Summary
循環腫瘍細胞（CTCの）は、いくつかの転移性癌において予後である。この原稿は、ゴールドスタンダードCellSearchシステム（CSS）CTC列挙プラットフォームについて説明し、一般的な誤分類のエラーを強調しています。さらに、2つの適合プロトコルはこの技術を用いた転移の前臨床マウスモデルでのCTCおよびCTC列挙のユーザ定義のマーカーの特徴付けのために記載されている。
Abstract
癌関連死の大半は、転移性疾患の発症に続いて起こる。この非常に致命的な病気のステージは循環腫瘍細胞（CTCの）の存在と関連している。これらの稀な細胞は、転移性乳癌、前立腺癌、および結腸直腸癌における臨床的に重要であることが実証されている。臨床のCTC検出および計数の現在のゴールドスタンダードは、FDA-クリアCellSearchシステム（CSS）である。この原稿は、標準を使用して、このプラットフォームが利用する標準プロトコルだけでなく、タンパク質の患者CTCの特性評価およびCTCは、血液の非常に低いボリュームをキャプチャするための比較可能なプロトコルのためのユーザー定義のマーカーの最適化の詳細な処理を記述する二つの追加適応のプロトコルの概要を説明転移のin vivoでの前臨床マウスモデルで研究するためのCSSの試薬 。また、健康なドナーの血液との間のCTCの品質の違いは、患者の血液SAMPに対する組織培養由来の細胞をスパイクレスが強調表示されます。最後に、CTCの誤分類エラーにつながることができるいくつかの一般的な矛盾の項目が概説されている。まとめると、これらのプロトコルは、転移およびCTCのに関する前臨床および臨床研究に興味を持って、このプラットフォームのユーザーにとって有益なリソースを提供します。
Introduction
2013年には580350人々が癌で死亡すると推定されており、この病気のこと1660290新しい例は、一人で1米国で診 断されます。これらの死亡の大半は転移性疾患2の開発に続いて起こる。転移および転移カスケードの限られた理解の治療に有効な治療法の現在の不足は、病気のこの段階は非常に致命的なことができます。血流内の腫瘍細胞（CTCの）の循環の存在は、転移性疾患3と相関することが実証されている。これらの細胞は非常にまれであり、その検出は、転移性乳癌4、前立腺5で全生存期間を示すものであり、大腸癌6。少ないまたはSAMにおいて検出のCTCを有する患者と比較した場合、これらの患者では、血液7.5mlの中≥5（乳癌および前立腺）の存在下または≥3（大腸）のCTCは、予後不良の指標であるEの血液量。また、治療的介入の間または後のCTC数の変化は、しばしば、より早く現在利用技術7-10よりも、治療応答の予測因子として有用であることが実証されている。
それは、転移癌患者において、CTCのは10 5〜10 7血単核細胞当たり約1 CTCの頻度で発生し、限局性疾患を有する患者において、この周波数は（1〜10 8で〜）であっても低くてもよい、と推定されている。これらの細胞のまれな性質は、それが困難で正確かつ確実11のCTC を検出し、分析することができる。 （以前は12〜14日）のいくつかの方法は、血液成分を囲むと区別する特性を利用することにより、これらの細胞を濃縮し、検出するために利用されてきた。一般的には、CTCの列挙は、濃縮工程と検出工程の両方を必要とする2段階のプロセスである。伝統的に、濃縮のステップは、物理の違いに依存しているCTCの（細胞の大きさ、密度、変形能）またはタンパク質マーカー発現に対する（ すなわち、上皮細胞接着分子[EpCAMの】サイトケラチン[CK]）のiCalの特性。濃縮後、CTCの検出は、核酸に基づくアッセイおよび/またはフローサイトメトリーアプローチである最も一般的なものは、異なる多くの方法で行うことができる。これらの戦略はそれぞれ異なる利点と欠点を持つが、それらすべてが標準化を欠いている、ユニークである。臨床現場への進入のための必要性。 CellSearchシステム（CSS）は、したがって、蛍光顕微鏡および抗体ベースの技術4-6を用いて、ヒト血液中の希少なCTCの検出および計数のための標準化された方法を提供することを目的に開発されました。このプラットフォームは現在、CTCの列挙型のゴールドスタンダードとみなされ、診療所15で使用するために米国食品医薬品局（FDA）によって承認された唯一の技術です。
CSSは、2コンポーネントのプラットフォームconsistinですgの、ヒト血液試料の調製を自動化（1）CellTracksオートプレップシステム（以下、製造装置ともいう）と、これらをスキャンし、（2）CellTracksアナライザーII（以下、分析装置と称す）調製後のサンプル。準備器具白血球を汚染するのCTCを区別することは、抗体媒介性、磁性流体ベースの磁気分離手法及び示差的な蛍光染色を使用する。最初に、システムは、鉄ナノ粒子にコンジュゲート抗EpCAM抗体を使用したCTCを標識する。次いで、試料を磁場中でインキュベートされ、全ての未標識細胞が吸引される。選択された腫瘍細胞は、蛍光標識抗体と核染色試薬からなる差動蛍光染色に再懸濁し、インキュベートする。最後に、試料を、磁気カートリッジに移し（以下、磁気装置ともいう）と呼ばれるMagNest、およびscさ分析機器を用いてanned。
分析装置は、10X対物レンズを用いて、異なる蛍光フィルターを用いて調製されたサンプルは、適切な蛍光体粒子に最適化された各々をスキャンするために使用される。 CTCのは、抗EpCAM、抗パン-CK-フィコエリスリン（PE）が結合する細胞（CK8、18、および19）、および核染色4 '、6 - ジアミジノ-2 - フェニルインドール（DAPI）として識別される。逆に、混入白血球を、抗CD45-アロフィコシアニン（APC）およびDAPIが結合する細胞として同定される。走査に続いて、コンピュータで定義された潜在的な腫瘍細胞がユーザに提示される。これらの画像から、ユーザは、CTCのあるイベントを決定するために、上記の定義されたパラメータと差動染色を用いて定性分析を採用する必要があります。
CTCの計数のために標準化された方法を提供することに加えて、CSSは、目的のタンパク質マーカーに基づいて、CTCの分子特徴づけを可能にする。この呼び掛けCCTCの同定16には必要ないフルオレセインイソチオシアネート（FITC）蛍光チャンネルを使用して、単一細胞レベルで実行することができる。このプラットフォームは、分子特性解析のための能力を提供するが、プロトコル開発および最適化の詳細な処理は、明確に定義されていない。 3種の市販のマーカーは、上皮成長因子受容体（EGFR）、ヒト上皮成長因子受容体2（HER2）、およびインスリン様成長因子1受容体（IGF-1R）を含む、CSSでの使用のために製造業者によって開発されている。 HER2分析は、CSSと組み合わせて、臨床意思決定を通知するために、潜在的に既存の治療ガイドラインを変更するCTCの特徴づけの可能性を例示するためにいくつかのグループによって利用されてきた。例えば、Fehm ら は、HER2-17原発腫瘍を有する乳癌患者の約3分の1は、HER2 +のCTCを有していたことを実証した。また、Liu ら。18は最近、HER +転移性乳癌患者の最大50％がHER2陽性のCTCを持っていなかったことを報告した。ハーセプチン、大幅に腫瘍がHER2の十分なレベルを発現、HER2陽性原発腫瘍19〜21の患者さんのために一般的に利用され、治療された患者に利益をもたらすことが実証モノクローナル抗体を妨害HER2受容体。しかしながら、これらの研究は、ハーセプチンは、サブ最適に利用し、CTCの特徴づけは、治療応答の予測を助けることができることであることができることを示唆している。最終的に、CTCの特徴づけは、パーソナライズされたケアを改善する可能性を有していてもよい。
それは主にベッドサイド·ツー·ベンチトップアプローチを利用しているという点で、CTCの研究がユニークです。この方法は、多くの場合、患者のケアに影響を与えるには何年もかかることができ、ベンチトップ·ツー·ベッドサイドの研究とは異なり、臨床現場へのCTCクイック入力を可能にした。しかし、医師は患者の治療の意思決定MAKで、CTCの分析の結果を使用して躊躇しているそれらの基礎となる生物学の理解の不足のためにING。したがって、転移および相補CTC分析技術の適切な前臨床マウスモデルが、これらの未解決の疑問を調査するために利用されなければならない。一般的には、転移カスケードのすべてのステップの研究を可能にする転移カスケードを研究するために使用される前臨床モデルの2つのタイプ、（1）自然転移モデルは、存在のみを可能にする（2）実験的転移モデルこのような血管外漏出と二次腫瘍形成22として、転移プロセスの後の段階の研究。自然転移モデル（前立腺癌の研究のための前立腺に前立腺癌細胞の例えば、注射）の適切な位置に同所性腫瘍細胞の注射を伴う。次いで、細胞を、原発腫瘍を形成し、自発的に、骨、肺、およびリンパ節などの二次部位に転移する時間が与えられる。でこれに対し、実験的転移モデルは、（特定の場所に細胞を標的とする尾静脈や心臓内注射を介してなどして ）血流への腫瘍細胞の直接注入を含んでいるため、二次的な器官22に血管内および普及の初期段階をスキップします。これまでのin vivoモデル系においてCTC解析の大部分は、フローサイトメトリーベース23又はヒト適合CTCベースの技術（ 例えば AdnaTest）24のいずれかを用いて行われた。有用ではあるが、これらの技術はいずれも、適切にゴールドスタンダードのCSSを使用して、CTCの列挙を反映していない。結果は、匹敵するであろうように、臨床承認、標準化された性質、及びCSSの広範な使用に基づいて、 インビボためのCTC捕捉および検出技術の開発が同等の試料調製、処理、および識別基準を利用してモデリングが有利で あろう患者試料から得られた。しかしながら、ボリュームREQに準備器具のuirementsは、この自動化されたプラットフォームを使用して少量の血液を処理することは不可能である。イリアーヌらのほかに、これまでの研究25は、マウス上皮細胞の試料の汚染（標準、CTCの定義を満たす[のEpCAM + CK + DAPI + CD45が- ]）ことを実証しています。、マウス扁平上皮細胞の誤分類につながる可能性CTCの。これらの問題のマニュアルを単離操作と組み合わせたCSSのCTCキット試薬の利用が開発されたことができようになった技術に対処するために。アッセイのFITC標識ヒト白血球抗原（HLA）抗体の添加は、ヒト腫瘍細胞がマウス扁平上皮細胞と区別することを可能にする。
この原稿がdiscrepan含め遭遇する可能性がある患者の血液サンプルと共通の落とし穴を、処理するための商業的に開発された標準、および最適化されたCSSのプロトコルを記述CTCの誤分類エラーが発生する可能性のT項目。また、収集したCTCのユーザ定義のタンパク質の特性を調べるためのCSSアッセイのカスタマイズおよび転移の前臨床マウスモデルにおいて少量の血液からのCTCの濃縮および検出を可能に匹敵するように適合CSS技術が記載されている。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
本稿で説明したすべてのヒトでの研究は、ウェスタン大学の人間研究倫理委員会によって承認されたプロトコルの下で実施した。すべての動物実験は、ウェスタン大学の動物への使用小委員会によって承認されたプロトコルの下で、動物ケアカナダ評議会の勧告に従って行った。
1。 CSSを使用して患者血液サンプルから標準、CTC列挙
1。準備インストゥルメントの処理のための人間の血液サンプル採取と準備
- 標準的な無菌瀉血技法を使用して、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）および独自の細胞保存剤を含有する（以下、CTC防腐チューブともいう）を、10ml CellSaveチューブにヒト血液8.0mlの最小を描く。血液の凝固を防ぐために、チューブの5倍を反転します。サンプルはすぐに処理されるか、最大96時間室温で保存することができる。
- リムーバブル冷蔵庫から電子のCSS試薬およびそれらを使用する前に室温に温める。
- 使い捨ての10ミリリットルピペットや自動分注器を使用して、CTCの防腐管からの血液7.5ミリリットルを収集し、徐々に適切にラベル作成機器の処理チューブに血液を分注する。
- 各サンプルに希釈緩衝液6.5ミリリットルを追加します。サンプル5X転倒混和する。 「オフ」の位置にブレーキをかけながら10分間800×gで遠心分離サンプル。処理のためにシステムにすべての患者サンプルをロードするための準備機器で画面上の指示に従ってください。サンプルは、準備の1時間以内に処理されなければならない。
2。準備インストゥルメントの処理のための制御の準備
- 優しくコントロールバイアルをボルテックスし、混合することが5倍に反転。
- 慎重にコントロールバイアルからキャップを外し、キャップを外し、バイアルの上に反転準備計器処理チューブを配置します。 1迅速な運動では、反転バイアルを制御し、処理チューブに内容物を注ぐ。反転しながら、ゆっくりと残りの内容物を放出するために、制御バイアルの側面をフリック。
- 慎重に、処理チューブから反転制御バイアルを取り外し、液体が失われないことを保証し、脇に置きます。千μLピペットを用いて、処理チューブにバイアル蓋と静かにピペットから、残りの内容を収集します。
- 処理のためのシステムにコントロールをロードするための準備機器で画面上の指示に従ってください。
3。分析計測器上のサンプルのスキャン
- システムからすべてのサンプルをアンロードする準備機器で画面上の指示に従ってください。ゆるく各磁気デバイスカートリッジにキャップをし、カートリッジの端に貼り付けられている任意の泡を解放するために手や実験台を用いた磁気デバイスをタップします。すべての気泡が除去されていると、しっかりと私は、カートリッジにキャップを平らな磁気デバイスを置き、室温で少なくとも20分間、暗所ncubate。サンプルは準備の24時間以内にスキャンする必要があります。
- 分析装置の電源を入れ、ランプを初期化します。一回（15分〜）温め、分析機器へのシステム検証カートリッジをロードし、QCテスト ] タブを選択します。必要な品質管理対策を行うために、画面上の指示に従ってください。
- 分析装置にサンプルをロードして、 患者のテスト ] タブを選択します。製造器具からすべての保存された情報が表示されます。サンプルのスキャンを初期化するために、開始をクリックします。システムは、磁気デバイスカートリッジに粗い焦点およびエッジ検出を実行する。
- 方向キーを使用して、必要に応じてすべてのエッジを調整します。選択して受け入れます 。システムは、ファインフォーカスを実行し、サンプルのスキャンを開始します。
- 結果をスキャンし、以下のような制御は、高（CK + DAでスパイク細胞について定義された基準を使用して検証する必要がありますPI + CD45 - APC +）、低（CK + DAPI + CD45 - FITC +）濃度。結果をスキャンして、次の患者のサンプルは、定義されたCTCの基準（CK + DAPI + CD45 - ）を使用して収集したCTCのために見直すべきである。
2。 CSSを使用してユーザー定義マーカーのCTC特性評価
1。ユーザー定義のマーカーとインストゥルメントの初期化の準備
- 作業濃度は、試料に加えた後、抗体の濃度であり、ストック濃度は、抗体の濃度である以下の式を用いて、標識試薬カップに所望の濃度にボンド一次抗体希釈液を用いて目的の抗体を希釈試薬カップ。複数のサンプルについては、 表1に記載したように、抗体のボリュームを調整する。試薬カートリッジとLの位置1に標識試薬カップを置くCSSにカートリッジをOAD。
ストック濃度=（作用濃度X 850μL）/ 150μL - 、採血試料を作製し、CSSのプロトコルを使用して患者血液サンプルから標準、CTC列挙上記で説明したように、準備測定器をロードします。準備機器によって要求されたら、カスタムマーカー追加を有効にするには、[ユーザーは、アッセイを定義しました 。入力マーカー名および[保存]を選択します。サンプルは、機器にロードされるように、オペレータは、必要に応じていいえを選択するかによって、カスタムマーカーを受け取るべきかを示すプロンプトが表示されます。
2。分析計測器上のユーザー定義マーカーのサンプルスキャン
- CSSを使用して患者血液サンプルから標準のCTC列挙の3.2節で説明したように、分析装置の電源を入れ、ランプを初期化し、品質管理とシステム検証を実行
- 分析装置にサンプルをロードし、[セットアップ ] タブを選択します。 FITCチャンネルを初期化するには、 試験プロトコル]セクションの下にキットのIDとしてCellSearch CTCを選択します。このメニューから、CTCの研究を選択し、[編集]ボタンをクリックし、必要に応じて露光時間を設定します。これは、CTCの識別に利用される他の蛍光チャンネルにブリードスルーを増やすことができますように、CSSのCTCキットを使用する際に1.0秒の露光時間を超えないことをお勧めします。
3。前臨床マウスモデルで使用するための標準CSSProtocolの適応
** Veridexマウス/ラットCellCaptureキットからの適用（もはや商業的に入手可能）
1。マウス採血および保管
- 採血前、0.5M EDTAを30μlのは、ハブ中のEDTA、少量を残して、前後に22 G針を通して〜を実行します。
- 以前同所、尾静脈、または心臓内経路を介してヒト腫瘍細胞を注射したマウスからマウスの血液を50μlの最小値を収集します。 （シリアルCTC分析用）伏在静脈から、または（端末のCTC分析用）心臓穿刺により血液を収集します。針を外し、1ミリリットルのEDTAマイクロテイ採血管に血液を分注する。血液の凝固を防ぐために、反転やそっとフリックチューブで混ぜる。血液はCytoChexセルラ防腐剤、等量の添加直後に処理されるか、最大48時間室温で保存することができる。
2。 CTCの濃縮
- 冷蔵庫からCSSの試薬を除去し、それらを使用する前に室温に加温することができます。
- 12ミリメートル×75ミリメートル、フローサイトメトリーチューブに全血50μlのと同等のものを転送します。チューブの両側に残っているいずれかの血液を下洗い、各サンプルに希釈緩衝液500μlを追加します。必要に応じて、短い遠心スピン残りの血液を採取するために使用することができる。
- 優しく抗EpCAM磁性流体を渦を直接試料にピペットの先端を配置することによって、各サンプルに25μlを加える。穏やかに混合するキャプチャ強化試薬と渦の25を添加する。 15分間、室温でサンプルをインキュベートする。
- 磁石へのサンプルチューブをセットし、10分間インキュベートする。サンプルチューブを磁石に残っている間に、慎重に次の磁石にチューブの壁に触れることなく残留液を吸引し、廃棄するようにガラスピペットを使用しています。
3。 CTC染色
- 核酸染料、染色試薬、抗マウスCD45-APC、抗ヒトHLA-アレクサフルーア488、および透過100μlを5.0μLの1.5μlを50μlを50μlの磁石を再懸濁からサンプルチューブを取り外す試薬。複数の試料については、これらの試薬は、予め混合してもよいし、混合物の206.5μlを各チューブに添加してもよい。穏やかに混合する渦暗所で室温で20分間インキュベートする。
- 希釈緩衝液500μlを加え、ボルテックス優しく、磁石への場所のサンプルチューブを、そして10分間インキュベートする。サンプルチューブを磁石に残っている間に、慎重に次の磁石にチューブの壁に触れることなく残留液を吸引し、廃棄するようにガラスピペットを使用しています。磁石からサンプルチューブを取り外し、希釈緩衝液350μlに懸濁します。渦を静かに混合する。
4。磁気デバイスのロード
- ゲルローディングチップを使用して、慎重に磁気デバイス内のカートリッジにサンプルチューブからボリューム全体を転送します。カートリッジの下部に起動し、サンプルが分配されるように、ゆっくりと先端を引き出す。
- サンプル全体が転送されると、緩く磁気デバイスカートリッジにキャップをし、切開の説明に従って、カートリッジの端に貼り付けられている任意の泡を解放するために手や実験台を用いた磁気デバイスをタップしますN CSSを使用して患者血液サンプルから標準のCTC列挙の3.1。
- ベベルとカートリッジの縁との間に、それらを捕捉することによって、滅菌22 G針を使用して、任意の気泡をポップします。すべての気泡が除去されていると、しっかりと、カートリッジにキャップを平らな磁気デバイスを置き、少なくとも10分間、暗所でインキュベートする。サンプルは準備の24時間以内にスキャンする必要があります。
5。分析計測器で手動で分離されたサンプルのスキャン
- 、分析装置の電源を入れ、ランプを初期化して、CSSのプロトコルを使用して患者血液サンプルから標準のCTC列挙の3.2節で説明したように、品質管理とシステムの検証を行う。
- 分析装置にサンプルをロードし、[セットアップ ] タブを選択します。 フォーマットのサンプルボタンをクリックすることにより、磁気デバイスのデータボタン上の既存のデータをクリアします。 FITCチャンネルAを使用可能にCSSを使用してユーザー定義のマーカーについて、CTCの特徴付けのセクション2.2で説明したようにND 1.0秒の露光時間を設定します。
- 患者の試験タブをクリックして入力するサンプル情報を編集]を選択します。 試験プロトコルとしてキットIDとCellSearch CTCとCTCの研究を選択します。入力アスタリスクとして示されているように、残りの必要な情報。サンプル情報を保存し、[開始]をクリックします。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
標準CTC列挙アッセイ
CSSの感度および特異性は、文献に記載されている。しかし、同等のCTCの回収を検証するために、スパイク（1,000たLNCaPヒト前立腺癌細胞）および健常ドナー由来のスパイクしていないヒトの血液サンプルは、標準的なCSSCTCプロトコルを使用して、CSSで処理した。予想されるように、スパイクしていないサンプルは、0.00±0.00％CTCの自由だった、とCTCの回収は、添加サンプル（図1A）のために86.9±4.71パーセントであることが実証された。スパイクサンプルから得られたCSSのギャラリー画像が最適な品質のものであり、CTCのは、非のCTCとの鑑別が容易であった。癌患者から得られた試料を処理する際しかしながら、CTCの同定は、多くの細胞のサイズが小さく現れると非CTCを（図1B）から容易に区別未満であると、わずかにより困難である。また、イベントの患者サンプルをレビュー6カテゴリが識別する、だった一般的にレビュー（図1C）との間に矛盾項目だったエド。これらの6カテゴリーが含まれ、（1）小型のCTC分類のための4ミクロンサイズの要件を満たしていませんでしたイベント、薄暗いCKおよび/ またはDAPI染色した（2）の項目、（3）正当化は、不当な対（CTCとしてカウントする必要があります） （CTCとしてカウントすべきではない）明るいCK-PE染色によって引き起こされる、CD45-APCチャネルに滲み出し、（4）、FITC +イベント（5）CKおよび/ またはDAPIチャネルにおけるピクセル化画像、及び（6）のイベントCK画像またはCK画像と> 50％と重ならないDAPI染色を有するものよりも大きいDAPI染色を有する。カテゴリの（2）、（5）特定の基準は、CTCの分類が存在する。カテゴリ（2）について、薄暗いCK / DAPIを持つアイテムは、無傷のCTC膜がCKチャネルで観察することができることを条件として分類することができる適切なサイズのDAPI画像が注目される。 任意ピクセレーションがCKチャネルにおいて観察された場合、カテゴリ（5）を、ピクセル化CK / DAPIを持つアイテムは、CTCのように分類することができない。しかし、ピクセレーションは、DAPIチャネルで受け入れられるには、それはあまりにも深刻ではないことを条件とする（ つまりイメージがありませんが、灰色の領域の背景に完全に白ではない-白い黒い背景に塗料としてヤンセン診断（旧Veridex）によって記載されている）（または拡散しなければならないまだ）形状に楕円形の現れとCK内に収まる。
ユーザー定義のマーカーアッセイ開発
ユーザ定義のマーカーについてのCTCを特徴付けるCSSの適応が厳格なコントロールと有意な後処理を必要とし、以前に記載されている16。原則として、任意のユーザ定義のマーカーの適切な最適化は、陰性コントロールは結果が特異的であることを確実にするために使用されることを必要とする。スパイクした試料の両方で処理される場合に最良の結果が得られる標的抗体の代わりに、前述のように単独の抗体希釈液との非特異的IgGコントロール。様々な目的の抗体濃度と暴露時間も評価して、ハイ、ロー、および不在（負の）抗原密度の細胞株を用いて検証する必要があります。アッセイは、標的抗原に対して高い感度および非特異的結合を16からの低バックグラウンドノイズの両方を示しているときに最適なプロトコル条件が達成される。
癌幹細胞マーカー、CD44を使用してこのワークアップの例は、ここに提示されている。このマーカーとの最初の試験は、ユーザ定義のマーカー開発のためのFITCチャネルを利用する（以下、従来のCTCキットと称する）は、標準CSS CTCキットを用いて開始した。従来のCTCキットを使用して、それは有意な最適化の後、CD44 +のサンプルを使用して69.3±2.67パーセントであったとして分類することができたCTCの最大数が1000 MDA-MB-468 HUMAでスパイクした、ことが示されたn個の細胞の大部分は、高いCD44の発現を示すことが知られている乳癌細胞（98.4±0.90％、フローサイトメトリーによって決定される）、このタンパク質（図2A）を発現する。これらの知見に基づいて、それは商業的に入手可能なCSSのCXCキットが改善された結果を生み出すかもしれないという仮説を立てた。このキットには、/でのCK8蛍光チャンネルを逆にして（〜10万抗原/細胞の密度でマーカーに最適化された）伝統的なCTCのキットと比較して低い抗原密度（〜5万抗原/細胞）とマーカーの改善された可視化を可能にする19分の18（伝統的に、PEチャンネルで表される）、対象となるユーザのマーカー（伝統的に、FITCチャネルで表される）26（従って、CXCキット以下の低抗原密度のCTCキットと呼ぶことにする）表現されます。重要な最適化の後、それはこの変化がCD44 + <として分類CTCの98.8±0.51％で、改善されたCD44染色のために許可されていることが示された/商標> 1.0μg/ mlの0.6秒（図2A）の露光時間の濃度のCD44-PEを用いて、任意のユーザ定義のマーカーの適切な最適化は、高い抗原密度を用いて検証を必要とする（MDA-MB-468）、低抗原密度（21 NT）、および目的のマーカーについて陰性（LNCaPs）細胞株（図2B）。
前臨床マウスモデルにおけるCTCの分析
適合マウスCSSプロトコルの感度および特異性を決定するために、（1,000たLNCaPヒト前立腺癌細胞）をスパイクし、スパイクしていないマウスの血液試料を手動で処理され、分析機器上で走査し、標準を用いて処理し、同じ細胞株を用いて得られた結果と比較した準備装置（図3A）での自動化されたCSSのプロトコル。予想されるように、スパイクしていないサンプルは、両方のアッセイを使用してCTCの自由だった0.00±0.00％と適合したマウスキット（90.8±5.18パーセント）を使用して、CTCの回復はSではなかった標準的な自動化システム（表し、p> 0.05 86.9±4.71パーセント）を使用して得られた結果からignificantly異なる。手動マウス適合プロトコルを使用して得られた画像は、HLA-FITCマーカーの付加を除いて、標準的な自動化された技術を用いて観察されるものと異ならなかった。また、マウス扁平上皮細胞は、HLA-FITC（図3B）のために積極的に染色されない。この技術はCTCの数が少ないの単離のための標準的なCSSプロトコルと同じくらい敏感であることを確認し、連続希釈スパイク血液サンプルを用いて行った、細胞の回復数に対する細胞数の期待値の相関関係は（図3C）を評価した。結果は、CTCを効果的にこのアッセイを用いて全血の5μlのcells/50の感度にまで回復することができることを実証している。これらの値は、R 2 = 0.99と予想された結果と相関していた。
図2。 CSSを使用してユーザー定義のマーカーのためのCTCの特性評価（A）CD44は、CSS上のCTCおよびCXCキットを使用して+と分類された細胞の割合（N = 3）。データは、平均±SEMとして提示されている。 *** =（P <0.0005）。（B）は著しく異なる健常人ドナー（7.5ミリリットル）からの血液の代表的なCSSのギャラリー画像は、抗1.5μg/ mlのとインキュベートした識別された細胞株からの〜千細胞とスパイク-CD44-PE、および0.2秒の露光時間でスキャンした。オレンジ色の四角は+ <CD44を示す/ SUP> CK + / DAPI + / CD45として特定のCTC、 - / CD44 - PE +が より大きな画像を見るにはここをクリックしてください。
図3。転移の前臨床マウスモデルにおいて使用するためのCSS手順の適応。（A）スパイクされた細胞数の割合として測定し、標準ヒトCSSプロトコルを用いて得られた結果と比較して、適合マウスCSSプロトコルを使用して、CTCの回収。細胞を血球計により計数し、〜千のLNCaPヒト前立腺癌細胞を、ヒト血液7.5mlのにスパイクした。スパイクされていないヒト血液試料を陰性対照として使用した（n = 3）であった。データは、平均±SEMとして提示されている。 NS =有意ではない。（B） （C）の分析。たLNCaPヒト前立腺癌細胞は、最初は血球計により計数し、続いて血液の液千〜腫瘍cells/50の濃度でマウスの血液にスパイクした。スパイクマウスの血液は、その後、連続的に5腫瘍cells/50μLの濃度に希釈し、マウスに適応するCSSプロトコルを使用して処理（N = 3）。た拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
| ユーザー定義マーカーが追加されたサンプルの＃ | 総Volu私は、試薬カップ（μL）に追加するには |
| 1 | 450 |
| 2 | 600 |
| 3 | 750 |
| 4 | 900 |
| 5 | 1050 |
| 6 | 1200 |
| 7 | 1350 |
| 8 | 1500 |
表1。ユーザー定義のマーカーでのサンプルの様々な数を処理するCSSの総量要件 ** Veridex白書（で入手可能：から適応。 http://www.veridex.com/pdf/CXC_Application_Guideline.PDF ）。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
2004年には、CSSが導入されて以来、多くの新しいCTC技術の開発にもかかわらず、この技術は、現在も市場で唯一の臨床的に承認の技術であるため、それは、CTCの検出および計数のための現在のゴールドスタンダードと考えられている。この原稿は、CSSが厳格な品質管理基準を有しているが、それが解釈バイアスの対象とし、患者サンプル中のCTC識別が添加サンプルの身分と大きく異なっていることができることを実証しました。一般的に矛盾した項目の6つのカテゴリーは、CTCの誤分類が発生する可能性がありますが同定された。これらの矛盾の項目は、本機で処理された各患者の試料に複数のレビューの必要性を強調している。また、CTCのを得られた患者に対してスパイクで観察された差異は、スパイクと患者の両方のサンプルで検証する、新しいCTCの技術の必要性があることを実証している。また、これらの新技術は、aがbなければならないEスパイクサンプルからの効率的なCTCキャプチャのみ必ずしも患者サンプル中のCTC捕獲効率を反映していないとしても、スパイクと患者サンプルの分割サンプルテストを使用して、ゴールドスタンダードのCSSに比べて。
CSSが収集したCTCの特徴付けを実行する能力を持っているが、それは非常に高度にカスタマイズ可能な最適化に関しては制限されています。一般に、ユーザ定義のマーカーの最適化のために、この器具に変更することができる唯一のパラメータは、抗体濃度およびフルオロフォアが水銀ランプに暴露される時間の長さである。 CSSのユーザー定義マーカーをアップ作業時の最適化については、この限られた容量は、問題を提示することができます。本稿で提案さOne溶液が（以前に16に詳細に記載）FITCおよび低抗原密度を有するマーカーのより良好な可視化を可能にするPE蛍光チャンネルを切り替える低抗原密度CTCキットの使用である。関係なくこのキットを利用する（伝統的または低抗原密度のCTCキット）の適切なマーカーの感度、特異性、および最適化を確実にするために行わなければならないいくつかの必要なステップがあります。まず、アッセイ感度は、ユーザの（目的のマーカーを発現する細胞集団の細胞の割合、すなわち ）の予想される検出レベルの決定を可能にするようなフローサイトメトリーならびに検証の方法に比較して評価されなければならない定義されたマーカー。第二に、アッセイは、様々なレベルの発現（ すなわち、高および低抗原密度）及びその特異性を有する細胞株における目的のマーカーを検出するその能力について評価しなければならないが、目的のマーカーについて陰性である細胞株で検証されなければならない。全ての場合において、全ての細胞株は、モーションを決定するために細胞のみの対照（無抗体を添加しない）、適切なIgGコントロール、および種々の濃度および暴露時間で、目的の抗体を用いて試験されなければならないユーザー定義のマーカーの最適化を保証するST適切な設定。しかしながら、CTCの特徴づけは、CSSで可能であるが、現在関心のある唯一のユーザ定義のマーカーが各試料で検討することができることを、システムが非常に起因する厳しい処理のダウンストリームアプリケーションへに関して制限されることに留意すべきであるサンプルの。
CTCの研究に利用されるユニークなベッドサイド·ツー·ベンチトップアプローチは、臨床の現場にこの有用なアッセイのクイック入力を可能にした。しかし、これらの希少な細胞の基礎生物学の不十分な理解をもたらした。そのため、がんのin vivoマウスモデルにおける前臨床におけるCTCの査定を可能にアッセイの開発と最適化が必要とされている。この原稿は、CTCのは、理想的には、シリアル、CTCの収集実験モデルに適したマウスの血液を50μlのボリュームで評価されるのを可能にするようになったCSSプロトコルについて説明します。この原稿Dこのプロトコルを使用して、CTCの列挙は自動および手動の分離技術の間のCTC捕獲効率に有意差で、伝統的なCTCのキットと組み合わせて、CSSを使用して得られた結果に匹敵することをemonstrates。また、このアッセイの開発中に、それが以前に文献25に記載されているように、認識された、そのマウス扁平上皮細胞の混入はCTCの正確な同定をより困難に、時には不可能にすることができる。適切にCTCのように割り当てられているため、この問題に対処するための、ユーザ定義のHLA-アレクサフルーア488のみをヒト細胞（ - - HLAアレクサフルーア488 + CK + DAPI + CD45が）ことを確認するには、このプロトコルに追加されました。これは、本稿で用いたLNCaP細胞株はHLAlowであり、したがってHLA-アレクサフルーア488は、様々なHLA発現と細胞株について滴定される必要があり得ることに留意することが重要である。我々は、HLA-アレクサフルオを追加したものの、rは我々のプロトコル488 CTCの正確な識別を確実にするために、マウス扁平上皮細胞の大部分が形態学によって容易に識別可能であり、細胞数が制限されたことは注目すべきである（0.33±0.24 events/50液であり、n = 9）。 （心臓穿刺を介した ）採血が困難であることが証明され、繰り返しの試行が必要であった場合、より高い細胞数（最大11 events/50μl）をのみ観察された。そこで我々は、所望であれば、CTCのオン·システム特徴付けはこのマーカーを省略することによって達成することができることを提案する。また、ここでは説明しないが、我々は以前にCSS 27,28を用いて実証されるようにし、CTCの他の方法を用いてCTCのさらに下流特徴付けの収集を容易に達成することができると予想している。
CSSを効果的に転移性の乳癌、前立腺癌および結腸直腸癌患者4,10,29の血液中のCTCを検出するために臨床的に使用されてきたが、いくつかのリチウムを有していないmitations。様々な転移性癌を有する患者の最大35％が、CTCのは、広範な全身性疾患30の存在にもかかわらず検出されない。検出の欠如は、上皮-間葉転換、癌の浸潤、転移を増強することが知られ、よく文書化されたプロセス、および全体的な攻撃性31の結果であると提案されている。この遷移は、例えばEpCAMの上皮マーカーの有意な減少、および間葉マーカー32の対応する増加と関連している。いくつかの研究は、最近、これらのCTCの間葉系マーカーの存在が予後不良の指標であり、これらの細胞の多くはCSS 24,33-38を使用して検出に必要となる、上皮マーカーの発現を欠いていることを実証した。これは、標準のCSS定義が最も積極的なCTCのいくつかが欠けていることを示唆。
記載さ制限があるにもかかわらず、それが目の予想されるこの原稿に記載された電子プロトコルは、CSS、小説のCTC技術の開発、ユーザー定義のマーカーの最適化、および生体内前臨床マウスモデルで使用して、CTCの生物学の理解の向上を使用して改善されたCTCの分析のための重要なツールとなります。まとめると、これらのプロトコルは、転移およびCTCのに関する前臨床および臨床研究に興味を持って、このプラットフォームのユーザーにとって有益なリソースを提供します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者（ALA）は、その親会社ジョンソン·エンド·ジョンソンはまた、この記事で使用した試薬や器具を生産ヤンセン診断LLCを所有ヤンセン腫瘍学、提供された資金を受け取った。
Acknowledgments
この作品は、癌研究のオンタリオ研究所（＃08NOV230）、イノベーションのためのカナダ財団（＃13199）、前立腺がんカナダ、ヤンセン腫瘍学、ロンドンリージョナルがんプログラム、およびジョンとドナブリストルからドナーの支援を通じてからの補助金によって支えられて（ALA）は、ロンドン健康科学財団。 LELは、フレデリック·バンティングとチャールズベストカナダ大学院奨学金博士賞でサポートされています。 α-リノレン酸は、CIHR新しい研究者賞と研究とイノベーションのオンタリオ州省からの早期リサーチャー賞でサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M EDTA | |||
| Anti-human CD44-FITC | BD Pharmigen | 555478 | |
| Anti-human CD44-PE | BD Pharmigen | 555479 | |
| Anti-human HLA-Alexa Fluor 488 | BioLegend | 311415 | |
| Anti-mouse CD45-APC | eBioscience | 17-0451-82 | |
| Bond Primary Antibody Diluent | Leica | AR9352 | |
| CellSave Preservative Tubes | Veridex | 952820 (20 pack) 79100005 (100 pack) | |
| CellSearch CTC Control Kit | Veridex | 7900003 | |
| CellSearch CTC Kit | Veridex | 7900001 | |
| CellSearch CXC Control Kit | Veridex | 7900018RUO | |
| CellSearch CXC Kit | Veridex | 7900017RUO | |
| Instrument Buffer | Veridex | 7901003 | |
| Streck Cell Preservative (aka CytoChex) | Streck | 213350 | |
| 1 ml Syringe | |||
| 10 ml Serological pipette | |||
| 1,000 µl Pipette | |||
| 1,000 µl Pipette tips | |||
| 12 mm x 75 mm Flow tubes | |||
| 200 µl Gel loading tips | |||
| 200 µl Pipette | |||
| 22 G Needle | |||
| 5 3/4 in Disposible Pasteur pipet | VWR | 14672-200 | |
| 5 ml Serological pipette | |||
| Automated pipettor | |||
| Capillary Blood Collection Tube (EDTA) | BD Microtainer | 365974 | |
| CellSearch Analyzer II | Veridex | 9555 | Includes magnests and verification cartirdges |
| CellSearch AutoPrep System | Veridex | 9541 | |
| Centrifuge | |||
| MagCellect Magnet | R&D Systems | MAG997 | |
| Small Latex Bulb | VWR | 82024-550 | |
| Vortex |
References
- Siegel, R., Naishadham, D., Jemal, A.
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nat. Rev. Cancer. 2 (8), 563-572 (2002).
- Pantel, K., Brakenhoff, R. H.
- Cristofanilli, M., Budd, G. T., et al. Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer. New Engl. J. Med. 351 (8), 781-791 (2004).
- De Bono, J. S., Scher, H. I., et al. Circulating tumor cells predict survival benefit from treatment in metastatic castration-resistant prostate cancer. Clin. Cancer Res. 14 (19), 6302-6309 (2008).
- Cohen, S. J., Ja Punt, C., et al. Prognostic significance of circulating tumor cells in patients with metastatic colorectal cancer. Ann. Oncol. 20 (7), 1223-1229 (2009).
- Hayes, D. F., Cristofanilli, M., et al. Circulating tumor cells at each follow-up time point during therapy of metastatic breast cancer patients predict progression-free and overall survival. Clin. Cancer Res. 12 (14), 4218-4224 (2006).
- Budd, G. T., Cristofanilli, M., et al. Circulating tumor cells versus imaging--predicting overall survival in metastatic breast cancer. Clin. Cancer Res. 12 (21), 6403-6409 (2006).
- Olmos, D., Arkenau, H. -T., et al. Circulating tumour cell (CTC) counts as intermediate end points in castration-resistant prostate cancer (CRPC): a single-centre experience. Ann. Oncol. 20 (1), 27-33 (2009).
- De Bono, J. S., Scher, H. I., et al. Circulating tumor cells predict survival benefit from treatment in metastatic castration-resistant prostate cancer. Clin. Cancer Res. 14 (19), 6302-6309 (2008).
- Allan, A. L., Keeney, M. Circulating tumor cell analysis: technical and statistical considerations for application to the clinic. J. Oncol. 2010, 426218 (2010).
- Lowes, L. E., Goodale, D., Keeney, M., Allan, A. L. Image cytometry analysis of circulating tumor cells. Methods Cell Biol. 102, 261-290 (2011).
- Lianidou, E. S., Markou, A. Circulating tumor cells in breast cancer: detection systems, molecular characterization, and future challenges. Clin. Chem. 57 (9), 1242-1255 (2011).
- Alix-Panabières, C., Pantel, K. Circulating tumor cells: liquid biopsy of cancer. Clin. Chem. 59 (1), 110-118 (2013).
- Parkinson, D. R., Dracopoli, N., et al. Considerations in the development of circulating tumor cell technology for clinical use. J. Transl. Med. 10, 138 (2012).
- Lowes, L. E., Hedley, B. D., Keeney, M., Allan, A. L. User-defined protein marker assay development for characterization of circulating tumor cells using the CellSearch system. Cytomet. A. 81 (11), 983-995 (2012).
- Fehm, T., Müller, V., et al. HER2 status of circulating tumor cells in patients with metastatic breast cancer: a prospective, multicenter trial. Breast Cancer Res. Treat. 124 (2), 403-412 (2010).
- Liu, Y., Liu, Q., et al. Circulating tumor cells in HER2-positive metastatic breast cancer patients: a valuable prognostic and predictive biomarker. BMC Cancer. 13, 202 (2013).
- Slamon, D. J., Leyland-Jones, B., et al. Use of chemotherapy plus a monoclonal antibody against HER2 for metastatic breast cancer that overexpresses HER2. New Engl. J. Med. 344 (11), 783-792 (2001).
- Marty, M., Cognetti, F., et al. Randomized phase II trial of the efficacy and safety of trastuzumab combined with docetaxel in patients with human epidermal growth factor receptor 2-positive metastatic breast cancer administered as first-line treatment: the M77001 study group. J. Clin. Oncol. 23 (19), 4265-4274 (2005).
- Slamon, D., Eiermann, W., et al. Adjuvant trastuzumab in HER2-positive breast cancer. New Engl. J. Med. 365 (14), 1273-1283 (2011).
- Welch, D. R. Technical considerations for studying cancer metastasis in vivo. Clin. Exp. Metast. 15 (3), 272-306 (1997).
- Goodale, D., Phay, C., Postenka, C. O., Keeney, M., Allan, A. L. Characterization of tumor cell dissemination patterns in preclinical models of cancer metastasis using flow cytometry and laser scanning cytometry. Cytometry A. 75 (4), 344-355 (2009).
- Gorges, T. M., Tinhofer, I., et al. Circulating tumour cells escape from EpCAM-based detection due to epithelial-to-mesenchymal transition. BMC Cancer. 12, 178 (2012).
- Eliane, J. -P., Repollet, M., et al. Monitoring serial changes in circulating human breast cancer cells in murine xenograft models. Cancer Res. 68 (14), 5529-5532 (2008).
- White Pages, V. eridex , Available from: http://www.veridex.com/pdf/CXC_Application_Guideline.PDF (2008).
- Flores, L. M., Kindelberger, D. W., et al. Improving the yield of circulating tumour cells facilitates molecular characterisation and recognition of discordant HER2 amplification in breast. 102 (10), 1495-1502 (2010).
- Sieuwerts, A. M., Kraan, J., et al. Molecular characterization of circulating tumor cells in large quantities of contaminating leukocytes by a multiplex real-time PCR. Breast Cancer Res. Treat. 118 (3), 455-468 (2009).
- Cohen, S. J., Ja Punt, C., et al. Relationship of circulating tumor cells to tumor response, progression-free survival, and overall survival in patients with metastatic colorectal cancer. J. Clin. Oncol. 26 (19), 3213-3221 (2008).
- Allard, W. J., Matera, J., et al. Tumor cells circulate in the peripheral blood of all major carcinomas but not in healthy subjects or patients with nonmalignant diseases. Clin. Cancer Res. 10 (20), 6897-6904 (2004).
- Thiery, J. P., Acloque, H., Huang, R. Y. J., Nieto, M. A. Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease. Cell. 139 (5), 871-890 (2009).
- Yang, J., Weinberg, R. A Epithelial-mesenchymal transition: at the crossroads of development and tumor metastasis. Dev. Cell. 14 (6), 818-829 (2008).
- Gradilone, A., Raimondi, C., et al. Circulating tumour cells lacking cytokeratin in breast cancer: the importance of being mesenchymal. J. Cell. Mol. Med. 15 (5), 1066-1070 (2011).
- Königsberg, R., Obermayr, E., et al. Detection of EpCAM positive and negative circulating tumor cells in metastatic breast cancer patients. Acta Oncol. 50 (5), 700-710 (2011).
- Kasimir-Bauer, S., Hoffmann, O., Wallwiener, D., Kimmig, R., Fehm, T. Expression of stem cell and epithelial-mesenchymal transition markers in primary breast cancer patients with circulating tumor cells. Breast Cancer Res. 14 (1), (2012).
- Mego, M., Mani, S. A., et al. Expression of epithelial-mesenchymal transition-inducing transcription factors in primary breast cancer: The effect of neoadjuvant therapy. Int. J. Cancer. 130 (4), 808-816 (2012).
- Yu, M., Bardia, A., et al. Circulating breast tumor cells exhibit dynamic changes in epithelial and mesenchymal composition. Science. 339 (6119), 580-584 (2013).
- Armstrong, A. J., Marengo, M. S., et al. Circulating tumor cells from patients with advanced prostate and breast cancer display both epithelial and mesenchymal markers. Mol. Cancer Res. 9 (8), 997-1007 (2011).
