Summary
Циркулирующие опухолевые клетки (CTCs) являются прогностическим в нескольких метастатических раковых заболеваний. Эта рукопись описывает стандартный CellSearch систему золотую (CSS) CTC перечисления платформу и выделяет наиболее распространенные ошибки неправильной классификации. Кроме того, два адаптированные протоколы описаны для пользовательского маркера характеристике ЦОК и СТС перечисления в доклинических моделях мыши метастазов с использованием этой технологии.
Abstract
Большинство случаев смерти, связанных с раком происходить после развития метастазов. Это крайне опасная стадия заболевания связана с наличием циркулирующих опухолевых клеток (CTCs). Эти редкие элементы были продемонстрированы быть клиническое значение в метастатического рака молочной железы, простаты и колоректального рака. Нынешний золотым стандартом в клинической обнаружения и подсчета СТС является FDA-очищенный CellSearch система (CSS). Эта рукопись описывает стандартный протокол, используемые этой платформы, а также два дополнительных адаптированные протоколы, описывающие подробную процесс пользовательского оптимизации маркера для белка характеристике CTCs пациентов и сопоставимой протокола для СТС захвата в очень низких объемов крови, используя стандарт CSS реагенты, для изучения в естественных доклинических моделях мыши метастазов. Кроме того, различия в CTC качества между здоровой донорской крови подсыпали клеток из культуры тканей по сравнению с пациентами SAMP кровиле выделены. Наконец, несколько часто противоречивые элементы, которые могут привести к CTC ошибок ошибочной классификации изложены. Взятые вместе, эти протоколы будут служить полезным ресурсом для пользователей этой платформы, заинтересованного в доклинических и клинических исследований, касающихся метастазов и ЦОК.
Introduction
В 2013 году, по оценкам, 580 350 людей будет умирать от рака и что 1660290 новых случаев этого заболевания будут диагностированы только в 1 США. Большинство из этих случаев смерти происходит после развития метастазов 2. Отсутствие в настоящее время эффективных методов лечения в лечении метастазов и ограниченное понимание метастатического каскада делает это стадия заболевания крайне опасная. Наличие циркулирующих опухолевых клеток (CTCs) в кровоток были продемонстрированы коррелирует с метастатической болезни 3. Эти клетки встречаются крайне редко и их обнаружение свидетельствует о общей выживаемости в метастатического рака молочной железы 4, простаты 5, и колоректальный рак 6. У этих больных, наличие ≥ 5 (молочной железы и простаты) или ≥ 3 (колоректальный) ЦОК в 7,5 мл крови свидетельствует о менее благоприятный прогноз по сравнению с теми пациентами с менее или без обнаруженных ЦОК в СэмомОбъем электронной крови. Кроме того, изменение количества СТС во время или после терапевтического вмешательства было продемонстрировано, чтобы быть полезным в качестве предсказателя ответа на лечение, зачастую раньше, чем используемых в настоящее время методов 7-10.
Было подсчитано, что в метастатических раковых больных, ЦОК происходят с частотой примерно 1 КТК за 10 5 -10 7 мононуклеарных клеток крови и у пациентов с локализованным заболеванием, эта частота может быть даже ниже (~ 1 в 10 8). Редкое характер этих клеток может сделать это трудно для точного и надежного обнаружения и анализа CTCs 11. Существует несколько методов (отзывы ранее 12-14) были использованы для обогащения и обнаружить эти клетки, используя свойства, которые отличают их от окружающих компонентов крови. В общем, СТС перечисление из двух частей процесс, который требует как стадию обогащения и стадию обнаружения. Традиционно по обогащению шаги полагаться на различия в физикеческих свойств ЦОК (размер ячейки, плотность, деформируемости) или на экспрессию белка-маркера (т.е. молекула эпителиальных клеточной адгезии [EpCAM], цитокератин [СК]). После обогащения, обнаружение CTC могут быть выполнены в нескольких различных направлениях, наиболее распространенным из которых анализы на основе нуклеиновых кислот и / или цитометрии подходы. Каждая из этих стратегий являются уникальными, имеющих свои преимущества и недостатки, однако все они не имеют стандартизации; необходимостью для входа в клинических условиях. Поэтому CellSearch система (CSS) был разработан для обеспечения стандартизованный метод обнаружения и подсчета редких ЦОК в крови человека с использованием флуоресцентной микроскопии и методов на основе антител 4-6. Эта платформа в настоящее время считается золотым стандартом в CTC перечисления и является единственной методикой одобрен в США пищевых продуктов и медикаментов (FDA) для использования в клинике 15.
CSS состоит из двух компонент платформы consistinг, (1) система CellTracks AutoPrep (далее по тексту подготовки инструмента), который автоматизирует подготовку образцов крови человека, и (2) в CellTracks Analyzer II (именуемую в дальнейшем прибора исследования), который сканирует эти Образцы следующие подготовки. Чтобы отличить CTCs от загрязняющих лейкоцитов препарат инструмент использует антитело опосредованной, феррожидкость подход магнитной сепарации и дифференциального окрашивания флуоресценции. Первоначально система этикетки CTCs с использованием анти-EpCAM антител, конъюгированных с наночастиц железа. Затем образец инкубируют в магнитном поле, и все немаркированные клетки отсасывают. Отдельные опухолевые клетки ресуспендировали, и инкубировали в дифференциальной флуоресценции пятна, состоящий из флуоресцентно меченные антитела и ядерного окрашивающего реагента. Наконец, образец переносят в магнитном картриджа, называется MagNest (далее по тексту магнитного устройства) и подкожноanned помощью анализа инструмент.
Анализ инструмент используется для сканирования приготовленных образцов с использованием различных флуоресцентных фильтров, каждый из которых оптимизирован на соответствующий флуоресцентного частицы, с использованием 10X объектива. CTCs определены как клетки, которые связаны с анти-EpCAM, анти-пан-CK-фикоэритрин (РЕ) (CK8, 18, и 19), и окрашивающим ядра 4 ',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI). С другой стороны, загрязняющие лейкоциты определяются как клетки, которые связаны с анти-CD45-аллофикоцианина (APC) и DAPI. После сканирования, потенциальные опухолевые клетки компьютерные определенные представлены пользователю. Из этих изображений, пользователь должен использовать качественный анализ с использованием определенных параметров и дифференциальное окрашивание, описанные выше, чтобы определить, какие события являются CTCs.
В дополнение к предоставлению стандартизированный метод для СТС перечисления, CSS позволяет молекулярных характеристик ЦОК на основе белковых маркеров, представляющих интерес. Это допрос свыполняться на уровне одной клетки, используя изотиоцианат флуоресцеина (FITC) флуоресценции канал не требуется для идентификации СТС 16. Хотя эта платформа предоставляет возможности для молекулярной характеристики, подробное процесс разработки протокола и оптимизации не четко определены. Три коммерчески доступные маркеры были разработаны производителем для использования с CSS, в том числе рецептора эпидермального фактора роста (EGFR), человеческого рецептора эпидермального фактора роста 2 (HER2) и инсулиноподобного фактора роста 1 рецепторов (IGF-1R). Анализ HER2, в сочетании с CSS, была использована несколькими группами, чтобы проиллюстрировать потенциал для СТС характеристики сообщить клинических решений и потенциально изменить существующие принципы лечения. Например, Fehm др.. 17 показали, что примерно треть больных раком молочной железы с HER2-первичных опухолей был HER2 + CTCs. Кроме того, Liu и соавт.18 недавно сообщил, что до 50% пациентов с + метастатическим раком груди не было HER2 + CTCs. Герцептин, рецептор HER2 вмешиваясь моноклональное антитело подтверждение того, большую пользу пациентов, у которых опухоли выразить достаточные уровни HER2, является широко используются для лечения пациентов с HER2 + первичных опухолей 19-21. Тем не менее, эти исследования показывают, что Герцептин может быть быть субоптимально используются и что СТС характеристика может помочь в прогнозировании ответа на лечение. В конечном счете, СТС характеристика может иметь потенциал для улучшения индивидуальное обслуживание.
Исследование СТС уникален тем, что она в значительной степени использовал подход прикроватные к-лабораторного стола. Этот метод, в отличие от настольных-к-ухода за больным исследований, которые часто могут потребоваться годы, чтобы повлиять на уход за больным, позволило CTCs быстрый вход в клинических условиях. Тем не менее, врачи не решаются использовать результаты анализа СТС в лечении пациента принятия макING в связи с отсутствием понимания их основной биологии. Поэтому соответствующие доклинические мышиные модели метастазирования и дополняют друг друга анализа СТС методов должны быть использованы для того, чтобы расследовать эти нерешенные вопросы. В общем, есть два типа доклинических моделях используются для изучения метастатического каскада, (1) модели спонтанное метастазирование, которые позволяют для изучения всех этапов метастатического каскада, и (2) экспериментальные модели метастазов, которые позволяют только для изучение поздних стадий в метастатического процесса, таких как транссудации и формирование вторичных опухолей 22. Спонтанные модели метастазов, привлекать инъекции опухолевых клеток в соответствующие ортотопических местах (например, инъекций раковых клеток простаты в предстательную железу для изучения рака простаты). Затем клетки дали время, чтобы сформировать первичные опухоли и спонтанно метастазированию вторичных сайтов, таких как кости, легких и лимфатических узлов. Вконтрастность, экспериментальные модели метастазов включать прямую инъекцию опухолевых клеток в кровоток (например, через хвостовую вену или внутрисердечной инъекции с клетками-мишенями для определенных местах) и, следовательно, пропустить начальные шаги intravasation и распространения вторичных органов 22. До сих пор большинство анализа СТС в в естественных условиях модельных систем была выполнена с использованием либо цитометрии основе 23 или адаптированных методик CTC человека на основе (например AdnaTest) 24. Хотя это и полезно, ни один из этих методов адекватно не отражают СТС перечисление с помощью золотого стандарта CSS. На основании клинической апробации, стандартизированной природе, и широкое использование в CSS, разработка захвата и обнаружения техники CTC для естественных условиях моделирования в который использует эквивалент подготовки образца, обработку и критериев идентификации было бы выгодно как результаты были бы сопоставимы с получены из образцов пациентов. Тем не менее, из-за объема REQuirements подготовки инструмента это не возможно обработать небольшие объемы крови, используя эту автоматизированную платформу. . Кроме того, предыдущая работа Элиан и др. 25 показали, что загрязнение образцов с мышь эпителиальных клеток (которое также соответствует стандартной четкости СТС [EpCAM + CK + DAPI + CD45 -]) может привести к неправильной классификации мыши клеток плоского эпителия, как ЦОК. Для решения этих вопросов адаптированный метод, который позволяет разработан использование из реагентов набора CSS CTC в сочетании с ручной процедуры выделения. Добавление FITC меченого человеческого лейкоцитарного антигена (HLA) антител в анализе позволяет опухолевые клетки человека следует отличать от мыши клеток плоского эпителия.
Эта рукопись описывается стандарт, коммерчески разработанный и оптимизированный протокол CSS для обработки пациентов образцы крови и распространенных ошибок, которые могут возникнуть, в том числе discrepanт предметы, которые могут привести к CTC ошибок ошибочной классификации. Кроме того, настройки из CSS анализа изучения определяемые пользователем белковые характеристики захваченных ЦОК и сопоставимой адаптированной методики CSS, что позволяет для обогащения и выявления ЦОК из малых объемов крови в доклинических моделях мыши метастазов описаны.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все человеческие исследования, описанные в этой рукописи проводились под протоколами, утвержденными Советом Западной университета человеческого этике исследований. Все исследования на животных были проведены в соответствии с рекомендациями Канадского совета по уходу за животными, по протоколам, утвержденным Подкомитета использования животных Западного Университета.
1. Стандартный СТС Перечень от пациента проб крови с помощью CSS
1. Крови человека для сбора проб и подготовка к переработке по подготовке инструмента
- Используя стандартные асептических методов кровопускания, нарисовать минимум 8,0 мл крови человека в 10 мл CellSave трубки (далее как СТС консерванта трубки), который содержит этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA) и собственный сотовый консервант. Обратить 5x трубки, чтобы предотвратить свертывание крови. Образцы могут быть обработаны немедленно или хранить при комнатной температуре в течение до 96 часов.
- Снятиеэ CSS реагенты из холодильника и дать им возможность нагреться до комнатной температуры перед использованием.
- Использование одноразовый 10 мл пипетки и автоматизированной пипетки, собирают 7,5 мл крови из CTC консерванта трубки и медленно обойтись кровь в соответствующей маркировкой препарата обработки трубки прибора.
- Добавить 6,5 мл буфера для разведения в каждом образце. Смешайте путем обращения образец 5x. Центрифуга образца при 800 мкг в течение 10 мин с тормозом в положении "выключено". Следуйте инструкциям на экране по подготовке инструмента загрузить все образцы пациентов на систему для обработки. Образцы должны быть обработаны в течение 1 часа препарата.
2. Подготовка управления для обработки по подготовке инструмента
- Аккуратно вихрь управления флакон и инвертировать 5x перемешать.
- Осторожно снимите крышку с контрольной флакона и поместите перевернутый подготовки обработка труб инструмент сверху незакрытой пробирке. В одним быстрым движением, инвертироватьконтролировать флакон, и вылить содержимое в перерабатывающей трубки. В то время как перевернутый, мягко Флик стороны управления флакона выпустить оставшиеся содержимое.
- Осторожно снимите перевернутый флакон управления от обработки трубы, обеспечивая, чтобы жидкость не теряется и отложите в сторону. Использование 1000 мкл пипетки, собирать все оставшиеся содержимое из флакона и крышки и осторожно пипеткой в обрабатывающую трубки.
- Следуйте инструкциям на экране по подготовке инструмента, чтобы загрузить контроль на систему для обработки.
3. Образец Сканирование на прибор исследования
- Следуйте инструкциям на экране по подготовке инструмента, чтобы разгрузить все образцы из системы. Свободно ограничить каждый картридж магнитное устройство и нажмите магнитное устройство с помощью руки или лабораторном столе, чтобы освободить пузыри, которые застряли к краям картриджа. После того, как все пузырьки были удалены, твердо ограничить картридж, заложить магнитное устройство квартиру, и яncubate в темноте в течение по крайней мере 20 мин при комнатной температуре. Образцы должны быть отсканированы в течение 24 часов подготовки.
- Включите прибора исследования и инициализировать лампу. При нагреве (~ 15 мин), загрузить проверки системы картридж на приборе исследования и выберите вкладку Test QC. Следуйте инструкциям на экране для выполнения необходимых мер по контролю качества.
- Загрузите образец на анализ документа и выберите вкладку Test пациента. Все сохраненные данные из подготовки инструмента будет отображаться. Нажмите кнопку Пуск, чтобы инициализировать сканирование образца. Система будет выполнять грубую фокусировку и края обнаружения на картридже магнитного устройства.
- Отрегулируйте все ребра по мере необходимости с помощью кнопки со стрелками. Выберите Принять. Система будет выполнять точной фокусировки и начать сканирование образца.
- После контроля сканирования результаты должны быть проверены с помощью определенных критериев для клеток шипами на высокой (CK + DAП.И. + CD45 - APC +) и низкой (СК + ДАПИ + CD45 - FITC +) концентрации. После образец пациента сканирования результаты должны быть пересмотрены для захваченных ЦОК, используя определенные критерии CTC (СК + DAPI + CD45 -).
2. СТС Характеристика для пользовательских маркеров с помощью CSS
1. Подготовка определяемых пользователем маркеров и приборостроения инициализации
- Развести интерес антитело с использованием первичных антител Bond разбавитель до желаемой концентрации в чашке маркер реагента с помощью следующей формулы, где работает концентрация представляет собой концентрацию антитела после дополнение к пробе и концентрации фондовой концентрация антитела в Реагент чашки. Для нескольких образцов, отрегулируйте антител объемы, как описано в таблице 1. Поместите маркер чашку реагента в положение 1 в реагента картриджа и лOAD картридж на CSS.
Фото со концентрация = (Работа Концентрация х 850 мкл) / 150 мкл - Соберите кровь, подготовить образцы, и загрузить подготовки инструмента, как описано выше стандартной СТС Перечень от пациента проб крови с использованием протокола CSS. Чтобы включить пользовательский маркер дополнение, выберите User Defined Пробирной при запросе подготовки инструмента. Введите имя маркер и выберите Сохранить. Как образцы загружаются в прибор, оператор будет предложено указать, какие должны получать пользовательский маркер, выбрав Да или Нет, если необходимо.
2. Образец Сканирование определяемых пользователем маркеров на прибор исследования
- Включите прибора исследования, инициализировать лампу, и осуществлять контроль качества и проверку системы, как описано в разделе 3.2 Стандартной СТС Перечень от пациента проб крови с помощью CSS
- Загрузите образец на анализ документа и выберите вкладку Настройка. Для инициализации канала FITC, выберите CellSearch КТК в качестве Kit ID в разделе протоколы испытаний. Из этого меню выберите СТС Исследования, нажмите кнопку Изменить и установите время экспозиции по желанию. Рекомендуется, чтобы время экспозиции 1,0 сек быть не превышен, когда с использованием набора CSS СТС, так как это может увеличить проступание в других флуоресцентных каналов, используемых для идентификации СТС.
3. Адаптация Стандартной CSSProtocol для использования в Доклинические мыши моделей
** Адаптировано из Veridex Мыши / Rat CellCapture Kit (больше не коммерчески доступных)
1. Мышь крови Сбор и хранение
- До сбора крови, запускать ~ 30 мкл 0,5 М ЭДТА и обратно через 22 G иглу, в результате чего небольшое количество ЭДТА в ступице.
- Собрать минимум 50 мкл крови мышей от мышей, предварительно вводили опухолевые клетки человека через ортотопических, хвостовую вену или внутрисердечных маршрутов. Сбор крови из подкожной вены (для последовательного анализа КТК) или пункции сердца (для терминала анализа КТК). Удалить иглу и обойтись кровь в 1 мл ЭДТА Microtainer пробирку для сбора крови. Смешайте инверсией или мягко Флик трубки, чтобы предотвратить свертывание крови. Кровь могут быть обработаны немедленно или хранить при комнатной температуре в течение до 48 ч после добавлени равного объема CytoChex сотовой консерванта.
2. СТС Обогащение
- Удалить CSS реагенты из холодильника и дать им возможность нагреться до комнатной температуры перед использованием.
- Передача эквивалент 50 мкл цельной крови на 12 мм х 75 мм проточной цитометрии трубки. Добавить 500 мкл буфера для разведения к каждому образцу, запивая никакой крови, которая остается на сторонах трубы. При необходимости, в нескольких минутах спин центрифугиможет быть использован для сбора оставшуюся кровь.
- Аккуратно вихрь анти-EpCAM магнитную жидкость и добавить 25 мкл к каждой пробе, помещая наконечник пипетки непосредственно в образце. Добавить 25 мкл Захват Повышение реагента и вихря мягко смешать. Инкубируйте образцы при комнатной температуре в течение 15 мин.
- Поместите пробирки с образцами в магнит и инкубировать в течение 10 мин. В то время как пробирки с образцом по-прежнему в магните, используйте стеклянную пипетку тщательно аспирации остаточной жидкости, не касаясь стенки трубы рядом с магнитом и выбросить.
3. СТС Окрашивание
- Удалить пробирки с образцами от магнита и ресуспендируют в 50 мкл Нуклеиновой Кислоты-Dye, 50 мкл окрашивающего реагента, 1,5 мкл анти-CD45-мыши APC, 5,0 мкл анти-человеческим HLA-Alexa Fluor 488, и 100 мкл проницаемости Реагент. Для нескольких образцов, эти реагенты могут быть предварительно смешаны и 206,5 мкл смеси могут быть добавлены в каждую пробирку. Vortex мягко смешиватьи инкубировать в течение 20 мин при комнатной температуре в темноте.
- Добавить 500 мкл буфера для разведения, вихрь мягко, место пробирки с образцами в магнит, и инкубировать в течение 10 мин. В то время как пробирки с образцом по-прежнему в магните, используйте стеклянную пипетку тщательно аспирации остаточной жидкости, не касаясь стенки трубы рядом с магнитом и выбросить. Удалить пробирки с образцами от магнита и ресуспендируйте в 350 мкл буфера для разведения. Vortex мягко перемешать.
4. Магнитное устройство Загрузка
- Использование гель наливного наконечника, тщательно передавать весь объем от пробирку в патрон в магнитном устройстве. Начало в нижней части картриджа и медленно вывести кончик как образец обойтись.
- После того, как весь образец был передан, свободно колпачок картриджа магнитное устройство и нажмите на магнитное устройство с помощью руки или лабораторном столе, чтобы выпускать любые пузырьки, которые прилипли к краям картриджа, как описано в Sectioн 3.1 Standard СТС Перечень от пациента проб крови с помощью CSS.
- Поп пузырьки с помощью стерильной иглой 22 G путем захвата их между фаской и краем картриджа. После того, как все пузырьки были удалены, твердо ограничить картридж, заложить магнитное устройство плоским, и инкубировать в темноте в течение не менее 10 мин. Образцы должны быть отсканированы в течение 24 часов подготовки.
5. Сканирование разлученных вручную образцов на анализ инструмента
- Включите прибора исследования, инициализировать лампу, и осуществлять контроль качества и проверку системы, как описано в разделе 3.2 Стандартной СТС Перечень от пациента проб крови с использованием протокола CSS.
- Загрузите образец на анализ документа и выберите вкладку Настройка. Удалите все существующие данные по кнопке данных магнитного устройства, нажав кнопку Формат сэмплов. Включите FITC Канал Aй установить время экспозиции до 1,0 сек, как описано в разделе 2.2 КТК характеризации для пользовательских маркеров с помощью CSS.
- Перейдите на вкладку Test пациента и выберите Редактировать, чтобы ввести информацию образец. Выберите CellSearch КТК как комплект ID и СТС исследований как Протокол испытаний. Входной остальные необходимая информация, как указано в качестве звездочкой. Сохраните информацию образец и нажмите кнопку Пуск.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Стандартный СТС Перечень Анализ
Чувствительность и специфичность CSS была хорошо документирована в литературе. Тем не менее, для проверки эквивалентную восстановление СТС, с шипами (1000 LNCaP раковые клетки предстательной железы человека) и unspiked образцы человеческой крови от здоровых доноров-добровольцев были обработаны на CSS, используя стандартный протокол CSSCTC. Как и ожидалось, unspiked образцы были свободны от ЦОК, 0,00 ± 0,00%, и восстановление СТС Было показано, что 86,9 ± 4,71% для колосовых образцов (рис. 1А). CSS галерея изображений, полученных от шипами образцов были оптимального качества и ЦОК было легко отличить от не-ЦОК. Тем не менее, при обработке образцов, полученных от больных раком, определение CTCs немного более сложной, со многими клеток, появляющихся меньше по размеру и быть менее легко отличить от не-CTCs (рис. 1В). Кроме того, при рассмотрении образцов пациентов 6 категорий событий были идентификацияред, что были широко противоречивые элементы между рецензентов (рис. 1в). Эти 6 категорий включены, (1) незначительные события, которые не выполнили требования о 4 размер мкм для классификации СТС; (2) элементы с тусклым CK и / или окрашивания DAPI; (3) оправдано (должны учитываться как КТК) по сравнению с неоправданным (не должно быть расценено как КТК) проступать в канал CD45-APC, вызванного ярким окрашивания CK-PE; (4) FITC + события; (5) неровной изображения в CK и / или DAPI каналов, и (6) события с DAPI окрашивания, который больше, чем CK изображений или тех, с окрашиванием DAPI, что не перекрывает> 50% с CK изображения. Для категорий (2) и (5) конкретные критерии существуют для классификации СТС. Для категории (2), элементы с тусклым CK / DAPI могут быть классифицированы как ЦОК при условии, что нетронутыми мембраны можно наблюдать в CK канала исоответствующего размера ДАПИ изображение отметил. Для категории (5), элементы с неровной CK / DAPI не может быть классифицирован как CTCs если таковые пикселизация наблюдается в CK канала. Тем не менее, пикселизация приемлемо в канале DAPI при условии, что это не слишком тяжелой (т.е. изображение полностью белым цветом на фоне, не серые области - описываемые Janssen Diagnostics (ранее Veridex), а белой краской на черном фоне) или диффузной (должны еще появляются овал в форме и вписываются в СК).
User-Defined Маркер Анализ развития
Адаптация CSS охарактеризовать CTCs для пользовательских маркеров требует значительных Обработка с строгим контролем и был описан ранее 16. Как правило, целесообразно оптимизации всех определяемых пользователем маркера требует, чтобы отрицательные контроли быть использованы для того, чтобы результаты являются специфическими. Наилучшие результаты получают, когда шипами Выборки обрабатываются с обоимиконтроль неспецифический IgG вместо целевого антитела и с разбавителем антител только как описано ранее. Различные концентрации целевой антител и время экспозиции также должна быть оценена и проверена с помощью клеточных линий с высоких, низких, и отсутствующих (отрицательных) плотностей антиген. Оптимальные условия протокола достигаются, когда анализ показывает, как высокую чувствительность к антигену-мишени и низкий фоновый шум от неспецифического связывания 16.
Примером такого Обработка с использованием стволовых клеток рака маркер, CD44, представлена здесь. Первоначальное тестирование с этим маркером начала использовать стандартный набор CSS СТС (именуемую в дальнейшем традиционной комплекте СТС), которая использует канал FITC для пользовательского развития маркера. Использование традиционной комплект СТС, было показано, что после значительного оптимизации, максимальное количество ЦОК, которые могут быть классифицированы как CD44 + было 69,3 ± 2,67% с использованием образцов с шипами с 1000 MDA-MB-468 ХумыN клетки рака молочной железы, известные демонстрировать высокую экспрессию CD44 с большинством клеток (98,4 ± 0,90%; как определено с помощью проточной цитометрии), экспрессирующие этот протеин (рис. 2а). На основании этих выводов была высказана гипотеза о том, что в продаже CSS СХС комплект может производить более высокие результаты. Этот комплект позволяет улучшить визуализацию маркеров с более низкой плотностью антигена (~ 50000 антигены / элемент) по сравнению с традиционным набором СТС (оптимизированной для маркеров с плотностью ~ 100 000 антигенов / клетку) путем изменения флуоресценции канал, в котором CK8 / 18/19 (традиционно представлены в канале PE) и представлены маркер пользователя интерес (традиционно представлены в канале FITC) (поэтому в дальнейшем комплекте CXC будет называться низкой плотности антиген CTC комплекта) 26. После значительного оптимизации, было продемонстрировано, что это изменение позволило улучшить окрашивания CD44, с 98,8 ± 0,51% от ЦОК, классифицированных как CD44 + </ SUP> с помощью CD44-PE в концентрации 1,0 мкг / мл и времени экспозиции 0,6 с (рис. 2а). Соответствующее оптимизация всех определяемых пользователем маркера также требует проверку с помощью высокой плотности антигена (MDA-MB-468), низкой плотности антигена (21 NT), и отрицательные (LNCaPs) клеточные линии для маркера интереса (рис. 2В).
СТС анализ в Доклинические мыши моделей
Для определения чувствительности и специфичности адаптированного протокола CSS мыши, шипами (1000 раковые клетки LNCaP предстательной железы человека) и unspiked мыши образцы крови были обработаны вручную и отсканированы на приборе исследования и по сравнению с результатами, полученными с использованием той же клеточной линии обрабатываются с использованием стандарта автоматизированный протокол CSS на подготовку инструмент (рис. 3А). Как и ожидалось, unspiked образцы были свободны от ЦОК с использованием как анализы, 0,00 ± 0,00% и КТК восстановления с помощью адаптированного комплекта мыши (90,8 ± 5,18%) не было сignificantly отличается от результатов, полученных с использованием стандартной автоматизированной системы (86,9 ± 4,71%, р> 0,05). Изображения, полученные с помощью ручного мыши адаптированный протокол не отличались от наблюдаемых с помощью стандартного автоматизированного технику, за исключением добавления маркера HLA-FITC. Кроме того, мыши эпителиальных клеток не окрашивают положительно для HLA-FITC (рис. 3В). Чтобы подтвердить, что этот метод был так чувствительны, как стандартному протоколу CSS для выделения низким числом циркулирующих опухолевых клеток, серийные разведения проводили с шипами образцов крови и соотношение ожидаемого числа клеток по сравнению с восстановленного количества клеток оценивали (Фигура 3С). Результаты показывают, что ЦОК может эффективно быть восстановлены до чувствительностью 5 клеток/50 мкл цельной крови с помощью этого анализа. Эти значения коррелируют с ожидаемыми результатами с R 2 = 0,99.
Рисунок 2. Характеристика ЦОК для пользовательских маркеров с помощью CSS. (А) Процент клеток классифицируются как CD44 + с использованием комплектов СТС и СХС на CSS (п = 3). Данные представлены как среднее ± SEM. *** = Значительно отличались (Р <0,0005). (B) Характерные CSS галерея изображения крови от здорового добровольца донора (7,5 мл), с шипами ~ 1000 клеток из идентифицированной линии клеток, инкубировали с 1,5 мкг / мл анти -CD44-PE, и сканировали при времени экспозиции 0,2 сек. Квадраты Orange указывают CD44 + </ SUP> ЦОК, определены как CK + / DAPI + / CD45 - / CD44 -. ЧП + Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.
Рисунок 3. Адаптация процедуры CSS для использования в доклинических моделей мыши метастазов. (A) CTC восстановление с использованием адаптированного протокола мыши CSS, измеренную как процент от количества меченых клеток и по сравнению с результатами, полученными с использованием стандартного протокола человеческий CSS. Клетки подсчитывали по гемоцитометре и ~ 1000 LNCaP раковые клетки предстательной железы человека вносили в 7,5 мл крови человека. Unspiked образцы крови человека были использованы в качестве отрицательного контроля (п = 3). Данные представлены как среднее ± SEM. NS = не имеет значения. (B) (С) Анализ корреляции и линейной регрессии ожидается против восстановленного числа колосовых опухолевых клеток при различных концентрациях . LNCaP человека клетки рака простаты были первоначально рассчитывали по гемоцитометре, а затем с шипами в крови мышей при концентрации ~ 1000 опухоли клеток/50 мкл крови. Шипастая крови мыши затем серийно разводили до концентрации 5 опухоли клеток/50 мкл и обрабатываются с помощью мыши адаптированный протокол CSS (N = 3). Нажмите сюда, чтобы посмотреть увеличенное изображение.
| # Образцов с User Defined Marker Добавлено | Всего Voluмне Добавить в Кубке реагента (мкл) |
| 1 | 450 |
| 2 | 600 |
| 3 | 750 |
| 4 | 900 |
| 5 | 1050 |
| 6 | 1200 |
| 7 | 1350 |
| 8 | 1500 |
Таблица 1. . Всего объем требований для CSS при обработке различного количества образцов с определенной пользователем маркера ** Адаптировано из Veridex Белой книги (можно купить в: http://www.veridex.com/pdf/CXC_Application_Guideline.PDF ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Несмотря на развитие многих новых технологий СТС с момента введения CSS в 2004 году, этот метод остается единственным клинически одобрено технология на рынке сегодня, и поэтому он считается нынешний золотой стандарт для обнаружения и подсчета СТС. Эта рукопись показал, что хотя CSS имеет строгие стандарты контроля качества, это может быть предметом для смещения интерпретации и что идентификация СТС в образцах пациента значительно отличается от идентификации в колосовых образцов. Шесть категорий обычно противоречивых элементов были определены, что может привести к CTC неверной классификации произойти. Эти противоречивые элементы подчеркивают необходимость для нескольких рецензентов на каждого образца пациента обработанных на этом инструменте. Кроме того, различия, наблюдаемые в шипами против пациента, полученные CTCs показывает, что существует необходимость для любых новых технологий СТС быть подтверждено в обоих шипами и клинических образцов. Кроме того, эти новые технологии должны бэ по сравнению с золотым стандартом CSS с использованием сплит образец тестирование обоих колосовых и клинических образцов, а эффективным СТС захват с шипами образцов только не обязательно отражает СТС эффективности захвата в образцах пациента.
Хотя CSS имеет возможность выполнять характеристику захваченных ЦОК, это довольно ограничен в отношении настраиваемый оптимизации. В общем, только параметры, которые можно изменить на этом инструменте для оптимизации определенных пользователем маркеров концентрация антитела и продолжительность времени, что флуорофор подвергается воздействию ртутной лампы. Это ограниченные возможности для оптимизации может представлять проблемы при работе планом определяемые пользователем маркеры на CSS. Одно решение предложено в этой рукописи (подробно описаны ранее 16) является использование низкой плотности антиген CTC комплект, который переключает FITC и PE каналов флуоресцентные позволяющие для лучшей визуализации маркеров с низкой плотностью антигенов. Несмотря наиз которых комплект используется (в традиционном или низкой плотности антигена СТС комплект) есть несколько необходимых шагов, которые должны быть предприняты для обеспечения соответствующих чувствительности маркер, специфичности и оптимизации. Во-первых, чувствительность анализа должны быть оценены по сравнению с хорошо утвержденным методом, например, проточной цитометрии, что позволит определить ожидаемого уровня обнаружения (т.е. процент клеток в популяции клеток, которые выражают маркер интереса) пользователя- определяется маркер. Во-вторых, анализ следует оценивать по его способности обнаруживать маркер интереса к клеточных линий с различными уровнями экспрессии (т.е. высокие и низкие антиген плотностей) и ее специфику, должны быть проверены в клеточной линии, что является отрицательным для маркера интереса . Во всех случаях, все клеточные линии должны быть проверены с использованием клеток только контроль (не антитела не добавлено), надлежащий контроль IgG и представляющее интерес антитело в различных концентрациях и времени экспозиции, чтобы определить месул соответствующие настройки, которые будут обеспечивать оптимизацию пользовательского маркера. Тем не менее, следует отметить, что, хотя характеристика CTCs возможно на CSS, в настоящее время только один определенный пользователем маркер интерес могут быть изучены в каждом образце, и что система очень ограничена в отношении последующих применений из-за суровых обработки образцов.
Уникальный подход прикроватная к лабораторного стола используется в исследованиях СТС позволило для быстрого ввода этой полезной анализа в клинических условиях. Тем не менее, это привело к неадекватным пониманием фундаментальной биологии этих редких клеток. Таким образом, разработка и оптимизация анализов, которые позволяют для оценки ЦОК в доклинических моделей в естественных мыши рака необходимы. Эта рукопись описывает адаптированный протокол CSS, которая позволяет ЦОК быть оценены в 50 объемах мкл крови мышей, которые идеально подходят для последовательного сбора СТС экспериментальных моделях. Эта рукопись гemonstrates, что СТС перечисление с помощью этого протокола можно сравнить с результатами, полученными с помощью CSS в сочетании с традиционной комплекте СТС, без существенных различий в эффективности захвата СТС между автоматизированных и ручных методов разделения. Кроме того, в процессе разработки этого анализа было признано, как описано ранее в литературе 25, что мышь плоскоклеточный загрязнение эпителиальных клеток может сделать точная идентификация CTCs более трудным, а иногда и невозможным. Поэтому борьбе с этим явлением, определенный пользователем, HLA-Alexa Fluor 488 был добавлен в этом протоколе, чтобы гарантировать, что только клетки человека (CK + DAPI + CD45 - HLA - Alexa Fluor 488 +) в настоящее время соответствующим образом назначен ЦОК. Важно отметить, что линия клеток LNCaP, используемый в этом рукописи HLAlow и, следовательно, HLA-Alexa Fluor 488 может потребоваться титровали для клеточных линий с различной экспрессии HLA. Хотя мы добавили HLA-Alexa Fluoг 488 в нашем протоколе, чтобы обеспечить точную идентификацию ЦОК, следует отметить, что подавляющее большинство мыши клеток плоского эпителия были легко узнаваемы по морфологии и были ограничены по числу клеток (0,33 ± 0,24 events/50 мкл; п = 9). Более высокие числа клеток (до 11 events/50 мкл) наблюдались только когда сбор крови (посредством пункции сердца) оказалось трудным и неоднократные попытки были необходимы. Поэтому мы предлагаем, чтобы при желании, на-системы характеристика ЦОК может быть достигнуто путем исключения этого маркера. Кроме того, хотя здесь не описана, мы ожидаем, что сбор ЦОК и далее вниз по течению характеристики ЦОК с помощью других методов может быть легко достигнуто, как показано ранее при помощи CSS 27,28.
Хотя CSS была использована клинически эффективно обнаруживать CTCs в крови метастатического рака молочной железы, предстательной железы и больных колоректальным раком 4,10,29, у него есть несколько Limitations. В до 35% больных с различными метастатических раков, ЦОК не обнаруживаются, несмотря на наличие широкого системного заболевания 30. Это отсутствие обнаружения было предложено, чтобы быть в результате перехода эпителия-к-мезенхимальных, хорошо документированный процесс, известный для повышения вторжение рака, метастазы, и общей агрессивности 31. Этот переход был связан со значительным снижением в эпителиальных маркеров, таких как ЕрСАМ, и соответствующее увеличение мезенхимальных маркеров 32. Несколько исследований недавно продемонстрировали, что наличие этих мезенхимальных маркеров в ЦОК свидетельствуют о менее благоприятный прогноз и что многие из этих клеток лишены экспрессии эпителиальных маркеров, которые будут необходимы для их обнаружения с помощью CSS 24,33-38. Это говорит о том, что стандартное определение CSS могут отсутствовать некоторые из самых агрессивных ЦОК.
Несмотря на описанные ограничения, предполагается йе протоколы, описанные в этой рукописи будет важными инструментами для более качественного анализа CTC с помощью CSS, разработка новых технологий СТС, оптимизации определяемых пользователем маркеров, а также улучшение понимания СТС биологии с использованием в естественных условиях доклинических моделях мыши. Взятые вместе, эти протоколы будут служить полезным ресурсом для пользователей этой платформы, заинтересованного в доклинических и клинических исследований, касающихся метастазов и ЦОК.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Автор (ALA) получил финансирование, который был предоставлен Janssen онкологии, чья материнская компания Johnson & Johnson также владеет Janssen Diagnostics LLC, которая производит реагенты и инструменты, используемые в этой статье.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантами от Онтарио Института исследований рака (# 08NOV230), Канады фонда инноваций (# 13199), рака простаты Канады, Janssen онкологии Программы Лондонской регионального рака, и донорской поддержки от Джона и Донна Бристоль через Лондон медицинских наук Фонд (в ALA). НПВ поддерживается Фредерик Бантинг и Чарльз Лучший Канада Высшее стипендии докторской премии. ALA поддерживается CIHR Нью следователь премии и раннего премии исследователь из Онтарио Министерство исследований и инноваций.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M EDTA | |||
| Anti-human CD44-FITC | BD Pharmigen | 555478 | |
| Anti-human CD44-PE | BD Pharmigen | 555479 | |
| Anti-human HLA-Alexa Fluor 488 | BioLegend | 311415 | |
| Anti-mouse CD45-APC | eBioscience | 17-0451-82 | |
| Bond Primary Antibody Diluent | Leica | AR9352 | |
| CellSave Preservative Tubes | Veridex | 952820 (20 pack) 79100005 (100 pack) | |
| CellSearch CTC Control Kit | Veridex | 7900003 | |
| CellSearch CTC Kit | Veridex | 7900001 | |
| CellSearch CXC Control Kit | Veridex | 7900018RUO | |
| CellSearch CXC Kit | Veridex | 7900017RUO | |
| Instrument Buffer | Veridex | 7901003 | |
| Streck Cell Preservative (aka CytoChex) | Streck | 213350 | |
| 1 ml Syringe | |||
| 10 ml Serological pipette | |||
| 1,000 µl Pipette | |||
| 1,000 µl Pipette tips | |||
| 12 mm x 75 mm Flow tubes | |||
| 200 µl Gel loading tips | |||
| 200 µl Pipette | |||
| 22 G Needle | |||
| 5 3/4 in Disposible Pasteur pipet | VWR | 14672-200 | |
| 5 ml Serological pipette | |||
| Automated pipettor | |||
| Capillary Blood Collection Tube (EDTA) | BD Microtainer | 365974 | |
| CellSearch Analyzer II | Veridex | 9555 | Includes magnests and verification cartirdges |
| CellSearch AutoPrep System | Veridex | 9541 | |
| Centrifuge | |||
| MagCellect Magnet | R&D Systems | MAG997 | |
| Small Latex Bulb | VWR | 82024-550 | |
| Vortex |
References
- Siegel, R., Naishadham, D., Jemal, A.
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nat. Rev. Cancer. 2 (8), 563-572 (2002).
- Pantel, K., Brakenhoff, R. H.
- Cristofanilli, M., Budd, G. T., et al. Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer. New Engl. J. Med. 351 (8), 781-791 (2004).
- De Bono, J. S., Scher, H. I., et al. Circulating tumor cells predict survival benefit from treatment in metastatic castration-resistant prostate cancer. Clin. Cancer Res. 14 (19), 6302-6309 (2008).
- Cohen, S. J., Ja Punt, C., et al. Prognostic significance of circulating tumor cells in patients with metastatic colorectal cancer. Ann. Oncol. 20 (7), 1223-1229 (2009).
- Hayes, D. F., Cristofanilli, M., et al. Circulating tumor cells at each follow-up time point during therapy of metastatic breast cancer patients predict progression-free and overall survival. Clin. Cancer Res. 12 (14), 4218-4224 (2006).
- Budd, G. T., Cristofanilli, M., et al. Circulating tumor cells versus imaging--predicting overall survival in metastatic breast cancer. Clin. Cancer Res. 12 (21), 6403-6409 (2006).
- Olmos, D., Arkenau, H. -T., et al. Circulating tumour cell (CTC) counts as intermediate end points in castration-resistant prostate cancer (CRPC): a single-centre experience. Ann. Oncol. 20 (1), 27-33 (2009).
- De Bono, J. S., Scher, H. I., et al. Circulating tumor cells predict survival benefit from treatment in metastatic castration-resistant prostate cancer. Clin. Cancer Res. 14 (19), 6302-6309 (2008).
- Allan, A. L., Keeney, M. Circulating tumor cell analysis: technical and statistical considerations for application to the clinic. J. Oncol. 2010, 426218 (2010).
- Lowes, L. E., Goodale, D., Keeney, M., Allan, A. L. Image cytometry analysis of circulating tumor cells. Methods Cell Biol. 102, 261-290 (2011).
- Lianidou, E. S., Markou, A. Circulating tumor cells in breast cancer: detection systems, molecular characterization, and future challenges. Clin. Chem. 57 (9), 1242-1255 (2011).
- Alix-Panabières, C., Pantel, K. Circulating tumor cells: liquid biopsy of cancer. Clin. Chem. 59 (1), 110-118 (2013).
- Parkinson, D. R., Dracopoli, N., et al. Considerations in the development of circulating tumor cell technology for clinical use. J. Transl. Med. 10, 138 (2012).
- Lowes, L. E., Hedley, B. D., Keeney, M., Allan, A. L. User-defined protein marker assay development for characterization of circulating tumor cells using the CellSearch system. Cytomet. A. 81 (11), 983-995 (2012).
- Fehm, T., Müller, V., et al. HER2 status of circulating tumor cells in patients with metastatic breast cancer: a prospective, multicenter trial. Breast Cancer Res. Treat. 124 (2), 403-412 (2010).
- Liu, Y., Liu, Q., et al. Circulating tumor cells in HER2-positive metastatic breast cancer patients: a valuable prognostic and predictive biomarker. BMC Cancer. 13, 202 (2013).
- Slamon, D. J., Leyland-Jones, B., et al. Use of chemotherapy plus a monoclonal antibody against HER2 for metastatic breast cancer that overexpresses HER2. New Engl. J. Med. 344 (11), 783-792 (2001).
- Marty, M., Cognetti, F., et al. Randomized phase II trial of the efficacy and safety of trastuzumab combined with docetaxel in patients with human epidermal growth factor receptor 2-positive metastatic breast cancer administered as first-line treatment: the M77001 study group. J. Clin. Oncol. 23 (19), 4265-4274 (2005).
- Slamon, D., Eiermann, W., et al. Adjuvant trastuzumab in HER2-positive breast cancer. New Engl. J. Med. 365 (14), 1273-1283 (2011).
- Welch, D. R. Technical considerations for studying cancer metastasis in vivo. Clin. Exp. Metast. 15 (3), 272-306 (1997).
- Goodale, D., Phay, C., Postenka, C. O., Keeney, M., Allan, A. L. Characterization of tumor cell dissemination patterns in preclinical models of cancer metastasis using flow cytometry and laser scanning cytometry. Cytometry A. 75 (4), 344-355 (2009).
- Gorges, T. M., Tinhofer, I., et al. Circulating tumour cells escape from EpCAM-based detection due to epithelial-to-mesenchymal transition. BMC Cancer. 12, 178 (2012).
- Eliane, J. -P., Repollet, M., et al. Monitoring serial changes in circulating human breast cancer cells in murine xenograft models. Cancer Res. 68 (14), 5529-5532 (2008).
- White Pages, V. eridex , Available from: http://www.veridex.com/pdf/CXC_Application_Guideline.PDF (2008).
- Flores, L. M., Kindelberger, D. W., et al. Improving the yield of circulating tumour cells facilitates molecular characterisation and recognition of discordant HER2 amplification in breast. 102 (10), 1495-1502 (2010).
- Sieuwerts, A. M., Kraan, J., et al. Molecular characterization of circulating tumor cells in large quantities of contaminating leukocytes by a multiplex real-time PCR. Breast Cancer Res. Treat. 118 (3), 455-468 (2009).
- Cohen, S. J., Ja Punt, C., et al. Relationship of circulating tumor cells to tumor response, progression-free survival, and overall survival in patients with metastatic colorectal cancer. J. Clin. Oncol. 26 (19), 3213-3221 (2008).
- Allard, W. J., Matera, J., et al. Tumor cells circulate in the peripheral blood of all major carcinomas but not in healthy subjects or patients with nonmalignant diseases. Clin. Cancer Res. 10 (20), 6897-6904 (2004).
- Thiery, J. P., Acloque, H., Huang, R. Y. J., Nieto, M. A. Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease. Cell. 139 (5), 871-890 (2009).
- Yang, J., Weinberg, R. A Epithelial-mesenchymal transition: at the crossroads of development and tumor metastasis. Dev. Cell. 14 (6), 818-829 (2008).
- Gradilone, A., Raimondi, C., et al. Circulating tumour cells lacking cytokeratin in breast cancer: the importance of being mesenchymal. J. Cell. Mol. Med. 15 (5), 1066-1070 (2011).
- Königsberg, R., Obermayr, E., et al. Detection of EpCAM positive and negative circulating tumor cells in metastatic breast cancer patients. Acta Oncol. 50 (5), 700-710 (2011).
- Kasimir-Bauer, S., Hoffmann, O., Wallwiener, D., Kimmig, R., Fehm, T. Expression of stem cell and epithelial-mesenchymal transition markers in primary breast cancer patients with circulating tumor cells. Breast Cancer Res. 14 (1), (2012).
- Mego, M., Mani, S. A., et al. Expression of epithelial-mesenchymal transition-inducing transcription factors in primary breast cancer: The effect of neoadjuvant therapy. Int. J. Cancer. 130 (4), 808-816 (2012).
- Yu, M., Bardia, A., et al. Circulating breast tumor cells exhibit dynamic changes in epithelial and mesenchymal composition. Science. 339 (6119), 580-584 (2013).
- Armstrong, A. J., Marengo, M. S., et al. Circulating tumor cells from patients with advanced prostate and breast cancer display both epithelial and mesenchymal markers. Mol. Cancer Res. 9 (8), 997-1007 (2011).
