Summary
Sirkulerende tumorceller (CTCs) er prognostisk i flere metastatisk kreft. Dette manuskriptet beskriver gullstandarden CellSearch system (CSS) CTC opplisting plattform og høydepunkter vanlige feilklassifisering feil. I tillegg er to tilpasset protokoller beskrevet for brukerdefinert markør karakterisering av CTCs og CTC oppregning i prekliniske musemodeller av metastasering ved hjelp av denne teknologien.
Abstract
Flertallet av kreftrelaterte dødsfall forekommer i etterkant av utviklingen av metastatisk sykdom. Denne svært dødelig sykdom trinn er forbundet med nærværet av sirkulerende tumorceller (CTCS). Disse sjeldne celler har vist seg å være av klinisk betydning i metastatisk brystkreft, prostatakreft og kolorektal kreft. Dagens gullstandard i klinisk CTC deteksjon og telling er FDA-ryddet CellSearch system (CSS). Dette manuskriptet skisserer standard protokoll benyttes av denne plattformen, samt to ekstra tilpasset protokoller som beskriver den detaljerte prosessen med brukerdefinert markør optimalisering for protein karakterisering av pasient CTCs og en tilsvarende protokoll for CTC-fangst på svært lave volumer av blod, ved hjelp av standard CSS reagenser, for å studere i vivo prekliniske musemodeller av metastasering. I tillegg forskjeller i CTC kvalitet mellom frisk donor blod tilsatt celler fra vev kultur versus pasient blod SAMPles er uthevet. Til slutt, er flere vanlige avvik elementer som kan føre til CTC feilklassifisering feil skissert. Til sammen vil disse protokollene gi en nyttig ressurs for brukere av denne plattformen interessert i preklinisk og klinisk forskning knyttet til metastasering og CTCs.
Introduction
I 2013 er det anslått at 580 350 personer vil dø av kreft og at 1.660.290 nye tilfeller av denne sykdommen vil bli diagnostisert i USA alene en. De fleste av disse dødsfallene skjer i etterkant av utviklingen av metastatisk sykdom to. Dagens mangel på effektive behandlingsformer i behandling av metastaser og en begrenset forståelse av metastatisk kaskade gjør dette stadiet av sykdommen svært dødelig. Tilstedeværelsen av sirkulerende tumorceller (CTCS) i blodet har blitt vist å korrelere med metastatisk sykdom 3.. Disse cellene er ekstremt sjeldne og deres oppdagelse er et tegn på total overlevelse i metastatisk brystkreft 4, prostata 5, og tykktarms 6 kreft. Hos disse pasientene ≥ 5 (bryst og prostata) eller ≥ 3 (kolorektal) CTCs i 7,5 ml blod er tilstedeværelsen av et tegn på dårligere prognose i forhold til pasienter med færre eller ingen påvisbare CTCs i same blodvolum. I tillegg, er endringen i CTC antall under eller etter terapeutisk intervensjon blitt vist å være nyttig som en prediktor for behandling respons, ofte raskere enn for tiden utnyttes teknikker 7-10.
Det har blitt anslått at i metastatiske kreftpasienter, CTCs inntreffer med en frekvens på omtrent 1 CTC per 10 5 -10 7 blod mononukleære celler og hos pasienter med lokalisert sykdom, kan denne frekvensen bli enda lavere (~ 1 i 10 8). Den sjeldne natur av disse celler kan gjøre det vanskelig å nøyaktig og pålitelig detektere og analysere CTCs 11.. Flere metoder (gjennomgått tidligere 12-14) er blitt anvendt for å berike og detektere disse cellene ved å utnytte egenskaper som skiller dem fra omkring blodkomponenter. Generelt er CTC oppregning en prosess i to deler som krever både en berikelse trinn, og en deteksjonstrinn. Tradisjonelt berikelse trinn avhengige forskjeller i PhysiCal egenskaper CTCs (celle størrelse, tetthet, formbarhet) eller på protein markør uttrykk (dvs. epithelial celleadhesjonsmolekylet [EpCAM], cytokeratin [CK]). Etter anrikning kan CTC deteksjon utføres på en rekke forskjellige måter, den mest vanlige av disse er nukleinsyre-baserte analyser og / eller cytometriske metoder. Hver av disse strategiene er unike, har klare fordeler og ulemper, men de alle mangler standardisering, en nødvendighet for inngangen til klinisk setting. Den CellSearch system (CSS) ble derfor utviklet for å gi en standardisert metode for påvisning og telling av sjeldne CTCs i menneskelig blod ved hjelp av fluorescens mikroskopi og antistoffbaserte teknikker 4-6. Denne plattformen er for tiden regnet som gullstandarden i CTC oppregning og er den eneste teknikken godkjent av US Food and Drug Administration (FDA) for bruk i klinikken 15.
CSS er en to-komponent plattform consisting, (1) den CellTracks AutoPrep system (heretter referert til som preparat instrument), som automatiserer fremstilling av humane blodprøver, og (2) den CellTracks Analyzer II (heretter referert til som analyseapparatet), som skanner disse prøver følgende forberedelser. For å skille CTCs forurenser leukocytter utarbeidelse instrument sysselsetter et antistoff mediert, ferrofluid basert magnetisk separasjon tilnærming og differensial fluorescensbeising. I utgangspunktet etiketter systemet CTCs bruker anti-EpCAM antistoffer konjugert til jern nanopartikler. Prøven blir deretter inkubert i et magnetisk felt, og alle umerkede celler blir aspirert. Valgte tumorceller blir resuspendert og inkubert i en differensial fluorescens beis, som består av fluorescensmerket-merkede antistoffer og en nukleær farging reagens. Til slutt blir prøven overført til en magnetisk patron, kalt en MagNest (heretter referert til som den magnetiske enhet), og scanned ved hjelp av analyseinstrumentet.
Analysen instrument blir brukt til å skanne preparerte prøver ved bruk av forskjellige fluorescens-filtre, hvert er optimalisert til passende fluorescerende partikler, ved hjelp av et 10X objektiv. CTCs er identifisert som celler som er bundet av anti-EpCAM, anti-pan-CK-fysoerytrin (PE) (CK8, 18, og 19), og den kjernefysiske beis 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Omvendt er forurensende leukocytter identifisert som celler som er bundet ved anti-CD45-allophycocyanin (APC) og DAPI. Etter skanning, er datadefinerte potensielle kreftceller presenteres for brukeren. Fra disse bildene, må brukeren benytte kvalitativ analyse ved hjelp av de definerte parametere og differensialfarging diskutert ovenfor for å bestemme hvilke hendelser er CTCs.
I tillegg til å gi en standardisert metode for CTC oppregning, gjør at CSS for molekylær karakterisering av CTCs basert på protein markører av interesse. Dette avhør cen bli utført på enkeltcelle-nivå, ved hjelp av et fluorescein isothiocyanat (FITC) fluorescens-kanalen ikke er nødvendig for identifikasjon CTC 16.. Selv om denne plattformen gir kapasitet for molekylær karakterisering, den detaljerte prosessen med protokoll utvikling og optimalisering er ikke godt definert. Tre kommersielt tilgjengelige markører er blitt utviklet av fabrikanten for anvendelse med CSS, inkludert epidermal vekstfaktorreseptor (EGFR), human epidermal vekstfaktor-reseptor-2 (HER2) og insulin-lignende vekstfaktor-1-reseptor (IGF-1R). HER2 analyse, i kombinasjon med CSS, har blitt benyttet av flere grupper for å illustrere potensialet for CTC karakterisering å informere kliniske beslutninger og å potensielt endre eksisterende retningslinjer for behandling. For eksempel, Fehm et al. 17 viste at om lag en tredel av brystkreftpasienter med HER2-primære svulster hadde HER2 + CTCs. I tillegg, Liu et al.18 nylig rapportert at opptil 50% av pasienter med henne + metastatisk brystkreft ikke har HER2 + CTCs. Herceptin, en HER2 reseptor forstyrrer monoklonalt antistoff viste til stor nytte pasienter med tumorer uttrykke tilstrekkelig nivå av HER2, er en ofte benyttet behandling for pasienter med HER2 + primære svulster 19-21. Men disse studiene tyder på at Herceptin kan være sub-optimalt utnyttet og at CTC karakterisering kan hjelpe til å forutsi behandlingsrespons. I siste instans kan CTC karakterisering har potensial til å forbedre personlig omsorg.
CTC forskning er unik i at det har i stor grad benyttet en sengekanten-til-bord tilnærming. Denne metoden, i motsetning til stasjonære maskiner til sengen forskning, noe som ofte kan ta år å påvirke pasientbehandlingen, har tillatt CTCs rask inntreden i klinisk setting. Men leger er nølende til å bruke resultater fra CTC analyse i pasientbehandling beslutningsing på grunn av en manglende forståelse av deres underliggende biologi. Derfor egnede prekliniske musemodeller av metastasering og utfyllende CTC analyseteknikker må utnyttes for å undersøke disse utestående spørsmålene. Generelt er det to typer av prekliniske modeller som brukes for å studere metastatisk kaskade, (1) spontan metastase modeller, som gir mulighet for studiet av alle trinnene i den metastatisk kaskade, og (2) eksperimentelle metastase modeller, som kun tillater studiet av de senere trinn i prosessen slik som metastatisk ekstravasasjon og sekundær tumordannelse 22.. Spontane metastase modeller, involvere tumorcelle injeksjoner i egnede ortotopiske steder (f.eks injeksjon av prostata kreft celler i prostatakjertelen for studiet av prostatakreft). Celler blir deretter gitt tid til å danne primære tumorer og spontant metastasere til sekundære steder som ben, lunge, og lymfeknuter. Ikontrast, eksperimentelle metastase modeller bære direkte injeksjon av kreftceller i blodet (f.eks via halen blodåre eller intrakardiell injeksjon for å målrette celler til bestemte steder), og dermed hoppe over de første trinnene av intravasation og formidling til sekundære organer 22. Så langt de fleste av CTC analyse i in vivo modellsystemer har blitt utført ved hjelp av enten cytometry-baserte 23 eller tilpasset menneskebasert CTC teknikker (f.eks AdnaTest) 24. Selv nyttig, ingen av disse teknikkene tilstrekkelig reflektere CTC oppregning hjelp gullstandarden CSS. Basert på klinisk godkjenning, standardisert natur, og utbredt bruk av CSS, vil utviklingen av en CTC-fangst og påvisning teknikk for in vivo modellering som benytter tilsvarende prøveopparbeidelse, prosessering, og identifikasjonskriterier være en fordel som resultatene ville være sammenlignbare med de hentet fra pasientprøver. Imidlertid, på grunn av volumet requirements i preparatet instrumentet er det ikke mulig å bearbeide små mengder blod ved hjelp av denne automatiske plattformen. . I tillegg har tidligere arbeidet ved Eliane et al 25 viste at forurensning av prøver med musen epitelceller (som også oppfyller standarden CTC definisjon [EpCAM + CK + DAPI + CD45 -]) kan føre til feilklassifisering av mus squamous epitelceller som CTCs. For å løse disse problemene en tilpasset teknikk som gjør at utnyttelse av CSS CTC kitreagenser kombinert med en manuell isolasjon prosedyren ble utviklet. Tilsetningen av et FITC-merket humant leukocyttantigen (HLA) antistoff til analysen tillater humane tumorceller som skal skilles fra mus squamous epitelceller.
Dette manuskriptet beskriver standard, kommersielt utviklet og optimalisert CSS protokoll for behandling av pasientblodprøver og vanlige fallgruvene som kan oppstå, inkludert discrepant elementer som kan føre til CTC feilklassifisering feil. I tillegg blir tilpasning av CSS analyse for å undersøke brukerdefinerte protein karakteristikker av fangede CTCs og en tilsvar innrettet CSS teknikk som gjør det mulig for anriking og påvisning av CTCs fra små volumer av blod i prekliniske musemodeller av metastasering beskrevet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle studier på mennesker som er beskrevet i dette manuskriptet ble utført under protokoller godkjent av Western University Human forskningsetikk Board. Alle Dyrestudier ble utført i tråd med anbefalingene fra den kanadiske rådet på Animal Care under protokoller godkjent av Western University Animal Bruk Subcommittee.
En. Standard CTC Enumeration fra Pasientblodprøver ved hjelp av CSS
En. Human Blood Prøvetaking og klargjøring for prosessering på Forberedelse Instrument
- Ved anvendelse av standard aseptiske teknikker phlebotomy, tegne et minimum av 8,0 ml humant blod inn i en 10 ml CellSave røret (i det følgende referert til som CTC konserverings rør), som inneholder etylendiamintetraeddiksyre (EDTA), og en egencellekonserveringsmiddel. Snu røret 5x å hindre blodet fra clotting. Prøver kan bli behandlet umiddelbart eller lagres ved romtemperatur i opp til 96 timer.
- Løsnee CSS reagenser fra kjøleskapet og la dem varmes opp til romtemperatur før bruk.
- Ved hjelp av en disponibel 10 ml pipette og automatisert pipettor, samle 7,5 ml blod fra CTC konserverings tube og sakte dispensere blod inn i en hensiktsmessig merket forberedelse instrument behandling tube.
- Til 6,5 ml fortynningsbuffer til hver prøve. Bland ved å snu prøve 5x. Sentrifugeprøve ved 800 xg i 10 min med bremsen i "av"-stilling. Følg instruksjonene på forberedelse instrument på skjermen for å laste inn alle pasientprøvene til systemet for behandling. Prøvene må behandles innen en time med forberedelser.
2. Kontroll Forberedelse for prosessering på Forberedelse Instrument
- Forsiktig vortex kontrollflaske og invertere 5x å blande.
- Fjern forsiktig hetten fra kontrollflaske og plassere en invertert forberedelse instrument behandling rør på toppen av Uncapped hetteglass. I en rask bevegelse, inverterekontrollere hetteglass, og hell innholdet i behandlingen tube. Mens invertert, knips forsiktig sidene av styre vial for å løsne eventuelle gjenværende innhold.
- Fjern forsiktig invertert kontrollflaske fra behandlingen røret, slik at ingen væske er tapt og legg til side. Ved hjelp av en 1000 mL pipette, samle eventuelle gjenværende innholdet fra hetteglasset og lokket og forsiktig pipette inn behandlingen tube.
- Følg instruksjonene på forberedelse instrument på skjermen for å laste kontroll på systemet for behandling.
Tre. Sample Scanning på analyseinstrumentet
- Følg instruksjonene på forberedelse instrument på skjermen for å losse alle prøvene fra systemet. Løst cap hver magnetisk enhet kassetten og trykk på magnetisk enhet ved hjelp av hender eller lab benken for å slippe eventuelle bobler som er klistret til kantene av kassetten. Når alle boblene er fjernet, fast cap patronen, lå det magnetiske enhet flat, og jegncubate i mørke i minst 20 min ved romtemperatur. Prøvene må skannes innen 24 timers forberedelse.
- Slå på analyseinstrumentet og initial lampen. En gang varmet (~ 15 min), laste system verifisering patron på analyseinstrumentet og velg Test kategorien QC. Følg instruksjonene på skjermen for å utføre de nødvendige kvalitetskontroll tiltak.
- Legg i en prøve på analyseinstrumentet og velg pasienttest kategorien. All lagret informasjon fra utarbeidelse instrumentet vil bli vist. Klikk Start for å initialisere prøven skanning. Systemet vil utføre en grov og kantdeteksjon på magnetenheten patronen.
- Juster alle kanter etter behov ved hjelp av retningstastene. Velg Godta. Systemet vil utføre en fin fokus og begynne å sample scanning.
- Etter kontroll skanning resultatene skal valideres ved hjelp av definerte kriterier for celler piggete på høy (CK + DAPI + CD45 - APC +) og lav (CK + DAPI + CD45 - FITC +)-konsentrasjoner. Etter pasientprøve skanning resultatene bør gjennomgås for fangede CTCs bruker de definerte CTC kriteriene (CK + DAPI + CD45 -).
2. CTC Karakterisering for brukerdefinerte Markører ved hjelp av CSS
En. Utarbeidelse av brukerdefinerte markører og Instrument initialisering
- Fortynn antistoffet av interesse ved hjelp av Bond primær antistoff fortynningsmiddel til ønsket konsentrasjon i en markør reagens koppen ved hjelp av følgende formel, der arbeider konsentrasjon er konsentrasjonen av antistoffet etter tilsetning til prøven og lager-konsentrasjon er den konsentrasjon av antistoff i reagens cup. Til flere prøver, justere antistoffmengder som beskrevet i tabell 1. Plasser markøren reagens cup i posisjon 1 i reagensforpakningen og lOAD kassetten på CSS.
Stock Konsentrasjon = (Arbeide Konsentrasjon x 850 mL) / 150 mL - Samle blod, forberede prøver, og laste forberedelse instrumentet som beskrevet i ovennevnte Standard CTC Enumeration fra Pasientblodprøver ved hjelp av CSS-protokollen. For å muliggjøre tilpasset markør tillegg, velger du Brukerdefinert analysen når du blir bedt om utarbeidelse instrument. Input markøren navn og velg Lagre. Som prøvene er lastet inn i instrumentet, vil operatøren bli bedt om å angi hvilke bør få tilpasset markør ved å velge Ja eller Nei som nødvendig.
2. Sample Scanning av brukerdefinerte markører på analyseinstrumentet
- Slå på analyseinstrumentet, initial lampen, og utføre kvalitetskontroll og systemverifikasjon som beskrevet i punkt 3.2 i Standard CTC Enumeration fra Pasientblodprøver ved hjelp av CSS
- Legg i en prøve på analyseinstrumentet og velg kategorien Oppsett. For å initialisere FITC kanal, velger CellSearch CTC som Kit ID under Test Protokoller delen. Fra denne menyen, velg CTC Research, klikk på Rediger-knappen og stille inn eksponeringstiden som ønsket. Det anbefales at en eksponeringstid på 1,0 sek ikke overskrides ved bruk av CSS CTC kit da dette kan øke bleed-through i andre fluorescerende kanaler benyttes for CTC identifikasjon.
Tre. Tilpasning av Standard CSSProtocol for bruk i Preklinisk musemodeller
** Tilpasset fra Veridex Mus / Rotte CellCapture Kit (ikke lenger kommersielt tilgjengelig)
En. Mus Blodprøvetaking og Lagring
- Før blodsamling, løpe ~ 30 pl av 0,5 M EDTA og tilbake gjennom en 22 G nål, og etterlater en liten mengde av EDTA i navet.
- Samle minst 50 mL av mus blod fra mus tidligere injisert med humane tumorceller via ortotopiske, hale vene, eller intrakardiale ruter. Samle blod fra vena saphena magna (for seriell CTC-analyse), eller ved hjertepunktur (for terminal CTC-analyse). Fjern nål og dispensere blod inn i en 1 ml EDTA microtainer blodprøverøret. Bland ved inversjon eller forsiktig flick røret for å hindre blodet fra clotting. Blod kan behandles umiddelbart eller lagres ved romtemperatur i opp til 48 timer etter tilsetning av et likt volum CytoChex cellekonserveringsmiddel.
2. CTC Enrichment
- Fjern CSS reagenser fra kjøleskapet og la dem varmes opp til romtemperatur før bruk.
- Overfør den tilsvarende 50 pl fullblod til et 12 mm x 75 mm flowcytometri rør. Til 500 mL av fortynningsbuffer til hver prøve, vasket ned noe blod som forblir på hver side av røret. Hvis det er nødvendig, en kort sentrifuge spinkan brukes til å samle opp eventuelt gjenværende blod.
- Forsiktig vortex anti-EpCAM ferrofluid og tilsett 25 pl av hver prøve ved å plassere spissen av pipetten direkte inn i prøven. Legg 25 mL av Capture Enhancement reagens og virvle forsiktig for å blande. Inkuber prøvene ved romtemperatur i 15 min.
- Plasser prøverør inn i magneten, og inkuber i 10 min. Når prøverørene fremdeles er i magneten, bruker en glass pipette til å aspirere nøye rest væske uten å berøre veggen av røret ved siden av magneten og kastes.
Tre. CTC Farging
- Fjern prøverørene fra magneten og resuspender i 50 mL av nukleinsyre Dye, 50 mL av Farging Reagens, 1,5 mL av anti-mus CD45-APC, 5,0 mL av anti-human HLA-Alexa Fluor 488, og 100 mL av Permeabilization Reagens. Til flere prøver, kan disse reagensene være forhåndsblandet og 206,5 ul av blandingen kan tilsettes til hvert rør. Vortex forsiktig for å blandeog inkuberes i 20 min ved romtemperatur i mørke.
- Til 500 mL av fortynningsbuffer, vortex forsiktig, place prøverør inn i magneten, og inkuber i 10 min. Når prøverørene fremdeles er i magneten, bruker en glass pipette til å aspirere nøye rest væske uten å berøre veggen av røret ved siden av magneten og kastes. Fjern prøverørene fra magneten og resuspender i 350 ul fortynningsbuffer. Vortex forsiktig for å blande.
4. Magnetisk Device Loading
- Ved hjelp av en gel lasting tips, nøye overføre hele volumet fra prøverøret inn i en patron i det magnetiske enhet. Starter på bunnen av ampullen og langsomt trekke spissen som prøven er dispensert.
- Når hele prøven er overført, løst cap magnetisk enhet kassetten og trykk den magnetiske enheten ved hjelp av hender eller lab benken for å slippe eventuelle bobler som er klistret til kantene av patronen som beskrevet i seksjonn 3,1 av Standard CTC Enumeration fra Pasientblodprøver ved hjelp av CSS.
- Pop noen bobler ved hjelp av en steril 22 G nål ved å fange dem mellom skrå og kanten av patronen. Når alle boblene er fjernet, fast cap patronen, lå det magnetiske enhet flat, og inkuberes i mørke i minst 10 min. Prøvene må skannes innen 24 timers forberedelse.
5. Skanning av manuelt Separerte Prøver på analyseinstrumentet
- Slå på analyseinstrumentet, initial lampen, og utføre kvalitetskontroll og systemverifikasjon som beskrevet i punkt 3.2 i Standard CTC Enumeration fra Pasientblodprøver ved hjelp av CSS-protokollen.
- Laste prøven på analyseinstrumentet og velg kategorien Oppsett. Fjern eventuelle eksisterende data på magnetenheten data-knappen ved å klikke Format Sample knappen. Aktiver FlTC kanalen ennd sette eksponeringstiden til 1,0 sek som beskrevet i punkt 2.2 i CTC Karakterisering for brukerdefinerte Markører ved hjelp av CSS.
- Klikk på pasienttest fanen og velg Rediger for å legge inn eksempelinformasjon. Velg CellSearch CTC som Kit-ID og CTC Forskning som testprotokollen. Input de resterende nødvendig informasjon som er angitt som stjernen. Lagre prøveinformasjon og klikk Start.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Standard CTC Enumeration analysen
Sensitiviteten og spesifisiteten av CSS er godt dokumentert i litteraturen. Men for å validere tilsvar CTC utvinning, piggete (1000 LNCAP menneskelig prostata kreft celler) og unspiked humane blodprøver fra friske frivillige givere ble behandlet på CSS ved hjelp av standard CSSCTC protokollen. Som forventet, unspiked prøvene var fri for CTCs, 0,00 ± 0,00%, og CTC utvinning ble vist å være 86,9 ± 4,71% for piggete prøver (Figur 1a). CSS galleribilder hentet fra piggete prøvene var av optimal kvalitet og CTCs var lett å skille fra ikke-CTCs. Imidlertid, ved behandling av prøver hentet fra cancerpasienter, er identifisering av CTCs litt mer utfordrende, med mange celler vises mindre i størrelse og er mindre lett skjelnes fra ikke-CTCs (figur 1B). I tillegg, når vi vurderer pasientprøver seks kategorier av hendelsene var identified som var ofte avvikende elementer mellom anmeldere (figur 1C). Disse seks kategoriene inkludert, (1) små hendelser som ikke oppfyller kravet om fire mikrometer størrelse for CTC klassifisering, (2) elementer med dim CK og / eller DAPI farging, (3) rettferdiggjort (som skal regnes som en CTC) versus uberettiget (bør ikke regnes som en CTC) blø gjennom i CD45-APC kanal forårsaket av lys CK-PE flekker; (4) FITC + hendelser; (5) pixelated bilder i CK og / eller DAPI kanaler, og (6) hendelser med DAPI farging som er større enn CK bilder eller de med DAPI flekker som ikke overlapper> 50% med CK bilde. For kategoriene (2) og (5) bestemte kriterier finnes for CTC klassifisering. For kategori (2), kan elementer med dim CK / DAPI bli klassifisert som CTCs forutsatt at en intakt membran kan observeres i CK-kanal og enpassende størrelse DAPI bilde er angitt. For kategori (5), elementer med pixelated CK / DAPI ikke kan klassifiseres som CTCs hvis noen pikselering er observert i CK-kanalen. Imidlertid er piksele akseptabelt i DAPI kanalen forutsatt at det ikke er for alvorlig (dvs. bildet er helt hvitt på en bakgrunn, ingen gråsoner - beskrevet av Janssen Diagnostics (tidligere Veridex) som hvit maling på svart bakgrunn) må eller diffus ( fortsatt vises oval i formen og passer i de CK).
Brukerdefinerte Marker analysen utvikling
Tilpasning av CSS for å karakter CTCs for brukerdefinerte markører krever betydelig arbeid opp med strenge kontroller, og har blitt beskrevet tidligere 16. Som en generell regel, riktig optimalisering av alle brukerdefinerte markør krever at negative kontroller brukes for å sikre at resultatene er bestemt. De beste resultater oppnås når piggete prøvene behandles med bådeen ikke-spesifikk IgG-kontroll på plass av target-antistoff og med antistoffet fortynningsmiddelet alene som tidligere beskrevet. Ulike konsentrasjoner target antistoff og eksponeringstider bør også bli vurdert og validert ved hjelp av cellelinjer med høye, lave, og fraværende (negative) antigen tettheter. Optimale protokollforhold oppnås når analysen viser både høy følsomhet for mål-antigenet og lav bakgrunnsstøy fra ikke-spesifikk binding 16.
Et eksempel på denne opparbeidelse ved hjelp av en kreft stamcelle markør, CD44, er presentert her. Innledende prøving med denne markør begynte å bruke standard CSS CTC kit (heretter referert til som den tradisjonelle CTC kit), som benytter FITC-kanalen for bruker-definerte markør utvikling. Bruke den tradisjonelle CTC kit, ble det vist at, etter betydelig optimalisering, var det maksimale antallet CTCs som kunne klassifiseres som CD44 + 69,3 ± 2,67% ved bruk av prøver tilsatt 1000 MDA-MB-468 Human brystkreft celler, kjent for å demonstrere høy CD44 uttrykk med flertallet av celler (98,4 ± 0,90%, som bestemmes av flowcytometri) uttrykker dette proteinet (Figur 2A). Basert på disse funnene det ble antatt at den kommersielt tilgjengelige CSS CXC kit kan gi bedre resultater. Dette settet gir forbedret visualisering av markører med en nedre antigen densitet (~ 50000 antigener / celle), sammenlignet med den tradisjonelle CTC kit (optimalisert for markører med en tetthet på ~ 100000 antigener / celle), ved å reversere den fluorescens-kanalen hvori CK8 / 18/19 (tradisjonelt representert i PE kanalen) og brukerens markøren av interesse (tradisjonelt representert i FITC-kanalen) er representert (derfor i det følgende til CXC kit vil bli referert til som den lave antigen densitet CTC kit) 26. Etter vesentlig optimalisering, ble det demonstrert at denne forandring er tillatt for forbedret CD44 farging, med 98,8 ± 0,51% av CTCs klassifisert som CD44 + </ Sup> ved hjelp av CD44-PE ved en konsentrasjon på 1,0 pg / ml og en eksponeringstid på 0,6 sekunder (figur 2A). Passende optimalisering av enhver brukerdefinert da også krever validering med høy antigen densitet (MDA-MB-468), lav antigen tetthet (21 NT), og negative (LNCaPs) cellelinjer for markør av interesse (figur 2B).
CTC Analyse i Preklinisk musemodeller
For å bestemme sensitiviteten og spesifisiteten til det tilpassede mus CSS-protokollen, piggete (1000 LNCaP human prostatacancerceller) og unspiked museblodprøver ble bearbeidet manuelt og skannet i analyseinstrumentet og sammenlignet med resultatene oppnådd ved anvendelse av den samme cellelinje behandlet ved hjelp av standard automatisert CSS-protokollen om utarbeidelse instrument (figur 3A). Som forventet, unspiked prøvene var fri for CTCs bruker begge analysene, 0,00 ± 0,00% og CTC utvinning ved hjelp av tilpasset muse kit (90,8 ± 5,18%) var ikke significantly forskjellig fra resultatene som er oppnådd ved bruk av standard automatisert system (86,9 ± 4,71%, p> 0,05). Bilder fremstilt ved hjelp av den manuelle mus tilpasset protokollen var ikke forskjellig fra de som ble observert ved bruk av standard automatisert teknikk, med unntak av at tilsetningen av HLA-FITC markør. I tillegg trenger mus squamous epitelceller ikke flekker positivt for HLA-FITC (Figur 3B). For å bekrefte at denne teknikken var like følsom som standard CSS protokoll for isolering av lavt antall CTCs ble seriefortynning utført med piggete blodprøver, og den forventede korrelasjon av antall celler versus gjenvunnet antall celler ble bestemt (figur 3C). Resultatene demonstrerer at CTCs kan effektivt gjenvinnes ned til en sensitivitet på 5 cells/50 ul helt blod ved hjelp av denne analysen. Disse verdiene korrelerte med forventede resultater med en r 2 = 0,99.
Figur 2. Karakterisering av CTCs for brukerdefinerte markører ved hjelp av CSS. (A) Andel av celler klassifisert som CD44 + ved hjelp av CTC og CXC kits på CSS (n = 3). Dataene er presentert som gjennomsnitt ± SEM. *** = Signifikant forskjellig (P <0,0005). (B) Representative CSS galleri bilder av blod fra en frisk frivillig donor (7,5 ml), tilsatt ~ 1 000 celler fra den identifiserte cellelinje, inkubert med 1,5 ug / ml av anti -CD44-PE, og skannes i en eksponeringstid på 0,2 sek. Orange firkantene indikerer CD44 + </ Sup> CTCs, identifisert som CK + / DAPI + / CD45 - / CD44 -. PE + Klikk her for å se større bilde.
Figur 3. Tilpasning av CSS fremgangsmåte for anvendelse i prekliniske musemodeller av metastasering. (A) CTC utvinning ved hjelp av tilpasset mus CSS protokoll målt som en prosent av antall tilsatte celler og sammenlignet med resultater oppnådd ved hjelp av standard human CSS-protokoll. Cellene ble talt ved hemocytometer og ~ 1000 LNCaP human prostatacancerceller ble tilsatt i 7,5 ml av humant blod. Unspiked humane blodprøver ble anvendt som en negativ kontroll (n = 3). Dataene er presentert som gjennomsnitt ± SEM. ns = ikke signifikant. (B) (C) Analyse av korrelasjon og lineær regresjon av forventet versus gjenvunnet antall piggete kreftceller på ulike konsentrasjoner . LNCaP humane prostatacancerceller ble først tellet ved hemocytometer, og deretter tilsatt i mus blodet i en konsentrasjon på ~ 1000 tumor cells/50 ul blod. Spiked mus blod ble deretter serie fortynnes til en konsentrasjon på 5 svulst cells/50 ul og behandlet ved hjelp av musen tilpasset CSS-protokollen (n = 3). Klikk her for å se større bilde.
| # Av Prøver med brukerdefinert Marker inn | Totalt Volumeg for å legge til Reagens Cup (mL) |
| 1 | 450 |
| 2 | 600 |
| 3 | 750 |
| 4 | 900 |
| 5 | 1050 |
| 6 | 1200 |
| 7 | 1350 |
| 8 | 1500 |
Tabell 1. . Totalt volum krav til CSS ved behandling av ulike antall prøver med et brukerdefinert markør ** Tilpasset fra Veridex White Paper (tilgjengelig på: http://www.veridex.com/pdf/CXC_Application_Guideline.PDF ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Til tross for utviklingen av mange nye CTC teknologier siden innføringen av CSS i 2004, er denne teknikken fortsatt den eneste klinisk godkjent teknologien på markedet i dag, og derfor er det anses dagens gullstandard for CTC deteksjon og telling. Dette manuskriptet har vist at selv om CSS har strenge kvalitetskontroll standarder kan det være gjenstand for fortolkning skjevhet og at CTC identifikasjon i pasientprøver er mye forskjellig fra identifikasjon i piggete prøver. Det ble identifisert seks kategorier av allment avvik elementer som kan føre til CTC feilklassifiseringer å skje. Disse avvikende elementer aktualiserer behovet for flere lesere på hver pasientprøve behandlet på dette instrumentet. I tillegg er forskjellene som observeres i piggete versus pasient innhentet CTCs viser at det er en nødvendighet for alle nye CTC teknologier for å bli validert i både piggete og pasientprøver. I tillegg må disse nye teknologier be forhold til gullstandarden CSS ved hjelp av delt prøvetesting av både piggete og pasientprøver, som effektiv CTC-fangst fra piggete prøver bare ikke nødvendigvis CTC fangst effektivitet i pasientprøver.
Selv om CSS har evnen til å utføre karakterisering av fanget CTCs, er det ganske begrenset med hensyn til svært tilpasses optimalisering. Generelt er de eneste parametere som kan endres på dette instrument for optimalisering av brukerdefinerte markører er antistoffkonsentrasjonen, og hvor lang tid at fluoroforen er utsatt for kvikksølvlampe. Dette begrenset kapasitet for optimalisering kan presentere problemer når man jobber opp brukerdefinerte markører på CSS. En løsning som foreslås i dette manuskriptet (beskrevet i detalj tidligere 16) er bruken av den lave antigen densitet CTC kit som slår FITC-og PE-fluorescerende kanaler som åpner for bedre visualisering av markører med lav antigen-tetthet. Uavhengighvorav kit utnyttes (tradisjonell eller lav antigen tetthet CTC kit) er det flere nødvendige skritt som må foretas for å sikre hensiktsmessig markør sensitivitet, spesifisitet, og optimalisering. For det første må assayfølsomhet vurderes i forhold til en brønn validert metode, slik som strømningscytometri, som vil tillate bestemmelse av det forventede deteksjonsnivå (dvs. prosentandelen av celler i cellepopulasjonen som uttrykker markøren av interesse) for den bruker definert markør. For det andre må analysen bli vurdert for sin evne til å påvise markøren av interesse i cellelinjer med ulike nivåer av ekspresjon (dvs. høye og lave antigen tettheter) og dets spesifisitet må valideres i en cellelinje som er negative for den markør av interesse . I alle tilfeller må alle cellelinjer testes ved hjelp av et celler bare kontroll (uten antistoff tilsatt), passende IgG-kontroll, og antistoffet av interesse i forskjellige konsentrasjoner og eksponeringstider for å bestemme most riktige innstillinger som vil sikre optimalisering av brukerdefinert markør. Imidlertid bør det bemerkes at selv om karakterisering av CTCs er mulig på CSS, som for tiden bare en brukerdefinert markør av interesse kan bli undersøkt i hver prøve, og at systemet er meget begrenset med hensyn til nedstrøms applikasjoner på grunn av den harde behandlingen av prøvene.
Den unike bedside-til-bord tilnærming benyttes i CTC forskning har åpnet for rask oppføring av denne nyttige analysen inn i klinisk setting. Det har imidlertid resultert i en utilstrekkelig forståelse av den grunnleggende biologi av disse sjeldne celler. Derfor utvikling og optimalisering av metoder som gir mulighet for vurdering av CTCs i prekliniske in vivo musemodeller av kreft er nødvendig. Dette manuskriptet beskriver en tilpasset CSS-protokoll som gjør det mulig for CTCs å bli vurdert i 50 mL volumer av mus blod, ideelt egnet for serie CTC samling eksperimentelle modeller. Dette manuskriptet demonstrates at CTC oppregning bruker denne protokollen er sammenlignbare med resultatene som er oppnådd ved bruk av CSS i kombinasjon med den tradisjonelle CTC kit, med ingen signifikante forskjeller i CTC fangst effektivitet mellom de automatiske og manuelle separasjonsteknikker. I tillegg, i løpet av utviklingen av denne analysen ble det erkjent, som tidligere beskrevet i litteraturen, 25, kan denne muse squamous epithelial cell forurensning foreta nøyaktig identifikasjon av CTCs mer vanskelig og noen ganger umulig. Derfor å bekjempe dette problemet en brukerdefinert HLA-Alexa Fluor 488 ble lagt inn i denne protokollen for å sikre at bare menneskelige celler (CK + DAPI + CD45 - HLA - Alexa Fluor 488 +) blir behørig tildelt som CTCs. Det er viktig å merke seg at LNCaP cellelinje som brukes i dette manuskriptet er HLAlow og derfor HLA-Alexa Fluor 488 kanskje må titreres for cellelinjer med varierende HLA uttrykk. Selv om vi har lagt til en HLA-Alexa Fluor 488 til vår protokoll for å sikre nøyaktig identifisering av CTCs, er det verdt å merke seg at de aller fleste av mus squamous epitelceller var lett gjenkjennelige med morfologi og var begrenset i celle nummer (0.33 ± 0.24 events/50 ul, n = 9). Høyere celle tall (opp til 11 events/50 mL) ble kun observert når blodprøvetaking (via hjertestans punktering) viste seg vanskelig, og gjentatte forsøk var nødvendig. Derfor foreslår vi at hvis det er ønskelig, kan på-system karakterisering av CTCs oppnås ved å utelate denne markøren. I tillegg, selv om det ikke er beskrevet her, forventer vi at samling av CTCs og videre nedstrøms karakterisering av CTCs ved hjelp av andre metoder kan enkelt oppnås som demonstrert tidligere ved hjelp av CSS 27,28.
Selv om CSS har blitt utnyttet klinisk for å effektivt oppdage CTCs i blodet av metastatisk brystkreft, prostatakreft og tykktarmskreftpasienter 4,10,29, det har flere limitations. I opp til 35% av pasienter med forskjellige metastatiske kreftformer, CTCs er detekterbar på tross av tilstedeværelsen av omfattende systemisk sykdom 30. Denne mangelen på deteksjon er blitt foreslått å være som et resultat av epitelial-til-mesenchymale overgang, en veldokumentert prosess som er kjent for å forbedre cancer invasion, metastasering, og den totale aggressivitet 31.. Denne overgangen har vært assosiert med en signifikant reduksjon i epitel-markører, slik som EpCAM, og en tilsvarende økning i mesenchymale markører 32.. Flere studier har nylig vist at tilstedeværelsen av disse mesenchymale markører i CTCs indikerer dårligere prognose og at mange av disse cellene mangler ekspresjon av epiteliale markører som ville være nødvendig for deres deteksjon ved hjelp av CSS 24,33-38. Dette tyder på at standarden CSS definisjonen kan mangle noen av de mest aggressive CTCs.
Til tross for de beskrevne begrensningene, er det forventet the-protokoller som er beskrevet i dette manuskriptet vil være viktige verktøy for forbedret CTC analyse ved hjelp av CSS, utvikling av nye CTC teknologi, optimalisering av brukerdefinerte markører og bedre forståelse av CTC biologi ved hjelp av in vivo prekliniske musemodeller. Til sammen vil disse protokollene gi en nyttig ressurs for brukere av denne plattformen interessert i preklinisk og klinisk forskning knyttet til metastasering og CTCs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatteren (ALA) fått midler som ble gitt av Janssen Oncology, morselskapet til Johnson & Johnson eier også Janssen Diagnostics LLC, som produserer reagenser og instrumenter som brukes i denne artikkelen.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Ontario Institute of Cancer Research (# 08NOV230), Canada Foundation for innovasjon (# 13199), prostatakreft Canada, Janssen Oncology, London Regional Cancer Program, og giverstøtte fra John og Donna Bristol gjennom London Health Sciences Foundation (ALA). LEL er støttet av en Frederick Banting og Charles Best Canada Graduate Scholarship Doctoral Award. ALA er støttet av en CIHR New Investigator Award og en tidlig Forsker Award fra Ontario Ministry of Research and Innovation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M EDTA | |||
| Anti-human CD44-FITC | BD Pharmigen | 555478 | |
| Anti-human CD44-PE | BD Pharmigen | 555479 | |
| Anti-human HLA-Alexa Fluor 488 | BioLegend | 311415 | |
| Anti-mouse CD45-APC | eBioscience | 17-0451-82 | |
| Bond Primary Antibody Diluent | Leica | AR9352 | |
| CellSave Preservative Tubes | Veridex | 952820 (20 pack) 79100005 (100 pack) | |
| CellSearch CTC Control Kit | Veridex | 7900003 | |
| CellSearch CTC Kit | Veridex | 7900001 | |
| CellSearch CXC Control Kit | Veridex | 7900018RUO | |
| CellSearch CXC Kit | Veridex | 7900017RUO | |
| Instrument Buffer | Veridex | 7901003 | |
| Streck Cell Preservative (aka CytoChex) | Streck | 213350 | |
| 1 ml Syringe | |||
| 10 ml Serological pipette | |||
| 1,000 µl Pipette | |||
| 1,000 µl Pipette tips | |||
| 12 mm x 75 mm Flow tubes | |||
| 200 µl Gel loading tips | |||
| 200 µl Pipette | |||
| 22 G Needle | |||
| 5 3/4 in Disposible Pasteur pipet | VWR | 14672-200 | |
| 5 ml Serological pipette | |||
| Automated pipettor | |||
| Capillary Blood Collection Tube (EDTA) | BD Microtainer | 365974 | |
| CellSearch Analyzer II | Veridex | 9555 | Includes magnests and verification cartirdges |
| CellSearch AutoPrep System | Veridex | 9541 | |
| Centrifuge | |||
| MagCellect Magnet | R&D Systems | MAG997 | |
| Small Latex Bulb | VWR | 82024-550 | |
| Vortex |
References
- Siegel, R., Naishadham, D., Jemal, A.
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nat. Rev. Cancer. 2 (8), 563-572 (2002).
- Pantel, K., Brakenhoff, R. H.
- Cristofanilli, M., Budd, G. T., et al. Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer. New Engl. J. Med. 351 (8), 781-791 (2004).
- De Bono, J. S., Scher, H. I., et al. Circulating tumor cells predict survival benefit from treatment in metastatic castration-resistant prostate cancer. Clin. Cancer Res. 14 (19), 6302-6309 (2008).
- Cohen, S. J., Ja Punt, C., et al. Prognostic significance of circulating tumor cells in patients with metastatic colorectal cancer. Ann. Oncol. 20 (7), 1223-1229 (2009).
- Hayes, D. F., Cristofanilli, M., et al. Circulating tumor cells at each follow-up time point during therapy of metastatic breast cancer patients predict progression-free and overall survival. Clin. Cancer Res. 12 (14), 4218-4224 (2006).
- Budd, G. T., Cristofanilli, M., et al. Circulating tumor cells versus imaging--predicting overall survival in metastatic breast cancer. Clin. Cancer Res. 12 (21), 6403-6409 (2006).
- Olmos, D., Arkenau, H. -T., et al. Circulating tumour cell (CTC) counts as intermediate end points in castration-resistant prostate cancer (CRPC): a single-centre experience. Ann. Oncol. 20 (1), 27-33 (2009).
- De Bono, J. S., Scher, H. I., et al. Circulating tumor cells predict survival benefit from treatment in metastatic castration-resistant prostate cancer. Clin. Cancer Res. 14 (19), 6302-6309 (2008).
- Allan, A. L., Keeney, M. Circulating tumor cell analysis: technical and statistical considerations for application to the clinic. J. Oncol. 2010, 426218 (2010).
- Lowes, L. E., Goodale, D., Keeney, M., Allan, A. L. Image cytometry analysis of circulating tumor cells. Methods Cell Biol. 102, 261-290 (2011).
- Lianidou, E. S., Markou, A. Circulating tumor cells in breast cancer: detection systems, molecular characterization, and future challenges. Clin. Chem. 57 (9), 1242-1255 (2011).
- Alix-Panabières, C., Pantel, K. Circulating tumor cells: liquid biopsy of cancer. Clin. Chem. 59 (1), 110-118 (2013).
- Parkinson, D. R., Dracopoli, N., et al. Considerations in the development of circulating tumor cell technology for clinical use. J. Transl. Med. 10, 138 (2012).
- Lowes, L. E., Hedley, B. D., Keeney, M., Allan, A. L. User-defined protein marker assay development for characterization of circulating tumor cells using the CellSearch system. Cytomet. A. 81 (11), 983-995 (2012).
- Fehm, T., Müller, V., et al. HER2 status of circulating tumor cells in patients with metastatic breast cancer: a prospective, multicenter trial. Breast Cancer Res. Treat. 124 (2), 403-412 (2010).
- Liu, Y., Liu, Q., et al. Circulating tumor cells in HER2-positive metastatic breast cancer patients: a valuable prognostic and predictive biomarker. BMC Cancer. 13, 202 (2013).
- Slamon, D. J., Leyland-Jones, B., et al. Use of chemotherapy plus a monoclonal antibody against HER2 for metastatic breast cancer that overexpresses HER2. New Engl. J. Med. 344 (11), 783-792 (2001).
- Marty, M., Cognetti, F., et al. Randomized phase II trial of the efficacy and safety of trastuzumab combined with docetaxel in patients with human epidermal growth factor receptor 2-positive metastatic breast cancer administered as first-line treatment: the M77001 study group. J. Clin. Oncol. 23 (19), 4265-4274 (2005).
- Slamon, D., Eiermann, W., et al. Adjuvant trastuzumab in HER2-positive breast cancer. New Engl. J. Med. 365 (14), 1273-1283 (2011).
- Welch, D. R. Technical considerations for studying cancer metastasis in vivo. Clin. Exp. Metast. 15 (3), 272-306 (1997).
- Goodale, D., Phay, C., Postenka, C. O., Keeney, M., Allan, A. L. Characterization of tumor cell dissemination patterns in preclinical models of cancer metastasis using flow cytometry and laser scanning cytometry. Cytometry A. 75 (4), 344-355 (2009).
- Gorges, T. M., Tinhofer, I., et al. Circulating tumour cells escape from EpCAM-based detection due to epithelial-to-mesenchymal transition. BMC Cancer. 12, 178 (2012).
- Eliane, J. -P., Repollet, M., et al. Monitoring serial changes in circulating human breast cancer cells in murine xenograft models. Cancer Res. 68 (14), 5529-5532 (2008).
- White Pages, V. eridex , Available from: http://www.veridex.com/pdf/CXC_Application_Guideline.PDF (2008).
- Flores, L. M., Kindelberger, D. W., et al. Improving the yield of circulating tumour cells facilitates molecular characterisation and recognition of discordant HER2 amplification in breast. 102 (10), 1495-1502 (2010).
- Sieuwerts, A. M., Kraan, J., et al. Molecular characterization of circulating tumor cells in large quantities of contaminating leukocytes by a multiplex real-time PCR. Breast Cancer Res. Treat. 118 (3), 455-468 (2009).
- Cohen, S. J., Ja Punt, C., et al. Relationship of circulating tumor cells to tumor response, progression-free survival, and overall survival in patients with metastatic colorectal cancer. J. Clin. Oncol. 26 (19), 3213-3221 (2008).
- Allard, W. J., Matera, J., et al. Tumor cells circulate in the peripheral blood of all major carcinomas but not in healthy subjects or patients with nonmalignant diseases. Clin. Cancer Res. 10 (20), 6897-6904 (2004).
- Thiery, J. P., Acloque, H., Huang, R. Y. J., Nieto, M. A. Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease. Cell. 139 (5), 871-890 (2009).
- Yang, J., Weinberg, R. A Epithelial-mesenchymal transition: at the crossroads of development and tumor metastasis. Dev. Cell. 14 (6), 818-829 (2008).
- Gradilone, A., Raimondi, C., et al. Circulating tumour cells lacking cytokeratin in breast cancer: the importance of being mesenchymal. J. Cell. Mol. Med. 15 (5), 1066-1070 (2011).
- Königsberg, R., Obermayr, E., et al. Detection of EpCAM positive and negative circulating tumor cells in metastatic breast cancer patients. Acta Oncol. 50 (5), 700-710 (2011).
- Kasimir-Bauer, S., Hoffmann, O., Wallwiener, D., Kimmig, R., Fehm, T. Expression of stem cell and epithelial-mesenchymal transition markers in primary breast cancer patients with circulating tumor cells. Breast Cancer Res. 14 (1), (2012).
- Mego, M., Mani, S. A., et al. Expression of epithelial-mesenchymal transition-inducing transcription factors in primary breast cancer: The effect of neoadjuvant therapy. Int. J. Cancer. 130 (4), 808-816 (2012).
- Yu, M., Bardia, A., et al. Circulating breast tumor cells exhibit dynamic changes in epithelial and mesenchymal composition. Science. 339 (6119), 580-584 (2013).
- Armstrong, A. J., Marengo, M. S., et al. Circulating tumor cells from patients with advanced prostate and breast cancer display both epithelial and mesenchymal markers. Mol. Cancer Res. 9 (8), 997-1007 (2011).
