطة). إزالة الإبرة والاستغناء الدم إلى 1 مل EDTA microtainer أنبوب جمع الدم. مزيج من قبل انقلاب أو أنبوب نفض الغبار بلطف لمنع الدم من التخثر. قد تتم معالجة الدم مباشرة أو تخزينها في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى 48 ساعة بعد إضافة حجم مساو من CytoChex حافظة الخلوية.
2. CTC التخصيب
- إزالة الكواشف CSS من الثلاجة والسماح لهم لتسخين إلى درجة حرارة الغرفة قبل استخدام.
- نقل ما يعادل 50 ميكرولتر من الدم الكامل إلى 12 ملم × 75 ملم أنبوب التدفق الخلوي. إضافة 500 ميكرولتر من العازلة التخفيف لكل عينة، وغسل أسفل أي الدم الذي يبقى على جانبي الأنبوب. إذا لزم الأمر، وتدور أجهزة الطرد المركزي قصيرةيمكن استخدامها لجمع أي دم المتبقية.
- دوامة بلطف ferrofluid مكافحة EpCAM وإضافة 25 ميكرولتر لكل عينة عن طريق وضع غيض من ماصة مباشرة في العينة. إضافة 25 ميكرولتر من كاشف تعزيز التقاط ودوامة بلطف لمزج. احتضان العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
- وضع أنابيب العينات في جذب واحتضان لمدة 10 دقيقة. في حين أن أنابيب العينات لا تزال في المغناطيس، واستخدام ماصة الزجاج لنضح بعناية السائل المتبقية دون لمس جدار الأنبوب بجانب المغناطيس والتخلص منها.
3. لجنة مكافحة الإرهاب يلطخ
- إزالة أنابيب العينات من المغناطيس وresuspend في 50 ميكرولتر من الحمض النووي صبغ، 50 ميكرولتر من تلطيخ الكاشف، 1.5 ميكرولتر من مكافحة فأر CD45-APC و 5.0 ميكرولتر من مكافحة الإنسان HLA-اليكسا فلور 488، و 100 ميكرولتر من Permeabilization كاشف. للحصول على عينات متعددة، ويمكن خلط هذه الكواشف ويمكن أن يضاف 206.5 ميكرولتر من خليط لكل أنبوب. دوامة برفق لمزجواحتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
- إضافة 500 ميكرولتر من العازلة التخفيف، دوامة بلطف، وأنابيب العينات في مكان المغناطيس، واحتضان لمدة 10 دقيقة. في حين أن أنابيب العينات لا تزال في المغناطيس، واستخدام ماصة الزجاج لنضح بعناية السائل المتبقية دون لمس جدار الأنبوب بجانب المغناطيس والتخلص منها. إزالة أنابيب العينات من المغناطيس و resuspend في 350 ميكرولتر من العازلة التخفيف. دوامة برفق لمزج.
4. جهاز مغناطيسي تحميل
- باستخدام طرف جل التحميل ونقل بعناية وحدة التخزين بالكامل من أنبوب العينة إلى خرطوشة في الجهاز المغناطيسي. تبدأ في الجزء السفلي من خرطوشة وسحب ببطء غيض كما هو الاستغناء العينة.
- مرة واحدة وقد تم نقل العينة بأكملها، وكأب فضفاضة خرطوشة الجهاز المغناطيسي والاستفادة من الجهاز المغناطيسي باستخدام اليدين أو مختبر مقاعد البدلاء الإفراج عن أي فقاعات التي تمسك حواف خرطوشة كما هو موضح في التقطيعةن 3.1 لجنة مكافحة الإرهاب تعداد قياسي من عينات الدم للمريض باستخدام CSS.
- البوب أي فقاعات باستخدام العقيمة 22 G إبرة من خلال محاصرة لهم بين شطبة وحافة خرطوشة. بمجرد إزالة كافة الفقاعات، وكأب بحزم خرطوشة، وضع الجهاز المغناطيسي مسطح، واحتضان في الظلام لمدة 10 دقيقة على الأقل. يجب أن تفحص العينات في غضون 24 ساعة من التحضير.
5. مسح العينات منفصل يدويا على الصك تحليل
- بدوره على أداة التحليل، وتهيئة مصباح، وأداء مراقبة الجودة ونظام التحقق كما هو موضح في القسم 3.2 من لجنة مكافحة الإرهاب تعداد قياسي من عينات الدم للمريض باستخدام بروتوكول CSS.
- تحميل العينة على أداة تحليل وحدد علامة التبويب الإعداد. مسح أية بيانات موجودة على زر بيانات الجهاز المغناطيسي عن طريق النقر فوق الزر تنسيق عينة. تمكين FITC قناة لالثانية تعيين وقت التعرض إلى 1.0 ثانية كما هو موضح في القسم 2.2 لجنة مكافحة الإرهاب لتوصيف علامات معرف من قبل المستخدم باستخدام CSS.
- انقر فوق علامة التبويب اختبار المريض وحدد تحرير لإدخال المعلومات العينة. حدد CellSearch CTC باسم معرف كيت والبحوث CTC باسم بروتوكول اختبار. إدخال المعلومات الضرورية المتبقية على النحو المشار إليه باسم النجمة. حفظ المعلومات العينة وانقر فوق ابدأ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
معيار لجنة مكافحة الإرهاب تعداد الفحص
حساسية وخصوصية CSS تم توثيقه جيدا في الأدب. ومع ذلك، للتحقق من صحة الانتعاش CTC ما يعادلها، ارتفعت (1،000 LNCaP خلايا سرطان البروستاتا البشرية) وتمت معالجة unspiked عينات الدم البشري من المتبرعين الأصحاء على CSS باستخدام بروتوكول CSSCTC القياسية. كما هو متوقع، كانت عينات unspiked خالية من التدرجي، 0.00 ± 0.00٪، وتجلى الانتعاش جنة مكافحة الإرهاب أن تكون 86.9 ± 4.71٪ للعينات ارتفعت (الشكل 1A). وكانت الصور التي تم الحصول عليها من معرض CSS عينات ارتفعت الجودة المثلى وكان من السهل تمييزها عن غير التدرجي-التدرجي. ومع ذلك، عند معالجة عينات تم الحصول عليها من مرضى السرطان، وتحديد التدرجي هو قليلا أكثر تحديا، مع العديد من الخلايا التي تظهر أصغر حجما وأقل يجري تمييزها بسهولة من غير التدرجي (الشكل 1B). بالإضافة إلى ذلك، عند استعراض عينات من المرضى 6 فئات من الأحداث كانت املحددةالطبعة التي كانت العناصر خلافات عادة بين المقيمين (الشكل 1C). وشملت هذه الفئات 6، (1) الأحداث الصغيرة التي لا تلبي متطلبات حجم 4 ميكرومتر لتصنيف لجنة مكافحة الإرهاب، (2) وحدات مع CK قاتمة و / أو تلطيخ دابي؛ (3) له ما يبرره (ينبغي أن يحسب على أنه CTC) مقابل غير مبرر (لا ينبغي أن تحسب على أنها CTC) تنزف من خلال في القناة CD45-APC تسببها مشرق تلطيخ CK-PE، (4) FITC + الأحداث؛ (5) صور منقطة في CK و / أو قنوات دابي، و (6) أحداث مع تلوين دابي أكبر من الصور CK أو تلك مع تلطيخ دابي لا تتداخل> 50٪ مع صورة CK. لفئات (2) و (5) وجود معايير محددة لتصنيف لجنة مكافحة الإرهاب. للفئة (2)، والبنود مع CK خافت / دابي يمكن تصنيفها على النحو المنصوص التدرجي أن غشاء سليمة يمكن ملاحظتها في القناة CK وويلاحظ بحجم مناسب صورة دابي. للفئة (5)، لا يمكن أن تصنف العناصر مع CK منقطة / دابي كما التدرجي إذا لوحظ أي البيكسيلاشن في القناة CK. ومع ذلك، البيكسيلاشن هو مقبول في قناة دابي شريطة أن ليست خطيرة جدا (أي صورة أبيض كليا على خلفية، لا مناطق رمادية - التي وصفها يانسن التشخيص (Veridex سابقا) كما الطلاء الأبيض على خلفية سوداء) أو منتشر (يجب لا تزال تظهر بيضاوية الشكل وتناسب داخل CK).
معرف من قبل المستخدم ماركر الفحص التنمية
تكييف CSS لتوصيف التدرجي للعلامات المعرفة يتطلب هامة متابعة العمل مع وجود ضوابط صارمة ولقد وصفت سابقا 16. كقاعدة عامة، والتحسين المناسب من أي علامة المعرفة يتطلب ضوابط السلبية استخدامها لضمان نتائج محددة. ويتم الحصول على أفضل النتائج عندما تتم معالجة عينات ارتفعت مع كل منعنصر تحكم غير محدد مفتش بدلا من الأضداد المستهدفة ومع مخفف الأجسام المضادة وحدها كما هو موضح سابقا. وينبغي أيضا تقييم مختلف تركيزات الضد المستهدف ومرات التعرض والتحقق من صحتها باستخدام خطوط الخليوي مع ارتفاع وانخفاض، وتغيب (السلبية) كثافة مستضد. وتتحقق شروط بروتوكول الأمثل عند يوضح فحص كل من حساسية عالية للمستضد المستهدفة وانخفاض الضوضاء في الخلفية من غير محدد ملزم 16.
مثال على هذا العمل حتى باستخدام علامة الخلية الجذعية السرطانية، CD44، ويرد هنا. بدأت التجارب الأولية مع هذه العلامة باستخدام معيار CSS CTC عدة (ويشار إليها فيما بعد عدة CTC التقليدية)، الذي يستخدم القناة للتنمية FITC علامة المعرفة من قبل المستخدم. استخدام عدة CTC التقليدية، وقد تجلى ذلك أنه بعد الأمثل كبير، وكان الحد الأقصى لعدد التدرجي التي يمكن أن تصنف على أنها CD44 + 69.3 ± 2.67٪ باستخدام عينات ارتفعت مع 1،000 MDA-MB-468 هومان خلايا سرطان الثدي، والمعروفة لإثبات عالية التعبير CD44 مع الغالبية العظمى من الخلايا (98.4 ± 0.90٪؛ على النحو الذي يحدده التدفق الخلوي) التعبير عن هذا البروتين (الشكل 2A). بناء على هذه النتائج تم الافتراض بأن المتاحة تجاريا CSS CXC عدة قد تنتج نتائج أفضل. هذه المجموعة يسمح لتحسين التصور من علامات مع كثافة أقل مستضد (~ 50،000 المستضدات / خلية) مقارنة مع عدة CTC التقليدية (الأمثل لعلامات مع كثافة ~ 100،000 المستضدات / خلية) عن طريق عكس قناة مضان فيه CK8 / 18/19 (ممثلة تقليديا في القناة PE) ويتم تمثيل علامة المستخدم من الفائدة (ممثلة تقليديا في القناة FITC) (لذلك فيما بعد عدة CXC سيتم يشار إلى منخفض الكثافة مستضد عدة CTC) 26. بعد الأمثل كبير، وقد تبين أن هذا التغيير يسمح لتحسين تلطيخ CD44، مع 98.8 ± 0.51٪ من التدرجي تصنف على أنها CD44 + </ sup> في استخدام CD44-PE بتركيز 1.0 ميكروغرام / مل ووقت التعرض من 0.6 ثانية (الشكل 2A). الأمثل المناسب للأي علامة المعرفة يتطلب أيضا التحقق من صحة استخدام كثافة عالية المستضد (MDA-MB-468)، منخفض الكثافة المستضد (21 NT)، وسلبية (LNCaPs) خطوط الخلايا للعلامة الفائدة (الشكل 2B).
تحليل لجنة مكافحة الإرهاب في ما قبل السريرية ماوس نماذج
لتحديد حساسية ونوعية الماوس بروتوكول CSS تكييفها، ارتفعت (1،000 LNCaP خلايا سرطان البروستاتا البشرية) وتمت معالجة unspiked عينات الدم وفحصها يدويا الماوس على أداة تحليل ومقارنة النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام خط الخلية نفسها معالجتها باستخدام معيار بروتوكول CSS الآلي على (3A الشكل) إعداد الصك. كما هو متوقع، كانت عينات unspiked خالية من التدرجي باستخدام كل المقايسات، 0.00 ± 0.00٪ وكان الانتعاش CTC استخدام عدة الماوس تكييفها (90.8 ± 5.18٪) لا قignificantly مختلفة من النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام نظام آلي معياري (86.9 ± 4.71٪؛ ع> 0.05). لم الصور التي تم الحصول عليها باستخدام الماوس دليل بروتوكول تكييفها لا تختلف عن تلك التي لوحظت باستخدام تقنية الآلي القياسية، باستثناء إضافة علامة HLA-FITC. بالإضافة إلى ذلك، الماوس الخلايا الظهارية الحرشفية لا صمة إيجابيا لHLA-FITC (الشكل 3B). للتأكد من أن هذه التقنية كانت حساسة مثل بروتوكول CSS القياسية لعزل انخفاض عدد التدرجي، أجريت التخفيفات المسلسل مع عينات الدم ارتفعت وتم تقييم العلاقة بين العدد المتوقع للخلايا مقابل عدد تعافى من الخلايا (الشكل 3C). تثبت النتائج أن التدرجي يمكن استردادها بشكل فعال وصولا الى وجود حساسية من 5 cells/50 ميكرولتر من الدم الكامل باستخدام هذا الاختبار. هذه القيم المترابطة مع النتائج المتوقعة مع ص 2 = 0.99.
الشكل 2. توصيف التدرجي للعلامات المعرفة من قبل المستخدم باستخدام CSS. (A) النسبة المئوية للخلايا CD44 + المصنفة باستخدام لجنة مكافحة الإرهاب وCXC مجموعات على CSS (ن = 3). يتم عرض البيانات كما يعني ± SEM. = *** مختلفة معنويا (P <0.0005). (B) الممثل صور معرض CSS الدم من متبرع متطوع صحي (7.5 مل)، ارتفعت مع ~ 1،000 الخلايا من خط الخلية التي تم تحديدها، حضنت مع 1.5 ميكروغرام / مل من مكافحة -CD44-PE، ومسحها في وقت تعرض 0.2 ثانية. الساحات البرتقال تشير CD44 + </ سوب> التدرجي ويدعى CK + / دابي + / CD45 - / CD44 - PE + اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
الرقم 3. التكيف الإجراء CSS لاستخدامها في نماذج الماوس قبل السريرية للورم خبيث. (A) CTC الانتعاش باستخدام الماوس تكييفها بروتوكول CSS تقاس كنسبة مئوية من عدد الخلايا ارتفعت ومقارنة النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام بروتوكول CSS الإنسان القياسية. احصي الخلايا عدادة الكريات وكانت ارتفعت ~ 1،000 LNCaP خلايا سرطان البروستاتا البشرية إلى 7.5 مل من الدم البشري. واستخدمت Unspiked عينات دم الإنسان كعنصر تحكم السلبية (ن = 3). يتم عرض البيانات كما يعني ± SEM. نانوثانية = ليس كبيرا. (B) (C) تحليل الارتباط والانحدار الخطي من المتوقع استردادها مقابل عدد من الخلايا السرطانية في تركيزات مختلفة ارتفعت . احصي LNCaP خلايا سرطان البروستاتا البشرية في البداية من قبل عدادة الكريات وارتفعت في وقت لاحق في الماوس الدم بتركيز ~ 1،000 الورم cells/50 ميكرولتر من الدم. ثم تم تخفيفه ارتفعت الدم الماوس متسلسل إلى تركيز من 5 ميكرولتر الورم cells/50 ومعالجتها باستخدام الماوس تكييفها بروتوكول CSS (ن = 3). اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
| عدد العينات مع معرف المستخدم واضاف ماركر | مجموع Voluلي إضافة إلى كأس الكاشف (ميكرولتر) |
| 1 | 450 |
| 2 | 600 |
| 3 | 750 |
| 4 | 900 |
| 5 | 1،050 |
| 6 | 1،200 |
| 7 | 1،350 |
| 8 | 1،500 |
الجدول 1. . حجم مجموع الاحتياجات لCSS عند معالجة أعداد مختلفة من العينات مع علامة المعرفة من قبل المستخدم ** مقتبس من Veridex الكتاب الأبيض (متوفر في: http://www.veridex.com/pdf/CXC_Application_Guideline.PDF ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
على الرغم من تطوير العديد من التقنيات الجديدة لجنة مكافحة الإرهاب منذ إدخال المغلق في عام 2004، هذه التقنية لا تزال التكنولوجيا المعتمدة فقط سريريا في السوق اليوم، وبالتالي فهو يعتبر المعيار الذهبي الحالي للكشف عن لجنة مكافحة الإرهاب والتعداد. وقد أثبتت هذه المخطوطة على الرغم من أن CSS لديه معايير صارمة لمراقبة الجودة يمكن أن تكون عرضة للتحيز وتفسير أن تحديد رابع كلوريد الكربون في عينات المرضى يختلف كثيرا عن تحديد الهوية في عينات ارتفعت. وقد تم تحديد ست فئات من البنود خلافات شيوعا التي يمكن أن تسبب misclassifications جنة مكافحة الإرهاب أن يحدث. هذه العناصر خلافات تسليط الضوء على الحاجة للمراجعين متعددة على كل عينة مريض معالجتها على هذا الصك. بالإضافة إلى ذلك، الاختلافات التي لوحظت في مقابل ارتفعت المريض الحصول التدرجي يوضح أن هناك ضرورة لأية تقنيات جديدة لمكافحة الإرهاب يمكن التحقق من صحة في كل من عينات ارتفعت والمريض. بالإضافة إلى ذلك، يجب أن تكون هذه التكنولوجيات الجديدة به مقارنة مع CSS معيار الذهب باستخدام انقسام اختبار عينة من العينات على حد سواء ارتفعت والمريض، والقبض على رابع كلوريد الكربون كفاءة من عينات ارتفعت فقط لا يعكس بالضرورة CTC الكفاءة في التقاط عينات المرضى.
على الرغم من أن CSS لديها القدرة على أداء توصيف التدرجي القبض عليه، ويقتصر ذلك تماما فيما يتعلق عالية للتخصيص الأمثل. بشكل عام، المعلمات فقط التي يمكن تغييرها على هذا الصك لتعظيم الاستفادة من علامات المعرفة هي تركيز الأجسام المضادة وطول الفترة الزمنية التي يتعرض لها fluorophore إلى مصباح الزئبق. هذه القدرة محدودة من أجل التحسين يمكن أن تثير مشاكل عند العمل متابعة علامات المعرفة من قبل المستخدم على CSS. واحد الحل المقترح في هذه المخطوطة (وصفها بالتفصيل سابقا 16) هو استخدام منخفض الكثافة مستضد عدة CTC الذي يبدل FITC وقنوات الفلورسنت PE السماح لتصور أفضل للعلامات ذات الكثافة المنخفضة مستضد. بغض النظرمن الذي يستخدم عدة (التقليدية أو منخفضة الكثافة مستضد عدة CTC) هناك العديد من الخطوات الضرورية التي يجب اتخاذها لضمان حساسية علامة المناسب، والنوعية، والتحسين. أولا، يجب تقييم حساسية الفحص بالمقارنة مع طريقة التحقق من صحة أيضا، مثل التدفق الخلوي، من شأنها أن تسمح تحديد مستوى الكشف المتوقع (أي النسبة المئوية للخلايا في عدد السكان الخلية التي تعبر عن علامة من الفائدة) من المستخدمين علامة محددة. ثانيا، يجب أن يقدر لفحص قدرتها على اكتشاف علامة من الاهتمام في خطوط الخلايا مع مستويات مختلفة من التعبير (أي كثافة مستضد العالية والمنخفضة) وخصوصيته يجب التحقق من صحة في خط الخلية التي هي سلبية على علامة الفائدة . في جميع الحالات، يجب أن يتم اختبار جميع خطوط الخلايا باستخدام الخلايا السيطرة فقط (وليس الضد المضافة)، ومراقبة مفتش المناسبة، والضد من مصلحة على مختلف تركيزات ومرات التعرض لتحديد موشارع الإعدادات المناسبة التي من شأنها ضمان تعظيم الاستفادة من علامة المعرفة من قبل المستخدم. ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أنه على الرغم من توصيف التدرجي هو ممكن على CSS، حاليا واحدة فقط علامة المعرفة من قبل المستخدم من الفائدة يمكن استكشافها في كل عينة، والتي هو نظام محدود جدا فيما يتعلق التطبيقات المصب بسبب تجهيز قاسية من العينات.
وقد سمح هذا الأسلوب الفريد السرير إلى الفوق المستخدمة في البحوث CTC للدخول السريع لهذا الاختبار مفيدا في إعداد سريرية. ومع ذلك، فقد أدى ذلك في فهم عدم كفاية بيولوجيا الأساسية لهذه الخلايا النادرة. وبالتالي هناك حاجة لتطوير والتحسين من المقايسات التي تسمح لتقييم التدرجي في قبل السريرية المجراة في نماذج الماوس من السرطان. يصف هذا المخطوط بروتوكول CSS تكييفها تسمح التدرجي على أن يقسم في 50 مجلدات ميكرولتر من الدم الماوس، مناسبة بشكل مثالي لنماذج تجريبية المسلسل جمع جنة مكافحة الإرهاب. هذا المخطوط دemonstrates أن CTC التعداد باستخدام هذا البروتوكول هي مماثلة لنتائج التي تم الحصول عليها باستخدام CSS في تركيبة مع عدة CTC التقليدية، مع عدم وجود فروق ذات دلالة إحصائية في CTC كفاءة التقاط بين تقنيات الفصل الآلي واليدوي. بالإضافة إلى ذلك، أثناء وضع هذا الاختبار كان من المسلم به، كما هو موضح سابقا في الأدب 25، ويمكن أن تلوث الماوس الحرشفية الخلايا الظهارية جعل التحديد الدقيق للالتدرجي أكثر صعوبة ومستحيلة في بعض الأحيان. لذا لمكافحة هذه القضية المعرفة HLA-اليكسا فلور 488 تم إضافتها إلى هذا البروتوكول لضمان أن الخلايا البشرية فقط (CK + + CD45 دابي - HLA - اليكسا فلور 488 +) يتم تعيين بشكل مناسب كما التدرجي. من المهم أن نلاحظ أن خط الخلية LNCaP المستخدمة في هذه المخطوطة هو HLAlow وبالتالي HLA-اليكسا فلور 488 قد تحتاج إلى معاير للخطوط الخلايا مع اختلاف التعبير HLA. على الرغم من أننا قد أضافت إلى HLA-اليكسا فلووص 488 لدينا بروتوكول لضمان تحديد دقيق للالتدرجي، من الجدير بالذكر أن الغالبية العظمى من الخلايا الظهارية الحرشفية الماوس ويسهل التعرف عليها من قبل التشكل وكانت محدودة في عدد الخلايا (0.33 ± 0.24 events/50 ميكرولتر، ن = 9). وقد لوحظت أعداد الخلايا أعلى (تصل إلى 11 events/50 ميكرولتر) فقط عندما ثبت جمع الدم (عبر ثقب في القلب) صعبة وكانت المحاولات المتكررة اللازمة. لذا نقترح أنه إذا رغبت في ذلك، على توصيف نظام التدرجي يمكن أن يتحقق عن طريق حذف هذه العلامة. بالإضافة إلى ذلك، وإن لم يكن هو موضح هنا، ونحن نتوقع أن جمع التدرجي وكذلك توصيف المصب التدرجي باستخدام طرق أخرى يمكن أن يتحقق بسهولة كما هو موضح سابقا باستخدام CSS 27،28.
على الرغم من أن CSS وقد استخدمت سريريا للكشف على نحو فعال التدرجي في الدم من الثدي النقيلي والبروستات وسرطان القولون والمستقيم المرضى 4،10،29، لا توجد لديها عدة لىmitations. في ما يصل الى 35٪ من المرضى الذين يعانون من مختلف أنواع السرطان النقيلي، التدرجي لا يمكن اكتشافها رغم وجود أمراض جهازية على نطاق واسع 30. وقد اقترح هذا النقص في الكشف عن أن تكون نتيجة للانتقال الظهارية-إلى الوسيطة، وهي عملية موثقة جيدا يعرف لتعزيز غزو سرطان، ورم خبيث، والعدوانية الشاملة 31. وقد ارتبط هذا التحول مع انخفاض كبير في علامات الظهارية، مثل EpCAM، والزيادة المقابلة في علامات الوسيطة 32. وقد أثبتت العديد من الدراسات مؤخرا أن وجود هذه العلامات الوسيطة في التدرجي تدل على التكهن الأكثر فقرا وأن العديد من هذه الخلايا تفتقر التعبير عن علامات الظهارية التي ستكون ضرورية للكشف عنها باستخدام CSS 24،33-38. هذا يشير إلى أن تعريف CSS القياسية قد تكون مفقودة بعض التدرجي الأكثر عدوانية.
على الرغم من القيود وصفها، فمن المتوقع عشرسوف بروتوكولات البريد الوارد وصفها في هذه المخطوطة تكون أدوات هامة لتحسين تحليل CTC باستخدام CSS، وتطوير تكنولوجيات جديدة CTC، والتحسين من علامات المعرفة، وتحسين فهم البيولوجيا لجنة مكافحة الإرهاب في الجسم الحي باستخدام نماذج الماوس قبل السريرية. أخذت معا، فإن هذه البروتوكولات توفر مصدرا مفيدا للمستخدمين من هذا المنبر المهتمين في مجال البحوث قبل السريرية والسريرية المتعلقة ورم خبيث والتدرجي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
المؤلف (ALA) تلقت تمويلا التي تم توفيرها من قبل يانسن الأورام، الذي جونسون آند جونسون كما تمتلك يانسن تشخيص ذ م م، التي تنتج الكواشف والأدوات المستخدمة في هذه المقالة الشركة الأم.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من معهد أونتاريو للبحوث السرطان (# 08NOV230)، ومؤسسة كندا للإبداع (# 13199)، سرطان البروستاتا كندا، يانسن الأورام، وبرنامج سرطان الإقليمي لندن، ودعم الجهات المانحة من جون ودونا بريستول من خلال مؤسسة العلوم الصحية في لندن (لALA). يتم اعتماد الحد الأدنى للانفجار من قبل فريدريك بانتينغ وتشارلز أفضل كندا العليا منحة جائزة الدكتوراه. ويدعم ALA من قبل جائزة الباحث جديد CIHR وجائزة الباحث في وقت مبكر من وزارة أونتاريو للبحوث والابتكار.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M EDTA | |||
| Anti-human CD44-FITC | BD Pharmigen | 555478 | |
| Anti-human CD44-PE | BD Pharmigen | 555479 | |
| Anti-human HLA-Alexa Fluor 488 | BioLegend | 311415 | |
| Anti-mouse CD45-APC | eBioscience | 17-0451-82 | |
| Bond Primary Antibody Diluent | Leica | AR9352 | |
| CellSave Preservative Tubes | Veridex | 952820 (20 pack) 79100005 (100 pack) | |
| CellSearch CTC Control Kit | Veridex | 7900003 | |
| CellSearch CTC Kit | Veridex | 7900001 | |
| CellSearch CXC Control Kit | Veridex | 7900018RUO | |
| CellSearch CXC Kit | Veridex | 7900017RUO | |
| Instrument Buffer | Veridex | 7901003 | |
| Streck Cell Preservative (aka CytoChex) | Streck | 213350 | |
| 1 ml Syringe | |||
| 10 ml Serological pipette | |||
| 1,000 µl Pipette | |||
| 1,000 µl Pipette tips | |||
| 12 mm x 75 mm Flow tubes | |||
| 200 µl Gel loading tips | |||
| 200 µl Pipette | |||
| 22 G Needle | |||
| 5 3/4 in Disposible Pasteur pipet | VWR | 14672-200 | |
| 5 ml Serological pipette | |||
| Automated pipettor | |||
| Capillary Blood Collection Tube (EDTA) | BD Microtainer | 365974 | |
| CellSearch Analyzer II | Veridex | 9555 | Includes magnests and verification cartirdges |
| CellSearch AutoPrep System | Veridex | 9541 | |
| Centrifuge | |||
| MagCellect Magnet | R&D Systems | MAG997 | |
| Small Latex Bulb | VWR | 82024-550 | |
| Vortex |
References
- Siegel, R., Naishadham, D., Jemal, A.
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nat. Rev. Cancer. 2 (8), 563-572 (2002).
- Pantel, K., Brakenhoff, R. H.
- Cristofanilli, M., Budd, G. T., et al. Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer. New Engl. J. Med. 351 (8), 781-791 (2004).
- De Bono, J. S., Scher, H. I., et al. Circulating tumor cells predict survival benefit from treatment in metastatic castration-resistant prostate cancer. Clin. Cancer Res. 14 (19), 6302-6309 (2008).
- Cohen, S. J., Ja Punt, C., et al. Prognostic significance of circulating tumor cells in patients with metastatic colorectal cancer. Ann. Oncol. 20 (7), 1223-1229 (2009).
- Hayes, D. F., Cristofanilli, M., et al. Circulating tumor cells at each follow-up time point during therapy of metastatic breast cancer patients predict progression-free and overall survival. Clin. Cancer Res. 12 (14), 4218-4224 (2006).
- Budd, G. T., Cristofanilli, M., et al. Circulating tumor cells versus imaging--predicting overall survival in metastatic breast cancer. Clin. Cancer Res. 12 (21), 6403-6409 (2006).
- Olmos, D., Arkenau, H. -T., et al. Circulating tumour cell (CTC) counts as intermediate end points in castration-resistant prostate cancer (CRPC): a single-centre experience. Ann. Oncol. 20 (1), 27-33 (2009).
- De Bono, J. S., Scher, H. I., et al. Circulating tumor cells predict survival benefit from treatment in metastatic castration-resistant prostate cancer. Clin. Cancer Res. 14 (19), 6302-6309 (2008).
- Allan, A. L., Keeney, M. Circulating tumor cell analysis: technical and statistical considerations for application to the clinic. J. Oncol. 2010, 426218 (2010).
- Lowes, L. E., Goodale, D., Keeney, M., Allan, A. L. Image cytometry analysis of circulating tumor cells. Methods Cell Biol. 102, 261-290 (2011).
- Lianidou, E. S., Markou, A. Circulating tumor cells in breast cancer: detection systems, molecular characterization, and future challenges. Clin. Chem. 57 (9), 1242-1255 (2011).
- Alix-Panabières, C., Pantel, K. Circulating tumor cells: liquid biopsy of cancer. Clin. Chem. 59 (1), 110-118 (2013).
- Parkinson, D. R., Dracopoli, N., et al. Considerations in the development of circulating tumor cell technology for clinical use. J. Transl. Med. 10, 138 (2012).
- Lowes, L. E., Hedley, B. D., Keeney, M., Allan, A. L. User-defined protein marker assay development for characterization of circulating tumor cells using the CellSearch system. Cytomet. A. 81 (11), 983-995 (2012).
- Fehm, T., Müller, V., et al. HER2 status of circulating tumor cells in patients with metastatic breast cancer: a prospective, multicenter trial. Breast Cancer Res. Treat. 124 (2), 403-412 (2010).
- Liu, Y., Liu, Q., et al. Circulating tumor cells in HER2-positive metastatic breast cancer patients: a valuable prognostic and predictive biomarker. BMC Cancer. 13, 202 (2013).
- Slamon, D. J., Leyland-Jones, B., et al. Use of chemotherapy plus a monoclonal antibody against HER2 for metastatic breast cancer that overexpresses HER2. New Engl. J. Med. 344 (11), 783-792 (2001).
- Marty, M., Cognetti, F., et al. Randomized phase II trial of the efficacy and safety of trastuzumab combined with docetaxel in patients with human epidermal growth factor receptor 2-positive metastatic breast cancer administered as first-line treatment: the M77001 study group. J. Clin. Oncol. 23 (19), 4265-4274 (2005).
- Slamon, D., Eiermann, W., et al. Adjuvant trastuzumab in HER2-positive breast cancer. New Engl. J. Med. 365 (14), 1273-1283 (2011).
- Welch, D. R. Technical considerations for studying cancer metastasis in vivo. Clin. Exp. Metast. 15 (3), 272-306 (1997).
- Goodale, D., Phay, C., Postenka, C. O., Keeney, M., Allan, A. L. Characterization of tumor cell dissemination patterns in preclinical models of cancer metastasis using flow cytometry and laser scanning cytometry. Cytometry A. 75 (4), 344-355 (2009).
- Gorges, T. M., Tinhofer, I., et al. Circulating tumour cells escape from EpCAM-based detection due to epithelial-to-mesenchymal transition. BMC Cancer. 12, 178 (2012).
- Eliane, J. -P., Repollet, M., et al. Monitoring serial changes in circulating human breast cancer cells in murine xenograft models. Cancer Res. 68 (14), 5529-5532 (2008).
- White Pages, V. eridex , Available from: http://www.veridex.com/pdf/CXC_Application_Guideline.PDF (2008).
- Flores, L. M., Kindelberger, D. W., et al. Improving the yield of circulating tumour cells facilitates molecular characterisation and recognition of discordant HER2 amplification in breast. 102 (10), 1495-1502 (2010).
- Sieuwerts, A. M., Kraan, J., et al. Molecular characterization of circulating tumor cells in large quantities of contaminating leukocytes by a multiplex real-time PCR. Breast Cancer Res. Treat. 118 (3), 455-468 (2009).
- Cohen, S. J., Ja Punt, C., et al. Relationship of circulating tumor cells to tumor response, progression-free survival, and overall survival in patients with metastatic colorectal cancer. J. Clin. Oncol. 26 (19), 3213-3221 (2008).
- Allard, W. J., Matera, J., et al. Tumor cells circulate in the peripheral blood of all major carcinomas but not in healthy subjects or patients with nonmalignant diseases. Clin. Cancer Res. 10 (20), 6897-6904 (2004).
- Thiery, J. P., Acloque, H., Huang, R. Y. J., Nieto, M. A. Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease. Cell. 139 (5), 871-890 (2009).
- Yang, J., Weinberg, R. A Epithelial-mesenchymal transition: at the crossroads of development and tumor metastasis. Dev. Cell. 14 (6), 818-829 (2008).
- Gradilone, A., Raimondi, C., et al. Circulating tumour cells lacking cytokeratin in breast cancer: the importance of being mesenchymal. J. Cell. Mol. Med. 15 (5), 1066-1070 (2011).
- Königsberg, R., Obermayr, E., et al. Detection of EpCAM positive and negative circulating tumor cells in metastatic breast cancer patients. Acta Oncol. 50 (5), 700-710 (2011).
- Kasimir-Bauer, S., Hoffmann, O., Wallwiener, D., Kimmig, R., Fehm, T. Expression of stem cell and epithelial-mesenchymal transition markers in primary breast cancer patients with circulating tumor cells. Breast Cancer Res. 14 (1), (2012).
- Mego, M., Mani, S. A., et al. Expression of epithelial-mesenchymal transition-inducing transcription factors in primary breast cancer: The effect of neoadjuvant therapy. Int. J. Cancer. 130 (4), 808-816 (2012).
- Yu, M., Bardia, A., et al. Circulating breast tumor cells exhibit dynamic changes in epithelial and mesenchymal composition. Science. 339 (6119), 580-584 (2013).
- Armstrong, A. J., Marengo, M. S., et al. Circulating tumor cells from patients with advanced prostate and breast cancer display both epithelial and mesenchymal markers. Mol. Cancer Res. 9 (8), 997-1007 (2011).
