Summary
Cirkulerende tumorceller (CTCs) er prognostisk i flere metastatiske cancere. Dette håndskrift beskriver guldstandarden CellSearch systemet (CSS) CTC tælling platform og fremhæver fælles misklassifikation fejl. Desuden er to tilpassede protokoller beskrevet for brugerdefineret markør karakterisering af CTCs og CTC optælling i prækliniske musemodeller af metastaser ved hjælp af denne teknologi.
Abstract
Størstedelen af cancer-relaterede dødsfald sker efterfølgende til udviklingen af metastatisk sygdom. Denne meget dødelige sygdom fase er forbundet med tilstedeværelsen af cirkulerende tumorceller (CTCs). Disse sjældne celler har vist sig at være af klinisk betydning for metastatisk brystkræft, prostata-og tarmkræft. Den nuværende guldstandarden i klinisk CTC påvisning og tælling er FDA-godkendt CellSearch systemet (CSS). Dette håndskrift skitserer den standard protokol anvendes af denne platform, samt to yderligere tilpassede protokoller, der beskriver den detaljerede proces brugerdefineret markør optimering for protein karakterisering af patientens CTCs og en sammenlignelig protokol for CTC fange i meget lave mængder af blod, ved hjælp af standard CSS reagenser til at studere in vivo prækliniske musemodeller af metastaser. Derudover har forskellene i CTC kvalitet mellem rask donor blod tilsat celler fra vævskultur versus patient blod Samples fremhæves. Endelig er flere almindeligt afvigende elementer, der kan føre til CTC fejltarifering fejl skitseret. Tilsammen vil disse protokoller give en nyttig ressource for brugere af denne platform er interesseret i præklinisk og klinisk forskning vedrørende metastaser og CTCs.
Introduction
I 2013 anslås det, at 580.350 personer vil dø af kræft, og at 1.660.290 nye tilfælde af denne sygdom vil blive diagnosticeret i USA alene 1. De fleste af disse dødsfald sker efterfølgende til udviklingen af metastatisk sygdom 2. Den nuværende mangel på effektive behandlinger i behandling af metastaser og en begrænset forståelse af den metastatiske kaskade gør denne fase af sygdommen meget dødelig. Tilstedeværelsen af cirkulerende tumorceller (CTCs) i blodbanen har vist sig at korrelere med metastatisk sygdom 3. Disse celler er ekstremt sjældne, og deres opdagelse er betegnende for den samlede overlevelse i metastatisk brystkræft 4, prostata 5, og kolorektal 6 cancer. Hos disse patienter er tilstedeværelsen af ≥ 5 (bryst og prostata), eller ≥ 3 (kolorektal) CTCs i 7,5 ml blod er tegn på dårligere prognose sammenlignet med de patienter med færre eller ingen påviselige CTCs i SAMe blodvolumen. Endvidere har ændringen i CTC antal under eller efter terapeutisk intervention vist sig at være nyttig som en indikator for behandlingsrespons, ofte hurtigere end de nuværende anvendte teknikker 7-10.
Det er blevet anslået, at i metastatiske cancerpatienter CTCs sted med en frekvens på cirka 1 CTC per 10 5 -10 7 mononukleare celler og i patienter med lokaliseret sygdom, kan denne frekvens være endnu lavere (~ 1 i 10 8). Den sjældne art af disse celler kan gøre det vanskeligt præcist og pålideligt registrere og analysere CTCs 11. Flere metoder (tidligere 12-14 revideret) er blevet udnyttet til at berige og afsløre disse celler ved at udnytte egenskaber, der adskiller dem fra omgivende blodkomponenter. I almindelighed CTC tælling er en todelt proces, der kræver både en trin berigelse og påvisningstrin. Traditionelt berigelse skridt afhængige forskelle i physgiske egenskaber CTCs (cellestørrelse, densitet, deformerbarhed) eller på proteinmarkør ekspression (dvs. epitelcelleadhæsionsmolekyle [EpCAM] cytokeratin [CK]). Efter opformering kan CTC påvisning udføres på en række forskellige måder, hvoraf den mest almindelige er nukleinsyrebaserede assays og / eller cytometriske metoder. Hver af disse strategier er unikke, idet forskellige fordele og ulemper, men de mangler alle standardisering en nødvendighed for indgangen til det kliniske miljø. Den CellSearch systemet (CSS) blev derfor udviklet til at give en standardiseret metode til påvisning og tælling af sjældne CTCs i humant blod ved hjælp af fluorescens mikroskopi og antistof-baserede teknikker 4-6. Denne platform er i øjeblikket betragtes som den gyldne standard i CTC opregning og er den eneste teknik, der er godkendt af den amerikanske Food and Drug Administration (FDA) til brug i klinikken 15.
CSS er en to komponent platform consisting, (1) den CellTracks AutoPrep systemet (herefter benævnt forberedelse instrument), som automatiserer forberedelsen af humane blodprøver, og (2) den CellTracks Analyzer II (i det følgende benævnt analyse instrument), der scanner disse prøver efter forberedelse. For at skelne CTCs kontaminerende leukocytter forberedelse instrument anvender et antistof medieret, Ferrofluid-baserede magnetiske separation tilgang og differentieret fluorescens farvning. Indledningsvis etiketter systemet CTCs anvendelse af anti-EpCAM antistoffer konjugeret til jern nanopartikler. Prøven inkuberes derefter i et magnetfelt, og alle ikke-mærkede celler aspireres. Udvalgte tumorceller resuspenderet og inkuberet i en differentieret fluorescens plet bestående af fluorescens-mærkede antistoffer og en nuklear farvningsreagens. Endelig er prøven overført til en magnetisk patron, der kaldes en MagNest (i det følgende benævnt den magnetiske enhed), og scanned hjælp analyseinstrumentet.
Analysen instrument anvendes til at scanne fremstillede prøver ved hjælp af forskellige fluorescens-filtre, der hver er optimeret til den relevante fluorescerende partikel ved hjælp af en 10X objektiv. CTCs er identificeret som celler, der er bundet af anti-EpCAM, anti-pan-CK-phycoerythrin (PE) (CK8, 18 og 19), og det nukleare bejdse 4 ',6-diamidino-2-phenylindol (DAPI). Omvendt er kontaminerende leukocytter identificeret som celler, der er bundet af anti-CD45-allophycocyanin (APC) og DAPI. Efter scanning, er computer-definerede potentielle tumorceller præsenteres for brugeren. Fra disse billeder skal brugeren anvende kvalitativ analyse under anvendelse af de definerede parametre og differentialfarvning diskuteret ovenfor for at bestemme, hvilke hændelser er CTCs.
Ud over at give en standardiseret metode til CTC optælling, CSS giver mulighed for molekylær karakterisering af CTCs baseret på proteinmarkører af interesse. Denne forespørgsel cen udføres på enkelt-celle niveau, ved hjælp af et fluoresceinisothiocyanat (FITC) fluorescens kanal ikke påkrævet for CTC identifikation 16. Selv om denne platform giver evnen til molekylær karakterisering, den detaljerede proces protokol udvikling og optimering er ikke veldefineret. Tre kommercielt tilgængelige markører er blevet udviklet af producenten til brug med CSS, herunder epidermal vækstfaktor receptor (EGFR), human epidermal vækstfaktor receptor 2 (HER2) og insulin-lignende vækstfaktor 1 receptor (IGF-1R). HER2-analyse, i kombination med CSS, er blevet brugt af flere grupper til at illustrere potentialet for CTC karakterisering at informere den kliniske beslutningsproces og potentielt ændre de eksisterende retningslinjer for behandling. For eksempel Fehm et al. 17 viste, at cirka en tredjedel af brystkræftpatienter med HER2-primær tumorer havde HER2 + CTCs. Desuden Liu et al.18 for nylig rapporteret, at op til 50% af patienter med HER + metastatisk brystkræft ikke havde HER2 + CTCs. Herceptin, et HER2 receptor forstyrrende monoklonalt antistof påvist at være til fordel patienter, hvis tumorer udtrykker tilstrækkelige niveauer af HER2, er et almindeligt brugt til behandling af patienter med HER2 + primære tumorer 19-21. Men disse undersøgelser tyder på, at Herceptin kan være sub-optimalt udnyttet, og at CTC karakterisering kan støtte i at forudsige behandlingsrespons. I sidste ende kan CTC karakterisering har potentiale til at forbedre personlig pleje.
CTC forskning er enestående, fordi det har i høj grad udnyttet en seng-til-bord-tilgang. Denne metode, i modsætning til benchtop-til-bedside forskning, som ofte kan tage år at påvirke patientpleje, har tilladt CTCs hurtig indtræden i kliniske omgivelser. Men læger er tilbageholdende med at bruge resultaterne fra CTC-analyse i patientbehandlingen beslutningsprocessen MAKning på grund af en manglende forståelse af deres underliggende biologi. Derfor bør relevante prækliniske musemodeller for metastaser og supplerende CTC analyseteknikker skal udnyttes med henblik på at undersøge disse udestående spørgsmål. Generelt er der to typer af prækliniske modeller, der anvendes til at studere den metastatiske kaskade, (1) spontan metastase modeller, som giver mulighed for undersøgelse af alle de trin i den metastatiske kaskade, og (2) eksperimentelle metastase modeller, som kun giver mulighed for studiet af senere trin i den metastatiske proces såsom ekstravasation og sekundær tumor dannelse 22. Spontan metastase modeller involverer tumorcellevacciner injektioner i passende ortotopisk steder (f.eks injektion af prostatakræft celler i prostata for studiet af prostatakræft). Celler bliver derefter givet tid til at danne primære tumorer og spontant metastaserer til sekundære steder, såsom knogle, lunge og lymfeknuder. IDerimod eksperimentelle metastase modeller indebærer direkte indsprøjtning af tumorceller i blodbanen (fx via halevenen eller intrakardiel injektion til at målrette celler til specifikke steder), og derfor springe de indledende trin i intravasation og formidling til sekundære organer 22. Således Langt størstedelen af CTC-analyse in vivo modelsystemer er blevet udført ved hjælp af enten cytometri-baserede 23 eller tilpasset menneske-baserede CTC-teknikker (f.eks AdnaTest) 24. Selvom nyttigt, ingen af disse teknikker i tilstrækkelig grad afspejler CTC optælling ved hjælp af guldstandarden CSS. Baseret på den kliniske godkendelse, standardiseret karakter, og udbredt brug af CSS, vil udviklingen af en CTC opsamling og afsløring teknik til in vivo modellering, der bruger tilsvarende prøveforberedelse, forarbejdning og identifikationskriterier være fordelagtig, da resultaterne ville være sammenlignelige med de indhentet fra patientprøver. Men på grund af mængden REQuirements af præparatet instrument er det ikke muligt at bearbejde små volumener af blod ved hjælp af denne automatiske platform. . Desuden har tidligere arbejde af Eliane et al 25 viste, at kontaminering af prøverne med muse epithelceller (som også opfylder standarden CTC definition [EpCAM + CK + DAPI + CD45 -]) kan føre til forkert klassifikation af muse pladeepitelceller som CTCs. For at løse disse problemer en tilpasset teknik, der tillader udnyttelse af CSS CTC reagenser kombineret med en manuel isolation procedure blev udviklet. Tilføjelsen af en FITC-mærket human leukocyt antigen (HLA)-antistof til Analysen tillader humane tumorceller kan skelnes fra muse pladeepitelceller.
Dette håndskrift beskriver standard kommercielt udviklet og optimeret CSS protokol til behandling af patientens blodprøver og almindelige faldgruber, som kan opstå, herunder discrepant elementer, der kan føre til CTC Fejlklassificering fejl. Desuden er tilpasning af CSS assay at undersøge brugerdefinerede protein karakteristika tilfangetagne CTCs og en tilsvarende tilpasset CSS teknik, der giver mulighed for berigelse og påvisning af CTCs fra små volumener af blod i prækliniske musemodeller for metastase beskrevet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle humane undersøgelser, der er beskrevet i dette manuskript blev udført under protokoller godkendt af Western University Human Research Ethics Board. Alle Dyreforsøg blev gennemført i overensstemmelse med anbefalingerne fra den canadiske Rådet om Animal Care, under protokoller godkendt af Western University Animal Brug underudvalget.
1.. Standard CTC Enumeration fra patient Blodprøver Brug af CSS
1.. Menneskeblod Prøvetagning og forberedelse til forarbejdning om forberedelse Instrument
- Anvendelse af standard aseptisk tapning teknikker, tegne et minimum på 8,0 ml humant blod ind i en 10 ml CellSave rør (i det følgende benævnt CTC konserveringsmiddel rør), som indeholder ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) og en proprietær cellulær konserveringsmiddel. Vend røret 5x til at forhindre blodet i at størkne. Prøver kan straks behandles eller opbevares ved stuetemperatur i op til 96 timer.
- Løsnee CSS reagenser fra køleskabet og give dem mulighed for at varme op til stuetemperatur før brug.
- Ved hjælp af en engangs 10 ml pipette og automatiseret pipette, indsamle 7,5 ml blod fra CTC konserveringsmiddel rør og langsomt dispensere blod ind i en hensigtsmæssigt mærket præparat instrument forarbejdning rør.
- Tilføj 6,5 ml fortynding buffer til hver prøve. Bland ved at vende prøve 5x. Centrifugér prøven ved 800 xg i 10 min med bremsen i positionen "off". Følg vejledningen på skærmen om udarbejdelse instrument til at indlæse alle patientprøver på systemet til forarbejdning. Prøverne skal behandles inden for 1 time forberedelse.
2. Kontrol Forberedelse Processing om forberedelse Instrument
- Forsigtigt vortex kontrol hætteglasset og vend 5x at blande.
- Fjern forsigtigt hætten fra kontrolgruppen hætteglasset og placer en omvendt forberedelse instrument behandling rør på toppen af den ikke-reducerede hætteglasset. I en hurtig bevægelse, vendkontrollere hætteglasset, og hæld indholdet i behandlingen røret. Mens omvendt, knips forsigtigt siderne af kontrol hætteglasset for at frigive de resterende indhold.
- Fjern forsigtigt det omvendte kontrol hætteglasset ved forarbejdning rør, der sikrer, at ingen væske er tabt, og læg til side. Ved hjælp af en 1.000 gl pipette, indsamle resterende indhold fra hætteglasset og låg og forsigtigt Tilsæt til forarbejdning røret.
- Følg vejledningen på skærmen om udarbejdelse instrument til at indlæse kontrol på systemet til forarbejdning.
3. Prøve Scanning på Analyse Instrument
- Følg vejledningen på skærmen om udarbejdelse instrument til at losse alle prøver fra systemet. Løst cap hver magnetisk enhed patron og trykke den magnetiske enhed ved hjælp af hænder eller lab bænk til at frigive eventuelle bobler, der sidder fast på kanten af patronen. Når alle boblerne er blevet fjernet, fast loft patronen, lå den magnetiske enhed flad, og jegncubate i mørke i mindst 20 minutter ved stuetemperatur. Prøverne skal scannes inden 24 timer forberedelse.
- Tænd analyse instrument og initialisere lampen. Når varmes (~ 15 min), indlæse systemet verifikation patron på analyse instrument, og vælg Test fanen QC. Følg vejledningen på skærmen for at udføre de nødvendige kontrolforanstaltninger kvalitet.
- Indlæse en prøve på analyse instrument og vælg Patient Test fane. Alle gemte oplysninger fra præparatet instrument vil blive vist. Klik på Start for at initialisere prøve scanning. Systemet vil udføre en grov fokus og kantdetektering på den magnetiske enhed patron.
- Juster alle kanter efter behov ved hjælp af piletasterne. Vælg Accepter. Systemet vil udføre et fint fokus og begynde prøve scanning.
- Efter kontrol scanning resultaterne bør valideres ved hjælp af de definerede kriterier for celler spiket ved høj (CK + DAPI + CD45 - APC +) og lav (CK DAPI + CD45 - FITC +) koncentrationer. Efter patientprøve scanning resultaterne bør gennemgås for optagne CTCs anvender de definerede CTC kriterier (CK + DAPI + CD45 -).
2. CTC Karakterisering for brugerdefinerede markører ved hjælp af CSS
1.. Udarbejdelse af Brugerdefinerede markører og Instrument Initialisering
- Fortynd antistoffet af interesse under anvendelse af Bond Primary Antibody Diluent til den ønskede koncentration i en markør reagens kop hjælp af følgende formel, hvor den arbejdende koncentration er koncentrationen af antistoffet efter tilsætning til prøven og bestanden koncentration er koncentrationen af antistof i reagens kop. For flere prøver, justere antistof mængder som beskrevet i tabel 1. Anbring markør reagens kop i position 1 i reagenskassetten og lOAD patronen på CSS.
Stock Koncentration = (Arbejde Koncentration x 850 ul) / 150 pi - Indsaml blod, forberede prøver og indlæse forberedelse instrument som beskrevet i ovennævnte standard CTC Enumeration fra patient Blodprøver ved hjælp af CSS-protokollen. For at aktivere brugerdefinerede markør kommer, skal du vælge Brugerdefineret Assay når du bliver bedt af præparatet instrument. Input markør navn, og vælg Gem. Da prøverne er læsset på instrumentet, vil operatøren blive bedt om at angive, hvilke bør modtage brugerdefinerede markør ved at vælge Ja eller Nej det er nødvendigt.
2. Prøve Scanning af brugerdefinerede markører på Analyse Instrument
- Tænd analyse instrument, initialisere lampen, og udføre kvalitetskontrol og systemet verifikation som beskrevet i afsnit 3.2 i standard CTC Enumeration fra patient Blodprøver ved hjælp af CSS
- Indlæse en prøve på analyse instrument og vælg fanen Opsætning. Sådan initialiserer FITC-kanalen, skal du vælge CellSearch CTC som Kit-ID under forsøgsprotokollerne sektionen. Fra denne menu skal du vælge CTC Research klikke på knappen Rediger og indstille eksponeringen tid som ønsket. Det anbefales, at en eksponeringstid på 1,0 sek ikke overskrides, når du bruger CSS CTC kit, da dette kan øge gennemblødning i andre fluorescerende kanaler udnyttes til CTC identifikation.
3. Tilpasning af standard CSSProtocol til brug i prækliniske musemodeller
** Tilpasset fra Veridex Mouse / Rat CellCapture Kit (ikke længere er kommercielt tilgængeligt)
1.. Museblod Indsamling og opbevaring
- Forud for tapning køre ~ 30 pi 0,5 M EDTA og tilbage gennem en 22 G nål, hvilket efterlader en lille mængde af EDTA i navet.
- Indsamle mindst 50 pi museblod fra mus tidligere injiceret med humane tumorceller via ortotopisk, hale vene, eller intrakardiale ruter. Indsamle blod fra vena vene (for seriel CTC analyse) eller ved hjertepunktur (for terminal CTC analyse). Tag nålen og dispensere blod ind i en 1 ml EDTA microtainer blodopsamlingsrør. Bland ved at vende eller Knips forsigtigt på røret for at forhindre blodet i at størkne. Blod kan straks forarbejdes eller opbevares ved stuetemperatur i op til 48 timer efter tilsætning af et lige volumen af CytoChex cellulære konserveringsmiddel.
2. CTC berigelse
- Fjern CSS reagenser fra køleskabet og give dem mulighed for at varme op til stuetemperatur før brug.
- Overfør svarer til 50 pi helblod til et 12 mm x 75 mm flowcytometri rør. Tilsæt 500 pi fortyndingsbuffer til hver prøve, afvaskning noget blod, der forbliver på siderne af røret. Hvis det er nødvendigt, en kort centrifugerotationenskan bruges til at indsamle nogen resterende blod.
- Forsigtigt vortex anti-EpCAM Ferrofluid og tilsættes 25 pi til hver prøve ved at placere spidsen af pipetten direkte ind i prøven. Tilsæt 25 ul Capture Enhancement reagens og vortex forsigtigt for at blande. Inkuber prøver ved stuetemperatur i 15 min.
- Placer prøveglas i magneten og inkuberes i 10 min. Mens prøveglas er stadig i magneten bruge en glaspipette til nøje at aspirere den resterende væske uden at berøre væggen af røret ved siden af magneten og kasseres.
3. CTC Farvning
- Fjern prøveglas fra magneten og resuspender i 50 ul Nucleic Acid Dye, 50 pi farvningsreagens 1,5 ul af anti-muse-CD45-APC, 5,0 pi anti-humant HLA-Alexa Fluor 488, og 100 pi Permeabilisering reagens. For flere prøver, kan disse reagenser forblandes og 206,5 pi blanding kan tilsættes til hvert rør. Vortex forsigtigt for at blandeog inkuberes i 20 minutter ved stuetemperatur i mørke.
- Tilsæt 500 pi fortyndingsbuffer, vortex forsigtigt, sted prøverør i magneten, og inkuberes i 10 min. Mens prøveglas er stadig i magneten bruge en glaspipette til nøje at aspirere den resterende væske uden at berøre væggen af røret ved siden af magneten og kasseres. Fjern prøveglas fra magneten og resuspenderes i 350 pi fortyndingsbuffer. Vortex forsigtigt for at blande.
4.. Magnetisk Device Loading
- Ved hjælp af en gel lastning spids, omhyggeligt overføre hele mængden fra prøverøret ind i en patron i den magnetiske enhed. Start i bunden af patronen og langsomt trække tip som prøven er doseret.
- Når hele prøven er blevet overført, løst cap magnetiske enhed patron og trykke den magnetiske enhed ved hjælp af hænder eller lab bænk til at frigive eventuelle bobler, der sidder fast på kanten af patronen, som beskrevet i sektionn 3.1 i standard CTC Enumeration fra patient Blodprøver ved hjælp af CSS.
- Pop alle boblerne ved hjælp af en steril 22 G kanyle ved at fange dem mellem facet og kanten af patronen. Når alle boblerne er blevet fjernet, fast loft patronen, lå den magnetiske enhed flad, og inkuberes i mørke i mindst 10 min. Prøverne skal scannes inden 24 timer forberedelse.
5.. Scanning af manuelt Adskilte prøver på analysen Instrument
- Tænd analyse instrument, initialisere lampen, og udføre kvalitetskontrol og systemet verifikation som beskrevet i afsnit 3.2 i standard CTC Enumeration fra patient Blodprøver ved hjælp af CSS-protokollen.
- Load prøven på analyse instrument og vælg fanen Opsætning. Fjern eventuelle eksisterende data på magnetiske enhed knap data ved at klikke Formater Sample knappen. Aktiver FITC-kanalen ennd indstille eksponeringen tid til 1,0 sek som beskrevet i afsnit 2.2 i CTC Karakterisering for brugerdefinerede markører ved hjælp af CSS.
- Klik på Patient Test-fanen og vælg Rediger for at indtaste prøvens oplysninger. Vælg CellSearch CTC som Kit-id og CTC forskning som forsøgsprotokollen. Input den resterende nødvendige oplysninger som angivet som stjerne. Gem prøven, og klik på Start.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Standard CTC Enumeration Assay
Følsomheden og specificiteten af CSS er veldokumenteret i litteraturen. Men for at validere tilsvarende CTC opsving, spidse (1.000 LNCaP humane prostatacancerceller) og ikke-spikede blodprøver menneske fra raske frivillige donorer blev behandlet på CSS bruger standard CSSCTC protokollen. Som forventet, ikke-spikede prøver var fri for CTCs, 0,00 ± 0,00%, og CTC opsving blev påvist at være 86,9 ± 4,71% for spikede prøver (figur 1a). CSS galleribilleder opnået fra spidse prøver var af optimal kvalitet og CTCs var let at skelne fra ikke-CTCs. Men når behandlingen prøver fra kræftpatienter, identifikation af CTCs er lidt mere udfordrende, med mange celler, vises mindre i størrelse og er mindre lette at skelne fra ikke-CTCs (figur 1B). Hertil kommer, når gennemgå patientprøver 6 kategorier af begivenheder var identified, der var almindeligt afvigende elementer mellem anmeldere (jf. figur 1c). Disse 6 kategorier inkluderet, (1) små begivenheder, der ikke opfyldte kravet 4 mM størrelse for CTC klassificering, (2) poster med dim CK og / eller DAPI farvning, (3) berettiget (skal tælles som en CTC) versus uberettiget (bør ikke medregnes som en CTC) bløder igennem til CD45-APC-kanal forårsaget af lyse CK-PE-farvning (4) FITC + hændelser, (5) pixelerede billeder i CK og / eller DAPI-kanaler, og (6) arrangementer med DAPI-farvning, der er større end CK billeder eller dem med DAPI-farvning, som ikke overlapper> 50% med CK billede. For kategori (2) og (5) specifikke kriterier findes for CTC klassificering. For kategori (2), kan emner med dim CK / DAPI klassificeres som CTCs forudsat at en intakt membran kan observeres i CK kanal og enpassende størrelse DAPI billede noteres. For kategori (5), poster med pixeleret CK / DAPI ikke kan klassificeres som CTCs hvis der observeres nogen pixelering i CK-kanal. Men pixelering er acceptable i DAPI kanal, forudsat at det ikke er for alvorlig (dvs. billedet er helt hvidt på en baggrund, ingen grå områder - beskrevet af Janssen Diagnostics (tidligere Veridex) som hvid maling på en sort baggrund), eller diffuse (skal stadig synes ovalt og det passer i CK).
Brugerdefineret Marker Assay Development
Tilpasning af CSS til at karakterisere CTCs for brugerdefinerede markører kræver betydelige arbejde op med streng kontrol og er blevet beskrevet tidligere 16. Som en generel regel, hensigtsmæssig optimering af enhver brugerdefineret markør kræver, at negative kontroller anvendes til at sikre, at resultaterne er specifikke. De bedste resultater opnås, når spidse prøver behandles med bådeuspecifik IgG kontrol i stedet for mål-antistof og med antistoffet fortyndingsmiddel alene som beskrevet tidligere. Forskellige mål antistofkoncentrationer og eksponeringstider skal også vurderes og valideres ved hjælp af cellelinier med høje, lave, og fraværende (negative) antigen tætheder. Optimale protokol betingelser opnås, når assay demonstrerer både høj sensitivitet for målantigenet og lav baggrundsstøj fra ikke-specifik binding 16.
Et eksempel på dette arbejde op ved hjælp af en kræft stamcelle markør, CD44, der præsenteres her. Indledende test med denne markør begyndte at bruge standard CSS CTC kit (i det følgende benævnt den traditionelle CTC kit), som udnytter FITC kanal for brugerdefineret markør udvikling. Brug af traditionelle CTC kit, blev det påvist, at efter betydelige optimering, det maksimale antal CTCs, der kan betegnes som CD44 + var 69,3 ± 2,67% ved hjælp prøver spiket med 1.000 MDA-MB-468 Human brystkræftceller, der er kendt for at demonstrere høj CD44-ekspression med de fleste af cellerne (98,4 ± 0,90%, som bestemt ved flowcytometri), der udtrykker dette protein (figur 2A). På baggrund af disse resultater blev det en hypotese, at den kommercielt tilgængelige CSS CXC kit kan producere bedre resultater. Dette sæt giver mulighed for en forbedret visualisering af markører med en lavere antigen densitet (~ 50.000 antigener / celler) sammenlignet med den traditionelle CTC kit (optimeret til markører med en densitet på ~ 100.000 antigener / celle) ved at vende fluorescens kanal som CK8 / 18/19 (traditionelt repræsenteret i PE-kanalen) og brugerens markering af interesse (traditionelt repræsenteret i FITC kanal) er repræsenteret (derfor følgende CXC-kit vil blive henvist til som den lave antigen densitet CTC kit) 26. Efter en betydelig optimering, blev det påvist, at denne ændring er tilladt for forbedret CD44 farvning med 98,8 ± 0,51% af CTCs klassificeret som CD44 + </ Sup> hjælp CD44-PE i en koncentration på 1,0 mg / ml og en eksponeringstid på 0,6 sekunder (figur 2A). Passende optimering af enhver brugerdefineret markør kræver også validering ved hjælp af høj antigen densitet (MDA-MB-468), lav antigen densitet (21 NT), og negative (LNCaPs) cellelinier til markør af interesse (figur 2B).
CTC Analyse i Prækliniske musemodeller
For at bestemme følsomheden og specificiteten af de tilpassede muse CSS protokol tilsat (1.000 LNCaP humane prostatacancerceller) og spikede muse blodprøver blev behandlet manuelt og scannet på analysen instrument og sammenlignes med resultaterne opnået ved anvendelse af den samme cellelinie behandles ved hjælp af standard automatiseret CSS protokol om forberedelse instrument (figur 3A). Som forventet, ikke-spikede prøver var fri for CTCs bruger begge analyser, 0,00 ± 0,00% og CTC genvinding ved hjælp af den tilpassede mus kit (90,8 ± 5,18%), ikke var significantly forskellig fra resultater opnået ved brug af standard automatiseret system (86,9 ± 4,71%, p> 0,05). Billeder opnået ved hjælp af den manuelle mus tilpasset protokol adskilte sig ikke fra dem, der ses ved brug af standard automatiseret teknik med undtagelse af tilføjelsen af HLA-FITC markør. Hertil kommer, at muse pladeepitelceller ikke farves positivt for HLA-FITC (figur 3B). For at bekræfte, at denne teknik var så følsom som standard CSS protokol til isolering af lave antal CTCs blev seriefortyndinger udført med blodprøver spidse og korrelationen af det forventede antal celler versus genvundet antal celler blev vurderet (fig. 3C). Resultaterne viser, at CTCs effektivt kan inddrives ned til en følsomhed på 5 cells/50 ul fuldblod ved hjælp af denne analyse. Disse værdier korreleret med de forventede resultater med en r 2 = 0,99.
Figur 2. Karakterisering af CTCs for brugerdefinerede markører ved hjælp af CSS. (A) procentdel af cellerne er klassificeret som CD44 + ved hjælp af CTC og CXC kits på CSS (n = 3). Data er præsenteret som gennemsnit ± SEM. *** = Signifikant forskellige (P <0,0005). (B) Repræsentative CSS galleri billeder af blod fra en rask frivillig donor (7,5 ml) tilsat ~ 1000 celler fra den identificerede cellelinje inkuberet med 1,5 ug / ml anti -CD44-PE, og scannet på en eksponeringstid på 0,2 sek. Orange firkanter indikerer CD44 + </ Sup> CTCs identificeret som CK + / DAPI + / CD45 - / CD44 -. PE + Klik her for at se større billede.
Figur 3. Tilpasning af proceduren til anvendelse i prækliniske musemodeller for metastase CSS. (A) CTC genvinding ved hjælp af tilpasset muse CSS protokol målt som en procentdel af antallet af spidse celler og sammenlignet med resultater opnået ved hjælp af standard humant CSS protokol. Celler blev talt med et hæmocytometer og ~ 1.000 LNCaP humane prostatacancerceller blev tilsat til 7,5 ml af humant blod. Spikede humane blodprøver blev anvendt som en negativ kontrol (n = 3). Data er præsenteret som gennemsnit ± SEM. ns = ikke signifikant. (B) (C) Analyse af korrelation og lineær regression af det forventede versus genvundet antal spidse tumorceller ved forskellige koncentrationer . LNCaP humane prostatacancerceller oprindeligt blev talt ved hæmocytometer og efterfølgende tilsat til museblod ved en koncentration på ~ 1.000 tumor cells/50 ul blod. Spiked museblod blev derefter serielt fortyndet til en koncentration på 5 tumor cells/50 pi og behandles ved hjælp af musen tilpasset CSS protokol (n = 3). Klik her for at se større billede.
| # Af Prøver med Brugerdefineret Marker Tilføjet | Samlet volumig at tilføje til Reagens Cup (ul) |
| 1 | 450 |
| 2 | 600 |
| 3 | 750 |
| 4. | 900 |
| 5. | 1.050 |
| 6 | 1.200 |
| 7 | 1.350 |
| 8. | 1.500 |
Tabel 1. . Samlet krav til CSS, når de behandler forskellige antal prøver med en brugerdefineret markør volumen ** Tilpasset fra Veridex hvidbog (findes på: http://www.veridex.com/pdf/CXC_Application_Guideline.PDF ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
På trods af udviklingen af mange nye CTC teknologier siden indførelsen af CSS i 2004, denne teknik er stadig den eneste klinisk godkendte teknologi på markedet i dag, og derfor betragtes som den aktuelle gold standard for CTC påvisning og tælling. Dette håndskrift har vist, at selv om CSS har strenge krav til kvalitetskontrol kan det være genstand for fortolkning bias og at CTC identifikation i patientprøver er meget anderledes fra identifikation i spidse prøver. Blev identificeret seks kategorier af almindeligt afvigende elementer, der kan forårsage CTC fejltariferinger at forekomme. Disse afvigende elementer fremhæver behovet for flere korrekturlæsere på hver patientprøve behandles på dette instrument. Desuden konstaterede forskelle i spidse versus patient opnåede CTCs viser, at der er en nødvendighed for alle nye CTC teknologier, der skal valideres i både spidse og patientprøver. Desuden skal disse nye teknologier be forhold til guldstandarden CSS hjælp split test prøve af både spidse og patientprøver så effektive CTC fange prøver med tilsætning betyder kun afspejler ikke nødvendigvis CTC fange effektivitet i patientprøver.
Selvom CSS har kapacitet til at udføre karakterisering af tilfangetagne CTCs, det er helt begrænset med hensyn til meget tilpasselig optimering. I almindelighed er de eneste parametre, der kan ændres på dette instrument til optimering af brugerdefinerede markører er antistofkoncentrationen og længden af tid, som fluoroforen er udsat for lampen kviksølv. Denne begrænsede kapacitet til optimering kan give problemer, når du arbejder op brugerdefinerede markører på CSS. En løsning, der foreslås i dette manuskript (beskrevet i detaljer tidligere 16) er brugen af den lave antigen densitet CTC kit, som skifter FITC og PE-fluorescerende kanaler giver mulighed for bedre visualisering af markører med lav antigen densitet. Uansethvoraf kit er udnyttet (traditionel eller lav antigen tæthed CTC kit) der er flere nødvendige skridt, der skal iværksættes for at sikre en hensigtsmæssig markør sensitivitet, specificitet og optimering. For det første må assayfølsomhed vurderes i forhold til en velvalideret fremgangsmåde, såsom flowcytometri, som vil tillade bestemmelse af den forventede detektionsgrænsen (dvs. procentdelen af celler i den cellepopulation, som udtrykker markøren af interesse) af bruger- defineret markør. For det andet skal analysen vurderes for sin evne til at detektere markør for interesse i cellelinier med forskellige niveauer af udtryk (dvs. høje og lave antigen tætheder) og dens specificitet skal valideres i en cellelinie, der er negativ for markør af interesse . I alle tilfælde skal alle cellelinier testes ved hjælp af en celler kun kontrol (intet antistof tilsat), passende IgG kontrol og antistoffet af interesse ved forskellige koncentrationer og eksponeringstider til at bestemme most relevante indstillinger, der vil sikre en optimering af den brugerdefinerede markør. Dog skal det bemærkes, at selv om karakterisering af CTCs er muligt på CSS, der i øjeblikket kun en brugerdefineret markør af interesse kan udforskes i hver prøve, og at systemet er meget begrænset med hensyn til downstream-applikationer på grund af den barske behandling af prøverne.
Den unikke bedside-til-bord-strategi udnyttes i CTC forskning har tilladt for hurtig indtastning af denne nyttige analyse i det kliniske miljø. Det har imidlertid resulteret i en manglende forståelse af de grundlæggende biologi af disse sjældne celler. Derfor er der behov for udvikling og optimering af analyser, som giver mulighed for vurdering af CTCs i prækliniske in vivo musemodeller af kræft. Dette håndskrift beskriver en tilpasset CSS-protokol, der giver mulighed for CTCs skal vurderes i mængder museblod 50 gl, velegnet til seriel CTC indsamling eksperimentelle modeller. Dette håndskrift demonstrates at CTC opregning ved hjælp af denne protokol er sammenligneligt med resultater opnået ved hjælp af CSS i kombination med den traditionelle CTC kit, med ingen signifikante forskelle i CTC fange effektivitet mellem de automatiske og manuelle separationsteknikker. Desuden er det under udviklingen af dette assay blev anerkendt, som tidligere beskrevet i litteraturen 25, kan den mus squamous forurening epitelcelle lave præcise identifikation af CTCs mere vanskeligt og sommetider umuligt. Derfor at bekæmpe dette problem en brugerdefineret HLA-Alexa Fluor 488 blev føjet til denne protokol til at sikre, at kun humane celler (CK + DAPI + CD45 - HLA - Alexa Fluor 488 +) bliver behørigt tildelt som CTCs. Det er vigtigt at bemærke, at LNCaP-cellelinie, der anvendes i dette skrift er HLAlow og derfor HLA-Alexa Fluor 488 kan være nødvendigt at titreres for cellelinier med varierende HLA ekspression. Selvom vi har tilføjet en HLA-Alexa Fluor 488 til vores protokol for at sikre nøjagtig identifikation af CTCs, er det bemærkelsesværdigt, at langt størstedelen af muse pladeepitelceller var let identificerbare ved morfologi og var begrænset i celle nummer (0,33 ± 0,24 events/50 pi, n = 9). Højere celle tal (op til 11 events/50 ul) blev kun observeret når blodtapning (via hjertepunktur) vist sig vanskeligt og gentagne forsøg var nødvendige. Vi foreslår derfor, at hvis det ønskes, kan på systemet karakterisering af CTCs opnås ved at udelade denne markør. Hertil kommer, at selv om der ikke er beskrevet her, forventer vi, at indsamlingen af CTCs og længere nedstrøms karakterisering af CTCs anvender andre metoder, som nemt kunne opnås som påvist tidligere ved hjælp af CSS 27,28.
Selvom CSS er blevet udnyttet klinisk effektivt opdage CTCs i blodet af metastatisk bryst-, prostata-og kolorektal cancer patienter 4,10,29, har det flere limitations. I op til 35% af patienter med forskellige metastatisk kræft, CTCs er målbart trods af tilstedeværelsen af udbredte systemisk sygdom 30. Denne mangel på detektion er blevet foreslået at være et resultat af epitelial-til-mesenchymale overgang en veldokumenteret proces, kendt for at øge cancer invasion, metastase, og den samlede aggressivitet 31. Denne overgang har været forbundet med en signifikant reduktion i epitel markører, såsom EpCAM, og en tilsvarende stigning i mesenchymale markører 32.. Flere undersøgelser har for nylig vist, at tilstedeværelsen af disse mesenkymale markører i CTCs er tegn på dårligere prognose, og at mange af disse celler mangler udtryk for epitelial markører, der ville være nødvendige for deres opdagelse ved hjælp af CSS 24,33-38. Dette tyder på, at standarden CSS definition kan mangle nogle af de mest aggressive CTCs.
På trods af de beskrevne begrænsninger, er det forventede the-protokoller, der er beskrevet i dette manuskript vil være vigtige redskaber for forbedret CTC analyse ved hjælp af CSS, udvikling af nye CTC teknologier, optimering af brugerdefinerede markører, samt bedre forståelse af CTC biologi hjælp in vivo prækliniske musemodeller. Tilsammen vil disse protokoller give en nyttig ressource for brugere af denne platform er interesseret i præklinisk og klinisk forskning vedrørende metastaser og CTCs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatteren (ALA) har modtaget støtte, der blev leveret af Janssen Oncology, hvis moderselskab Johnson & Johnson ejer også Janssen Diagnostics LLC, der producerer reagenser og instrumenter, der anvendes i denne artikel.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Ontario Institute for Cancer Research (# 08NOV230), Canada Foundation for Innovation (# 13199), prostatakræft Canada, Janssen Oncology, London Regional Cancer Program, og donorstøtte fra John og Donna Bristol gennem London Health Sciences Foundation (ALA). LEL er understøttet af en Frederick Banting og Charles Best Canada Graduate Scholarship Doctoral Award. ALA er understøttet af en CIHR New Investigator Award og en tidlig forsker Award fra Ontario Ministeriet for Forskning og Innovation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M EDTA | |||
| Anti-human CD44-FITC | BD Pharmigen | 555478 | |
| Anti-human CD44-PE | BD Pharmigen | 555479 | |
| Anti-human HLA-Alexa Fluor 488 | BioLegend | 311415 | |
| Anti-mouse CD45-APC | eBioscience | 17-0451-82 | |
| Bond Primary Antibody Diluent | Leica | AR9352 | |
| CellSave Preservative Tubes | Veridex | 952820 (20 pack) 79100005 (100 pack) | |
| CellSearch CTC Control Kit | Veridex | 7900003 | |
| CellSearch CTC Kit | Veridex | 7900001 | |
| CellSearch CXC Control Kit | Veridex | 7900018RUO | |
| CellSearch CXC Kit | Veridex | 7900017RUO | |
| Instrument Buffer | Veridex | 7901003 | |
| Streck Cell Preservative (aka CytoChex) | Streck | 213350 | |
| 1 ml Syringe | |||
| 10 ml Serological pipette | |||
| 1,000 µl Pipette | |||
| 1,000 µl Pipette tips | |||
| 12 mm x 75 mm Flow tubes | |||
| 200 µl Gel loading tips | |||
| 200 µl Pipette | |||
| 22 G Needle | |||
| 5 3/4 in Disposible Pasteur pipet | VWR | 14672-200 | |
| 5 ml Serological pipette | |||
| Automated pipettor | |||
| Capillary Blood Collection Tube (EDTA) | BD Microtainer | 365974 | |
| CellSearch Analyzer II | Veridex | 9555 | Includes magnests and verification cartirdges |
| CellSearch AutoPrep System | Veridex | 9541 | |
| Centrifuge | |||
| MagCellect Magnet | R&D Systems | MAG997 | |
| Small Latex Bulb | VWR | 82024-550 | |
| Vortex |
References
- Siegel, R., Naishadham, D., Jemal, A.
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nat. Rev. Cancer. 2 (8), 563-572 (2002).
- Pantel, K., Brakenhoff, R. H.
- Cristofanilli, M., Budd, G. T., et al. Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer. New Engl. J. Med. 351 (8), 781-791 (2004).
- De Bono, J. S., Scher, H. I., et al. Circulating tumor cells predict survival benefit from treatment in metastatic castration-resistant prostate cancer. Clin. Cancer Res. 14 (19), 6302-6309 (2008).
- Cohen, S. J., Ja Punt, C., et al. Prognostic significance of circulating tumor cells in patients with metastatic colorectal cancer. Ann. Oncol. 20 (7), 1223-1229 (2009).
- Hayes, D. F., Cristofanilli, M., et al. Circulating tumor cells at each follow-up time point during therapy of metastatic breast cancer patients predict progression-free and overall survival. Clin. Cancer Res. 12 (14), 4218-4224 (2006).
- Budd, G. T., Cristofanilli, M., et al. Circulating tumor cells versus imaging--predicting overall survival in metastatic breast cancer. Clin. Cancer Res. 12 (21), 6403-6409 (2006).
- Olmos, D., Arkenau, H. -T., et al. Circulating tumour cell (CTC) counts as intermediate end points in castration-resistant prostate cancer (CRPC): a single-centre experience. Ann. Oncol. 20 (1), 27-33 (2009).
- De Bono, J. S., Scher, H. I., et al. Circulating tumor cells predict survival benefit from treatment in metastatic castration-resistant prostate cancer. Clin. Cancer Res. 14 (19), 6302-6309 (2008).
- Allan, A. L., Keeney, M. Circulating tumor cell analysis: technical and statistical considerations for application to the clinic. J. Oncol. 2010, 426218 (2010).
- Lowes, L. E., Goodale, D., Keeney, M., Allan, A. L. Image cytometry analysis of circulating tumor cells. Methods Cell Biol. 102, 261-290 (2011).
- Lianidou, E. S., Markou, A. Circulating tumor cells in breast cancer: detection systems, molecular characterization, and future challenges. Clin. Chem. 57 (9), 1242-1255 (2011).
- Alix-Panabières, C., Pantel, K. Circulating tumor cells: liquid biopsy of cancer. Clin. Chem. 59 (1), 110-118 (2013).
- Parkinson, D. R., Dracopoli, N., et al. Considerations in the development of circulating tumor cell technology for clinical use. J. Transl. Med. 10, 138 (2012).
- Lowes, L. E., Hedley, B. D., Keeney, M., Allan, A. L. User-defined protein marker assay development for characterization of circulating tumor cells using the CellSearch system. Cytomet. A. 81 (11), 983-995 (2012).
- Fehm, T., Müller, V., et al. HER2 status of circulating tumor cells in patients with metastatic breast cancer: a prospective, multicenter trial. Breast Cancer Res. Treat. 124 (2), 403-412 (2010).
- Liu, Y., Liu, Q., et al. Circulating tumor cells in HER2-positive metastatic breast cancer patients: a valuable prognostic and predictive biomarker. BMC Cancer. 13, 202 (2013).
- Slamon, D. J., Leyland-Jones, B., et al. Use of chemotherapy plus a monoclonal antibody against HER2 for metastatic breast cancer that overexpresses HER2. New Engl. J. Med. 344 (11), 783-792 (2001).
- Marty, M., Cognetti, F., et al. Randomized phase II trial of the efficacy and safety of trastuzumab combined with docetaxel in patients with human epidermal growth factor receptor 2-positive metastatic breast cancer administered as first-line treatment: the M77001 study group. J. Clin. Oncol. 23 (19), 4265-4274 (2005).
- Slamon, D., Eiermann, W., et al. Adjuvant trastuzumab in HER2-positive breast cancer. New Engl. J. Med. 365 (14), 1273-1283 (2011).
- Welch, D. R. Technical considerations for studying cancer metastasis in vivo. Clin. Exp. Metast. 15 (3), 272-306 (1997).
- Goodale, D., Phay, C., Postenka, C. O., Keeney, M., Allan, A. L. Characterization of tumor cell dissemination patterns in preclinical models of cancer metastasis using flow cytometry and laser scanning cytometry. Cytometry A. 75 (4), 344-355 (2009).
- Gorges, T. M., Tinhofer, I., et al. Circulating tumour cells escape from EpCAM-based detection due to epithelial-to-mesenchymal transition. BMC Cancer. 12, 178 (2012).
- Eliane, J. -P., Repollet, M., et al. Monitoring serial changes in circulating human breast cancer cells in murine xenograft models. Cancer Res. 68 (14), 5529-5532 (2008).
- White Pages, V. eridex , Available from: http://www.veridex.com/pdf/CXC_Application_Guideline.PDF (2008).
- Flores, L. M., Kindelberger, D. W., et al. Improving the yield of circulating tumour cells facilitates molecular characterisation and recognition of discordant HER2 amplification in breast. 102 (10), 1495-1502 (2010).
- Sieuwerts, A. M., Kraan, J., et al. Molecular characterization of circulating tumor cells in large quantities of contaminating leukocytes by a multiplex real-time PCR. Breast Cancer Res. Treat. 118 (3), 455-468 (2009).
- Cohen, S. J., Ja Punt, C., et al. Relationship of circulating tumor cells to tumor response, progression-free survival, and overall survival in patients with metastatic colorectal cancer. J. Clin. Oncol. 26 (19), 3213-3221 (2008).
- Allard, W. J., Matera, J., et al. Tumor cells circulate in the peripheral blood of all major carcinomas but not in healthy subjects or patients with nonmalignant diseases. Clin. Cancer Res. 10 (20), 6897-6904 (2004).
- Thiery, J. P., Acloque, H., Huang, R. Y. J., Nieto, M. A. Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease. Cell. 139 (5), 871-890 (2009).
- Yang, J., Weinberg, R. A Epithelial-mesenchymal transition: at the crossroads of development and tumor metastasis. Dev. Cell. 14 (6), 818-829 (2008).
- Gradilone, A., Raimondi, C., et al. Circulating tumour cells lacking cytokeratin in breast cancer: the importance of being mesenchymal. J. Cell. Mol. Med. 15 (5), 1066-1070 (2011).
- Königsberg, R., Obermayr, E., et al. Detection of EpCAM positive and negative circulating tumor cells in metastatic breast cancer patients. Acta Oncol. 50 (5), 700-710 (2011).
- Kasimir-Bauer, S., Hoffmann, O., Wallwiener, D., Kimmig, R., Fehm, T. Expression of stem cell and epithelial-mesenchymal transition markers in primary breast cancer patients with circulating tumor cells. Breast Cancer Res. 14 (1), (2012).
- Mego, M., Mani, S. A., et al. Expression of epithelial-mesenchymal transition-inducing transcription factors in primary breast cancer: The effect of neoadjuvant therapy. Int. J. Cancer. 130 (4), 808-816 (2012).
- Yu, M., Bardia, A., et al. Circulating breast tumor cells exhibit dynamic changes in epithelial and mesenchymal composition. Science. 339 (6119), 580-584 (2013).
- Armstrong, A. J., Marengo, M. S., et al. Circulating tumor cells from patients with advanced prostate and breast cancer display both epithelial and mesenchymal markers. Mol. Cancer Res. 9 (8), 997-1007 (2011).
