Summary
Las células tumorales circulantes (CTC) son pronóstico en varios tipos de cáncer metastásico. Este manuscrito describe el sistema de patrón oro CellSearch (CSS) plataforma enumeración CTC y destaca los errores de clasificación errónea comunes. Además, dos protocolos adaptados se describen, por definido por el usuario caracterización marcador de CTCs y CTC enumeración en modelos de ratones preclínicos de metástasis que utilizan esta tecnología.
Abstract
La mayoría de las muertes relacionadas con el cáncer se produce con posterioridad a la presentación de enfermedad metastásica. Este estadio de la enfermedad altamente letal se asocia con la presencia de células tumorales circulantes (CTC). Estas células raras se han demostrado para ser de importancia clínica en cáncer de mama metastásico, de próstata, y cánceres colorrectales. El actual estándar de oro en la detección clínica CTC y enumeración es el sistema CellSearch aprobado por la FDA (CSS). Este manuscrito describe el protocolo estándar utilizado por esta plataforma, así como dos protocolos adaptados adicionales que describen el proceso detallado de la optimización de marcador definido por el usuario para la caracterización de proteínas de CTC paciente y un protocolo comparable para la captura de CTC en muy bajos volúmenes de sangre, utilizando el estándar reactivos CSS, para estudiar in vivo los modelos preclínicos de ratón de la metástasis. Además, las diferencias en la calidad de CTC entre la sangre de donantes sanos se dispararon con células de cultivo de tejidos en comparación con la sangre del paciente samples se destacan. Por último, varios artículos que se discrepantes que pueden conducir a errores de clasificación errónea de CTC se describen. Tomados en conjunto, estos protocolos proporcionarán un recurso útil para los usuarios de esta plataforma de interesados en la investigación preclínica y clínica relacionada con la metástasis y la CTC.
Introduction
En 2013 se estima que 580,350 personas morirán de cáncer y que los 1.660.290 nuevos casos de esta enfermedad se diagnostica sólo en 1 de los Estados Unidos. La mayoría de estas muertes se producen con posterioridad a la presentación de enfermedad metastásica 2. La actual falta de terapias efectivas en el tratamiento de metástasis y una comprensión limitada de la cascada metastásica hace que esta etapa de la enfermedad altamente letal. La presencia de células tumorales circulantes (CTC) en el torrente sanguíneo se ha demostrado que se correlaciona con la enfermedad metastásica 3. Estas células son muy poco frecuentes y su detección es indicativa de la supervivencia general en cáncer de mama metastásico 4, 5 de próstata y colorrectal 6 cáncer. En estos pacientes, la presencia de ≥ ≥ 3 (colorrectal) CTCs en 7,5 ml de sangre 5 (mama y próstata) o es un indicador de mal pronóstico en comparación con aquellos pacientes con menos o ningún CTCs detectables en el samvolumen e sangre. Además, el cambio en el número de CTC durante o después de la intervención terapéutica ha demostrado ser útil como un factor de predicción de la respuesta al tratamiento, a menudo antes de lo que las técnicas actualmente utilizadas 7-10.
Se ha estimado que, en pacientes con cáncer metastásico, CTC se produce a una frecuencia de aproximadamente 1 por CTC 10 5 -10 7 células mononucleares de la sangre y en los pacientes con enfermedad localizada, esta frecuencia puede ser aún más baja (~ 1 en 10 8). La naturaleza poco común de estas células puede hacer que sea difícil de detectar y analizar con precisión y fiabilidad CTC 11. Existen varios métodos (revisado previamente 12-14) se han utilizado para enriquecer y detectar estas células mediante la explotación de las propiedades que los diferencian de los alrededores componentes sanguíneos. En general, la enumeración CTC es un proceso de dos partes que requiere tanto una etapa de enriquecimiento y una etapa de detección. Tradicionalmente, las etapas de enriquecimiento se basan en las diferencias en educación físicapropiedades de iCal de CTC (tamaño de la celda, densidad, capacidad de deformación) o en la expresión del marcador de proteína (es decir, molécula de adhesión celular epitelial [EpCAM], citoqueratina [CK]). Después de enriquecimiento, la detección de CTC puede llevarse a cabo en un número de maneras diferentes, la más común de las cuales son ensayos basados en ácidos nucleicos y / o enfoques de citometría. Cada una de estas estrategias son únicos, tienen ventajas y desventajas, sin embargo todos ellos carecen de normalización; una necesidad para entrar en el entorno clínico. Por tanto, el sistema de CellSearch (CSS) se desarrolló para brindar un método estándar para la detección y enumeración de los CTC raras en la sangre humana utilizando microscopía de fluorescencia y técnicas basadas en anticuerpos 4-6. Esta plataforma es actualmente considerado el estándar de oro en la enumeración CTC y es la única técnica aprobado por los EE.UU. Food and Drug Administration (FDA) para su uso en la clínica 15.
El CSS es una consistin plataforma de dos componentesg de, (1) el sistema de CellTracks AutoPrep (de aquí en adelante referido como el instrumento de preparación), que automatiza la preparación de muestras de sangre humana, y (2) la CellTracks Analyzer II (en lo sucesivo referido como el instrumento de análisis), que analiza estos muestras siguientes preparación. Para distinguir CTC de leucocitos contaminantes del instrumento de preparación emplea un anticuerpo mediada, enfoque separación magnética a base de ferrofluido y tinción de fluorescencia diferencial. Inicialmente, el sistema de etiquetas CTC usando anticuerpos anti-EpCAM conjugados con nanopartículas de hierro. La muestra se incuba a continuación en un campo magnético, y todas las células no marcadas son aspirados. Las células tumorales seleccionadas se resuspendieron, y se incubaron en una mancha de fluorescencia diferencial, que consiste en anticuerpos marcados de forma fluorescente y un reactivo de tinción nuclear. Finalmente, la muestra se transfiere a un cartucho magnético, llamado un magnest (en lo sucesivo, el dispositivo magnético), y SCanned usando el instrumento de análisis.
El instrumento de análisis se utiliza para explorar muestras preparadas usando diferentes filtros de fluorescencia, cada uno optimizado para la partícula fluorescente apropiada, usando una lente objetivo de 10X. CTC se identifican como células que están obligados por anti-EpCAM, anti-pan-CK-ficoeritrina (PE) (CK8, 18, y 19), y la mancha nuclear 4 ',6-diamino-2-fenilindol (DAPI). Por el contrario, los leucocitos contaminantes se identifican como células que están obligados por anti-CD45-aloficocianina (APC) y DAPI. Después de la exploración, potenciales células tumorales informáticos definidos se presentan al usuario. A partir de estas imágenes, el usuario debe emplear métodos cualitativos a través de los parámetros definidos y tinción diferencial discutidos anteriormente para determinar qué eventos son los CTC.
Además de proporcionar un método estandarizado para la enumeración de CTC, el CSS permite para la caracterización molecular de CTC basado en marcadores de proteínas de interés. Este interrogatorio cun ser realizadas a nivel de una sola célula, utilizando un isotiocianato de fluoresceína (FITC) canal de fluorescencia no se requiere para la identificación CTC 16. Aunque esta plataforma proporciona la capacidad para la caracterización molecular, no está bien definido el proceso detallado de elaboración de protocolos y optimización. Tres marcadores disponibles comercialmente han sido desarrollados por el fabricante para su uso con el CSS, incluyendo receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), receptor del factor de crecimiento epidérmico humano 2 (HER2), y factor de crecimiento similar a la insulina 1 receptor (IGF-1R). Análisis de HER2, en combinación con el CSS, ha sido utilizado por varios grupos para ilustrar el potencial para la caracterización de CTC para informar la toma de decisiones clínicas y de cambiar las pautas de tratamiento potencialmente existentes. Por ejemplo, Fehm et al. 17 demostraron que aproximadamente un tercio de los pacientes con cáncer de mama con tumores HER2-primaria tenía HER2 + CTC. Además, Liu et al.18 informó recientemente que hasta el 50% de los pacientes con cáncer de mama HER + metastásico no tenía HER2 + CTC. Herceptin, un receptor HER2 interferir anticuerpo monoclonal demostrado beneficiarse en gran medida los pacientes cuyos tumores expresan suficientes niveles de HER2, es un tratamiento comúnmente utilizado para los pacientes con tumores HER2 + primarias 19-21. Sin embargo, estos estudios sugieren que Herceptin puede estar siendo sub-óptima utilizada y que la caracterización de CTC puede ayudar en la predicción de la respuesta al tratamiento. En última instancia, la caracterización CTC puede tener el potencial de mejorar la atención personalizada.
Investigación CTC es único en que ha utilizado en gran medida un enfoque de la cabecera-a de sobremesa. Este método, a diferencia de-sobremesa-al lado de la cama de investigación, que a menudo puede tomar años para impactar el cuidado del paciente, ha permitido a CTC rápida entrada en el ámbito clínico. Sin embargo, los médicos no se atreven a utilizar los resultados de los análisis de CTC en el tratamiento del paciente la decisión de tomaing debido a una falta de entendimiento de su biología subyacente. Por lo tanto adecuados modelos preclínicos de ratón de las técnicas de metástasis y análisis complementarios CTC se deben utilizar con el fin de investigar estas cuestiones pendientes. En general, hay dos tipos de modelos preclínicos utilizados para estudiar la cascada metastásica, (1) modelos de metástasis espontánea, que permiten el estudio de todos los pasos de la cascada metastásica, y (2) modelos de metástasis experimentales, que sólo permiten el estudio de las etapas posteriores en el proceso metastásico, tales como la extravasación y la formación de tumor secundario 22. Modelos de metástasis espontáneas, implican inyecciones de células tumorales en lugares ortotópico apropiadas (por ejemplo, inyección de células de cáncer de próstata en la glándula prostática para el estudio del cáncer de próstata). Después las células se les da tiempo para formar tumores primarios y metástasis espontáneamente a los sitios secundarios, tales como el hueso, pulmón, y los ganglios linfáticos. EnPor el contrario, los modelos experimentales de metástasis implican la inyección directa de células tumorales en el torrente sanguíneo (por ejemplo a través de la vena de la cola o la inyección intracardiaca para dirigirse a las células a lugares específicos) y, por tanto, se saltan los pasos iniciales de intravasation y difusión a los órganos secundarios 22. Hasta ahora la mayoría de los análisis de CTC en vivo en sistemas modelo se ha realizado usando ya sea 23 o adaptados técnicas CTC basado en citometría de origen humano (por ejemplo AdnaTest) 24. Aunque útil, ninguna de estas técnicas refleja adecuadamente enumeración CTC usando el CSS estándar de oro. Sobre la base de la aprobación clínica, la naturaleza estandarizada, y el uso generalizado de la CSS, el desarrollo de una técnica de captura y detección de CTC para el modelado in vivo que utiliza preparación de la muestra equivalente, procesamiento, y los criterios de identificación sería ventajoso como resultados serían comparables a los obtenido a partir de muestras de pacientes. Sin embargo, debido a la REQ volumenuirements del instrumento de preparación no es posible procesar pequeños volúmenes de sangre utilizando esta plataforma automatizada. . Además, el trabajo previo de Eliane et al 25 han demostrado que la contaminación de las muestras con células epiteliales del ratón (que también cumplen con la definición estándar CTC [EpCAM + CK + DAPI + CD45 -]) puede dar lugar a errores de clasificación de ratón las células epiteliales escamosas como CTC. Para abordar estas cuestiones una técnica adaptada que permite la utilización de los reactivos del kit CSS CTC combinados con un procedimiento de aislamiento manual fue desarrollado. La adición de un antígeno leucocitario humano marcado con FITC (HLA) de anticuerpos para el ensayo permite que las células tumorales humanas para distinguirse de ratón células epiteliales escamosas.
Este manuscrito describe la norma, desarrollada comercialmente y protocolo CSS optimizado para el procesamiento de las muestras de pacientes de sangre y las trampas más comunes que se pueden encontrar, entre ellos discrepanciasartículos camisetas que pueden conducir a errores de clasificación errónea de CTC. Además, la personalización del ensayo CSS para examinar las características de la proteína de CTC capturados y una técnica de CSS adaptado comparable que permite el enriquecimiento y detección de CTC de pequeños volúmenes de sangre en modelos preclínicos de ratón de metástasis definidas por el usuario se describen.
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Protocol
Todos los estudios humanos descritas en este manuscrito se llevaron a cabo bajo los protocolos aprobados por la Junta de Ética de Investigación Humana de la Universidad de Western. Se realizaron todos los estudios en animales de acuerdo con las recomendaciones del Consejo Canadiense de los Animales, en virtud de los protocolos aprobados por el Uso de Animales Subcomité Universidad Occidental.
1. Estándar CTC Enumeración de muestras de sangre de pacientes utilizando los CSS
1. Sangre humana Recolección y Preparación para el procesamiento en el Instrumento de preparación
- Utilizando técnicas estándar de flebotomía asépticas, dibujar un mínimo de 8,0 ml de sangre humana en un tubo CellSave 10 ml (en lo sucesivo referido como el tubo conservante CTC), que contiene ácido etileno diaminotetraacético (EDTA) y un conservante celular patentada. Invierta las 5x tubo para evitar que la sangre se coagule. Las muestras pueden ser procesadas inmediatamente o almacenarse a temperatura ambiente durante un máximo de 96 horas.
- DESMONTAJEreactivos e CSS de la nevera y permita que alcancen la temperatura ambiente antes de usar.
- Usando una pipeta desechable 10 ml y pipeta automatizada, recolectar 7,5 ml de sangre del tubo conservante CTC y dispensar lentamente la sangre en un tubo de procesamiento instrumento de preparación marcada de manera apropiada.
- Añadir 6,5 ml de tampón de dilución a cada muestra. Mezclar por inversión de muestra 5x. Centrifugar la muestra a 800 xg durante 10 minutos con el freno en la posición "off". Siga las instrucciones que aparecen en pantalla en el instrumento de preparación para cargar todas las muestras de los pacientes en el sistema para su procesamiento. Las muestras deben ser procesadas dentro de 1 hora de preparación.
2. Preparación de control para el procesamiento en el Instrumento de Preparación
- Agite suavemente el frasco de control e invertir 5x para mezclar.
- Retire con cuidado la tapa del frasco de control y colocar un tubo de procesamiento de instrumentos de preparación invertida en la parte superior del vial destapado. En un movimiento rápido, invierta lacontrolar vial, y verter el contenido en el tubo de procesamiento. Si bien invertida, chasquear suavemente los lados del vial de control para liberar el contenido restante.
- Retire con cuidado el vial de control invertidos desde el tubo de procesamiento, garantizando que ningún líquido se pierde y coloque a un lado. Usando una pipeta de 1000 l, recoger el contenido restante del vial y de la tapa y la pipeta suavemente en el tubo de procesamiento.
- Siga las instrucciones que aparecen en pantalla en el instrumento de preparación para cargar el control en el sistema para su procesamiento.
3. Escaneo de muestra en el instrumento de análisis
- Siga las instrucciones que aparecen en pantalla en el instrumento de preparación para descargar todas las muestras del sistema. Sin apretar coronar cada cartucho dispositivo magnético y toque en el dispositivo magnético utilizando las manos o mesa de laboratorio para liberar las burbujas que están pegados a los bordes del cartucho. Una vez que se han eliminado todas las burbujas, cierre bien el cartucho, coloque el dispositivo magnético plano, y incubate en la oscuridad durante al menos 20 min a temperatura ambiente. Las muestras deben ser escaneados dentro de las 24 horas de preparación.
- Encienda el instrumento de análisis e inicializar la lámpara. Una vez calentado (~ 15 min), cargue el cartucho de verificación del sistema en el instrumento de análisis y seleccione la pestaña de prueba del control de calidad. Siga las instrucciones en pantalla para llevar a cabo las medidas de control de calidad necesarios.
- Cargue una muestra en el instrumento de análisis y seleccione la ficha Prueba de paciente. Se mostrará toda la información guardada en el instrumento de preparación. Haga clic en Inicio para iniciar la exploración de la muestra. El sistema lleva a cabo un enfoque grueso y detección de bordes en el cartucho de dispositivo magnético.
- Ajuste todos los bordes como sea necesario utilizando las teclas de dirección. Seleccione Aceptar. El sistema realizará una multa enfoque y empezar a escanear muestra.
- Tras el control de la exploración de los resultados debe ser validado utilizando los criterios definidos para las células enriquecidas en alto (CK + DAPI + CD45 - APC +) y baja (CK + DAPI + CD45 - FITC +) las concentraciones. A raíz de la muestra del paciente la exploración de los resultados debe ser revisado para CTCs capturadas utilizando los criterios definidos CTC (CK + DAPI + CD45 -).
2. CTC Caracterización de marcadores definidos por el usuario utilizando el CSS
1. Preparación de marcadores definidos por el usuario y de instrumentos de inicialización
- Diluir el anticuerpo de interés utilizando primarios de bonos diluyente de anticuerpos a la concentración deseada en una taza de reactivo marcador usando la siguiente fórmula, en donde la concentración de trabajo es la concentración del anticuerpo después de la adición a la muestra y la concentración de valores es la concentración de anticuerpo en el taza de reactivo. Para múltiples muestras, ajustar los volúmenes de anticuerpos como se describe en la Tabla 1. Coloque la taza de reactivo marcador en la posición 1 en el cartucho de reactivo y LOAD cartucho sobre CSS.
Stock Concentración = (concentración de trabajo x 850 mu l) / 150 l - Recoger la sangre, preparar muestras, y cargar el instrumento de preparación como se describe en el estándar por encima de CTC Enumeración de muestras de sangre de pacientes utilizando el protocolo de CSS. Para activar Además marcador personalizado, seleccione Definido por el usuario ensayo cuando se le solicite por el instrumento de preparación. Introduzca el nombre del marcador y seleccione Guardar. Como muestras se cargan en el instrumento, el operador se le solicitará que indique que debe recibir marcador personalizado seleccionando Sí o No, según sea necesario.
2. Escaneo Muestra de marcadores definidos por el usuario en el instrumento de análisis
- Encienda el instrumento de análisis, inicializar la lámpara, y llevar a cabo el control de calidad y verificación del sistema como se describe en la Sección 3.2 de la CTC Enumeración estándar de muestras de sangre de los pacientes con el CSS
- Cargue una muestra en el instrumento de análisis y seleccione la ficha Configuración. Para inicializar el canal FITC, seleccione CellSearch CTC como ID Kit en la sección Protocolos de pruebas. Desde este menú, seleccione CTC Investigación, haga clic en el botón Editar y establezca el tiempo de exposición si lo deseas. Se recomienda que un tiempo de exposición de 1,0 segundos no ser excedido cuando utilizando el kit de CSS CTC como esto puede aumentar sangrado a través en otros canales fluorescentes utilizados para la identificación de CTC.
3. Adaptación del CSSProtocol estándar para su uso en modelos preclínicos del ratón
** Adaptado de Veridex ratón / rata CellCapture Kit (ya no está disponible en el comercio)
1. Ratón extracción de sangre y almacenamiento
- Antes de la recogida de sangre, se ejecutan ~ 30 l de EDTA 0,5 M de ida y vuelta a través de una aguja de 22 G, dejando una pequeña cantidad de EDTA en el cubo.
- Reunir un mínimo de 50 l de la sangre del ratón de los ratones previamente inyectados con células tumorales humanas a través de rutas ortotópico, vena de la cola, o intracardiaca. Recoger sangre de la vena safena (para el análisis de CTC en serie) o por punción cardiaca (para el análisis de terminal de CTC). Retire la aguja y dispensar la sangre en un Microtainer con EDTA tubo de recogida de sangre de 1 ml. Mezclar por inversión o tubo suavemente flick evitar que la sangre se coagule. La sangre puede ser procesada inmediatamente o se almacenó a temperatura ambiente durante hasta 48 horas después de la adición de un volumen igual de CytoChex conservante celular.
2. CTC Enriquecimiento
- Retire reactivos CSS de la nevera y deje que alcancen la temperatura ambiente antes de usar.
- Transferir el equivalente de 50 l de sangre completa a un 12 mm x 75 mm flujo citometría de tubo. Añadir 500 l de tampón de dilución a cada muestra, lavando cualquier sangre que queda en los lados del tubo. Si es necesario, un breve centrifugado centrífugase puede utilizar para recoger cualquier sangre restante.
- Vórtice suavemente el ferrofluido anti-EpCAM y añadir 25 l de cada muestra mediante la colocación de la punta de la pipeta directamente en la muestra. Añadir 25 l de reactivo Mejora captura y agitar suavemente para mezclar. Incubar las muestras a temperatura ambiente durante 15 min.
- Coloque los tubos de muestra en el imán y se incuba durante 10 min. Mientras que los tubos de muestra son todavía en el imán, utilizar una pipeta de vidrio para aspirar cuidadosamente el líquido residual sin tocar la pared del tubo al lado del imán y desechar.
3. CTC tinción
- Quitar los tubos de muestra del imán y resuspender en 50 l de ácido nucleico Dye, 50 l de reactivo de tinción, 1,5 l de anti-ratón CD45-APC, 5,0 l de anti-humano HLA-Alexa Fluor 488, y 100 l de permeabilización Reactivo. Para múltiples muestras, estos reactivos se pueden mezclar previamente y 206,5 l de mezcla se pueden añadir a cada tubo. Vortex suavemente para mezclare incubar durante 20 min a temperatura ambiente en la oscuridad.
- Añadir 500 l de tampón de dilución, vórtice suavemente, tubos de muestra en lugar del imán, y se incuba durante 10 min. Mientras que los tubos de muestra son todavía en el imán, utilizar una pipeta de vidrio para aspirar cuidadosamente el líquido residual sin tocar la pared del tubo al lado del imán y desechar. Quitar los tubos de muestra del imán y resuspender en 350 l de tampón de dilución. Vortex suavemente para mezclar.
4. Magnética dispositivo de carga
- Con una punta de carga de gel, transferir cuidadosamente la totalidad del volumen del tubo de muestra en un cartucho en el dispositivo magnético. Comience en la parte inferior del cartucho y retirar lentamente la punta como se dispensa la muestra.
- Una vez que la muestra ha sido transferida, sin apretar tapar el cartucho de dispositivo magnético y toque en el dispositivo magnético utilizando las manos o mesa de laboratorio para liberar las burbujas que están pegados a los bordes del cartucho como se describe en la Sección 3.1 de la CTC Enumeración estándar de muestras de sangre de los pacientes utilizando el CSS.
- Pop las burbujas utilizando una aguja estéril 22 G atrapándolos entre el bisel y el borde del cartucho. Una vez que se han eliminado todas las burbujas, la tapa con firmeza el cartucho, coloque el dispositivo magnético plana, y se incuban en la oscuridad durante al menos 10 min. Las muestras deben ser escaneados dentro de las 24 horas de preparación.
5. Escaneo de muestras separadas de forma manual en el instrumento de análisis
- Encienda el instrumento de análisis, inicializar la lámpara, y llevar a cabo el control de calidad y verificación del sistema como se describe en la Sección 3.2 de la CTC Enumeración estándar de muestras de sangre de los pacientes que utilizan el protocolo CSS.
- Cargue la muestra en el instrumento de análisis y seleccione la ficha Configuración. Borre los datos existentes en el botón datos dispositivo magnético haciendo clic en el botón de formato de muestra. Habilitar el canal FITC unnd establecer el tiempo de exposición a 1,0 seg como se describe en la sección 2.2 de la CTC Caracterización de marcadores definidos por el usuario utilizando el CSS.
- Haga clic en la ficha Prueba de paciente y seleccione Editar para introducir la información de la muestra. Seleccione CellSearch CTC como ID Kit y CTC de Investigación como el Protocolo de prueba. Introduzca el resto de la información necesaria, como se indica como el asterisco. Guardar la información de la muestra y haga clic en Iniciar.
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Representative Results
Enumeración Ensayo CTC estándar
La sensibilidad y especificidad de la CSS ha sido bien documentado en la literatura. Sin embargo, para validar la recuperación de CTC equivalente, se dispararon (1000 LNCaP células de cáncer de próstata humano) y muestras de sangre humana no enriquecidos de donantes voluntarios sanos fueron procesadas en el CSS mediante el protocolo CSSCTC estándar. Como era de esperar, las muestras no enriquecidos estaban libres de CTCs, 0,00 ± 0,00%, y la recuperación de CTC se demostró que el 86,9 ± 4,71% para las muestras adicionadas (Figura 1A). Imágenes de la galería CSS obtenidos a partir de muestras contaminadas fueron de una calidad óptima y CTC eran fáciles de distinguir de los no-CTC. Sin embargo, cuando se procesan muestras obtenidas de pacientes con cáncer, la identificación de la CTC es un poco más difícil, con muchas células que aparece más pequeño en tamaño y ser menos fácilmente distinguible de no-CTC (Figura 1B). Además, en la revisión de muestras de pacientes 6 categorías de eventos fueron de identificacióned que eran artículos que se discrepantes entre los revisores (Figura 1C). Estos 6 categorías incluyen, (1) los pequeños acontecimientos que no cumplieron con el requisito de 4 micras de tamaño para la clasificación CTC, (2) los artículos con tenue CK y / o tinción DAPI; (3) estar justificados (se deben contar como CTC) frente injustificada (no debe ser contado como un CTC) traspase al interior del canal CD45-APC causado por la tinción de CK-PE brillante; (4) FITC + eventos, (5) imágenes pixeladas en la CK y / o canales de DAPI, y (6) eventos con DAPI que es mayor que las imágenes de CK o aquellos con tinción DAPI que no se superponen> 50% de la imagen con CK. Para las categorías (2) y (5) existen criterios específicos para la clasificación CTC. Para la categoría (2), elementos con tenue CK / DAPI se pueden clasificar como CTC siempre que una membrana intacta se puede observar en el canal de CK y unDAPI imagen de tamaño apropiado se observó. Para la categoría (5), los artículos con CK pixelada / DAPI no pueden ser clasificados como CTCs si alguna pixelación se observa en el canal de CK. Sin embargo, la pixelación es aceptable en el canal de DAPI a condición de que no es demasiado grave (es decir, la imagen es completamente blanca en un fondo, no hay áreas grises - descritos por Janssen Diagnostics (anteriormente Veridex) como pintura blanca sobre un fondo negro) o difusa (debe seguirán apareciendo de forma oval y encajar dentro de la CK).
Definido por el usuario Marker Ensayo Desarrollo
Adaptación de la CSS para caracterizar los CTC para los marcadores definidos por el usuario requiere considerable trabajo con controles rigurosos y ha sido descrito previamente 16. Como regla general, la optimización apropiada de cualquier marcador definido por el usuario requiere que se empleen controles negativos para asegurar que los resultados son específicos. Se obtienen los mejores resultados cuando las muestras enriquecidas se procesan con tantoun control de IgG no específica en lugar del anticuerpo diana y con el diluyente anticuerpo solo como se describe previamente. Varias concentraciones de anticuerpos de destino y el tiempo de exposición también deben ser evaluados y validados utilizando líneas celulares con densidades de antígeno (negativos) de alta, baja, y ausentes. Condiciones protocolo óptimos se obtienen cuando el ensayo demuestra tanto una alta sensibilidad para el antígeno diana y de poco ruido de fondo de la unión no específica 16.
Un ejemplo de este trabajo en marcha con un marcador de células madre del cáncer, CD44, se presenta aquí. Las pruebas iniciales con este marcador comenzó a usar el kit estándar CSS CTC (en adelante denominado el kit tradicional CTC), que utiliza el canal FITC para el desarrollo de marcador definido por el usuario. Usando el kit tradicional CTC, se demostró que, después de la optimización significativa, el número máximo de CTC que podrían ser calificadas como CD44 + fue de 69,3 ± 2,67% utilizando muestras adicionadas con 1000 MDA-MB-468 human células de mama con cáncer, conocidos para demostrar la alta expresión de CD44 con la mayoría de las células (98,4 ± 0,90%; según lo determinado por citometría de flujo) que expresan esta proteína (Figura 2A). Sobre la base de estos hallazgos se planteó la hipótesis de que el kit de CSS CXC comercialmente disponible podría producir mejores resultados. Este kit permite una mejor visualización de los marcadores con una densidad menor de antígenos (~ 50.000 antígenos / célula) en comparación con el kit tradicional CTC (optimizado para marcadores con una densidad de ~ 100.000 antígenos / célula) mediante la inversión del canal de fluorescencia en el que el CK8 / 18/19 (representado tradicionalmente en el canal PE) y el marcador del usuario de interés (tradicionalmente representado en el canal FITC) se representan (en lo sucesivo, por lo tanto, el kit de CXC se denominará como el kit de CTC baja densidad de antígeno) 26. Después de la optimización significativa, se demostró que este cambio permite para mejorar la tinción de CD44, con 98,8 ± 0,51% de CTC clasificados como CD44 + </ Sup> utilizando CD44-PE a una concentración de 1,0 g / ml y un tiempo de exposición de 0,6 segundos (Figura 2A). Optimización adecuada de cualquier marcador definido por el usuario también se requiere la validación utilizando una alta densidad de antígeno (MDA-MB-468), baja densidad de antígeno (21 NT), y (LNCaPs) las líneas celulares negativas para el marcador de interés (Figura 2B).
Análisis CTC en modelos preclínicos del ratón
Para determinar la sensibilidad y especificidad del protocolo CSS ratón adaptado, Punta (1.000 células de cáncer de próstata humano LNCaP) y muestras de sangre de ratón no enriquecidos fueron procesados manualmente y se escanean en el instrumento de análisis y se compararon con los resultados obtenidos utilizando la misma línea celular procesada utilizando la norma protocolo de CSS automatizado en el instrumento de preparación (Figura 3A). Como era de esperar, las muestras no enriquecidos estaban libres de CTCs utilizando ambos ensayos, 0,00 ± 0,00% y la recuperación de CTC usando el kit de ratón adaptado (90,8 ± 5,18%) no fue significantly diferentes de los resultados obtenidos utilizando el sistema automatizado estándar (86,9 ± 4,71%, p> 0,05). Las imágenes obtenidas utilizando el protocolo manual de ratón adaptado no difieren de los observados usando la técnica automatizada estándar, con la excepción de la adición del marcador de HLA-FITC. Además, ratón células epiteliales escamosas no se tiñen positivamente para HLA-FITC (Figura 3B). Para confirmar que esta técnica era tan sensible como el protocolo CSS estándar para el aislamiento de bajo número de CTC, diluciones en serie se realizaron con muestras de sangre de punta y la correlación de número esperado de células frente al número recuperado de las células se evaluó (Figura 3C). Los resultados demuestran que CTC eficaz podría ser recuperado a una sensibilidad de 5 células/50 l de sangre completa utilizando este ensayo. Estos valores se correlacionaron con los resultados esperados con un r 2 = 0,99.
Figura 2. Caracterización de los CTC para los marcadores definidos por el usuario utilizando el CSS. (A) Porcentaje de células clasificado como CD44 + usando los kits de CTC y CXC en el CSS (n = 3). Los datos se presentan como la media ± SEM. *** = Significativamente diferente (P <0,0005). (B) Representante imágenes de la galería CSS de sangre de un donante voluntario sano (7,5 ml), se dispararon con ~ 1.000 células de la línea celular identificado, incubados con 1,5 mg / ml de lucha -CD44-PE, y escaneado en un tiempo de exposición de 0,2 seg. Cuadrados de color naranja indican CD44 + </ Sup> CTC, identificado como CK + / DAPI + / CD45 - / CD44 -. PE + Haga clic aquí para ver la imagen más grande.
Figura 3. Adaptación del procedimiento CSS para uso en modelos preclínicos de ratón de metástasis. (A) de recuperación de CTC usando el protocolo CSS ratón adaptado medida como un porcentaje del número de células de punta y en comparación a los resultados obtenidos utilizando el protocolo estándar CSS humana. Las células se contaron mediante un hemocitómetro y ~ 1000 células de cáncer de próstata humano LNCaP se enriquecieron en 7,5 ml de sangre humana. Muestras de sangre humana no enriquecida se utilizaron como un control negativo (n = 3). Los datos se presentan como la media ± SEM. ns = no significativo. (B) (C) Análisis de correlación y regresión lineal de la esperada en función del número recuperado de las células tumorales con púas en diversas concentraciones . Células de cáncer de próstata humano LNCaP se contaron inicialmente por hemocitómetro y posteriormente se dispararon en la sangre del ratón a una concentración de ~ 1000 células/50 tumoral l de sangre. Sangre de ratón con pinchos se diluye en serie a una concentración de 5 tumor l células/50 y procesados utilizando el protocolo de ratón adaptado CSS (n = 3). Haga clic aquí para ver la imagen más grande.
| N º de muestras con User Defined Marker Agregado | Volu totalme a Añadir a Reactivo Cup (l) |
| 1 | 450 |
| 2 | 600 |
| 3 | 750 |
| 4 | 900 |
| 5 | 1050 |
| 6 | 1200 |
| 7 | 1350 |
| 8 | 1500 |
Tabla 1. . Requerimientos de volumen total de la CSS en el tratamiento de varios números de las muestras con un marcador definido por el usuario ** Adaptado de Libro Blanco Veridex (disponible en: http://www.veridex.com/pdf/CXC_Application_Guideline.PDF ).
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Discussion
A pesar del desarrollo de muchas nuevas tecnologías de CTC desde la introducción de la CSS en el año 2004, esta técnica sigue siendo la única tecnología clínicamente aprobada hoy en el mercado, por lo que se considera el estándar de oro actual para la detección y enumeración CTC. Este manuscrito ha demostrado que a pesar de la CSS tiene rigurosos estándares de control de calidad que puede estar sujeto a sesgos de interpretación y que la identificación de CTC en muestras de pacientes es muy diferente de la identificación en muestras adicionadas. Se identificaron seis categorías de artículos de uso común discrepantes que puede causar errores de clasificación de CTC que se produzca. Estos elementos discrepantes destacan la necesidad de varios revisores en cada muestra de pacientes tratados en este instrumento. Además, las diferencias observadas en pinchos frente paciente obtenidos CTCs demuestra que existe una necesidad de nuevas tecnologías de CTC para ser validados en las dos muestras de pinchos y de pacientes. Además, estas nuevas tecnologías debe be en comparación con el estándar de oro CSS usando la prueba de muestras separadas de ambas muestras enriquecidas y de pacientes, lo más eficiente la captura de CTC de muestras enriquecidas sólo no refleja necesariamente CTC eficiencia de la captura de muestras de pacientes.
Aunque el CSS tiene la capacidad para llevar a cabo la caracterización de los CTC capturadas, es bastante restringida con respecto a la optimización altamente adaptable. En general, los únicos parámetros que se pueden cambiar en este instrumento para la optimización de los marcadores definidos por el usuario son la concentración de anticuerpo y la longitud de tiempo que el fluoróforo está expuesto a la lámpara de mercurio. Esta capacidad limitada para la optimización puede presentar problemas cuando se trabaja en marcha marcadores definidos por el usuario en el CSS. Una solución propuesta en este manuscrito (descrito en detalle previamente 16) es el uso del kit de CTC baja densidad de antígeno que cambia el FITC y PE canales fluorescentes que permiten una mejor visualización de los marcadores con una baja densidad de antígeno. Independientementede los cuales se utiliza el kit (kit CTC densidad del antígeno tradicional o baja) hay varios pasos necesarios que deben llevarse a cabo para asegurar la sensibilidad marcador apropiado, la especificidad y la optimización. En primer lugar, la sensibilidad del ensayo debe evaluarse en comparación con un método bien validado, tales como la citometría de flujo, que permitirá la determinación del nivel de detección esperado (es decir, el porcentaje de células en la población de células que expresan el marcador de interés) de la facilidad de uso marcador definido. En segundo lugar, el ensayo debe ser evaluado por su capacidad para detectar el marcador de interés en líneas celulares con diferentes niveles de expresión (es decir, densidades de antígeno de alta y baja) y su especificidad debe ser validado en una línea celular que es negativa para el marcador de interés . En todos los casos, todas las líneas celulares deben ser probados usando un único control de las células (sin anticuerpo añadido), el control de IgG apropiada, y el anticuerpo de interés en diversas concentraciones y tiempos de exposición para determinar el most ajustes apropiados que garanticen la optimización del marcador definido por el usuario. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que, aunque la caracterización de los CTC es posible en el CSS, actualmente sólo un marcador definido por el usuario de interés puede ser explorada en cada muestra, y que el sistema es muy limitado con respecto a las aplicaciones posteriores, debido a la dura procesamiento de las muestras.
El enfoque único-de noche-para sobremesa utilizado en la investigación ha permitido a CTC para la entrada rápida de este ensayo útil en el ámbito clínico. Sin embargo, ha dado lugar a una comprensión inadecuada de la biología básica de estas células raras. Por lo tanto se requieren el desarrollo y la optimización de los ensayos que permiten la evaluación de los CTC en preclínica en modelos de ratón in vivo de cáncer. Este manuscrito describe un protocolo CSS adaptado que permite la CTC que deben evaluarse en 50 l volúmenes de sangre de ratón, ideal para los modelos experimentales de recogida de CTC serie. Este manuscrito demonstrates que CTC enumeración usando este protocolo es comparable a los resultados obtenidos usando el CSS en combinación con el kit tradicional CTC, con diferencias significativas en la eficiencia de la captura de CTC entre las técnicas automatizadas y manuales de separación. Además, durante el desarrollo de este ensayo se reconoció, como se ha descrito previamente en la literatura 25, que el ratón escamosas contaminación de células epiteliales puede hacer la identificación precisa de los CTC más difícil y algunas veces imposible. Por lo tanto, para combatir este problema de una definida por el usuario HLA-Alexa Fluor 488 esta en este protocolo para garantizar que sólo las células humanas (CK + DAPI + CD45 - HLA - Alexa Fluor 488 +) están siendo asignados apropiadamente como CTC. Es importante tener en cuenta que la línea celular LNCaP utilizado en este manuscrito es HLAlow y por lo tanto de HLA-Alexa Fluor 488 puede necesitar ser ajustadas individualmente para líneas celulares con diferentes expresión de HLA. Aunque hemos añadido un HLA-Alexa Fluor 488 a nuestro protocolo para asegurar la identificación exacta de los CTC, hay que destacar que la gran mayoría de ratón las células epiteliales escamosas eran fácilmente identificables por su morfología y se limitaron en el número de células (0,33 ± 0,24 events/50 l, n = 9). El número de células más elevada (hasta 11 events/50 mu l) sólo se observaron cuando la extracción de sangre (por punción cardíaca) fue difícil y los reiterados intentos fueron necesarios. Por lo tanto se propone que si se desea, la caracterización en-sistema de CTC podría conseguirse omitiendo este marcador. Además, aunque no se describe aquí, anticipamos que colección de CTC y caracterización adicional aguas abajo de CTC utilizando otros métodos podría conseguirse fácilmente como se ha demostrado anteriormente utilizando el CSS 27,28.
Aunque el CSS se ha utilizado clínicamente para detectar eficazmente las CTC en la sangre de mama metastásico, de próstata y pacientes con cáncer colorrectal 4,10,29, que tiene varios Limitations. En hasta un 35% de los pacientes con diversos cánceres metastásicos, CTC son indetectables a pesar de la presencia de enfermedad sistémica generalizada 30. Esta falta de detección ha sido propuesto para ser como resultado de la transición epitelial-mesenquimal, un proceso bien documentado conocido para mejorar la invasión del cáncer, metástasis, y la agresividad general 31. Esta transición se ha asociado con una reducción significativa en los marcadores epiteliales, tales como EpCAM, y un aumento correspondiente en mesenquimales marcadores 32. Varios estudios han demostrado recientemente que la presencia de estos marcadores mesenquimales en CTC son indicativos de peor pronóstico y que muchas de estas células carecen de expresión de marcadores epiteliales que serían necesarias para su detección usando el CSS 24,33-38. Esto sugiere que la definición estándar CSS pueden faltar algunos de los CTCs más agresivos.
A pesar de las limitaciones descritas, se prevé ªprotocolos e descritos en este manuscrito serán herramientas importantes para mejorar el análisis CTC usando el CSS, el desarrollo de nuevas tecnologías de la CTC, la optimización de los marcadores definidos por el usuario, y una mejor comprensión de la biología CTC utilizan en modelos de ratones preclínicos in vivo. Tomados en conjunto, estos protocolos proporcionarán un recurso útil para los usuarios de esta plataforma de interesados en la investigación preclínica y clínica relacionada con la metástasis y la CTC.
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Disclosures
El autor (ALA) recibió fondos que fue proporcionado por Janssen Oncología, cuya compañía matriz Johnson & Johnson también es propietaria de Janssen Diagnósticos LLC, que produce reactivos e instrumentos utilizados en este artículo.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Instituto de Ontario de Investigación del Cáncer (# 08NOV230), la Fundación Canadiense para la Innovación (# 13199), el cáncer de próstata Canadá, Janssen Oncología, el Programa Regional del Cáncer de Londres, y el apoyo de los donantes de John y Donna Bristol a través el London Health Sciences Foundation (ALA). LEL es apoyado por un Banting y Charles Best Frederick Canada Graduate Beca Premio de Doctorado. ALA es apoyado por un Premio al Investigador Nueva CIHR y un Premio Investigador Temprana del Ministerio de Investigación e Innovación de Ontario.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M EDTA | |||
| Anti-human CD44-FITC | BD Pharmigen | 555478 | |
| Anti-human CD44-PE | BD Pharmigen | 555479 | |
| Anti-human HLA-Alexa Fluor 488 | BioLegend | 311415 | |
| Anti-mouse CD45-APC | eBioscience | 17-0451-82 | |
| Bond Primary Antibody Diluent | Leica | AR9352 | |
| CellSave Preservative Tubes | Veridex | 952820 (20 pack) 79100005 (100 pack) | |
| CellSearch CTC Control Kit | Veridex | 7900003 | |
| CellSearch CTC Kit | Veridex | 7900001 | |
| CellSearch CXC Control Kit | Veridex | 7900018RUO | |
| CellSearch CXC Kit | Veridex | 7900017RUO | |
| Instrument Buffer | Veridex | 7901003 | |
| Streck Cell Preservative (aka CytoChex) | Streck | 213350 | |
| 1 ml Syringe | |||
| 10 ml Serological pipette | |||
| 1,000 µl Pipette | |||
| 1,000 µl Pipette tips | |||
| 12 mm x 75 mm Flow tubes | |||
| 200 µl Gel loading tips | |||
| 200 µl Pipette | |||
| 22 G Needle | |||
| 5 3/4 in Disposible Pasteur pipet | VWR | 14672-200 | |
| 5 ml Serological pipette | |||
| Automated pipettor | |||
| Capillary Blood Collection Tube (EDTA) | BD Microtainer | 365974 | |
| CellSearch Analyzer II | Veridex | 9555 | Includes magnests and verification cartirdges |
| CellSearch AutoPrep System | Veridex | 9541 | |
| Centrifuge | |||
| MagCellect Magnet | R&D Systems | MAG997 | |
| Small Latex Bulb | VWR | 82024-550 | |
| Vortex |
References
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