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Medicine

नैदानिक ​​और preclinical अनुसंधान अनुप्रयोगों के लिए ट्यूमर सेल (सीटीसी) Assays घूम semiautomated का अनुकूलन

Published: February 28, 2014 doi: 10.3791/51248
Automatic Translation
1,2, 3, 3,4, 1,2,4,5
1London Regional Cancer Program, London Health Sciences Centre, 2Department of Anatomy & Cell Biology, Schulich School of Medicine and Dentistry, Western University, 3Special Hematology/Flow Cytometry, London Health Sciences Centre, 4Lawson Health Research Institute, 5Department of Oncology, Western University

Summary

परिसंचारी ट्यूमर कोशिकाओं (CTCs) कई metastatic कैंसर में शकुन हैं. इस पांडुलिपि सोने के मानक CellSearch प्रणाली (सीएसएस) सीटीसी गणन मंच और डाला आम misclassification त्रुटियों का वर्णन करता है. इसके अलावा, दो अनुकूलित प्रोटोकॉल इस तकनीक का उपयोग कर मेटास्टेसिस के preclinical माउस मॉडल में CTCs और सीटीसी गणन के उपयोगकर्ता परिभाषित मार्कर लक्षण वर्णन के लिए वर्णित हैं.

Abstract

कैंसर से संबंधित मौतों के बहुमत metastatic रोग के विकास के लिए बाद में पाए जाते हैं. यह बेहद घातक बीमारी चरण ट्यूमर कोशिकाओं (CTCs) परिसंचारी की उपस्थिति के साथ जुड़ा हुआ है. इन दुर्लभ कोशिकाओं metastatic स्तन, प्रोस्टेट, और कोलोरेक्टल कैंसर में नैदानिक ​​महत्व का होना प्रदर्शित किया गया है. नैदानिक ​​सीटीसी का पता लगाने और गणन में वर्तमान सोने के मानक एफडीए को मंजूरी दे दी CellSearch प्रणाली (सीएसएस) है. इस पांडुलिपि मानक इस मंच द्वारा उपयोग प्रोटोकॉल के साथ ही रूपरेखा मानक का उपयोग कर, रोगी CTCs की प्रोटीन लक्षण वर्णन के लिए उपयोगकर्ता परिभाषित मार्कर अनुकूलन और खून की बहुत कम मात्रा में सीटीसी को पकड़ने के लिए एक तुलनीय प्रोटोकॉल की विस्तृत प्रक्रिया का वर्णन है कि दो अतिरिक्त अनुकूलित प्रोटोकॉल सीएसएस अभिकर्मकों, मेटास्टेसिस के विवो preclinical माउस मॉडल में अध्ययन के लिए. इसके अलावा, स्वस्थ दाता रक्त के बीच सीटीसी गुणवत्ता में अंतर मरीज रक्त samp बनाम टिशू कल्चर से कोशिकाओं के साथ नुकीलालेस डाला जाता है. अंत में, सीटीसी misclassification त्रुटियों के लिए नेतृत्व कर सकते हैं कि कई आमतौर पर प्रतिकूल आइटम रेखांकित कर रहे हैं. साथ में ले ली, इन प्रोटोकॉल मेटास्टेसिस और CTCs से संबंधित preclinical और नैदानिक ​​अनुसंधान में रुचि इस मंच के उपयोगकर्ताओं के लिए एक उपयोगी संसाधन प्रदान करेगा.

Introduction

2013 में यह 580,350 व्यक्तियों कैंसर से मर जाएगा अनुमान है कि इस रोग की कि 1660290 नए मामले अकेले 1 संयुक्त राज्य अमेरिका में निदान किया जाएगा. इन मौतों के बहुमत metastatic रोग 2 के विकास के लिए बाद में पाए जाते हैं. मेटास्टेसिस और metastatic झरना के एक सीमित समझ के उपचार में प्रभावी उपचार की मौजूदा कमी की बीमारी के इस स्तर अत्यधिक घातक बना देता है. खून के भीतर ट्यूमर कोशिकाओं (CTCs) परिसंचारी की उपस्थिति metastatic रोग 3 के साथ सहसंबंधी प्रदर्शन किया गया है. इन कोशिकाओं को अत्यंत दुर्लभ हैं और उनकी पहचान metastatic स्तन 4, प्रोस्टेट 5 में समग्र अस्तित्व का संकेत है, और कोलोरेक्टल 6 कैंसर. कम के साथ उन रोगियों या सैम में कोई detectable CTCs की तुलना में जब इन रोगियों में, की उपस्थिति ≥ 5 (स्तन और प्रोस्टेट) या रक्त के 7.5 मिलीलीटर में ≥ 3 (कोलोरेक्टल) CTCs गरीब रोग का निदान का संकेत हैई रक्त की मात्रा. इसके अलावा, चिकित्सकीय हस्तक्षेप के दौरान या बाद सीटीसी संख्या में परिवर्तन अक्सर जल्दी ही वर्तमान में उपयोग की तकनीक 7-10 से, उपचार की प्रतिक्रिया का एक कारक के रूप में उपयोगी होने के लिए प्रदर्शन किया गया है.

यह metastatic कैंसर के रोगियों में, CTCs 10 5 -10 7 रक्त कोशिकाओं mononuclear प्रति लगभग 1 सीटीसी की एक आवृत्ति पर पाए जाते हैं और स्थानीय रोग के साथ रोगियों में, इस आवृत्ति (1 से 8 10 में ~) भी कम हो सकता है, कि अनुमान लगाया गया है. इन कोशिकाओं के दुर्लभ प्रकृति यह मुश्किल सही और मज़बूती CTCs 11 का पता लगाने और विश्लेषण करने के लिए कर सकते हैं. कई तरीकों (पहले 12-14 समीक्षा) रक्त घटकों आसपास से उन्हें अलग गुण है कि शोषण से इन कोशिकाओं को समृद्ध और पता लगाने के लिए उपयोग किया गया है. सामान्य में, सीटीसी गणन एक संवर्धन कदम और एक का पता लगाने के कदम दोनों की आवश्यकता है कि एक दो भाग प्रक्रिया है. परंपरागत रूप से, संवर्धन कदम मानसिक में मतभेद पर भरोसाCTCs (सेल आकार, घनत्व, विरूपता) या प्रोटीन मार्कर अभिव्यक्ति पर (यानी उपकला कोशिका आसंजन अणु [EpCAM], cytokeratin [सी]) की राजनैतिक गुणों. संवर्धन के बाद, सीटीसी का पता लगाने न्यूक्लिक एसिड आधारित assays और / या cytometric दृष्टिकोण हैं जिनमें से सबसे आम के विभिन्न तरीकों की एक संख्या में किया जा सकता है. इन रणनीतियों में से प्रत्येक अलग फायदे और नुकसान होने, हालांकि वे सभी मानकीकरण की कमी है, अद्वितीय हैं, नैदानिक ​​सेटिंग में प्रवेश के लिए एक जरूरत. CellSearch प्रणाली (सीएसएस) इसलिए प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी और एंटीबॉडी आधारित तकनीक 4-6 का उपयोग मानव रक्त में दुर्लभ CTCs का पता लगाने और गणन के लिए एक मानकीकृत पद्धति प्रदान करने के लिए विकसित किया गया था. यह मंच वर्तमान में सीटीसी गणन में स्वर्ण मानक माना जाता है और क्लिनिक 15 में उपयोग के लिए अमेरिकी खाद्य एवं औषधि प्रशासन (एफडीए) ने मंजूरी दे दी है केवल तकनीक है.

सीएसएस एक दो घटक मंच consistin हैजी, मानव रक्त के नमूनों की तैयारी, और इन स्कैन जो (इसके बाद के विश्लेषण के साधन के रूप में करने के लिए कहा गया है) (2) CellTracks विश्लेषक द्वितीय, automates जो (इसके बाद तैयारी साधन के रूप में) (1) CellTracks AutoPrep प्रणाली, तैयारी निम्न नमूनों. Leukocytes तैयारी साधन contaminating से CTCs अलग करने के लिए मध्यस्थता एक एंटीबॉडी, ferrofluid आधारित चुंबकीय जुदाई दृष्टिकोण और अंतर प्रतिदीप्ति धुंधला कार्यरत हैं. प्रारंभ में, सिस्टम लोहा नैनोकणों संयुग्मित विरोधी EpCAM एंटीबॉडी का उपयोग CTCs लेबल. नमूना तो एक चुंबकीय क्षेत्र में incubated है, और सभी unlabeled कोशिकाओं aspirated हैं. चयनित ट्यूमर कोशिकाओं के fluorescently लेबल एंटीबॉडी और एक परमाणु धुंधला अभिकर्मक मिलकर, एक अंतर प्रतिदीप्ति दाग में resuspended, और incubated हैं. अंत में, नमूना, एक चुंबकीय कारतूस को हस्तांतरित (इसके बाद चुंबकीय उपकरण के रूप में करने के लिए कहा गया है) एक MagNest कहा जाता है, और सुप्रीम कोर्ट कर रहा हैविश्लेषण साधन का उपयोग कर anned.

विश्लेषण साधन एक 10X उद्देश्य लेंस का उपयोग, अलग प्रतिदीप्ति फिल्टर, उपयुक्त फ्लोरोसेंट कण को ​​अनुकूलित प्रत्येक का उपयोग कर तैयार नमूने स्कैन करने के लिए प्रयोग किया जाता है. CTCs विरोधी EpCAM, विरोधी अखिल सी.के.-phycoerythrin (पीई) से बंधे हैं कि कोशिकाओं (CK8, 18, और 19), और परमाणु दाग ​​4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) के रूप में पहचाने जाते हैं. इसके विपरीत, contaminating leukocytes विरोधी CD45-allophycocyanin (एपीसी) और DAPI से बंधे हैं कि कोशिकाओं के रूप में पहचाने जाते हैं. स्कैनिंग के बाद, कंप्यूटर से परिभाषित संभावित ट्यूमर कोशिकाओं उपयोगकर्ता के लिए प्रस्तुत कर रहे हैं. इन छवियों से, उपयोगकर्ता की घटनाओं CTCs हैं जो निर्धारित करने के लिए ऊपर चर्चा परिभाषित मानकों और अंतर धुंधला का उपयोग गुणात्मक विश्लेषण को रोजगार चाहिए.

सीटीसी गणना के लिए एक मानकीकृत पद्धति प्रदान करने के अलावा, सीएसएस ब्याज की प्रोटीन मार्कर पर आधारित CTCs की आणविक लक्षण वर्णन के लिए अनुमति देता है. इस पूछताछ गएक सीटीसी पहचान 16 के लिए आवश्यक नहीं एक fluorescein आइसोथियोसाइनेट (FITC) प्रतिदीप्ति चैनल का उपयोग कर, एकल कोशिका स्तर पर प्रदर्शन किया. इस मंच आणविक लक्षण वर्णन के लिए क्षमता प्रदान करता है, प्रोटोकॉल विकास और अनुकूलन की विस्तृत प्रक्रिया अच्छी तरह से परिभाषित नहीं है. तीन व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मार्करों epidermal वृद्धि कारक रिसेप्टर (EGFR), मानव epidermal वृद्धि कारक रिसेप्टर 2 (HER2), और इंसुलिन की तरह वृद्धि कारक 1 रिसेप्टर (IGF-1R) सहित सीएसएस के साथ प्रयोग के लिए निर्माता द्वारा विकसित किया गया है. HER2 विश्लेषण, सीएसएस के साथ संयोजन में, नैदानिक ​​निर्णय लेने को सूचित करने के लिए और संभवतः मौजूदा उपचार दिशानिर्देशों में परिवर्तन करने के लिए सीटीसी लक्षण वर्णन के लिए संभावित वर्णन करने के लिए कई समूहों द्वारा उपयोग किया गया है. उदाहरण के लिए, Fehm एट अल. 17 HER2 प्राथमिक ट्यूमर के साथ स्तन कैंसर के रोगियों के लगभग एक तिहाई HER2 + CTCs था कि प्रदर्शन किया. इसके अलावा, लियू एट अल.18 हाल ही में उसके + metastatic स्तन कैंसर के साथ रोगियों का 50% HER2 + CTCs नहीं था कि सूचना दी. Herceptin, बहुत ट्यूमर जिसका HER2 के पर्याप्त स्तर व्यक्त, HER2 + प्राथमिक ट्यूमर 19-21 के साथ रोगियों के लिए आमतौर पर उपयोग किया उपचार है रोगियों को लाभ का प्रदर्शन मोनोक्लोनल एंटीबॉडी हस्तक्षेप एक HER2 रिसेप्टर. हालांकि, इन अध्ययनों Herceptin उप बेहतर उपयोग और सीटीसी लक्षण वर्णन उपचार की प्रतिक्रिया की भविष्यवाणी करने में सहायता कर सकते हैं जा रहा है कि हो सकता है. अंत में, सीटीसी लक्षण वर्णन व्यक्तिगत देखभाल में सुधार करने की क्षमता हो सकती है.

यह काफी हद तक एक बिस्तर से benchtop दृष्टिकोण का उपयोग किया गया है कि में सीटीसी अनुसंधान अद्वितीय है. इस विधि अक्सर रोगी की देखभाल प्रभाव की साल लग सकते हैं जो benchtop को बिस्तर अनुसंधान के विपरीत, नैदानिक ​​सेटिंग में CTCs जल्दी प्रवेश की अनुमति दी है. हालांकि, चिकित्सकों रोगी उपचार निर्णय पहुंच में सीटीसी विश्लेषण से परिणाम का उपयोग करने से हिचक रहे हैंकारण अपनी अंतर्निहित जीव विज्ञान की समझ की कमी रही है. इसलिए मेटास्टेसिस और पूरक सीटीसी विश्लेषण तकनीक का उपयुक्त preclinical माउस मॉडल इन बकाया सवालों की जांच के क्रम में उपयोग किया जाना चाहिए. सामान्य में, metastatic झरना के सभी चरणों के अध्ययन के लिए अनुमति देते हैं जो metastatic झरना अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया preclinical मॉडल के दो प्रकार, (1) सहज मेटास्टेसिस मॉडल, वहाँ रहे हैं, और केवल के लिए अनुमति देते हैं जो (2) प्रायोगिक मेटास्टेसिस मॉडल, ऐसे परिस्त्राव और माध्यमिक ट्यूमर गठन के रूप में 22 metastatic प्रक्रिया में बाद के चरणों का अध्ययन. सहज मेटास्टेसिस मॉडल, उचित orthotopic स्थानों (प्रोस्टेट कैंसर के अध्ययन के लिए प्रोस्टेट ग्रंथि में प्रोस्टेट कैंसर की कोशिकाओं की जैसे इंजेक्शन) में ट्यूमर सेल इंजेक्शन शामिल है. कोशिकाओं तो प्राथमिक ट्यूमर के रूप में और अनायास ऐसी हड्डी, फेफड़े और लिम्फ नोड्स के रूप में माध्यमिक साइटों के लिए metastasize करने के लिए समय दिया जाता है. मेंइसके विपरीत, प्रयोगात्मक मेटास्टेसिस मॉडल (विशिष्ट स्थानों के लिए कोशिकाओं को लक्षित करने के लिए पूंछ नस या intracardiac इंजेक्शन के माध्यम से उदा) खून में ट्यूमर कोशिकाओं के प्रत्यक्ष इंजेक्शन शामिल है और इसलिए माध्यमिक अंगों तक 22 intravasation और प्रसार का प्रारंभिक कदम को छोड़. इस प्रकार अब तक में vivo मॉडल प्रणाली में सीटीसी विश्लेषण के बहुमत cytometry आधारित 23 या अनुकूलित मानव आधारित सीटीसी तकनीक (जैसे AdnaTest) 24 या तो उपयोग करते हुए प्रदर्शन किया गया है. उपयोगी हालांकि, इन तकनीकों में से कोई भी पर्याप्त रूप से सोने के मानक सीएसएस का उपयोग सीटीसी गणन को दर्शाते हैं. परिणाम उन लोगों के बराबर होगा के रूप में नैदानिक ​​अनुमोदन, मानकीकृत प्रकृति, और सीएसएस के व्यापक उपयोग के आधार पर, एक बराबर नमूना तैयार करने, प्रसंस्करण इस्तेमाल करता है कि vivo में मॉडलिंग के लिए सीटीसी कब्जा है और पता लगाने की तकनीक है, और पहचान के मानदंडों के विकास के लिए लाभप्रद होगा मरीज के नमूनों से प्राप्त की. हालांकि, की वजह मात्रा अनुरोध करने के लिएतैयारी साधन के uirements यह इस स्वचालित मंच का उपयोग कर रक्त की छोटी मात्रा प्रक्रिया के लिए संभव नहीं है. . के रूप में माउस स्क्वैमस उपकला कोशिकाओं के misclassification के लिए नेतृत्व कर सकते हैं - इसके अलावा, Eliane एट अल 25 द्वारा पिछले काम (भी मानक सीटीसी परिभाषा [EpCAM + सी + DAPI + CD45] को पूरा करता है) माउस उपकला कोशिकाओं के साथ नमूने के प्रदूषण को दिखा दिया है कि CTCs. इन मुद्दों पर एक पुस्तिका अलगाव की प्रक्रिया के साथ संयुक्त सीएसएस सीटीसी किट अभिकर्मकों का उपयोग विकसित किया गया था की अनुमति देता है कि एक अनुकूलित तकनीक का पता करने के लिए. परख के लिए एक FITC लेबल मानव ल्युकोसैट प्रतिजन (एचएलए) एंटीबॉडी के अलावा मानव ट्यूमर कोशिकाओं माउस स्क्वैमस उपकला कोशिकाओं से प्रतिष्ठित किया जा अनुमति देता है.

इस पांडुलिपि discrepan सहित सामना हो सकता है कि रोगी के रक्त के नमूने और आम नुकसान, प्रसंस्करण के लिए व्यावसायिक रूप से विकसित मानक, और अनुकूलित सीएसएस प्रोटोकॉल का वर्णनसीटीसी misclassification त्रुटियों को जन्म दे सकता है कि टी आइटम नहीं है. इसके अलावा, कब्जा कर लिया CTCs और मेटास्टेसिस के preclinical माउस मॉडल में खून की छोटी मात्रा से CTCs के संवर्धन और पता लगाने के लिए अनुमति देता है एक तुलनीय अनुकूलित सीएसएस तकनीक के उपयोगकर्ता परिभाषित प्रोटीन विशेषताओं की जांच करने के लिए सीएसएस परख का अनुकूलन वर्णित हैं.

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Protocol

इस पांडुलिपि में वर्णित सभी मानव अध्ययन पश्चिमी विश्वविद्यालय के मानव रिसर्च एथिक्स बोर्ड द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के तहत बाहर किया गया. सभी पशु अध्ययनों पश्चिमी विश्वविद्यालय जानवरों के उपयोग उपसमिति द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के तहत, पशु की देखभाल पर कनाडा परिषद की सिफारिशों के अनुसार आयोजित किया गया.

1. सीएसएस का उपयोग रोगी के रक्त के नमूने से मानक सीटीसी गणन

1. तैयारी साधन पर मानव रक्त नमूना संग्रह और प्रसंस्करण के लिए तैयार

  1. मानक सड़न रोकनेवाला शिराछदन तकनीकों का प्रयोग, इथाइलीन diaminetetraacetic एसिड (EDTA) और एक मालिकाना सेलुलर परिरक्षक जो होता है, (इसके बाद सीटीसी परिरक्षक ट्यूब के रूप में) एक 10 मिलीलीटर CellSave ट्यूब में मानव रक्त की 8.0 मिलीलीटर की एक न्यूनतम आकर्षित. थक्के से खून रोकने के लिए ट्यूब 5x उलटें. नमूने तुरंत संसाधित या अप करने के लिए 96 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर संग्रहित किया जा सकता है.
  2. Removई सीएसएस फ्रिज से अभिकर्मकों और उन्हें प्रयोग करने से पहले कमरे के तापमान को गर्म करने के लिए अनुमति देते हैं.
  3. एक डिस्पोजेबल 10 एमएल पिपेट और स्वचालित pipettor का उपयोग, सीटीसी परिरक्षक ट्यूब से रक्त के 7.5 मिलीलीटर लीजिए और धीरे धीरे एक उचित लेबल तैयारी उपकरण प्रसंस्करण ट्यूब में रक्त बांटना.
  4. प्रत्येक नमूने के कमजोर पड़ने बफर के 6.5 मिलीलीटर जोड़ें. नमूना 5x inverting द्वारा मिक्स. "बंद" स्थिति में ब्रेक के साथ 10 मिनट के लिए 800 XG पर नमूना अपकेंद्रित्र. प्रसंस्करण के लिए सिस्टम पर सभी मरीज के नमूनों को लोड करने की तैयारी साधन पर परदे पर निर्देशों का पालन करें. नमूने तैयार करने के 1 घंटे के भीतर कार्रवाई की जानी चाहिए.

2. तैयारी साधन पर प्रसंस्करण के लिए नियंत्रण की तैयारी

  1. धीरे नियंत्रण शीशी भंवर और मिश्रण करने के लिए 5x पलटना.
  2. सावधानी से नियंत्रण शीशी से टोपी को हटा दें और uncapped शीशी के शीर्ष पर एक औंधा तैयारी उपकरण प्रसंस्करण ट्यूब जगह. एक तेज गति में, पलटनाशीशी पर नियंत्रण है, और प्रसंस्करण ट्यूब में सामग्री डाल. उल्टे, वहीं धीरे किसी भी शेष सामग्री जारी करने के लिए नियंत्रण शीशी के पक्ष झटका.
  3. ध्यान से, प्रसंस्करण ट्यूब से उलटा नियंत्रण शीशी निकालें कोई तरल खो दिया है कि यह सुनिश्चित करने और एक तरफ रख दें. एक 1000 μl विंदुक का प्रयोग, शीशी और ढक्कन से किसी भी शेष सामग्री को इकट्ठा करने और धीरे प्रसंस्करण ट्यूब में पिपेट.
  4. प्रसंस्करण के लिए सिस्टम पर नियंत्रण लोड करने के लिए तैयारी साधन पर परदे पर निर्देशों का पालन करें.

3. विश्लेषण उपकरण पर नमूना स्कैन

  1. सिस्टम से सभी नमूनों को अनलोड करने के लिए तैयारी साधन पर परदे पर निर्देशों का पालन करें. शिथिल एक चुंबकीय उपकरण कारतूस टोपी और कारतूस के किनारों के लिए फंस रहे हैं कि किसी भी बुलबुले जारी करने के लिए हाथ या प्रयोगशाला बेंच का उपयोग चुंबकीय उपकरण टैप करें. सभी बुलबुले हटा दिया गया है एक बार, मजबूती से मैं, कारतूस टोपी फ्लैट चुंबकीय उपकरण रखना, औरकमरे के तापमान पर कम से कम 20 मिनट के लिए अंधेरे में ncubate. नमूने तैयार करने के 24 घंटे के भीतर स्कैन किया जाना चाहिए.
  2. विश्लेषण साधन पर मुड़ें और दीपक को प्रारंभ. एक बार (~ 15 मिनट) गरम, विश्लेषण साधन पर प्रणाली सत्यापन कारतूस लोड और QC परीक्षण टैब का चयन करें. आवश्यक गुणवत्ता नियंत्रण उपायों को करने के लिए स्क्रीन पर निर्देशों का पालन करें.
  3. विश्लेषण साधन पर एक नमूना लोड और रोगी परीक्षण टैब का चयन करें. तैयारी साधन से सभी को बचाया जानकारी प्रदर्शित किया जाएगा. नमूना स्कैनिंग को प्रारंभ करने के लिए प्रारंभ क्लिक करें. प्रणाली चुंबकीय उपकरण कारतूस पर एक मोटे ध्यान केंद्रित करने और पता लगाने के किनारे प्रदर्शन करेंगे.
  4. दिशात्मक कुंजियों का उपयोग आवश्यक के रूप में सभी किनारों को समायोजित करें. का चयन करें स्वीकारें. सिस्टम ठीक एक फोकस प्रदर्शन और नमूना स्कैनिंग शुरू हो जाएगा.
  5. परिणामों पर नजर डालने के बाद नियंत्रण उच्च (सी + डीए पर नुकीला कोशिकाओं के लिए परिभाषित मापदंड का उपयोग मान्य किया जाना चाहिएगड़बड़ी + CD45 - एपीसी) और कम (सी + DAPI + CD45 - FITC +) सांद्रता. परिणामों पर नजर डालने के बाद रोगी नमूना परिभाषित सीटीसी मापदंड (सी + DAPI + CD45 -) का उपयोग कर लिया CTCs के लिए समीक्षा की जानी चाहिए.

2. सीएसएस का उपयोग कर उपयोगकर्ता द्वारा परिभाषित मार्करों के लिए सीटीसी विशेषता

1. उपयोक्ता परिभाषित मार्करों और साधन का आरंभ करें तैयारी

  1. काम कर रहे एकाग्रता नमूना और स्टॉक एकाग्रता के अलावा के बाद एंटीबॉडी की एकाग्रता है जहां निम्न सूत्र का उपयोग कर एक मार्कर अभिकर्मक कप में वांछित एकाग्रता के लिए बॉण्ड प्राथमिक एंटीबॉडी मंदक का उपयोग ब्याज की प्रतिरक्षी पतला में एंटीबॉडी की एकाग्रता है अभिकर्मक कप. कई नमूने लिए, तालिका 1 में वर्णित के रूप में एंटीबॉडी मात्रा में समायोजित करें. अभिकर्मक कारतूस और एल में स्थिति 1 में मार्कर अभिकर्मक कप प्लेससीएसएस पर कारतूस oad.
    शेयर एकाग्रता = (काम एकाग्रता x 850 μl) / 150 μl
  2. , रक्त एकत्र नमूने तैयार है, और सीएसएस प्रोटोकॉल का उपयोग रोगी के रक्त के नमूने से मानक सीटीसी गणन ऊपर में वर्णित के रूप में तैयार करने के साधन लोड. तैयारी साधन से प्रेरित जब कस्टम मार्कर अलावा सक्षम करने के लिए, चुनें प्रयोक्ता परख परिभाषित किया. इनपुट मार्कर नाम का चयन करें और सहेजें. नमूने साधन पर लोड कर रहे हैं, ऑपरेटर के रूप में आवश्यक नहीं हां चयन या द्वारा कस्टम मार्कर प्राप्त करना चाहिए जो इंगित करने के लिए प्रेरित किया जाएगा.

2. विश्लेषण उपकरण पर उपयोगकर्ता निर्धारित मार्करों का नमूना स्कैन

  1. , विश्लेषण साधन पर मुड़ें दीपक को प्रारंभ, और सीएसएस का उपयोग रोगी के रक्त के नमूने से मानक सीटीसी गणन की धारा 3.2 में वर्णित के रूप में गुणवत्ता नियंत्रण और प्रणाली सत्यापन प्रदर्शन
  2. विश्लेषण साधन पर एक नमूना लोड और सेटअप टैब का चयन करें. FITC चैनल को प्रारंभ करने के लिए, परीक्षण प्रोटोकॉल खंड के अंतर्गत किट आईडी के रूप में CellSearch सीटीसी का चयन करें. इस मेनू से, चुनें सीटीसी अनुसंधान, संपादन बटन क्लिक करें और वांछित के रूप में जोखिम समय निर्धारित किया है. यह इस सीटीसी पहचान के लिए उपयोग अन्य फ्लोरोसेंट चैनलों में खून के माध्यम से वृद्धि कर सकते हैं के रूप में सीएसएस सीटीसी किट का उपयोग करते समय 1.0 सेकंड के एक जोखिम समय को पार नहीं किया जा सिफारिश की है.

3. Preclinical माउस मॉडल में उपयोग के लिए मानक CSSProtocol का अनुकूलन

** Veridex माउस / चूहा CellCapture किट से अनुकूलित (अब व्यावसायिक रूप से उपलब्ध)

1. माउस रक्त संग्रह और संग्रहण

  1. पिछले रक्त संग्रह करने के लिए, 0.5 एम EDTA के 30 μl हब में EDTA की एक छोटी राशि छोड़ रहा है, आगे और पीछे एक 22 जी सुई के माध्यम से ~ चलाते हैं.
  2. पहले orthotopic, पूंछ नस, या हृदी मार्गों के माध्यम से मानव ट्यूमर कोशिकाओं को इंजेक्शन के साथ चूहों से माउस रक्त का 50 μl की एक न्यूनतम जमा. (धारावाहिक सीटीसी विश्लेषण के लिए) saphenous नस से या (टर्मिनल सीटीसी विश्लेषण के लिए) हृदय पंचर द्वारा रक्त लीजिए. सुई निकालें और एक 1 मिलीलीटर EDTA microtainer रक्त संग्रह ट्यूब में रक्त बांटना. थक्के से खून रोकने के लिए उलटा या धीरे झटका ट्यूब से मिलाएं. रक्त CytoChex सेलुलर परिरक्षक के एक बराबर मात्रा के अलावा के बाद अप करने के लिए 48 घंटे के लिए तुरंत कार्रवाई की या कमरे के तापमान पर संग्रहित किया जा सकता है.

2. सीटीसी संवर्धन

  1. फ्रिज से सीएसएस अभिकर्मकों निकालें और उन्हें प्रयोग करने से पहले कमरे के तापमान को गर्म करने के लिए अनुमति देते हैं.
  2. ट्यूब cytometry एक 12 मिमी x 75 मिमी प्रवाह को पूरे रक्त के 50 μl के बराबर स्थानांतरण. ट्यूब के पक्षों पर रहता है कि किसी भी रक्त नीचे धोने, प्रत्येक नमूने के कमजोर पड़ने बफर के 500 μl जोड़ें. यदि आवश्यक हो, एक छोटी अपकेंद्रित्र स्पिनकिसी भी शेष रक्त एकत्रित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
  3. धीरे विरोधी EpCAM ferrofluid भंवर और सीधे नमूना में पिपेट की नोक रखकर प्रत्येक नमूने के 25 μl जोड़ें. धीरे मिश्रण को कैद संवर्धन अभिकर्मक और भंवर के 25 μl जोड़ें. 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर नमूने सेते हैं.
  4. चुंबक में नमूना ट्यूब प्लेस और 10 मिनट के लिए सेते हैं. नमूना ट्यूब चुंबक में अभी भी कर रहे हैं, ध्यान से अगले चुंबक के लिए ट्यूब की दीवार को छू बिना अवशिष्ट तरल aspirate और त्यागने के लिए एक गिलास पिपेट का उपयोग करें.

3. सीटीसी धुंधला

  1. न्यूक्लिक एसिड डाई, धुंधला अभिकर्मक, विरोधी माउस CD45-APC, विरोधी मानव एचएलए एलेक्सा Fluor 488, और permeabilization के 100 μl 5.0 μl के 1.5 μl के 50 μl के 50 μl में चुंबक और resuspend से नमूना ट्यूबों निकालें अभिकर्मक. कई नमूने लिए, इन अभिकर्मकों premixed किया जा सकता है और मिश्रण के 206.5 μl प्रत्येक ट्यूब करने के लिए जोड़ा जा सकता है. धीरे मिश्रण करने के भंवरऔर अंधेरे में कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए सेते हैं.
  2. चुंबक में 500 धीरे कमजोर पड़ने बफर के μl, भंवर, जगह नमूना ट्यूब जोड़ें, और 10 मिनट के लिए सेते हैं. नमूना ट्यूब चुंबक में अभी भी कर रहे हैं, ध्यान से अगले चुंबक के लिए ट्यूब की दीवार को छू बिना अवशिष्ट तरल aspirate और त्यागने के लिए एक गिलास पिपेट का उपयोग करें. चुंबक से नमूना ट्यूबों निकालें और कमजोर पड़ने बफर के 350 μl में resuspend. भंवर धीरे मिश्रण करने के लिए.

4. चुंबकीय उपकरण लोड हो रहा है

  1. एक जेल लोड हो रहा है टिप का उपयोग करना, ध्यान से चुंबकीय उपकरण में एक कारतूस में नमूना ट्यूब से पूरी मात्रा हस्तांतरण. कारतूस के नीचे से शुरू और नमूना तिरस्कृत रूप में धीरे धीरे टिप वापस ले लें.
  2. पूरे नमूना तबादला हो जाने के बाद शिथिल चुंबकीय उपकरण कारतूस टोपी और sectio में वर्णित के रूप में कारतूस के किनारों के लिए फंस रहे हैं कि किसी भी बुलबुले जारी करने के लिए हाथ या प्रयोगशाला बेंच का उपयोग चुंबकीय उपकरण नलn सीएसएस का उपयोग रोगी के रक्त के नमूने से मानक सीटीसी गणना के 3.1.
  3. उठाव और कारतूस के किनारे के बीच उन्हें फँसाने द्वारा एक बाँझ 22 जी सुई का उपयोग कर किसी भी बुलबुले पॉप. सभी बुलबुले हटा दिया गया है एक बार, दृढ़ता, कारतूस टोपी फ्लैट चुंबकीय उपकरण रखना, और कम से कम 10 मिनट के लिए अंधेरे में सेते हैं. नमूने तैयार करने के 24 घंटे के भीतर स्कैन किया जाना चाहिए.

5. विश्लेषण उपकरण पर मैन्युअल से अलग किए गए नमूने की स्कैनिंग

  1. , विश्लेषण साधन पर मुड़ें दीपक को प्रारंभ, और सीएसएस प्रोटोकॉल का उपयोग रोगी के रक्त के नमूने से मानक सीटीसी गणन की धारा 3.2 में वर्णित के रूप में गुणवत्ता नियंत्रण और प्रणाली सत्यापन करते हैं.
  2. विश्लेषण साधन पर नमूना लोड और सेटअप टैब का चयन करें. स्वरूप नमूना बटन पर क्लिक करके चुंबकीय उपकरण डेटा बटन पर किसी भी मौजूदा डेटा को साफ़ करें. FITC चैनल एक सक्षम करेंसीएसएस का उपयोग कर उपयोगकर्ता निर्धारित मार्करों के लिए सीटीसी विशेषता की धारा 2.2 में वर्णित के रूप में एन डी 1.0 सेकंड के लिए जोखिम समय निर्धारित किया है.
  3. रोगी परीक्षण टैब पर क्लिक करें और निवेश करने के लिए नमूना जानकारी संपादित करें का चयन करें. परीक्षण प्रोटोकॉल के रूप में किट आईडी के रूप में CellSearch सीटीसी और सीटीसी रिसर्च का चयन करें. इनपुट तारांकन के रूप में संकेत के रूप में शेष आवश्यक जानकारी. नमूना जानकारी सहेजें और प्रारंभ क्लिक करें.

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Representative Results

स्टैंडर्ड सीटीसी गणन परख

सीएसएस की संवेदनशीलता और विशिष्टता अच्छी तरह से साहित्य में प्रलेखित किया गया है. हालांकि, बराबर सीटीसी वसूली को मान्य करने के लिए, नुकीला (1000 LNCaP मानव प्रोस्टेट कैंसर की कोशिकाओं) और स्वस्थ स्वयंसेवक दाताओं से unspiked मानव रक्त के नमूने मानक CSSCTC प्रोटोकॉल का उपयोग कर सीएसएस पर प्रोसेस किया गया. जैसी कि उम्मीद थी, unspiked नमूने, 0.00 ± 0.00% CTCs से मुक्त थे, और सीटीसी वसूली नुकीला नमूने (चित्रा 1 ए) के लिए 86.9 ± 4.71% हो प्रदर्शन किया गया. नुकीला नमूनों से प्राप्त सीएसएस गैलरी छवियों इष्टतम गुणवत्ता के थे और CTCs गैर CTCs से अलग करने के लिए आसान थे. कैंसर रोगियों से प्राप्त नमूनों प्रसंस्करण हालांकि, जब CTCs की पहचान कई कोशिकाओं के आकार में छोटे दिखने और कम आसानी से अलग पहचाना गैर CTCs (चित्रा 1 बी) से होने के साथ थोड़ा अधिक चुनौतीपूर्ण है. इसके अलावा, रोगी के नमूने की घटनाओं का 6 श्रेणियों की समीक्षा करते हुए identifi थेसमीक्षकों (चित्रा 1C) के बीच आमतौर पर प्रतिकूल आइटम थे कि एड. इन 6 श्रेणियों शामिल, (1) छोटे सीटीसी वर्गीकरण के लिए 4 मीटर आकार की आवश्यकता को पूरा नहीं किया था कि घटनाओं, मंद सी और / या DAPI धुंधला के साथ (2) आइटम, (3) जायज अनुचित बनाम (एक सीटीसी के रूप में गिना जाना चाहिए) (एक सीटीसी के रूप में नहीं गिना जाना चाहिए) उज्ज्वल सी.के.-पीई धुंधला के कारण CD45-APC चैनल में खून के माध्यम से, (4) FITC + घटनाओं, (5) सी.के. और / या DAPI चैनलों में pixelated छवियों, और (6) आयोजन सी.के. छवियों या सी छवि के साथ> 50% ओवरलैप नहीं है कि DAPI धुंधला के साथ उन लोगों की तुलना में बड़ा है कि DAPI धुंधला के साथ. विभाग (2) और (5) विशेष मानदंडों सीटीसी वर्गीकरण के लिए मौजूद हैं. श्रेणी (2), मंद सी / DAPI के साथ आइटम CTCs एक अक्षुण्ण झिल्ली सी.के. चैनल में देखा जा सकता है बशर्ते कि के रूप में वर्गीकृत किया जा सकता है और एकउचित आकार DAPI छवि उल्लेख किया है. किसी भी pixelation सी.के. चैनल में मनाया जाता है श्रेणी (5), pixelated सी / DAPI के साथ आइटम CTCs के रूप में वर्गीकृत नहीं किया जा सकता. या फैलाना (चाहिए - हालांकि, pixelation DAPI चैनल में स्वीकार्य है कि यह (सफेद एक काले रंग की पृष्ठभूमि पर रंग के रूप में जैनसेन निदान (पूर्व Veridex) द्वारा वर्णित यानी छवि, कोई ग्रे क्षेत्रों में एक पृष्ठभूमि पर पूरी तरह से सफेद है) भी गंभीर नहीं है, बशर्ते कि अभी भी) आकार में अंडाकार दिखाई देते हैं और सी के भीतर फिट.

उपयोगकर्ता परिभाषित मार्कर परख विकास

उपयोगकर्ता परिभाषित मार्करों के लिए CTCs चिह्नित करने के लिए सीएसएस के अनुकूलन कठोर नियंत्रण के साथ महत्वपूर्ण काम हुआ आवश्यकता है और पहले 16 में वर्णित किया गया है. एक सामान्य नियम के रूप में, किसी भी उपयोगकर्ता परिभाषित मार्कर की उचित अनुकूलन नकारात्मक नियंत्रण के परिणाम की विशिष्ट हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए नियोजित किया जाना जरूरी है. नुकीला नमूने दोनों के साथ कार्रवाई कर रहे हैं जब सबसे अच्छा परिणाम प्राप्त कर रहे हैंलक्ष्य एंटीबॉडी के स्थान और पहले से वर्णित के रूप में अकेले एंटीबॉडी मंदक के साथ एक अविशिष्ट आईजीजी नियंत्रण. विभिन्न लक्ष्य प्रतिरक्षी सांद्रता और जोखिम बार भी मूल्यांकन और, उच्च कम, और अनुपस्थित (नकारात्मक) प्रतिजन घनत्व के साथ सेल लाइनों का उपयोग मान्य किया जाना चाहिए. परख 16 बाध्यकारी अविशिष्ट से लक्ष्य प्रतिजन और कम पृष्ठभूमि शोर के लिए उच्च संवेदनशीलता दोनों को दर्शाता है जब इष्टतम प्रोटोकॉल की स्थिति प्राप्त कर रहे हैं.

एक कैंसर स्टेम सेल मार्कर, CD44 का उपयोग इस काम हुआ का एक उदाहरण है, यहाँ प्रस्तुत है. इस मार्कर के साथ प्रारंभिक परीक्षण उपयोगकर्ता परिभाषित मार्कर विकास के लिए FITC चैनल का इस्तेमाल करता है जो (इसके बाद पारंपरिक सीटीसी किट के रूप में) मानक सीएसएस सीटीसी किट, का उपयोग शुरू किया. पारंपरिक सीटीसी किट का उपयोग करना, यह महत्वपूर्ण अनुकूलन के बाद, CD44 + के रूप में वर्गीकृत किया जा सकता है कि CTCs की अधिकतम संख्या नमूने का उपयोग 69.3 ± 2.67% 1,000 एमडीए MB-468 हुमा के साथ नुकीला था, कि प्रदर्शन किया गयाn कोशिकाओं के बहुमत के साथ उच्च CD44 अभिव्यक्ति को प्रदर्शित करने के लिए जाना जाता है स्तन कैंसर की कोशिकाओं, (98.4 ± 0.90%, फ्लो द्वारा निर्धारित) इस प्रोटीन (2A चित्रा) व्यक्त. इन निष्कर्षों के आधार पर यह व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सीएसएस CXC किट बेहतर परिणाम का उत्पादन हो सकता है कि धारणा थी. इस किट में जो CK8 / प्रतिदीप्ति चैनल पीछे से (~ 100000 एंटीजन / सेल की एक घनत्व के साथ मार्करों के लिए अनुकूलित) पारंपरिक सीटीसी किट के साथ तुलना में एक कम प्रतिजन घनत्व (~ 50,000 एंटीजन / सेल) के साथ मार्कर के बेहतर दृश्य के लिए अनुमति देता है 18/19 (पारंपरिक पीई चैनल में प्रतिनिधित्व) और (पारंपरिक FITC चैनल में प्रतिनिधित्व) ब्याज के उपयोगकर्ता मार्कर (इसलिए CXC किट इसके बाद कम प्रतिजन घनत्व सीटीसी किट के रूप में संदर्भित किया जाएगा) 26 प्रतिनिधित्व कर रहे हैं. महत्वपूर्ण अनुकूलन के बाद, यह इस बदलाव CD44 + <रूप में वर्गीकृत CTCs की 98.8 ± 0.51% के साथ सुधार CD44 धुंधला के लिए अनुमति दी है कि प्रदर्शन किया गया/ Sup> किसी भी उपयोगकर्ता परिभाषित मार्कर की उचित अनुकूलन भी उच्च प्रतिजन घनत्व (एमडीए MB-468) का उपयोग कर सत्यापन की आवश्यकता मिलीलीटर 1.0 माइक्रोग्राम / की एकाग्रता और 0.6 सेकंड के एक जोखिम समय (2A चित्रा). पर CD44-पीई का उपयोग कर, कम प्रतिजन घनत्व (21 एनटी), और ब्याज के मार्कर (चित्रा 2 बी) के लिए नकारात्मक (LNCaPs) सेल लाइनों.

Preclinical माउस मॉडल में सीटीसी विश्लेषण

अनुकूलित माउस सीएसएस प्रोटोकॉल की संवेदनशीलता और विशिष्टता का निर्धारण करने के लिए, मानक का उपयोग संसाधित नुकीला (1000 LNCaP मानव प्रोस्टेट कैंसर की कोशिकाओं) और unspiked माउस रक्त के नमूनों को मैन्युअल संसाधित और स्कैन किए गए विश्लेषण के साधन पर और एक ही सेल लाइन का उपयोग कर प्राप्त परिणामों की तुलना में थे तैयारी साधन (चित्रा 3) पर स्वचालित सीएसएस प्रोटोकॉल. जैसी कि उम्मीद थी, unspiked नमूने, दोनों assays का उपयोग CTCs से मुक्त थे 0.00 ± 0.00% और अनुकूलित माउस किट (90.8 ± 5.18%) का उपयोग सीटीसी वसूली नहीं थामानक स्वचालित प्रणाली का उपयोग कर प्राप्त परिणामों से ignificantly अलग (86.9 ± 4.71%, पी> 0.05). पुस्तिका माउस अनुकूलित प्रोटोकॉल का उपयोग कर प्राप्त छवियों एचएलए FITC मार्कर के अलावा के अपवाद के साथ मानक स्वचालित तकनीक का उपयोग कर मनाया उन लोगों से अलग नहीं किया था. इसके अलावा, माउस स्क्वैमस उपकला कोशिकाओं एचएलए FITC (3B चित्रा) के लिए सकारात्मक दाग नहीं है. इस तकनीक CTCs की कम संख्या के अलगाव के लिए मानक सीएसएस प्रोटोकॉल के रूप में संवेदनशील था कि इसकी पुष्टि के लिए धारावाहिक dilutions नुकीला रक्त नमूनों के साथ प्रदर्शन किया गया और कोशिकाओं की बरामद संख्या बनाम कोशिकाओं की उम्मीद की संख्या के संबंध (चित्रा -3 सी) मूल्यांकन किया गया था. परिणाम CTCs प्रभावी ढंग से इस परख का उपयोग पूरे रक्त का 5 cells/50 μl की संवेदनशीलता को नीचे से बरामद किया जा सकता है कि प्रदर्शित करता है. एक आर 2 = 0.99 से अपेक्षित परिणाम के साथ सहसंबद्ध ये मान.

चित्रा 1. मानक सीएसएस प्रोटोकॉल का उपयोग सीटीसी गणन और व्याख्या. (ए) सीटीसी वसूली नुकीला कोशिकाओं की संख्या के प्रतिशत के रूप में मापा. कोशिकाओं hemocytometer द्वारा गिना रहे थे और ~ 1000 LNCaP मानव प्रोस्टेट कैंसर की कोशिकाओं को मानव रक्त की 7.5 मिलीलीटर में नुकीला गया. Unspiked मानव रक्त के नमूने एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया (n = 3). डाटा ± SEM के मतलब के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं. (बी) के कैंसर के रोगियों से एकत्र नमूनों की तुलना में नुकीला रक्त के नमूने (संस्कृति से ट्यूमर कोशिकाओं के साथ नुकीला यानी स्वस्थ दाता रक्त) में मनाया सीटीसी गुणवत्ता में अंतर के प्रतिनिधि सीएसएस गैलरी. (सी) प्रतिनिधि अक्सर misclassified रहे हैं कि आमतौर पर प्रतिकूल वस्तुओं के सीएसएस गैलरी. ऑरेंज चौकों सी + / DAPI + / CD45 के रूप में पहचान स्वीकार्य CTCs, संकेत मिलता है-. 10X उद्देश्य बढ़ाई प्राप्त कर लिया छवियाँ. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2
चित्रा 2. सीएसएस का उपयोग कर उपयोगकर्ता द्वारा निर्धारित मार्कर के लिए CTCs की विशेषता. (ए) CD44 सीएसएस पर सीटीसी और CXC किट का उपयोग कर + के रूप में वर्गीकृत कोशिकाओं का प्रतिशत (n = 3). डाटा ± SEM के मतलब के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं. *** = (पी <0.0005). (बी) काफी अलग एक स्वस्थ स्वयंसेवक दाता (7.5 मिलीलीटर) से रक्त का प्रतिनिधि सीएसएस गैलरी छवियों, विरोधी की 1.5 ग्राम / मिलीलीटर के साथ incubated पहचान सेल लाइन से ~ 1,000 कोशिकाओं, साथ नुकीला -CD44-पीई, और 0.2 सेकंड के एक जोखिम समय पर स्कैन. ऑरेंज चौकों + <CD44 संकेत मिलता है/ Sup> सी + / DAPI + / CD45 के रूप में पहचान CTCs, - / CD44 -. पीई + बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 3
चित्रा 3. मेटास्टेसिस के preclinical माउस मॉडल में इस्तेमाल के लिए सीएसएस प्रक्रिया के अनुकूलन. (ए) नुकीला कोशिकाओं की संख्या के प्रतिशत के रूप में मापा और मानक मानव सीएसएस प्रोटोकॉल का उपयोग कर प्राप्त परिणामों की तुलना में रूपांतरित माउस सीएसएस प्रोटोकॉल का उपयोग सीटीसी वसूली. कोशिकाओं hemocytometer द्वारा गिना रहे थे और ~ 1000 LNCaP मानव प्रोस्टेट कैंसर की कोशिकाओं को मानव रक्त की 7.5 मिलीलीटर में नुकीला गया. Unspiked मानव रक्त के नमूने एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया (n = 3). डाटा ± SEM के मतलब के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं. एनएस = महत्वपूर्ण नहीं. (बी) (सी) विश्लेषण विभिन्न सांद्रता में नुकीला ट्यूमर कोशिकाओं की बरामद संख्या बनाम उम्मीद . LNCaP मानव प्रोस्टेट कैंसर की कोशिकाओं को शुरू में hemocytometer द्वारा गिना और बाद में खून की μl ~ 1000 ट्यूमर cells/50 की एकाग्रता पर माउस रक्त में नुकीला गया. नुकीला माउस खून तो क्रमानुसार 5 ट्यूमर cells/50 μl के एक एकाग्रता के लिए पतला और माउस अनुकूलित सीएसएस प्रोटोकॉल (n = 3). का उपयोग संसाधित किया गया था बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

उपयोगकर्ता निर्धारित मार्कर जोड़ा साथ नमूने की # कुल voluमुझे अभिकर्मक कप को जोड़ने के लिए (μl)
1 450
2 600
3 750
4 900
5 1,050
6 1,200
7 1,350
8 1500

तालिका 1. . एक उपयोगकर्ता द्वारा निर्धारित मार्कर के साथ नमूने की विभिन्न संख्या प्रसंस्करण जब सीएसएस के लिए कुल मात्रा आवश्यकताओं ** (: पर उपलब्ध Veridex श्वेत पत्र से अनुकूलित http://www.veridex.com/pdf/CXC_Application_Guideline.PDF ).

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Discussion

2004 में सीएसएस की शुरूआत के बाद से कई नए सीटीसी प्रौद्योगिकियों के विकास के बावजूद, इस तकनीक अभी भी आज बाजार पर केवल चिकित्सकीय अनुमोदित प्रौद्योगिकी है और इसलिए यह सीटीसी का पता लगाने और गणन के लिए वर्तमान सोने के मानक माना जाता है. इस पांडुलिपि सीएसएस कठोर गुणवत्ता नियंत्रण के मानकों की है हालांकि यह व्याख्या पूर्वाग्रह के अधीन हो और रोगी के नमूने में सीटीसी पहचान नुकीला नमूनों में पहचान से बहुत अलग है कि कर सकते हैं कि प्रदर्शन किया है. आमतौर पर प्रतिकूल आइटम की छह श्रेणियों सीटीसी misclassifications घटित करने के लिए पैदा कर सकता है कि पहचान की गई. इन प्रतिकूल आइटम इस उपकरण पर कार्रवाई की प्रत्येक रोगी के नमूने पर कई समीक्षकों के लिए आवश्यकता पर प्रकाश डाला. इसके अलावा, CTCs प्राप्त रोगी बनाम नुकीला में मनाया मतभेद दोनों नुकीला और मरीज के नमूनों में मान्य किया जा करने के लिए कोई नया सीटीसी प्रौद्योगिकियों के लिए एक आवश्यकता है कि वहाँ दर्शाता है. इसके अलावा, इन नई प्रौद्योगिकियों ख चाहिएई नुकीला नमूने से कुशल सीटीसी कब्जा ही जरूरी रोगी के नमूने में सीटीसी कब्जा क्षमता को प्रतिबिंबित नहीं करता है के रूप में दोनों नुकीला और रोगी के नमूने, का विभाजन नमूना परीक्षण का उपयोग सोने के मानक सीएसएस की तुलना में.

सीएसएस कब्जा कर लिया CTCs के लक्षण वर्णन प्रदर्शन करने की क्षमता है, यह काफी उच्च अनुकूलन अनुकूलन के संबंध के साथ ही सीमित है. सामान्य में, उपयोगकर्ता द्वारा निर्धारित मार्कर के अनुकूलन के लिए इस उपकरण पर बदला जा सकता है कि केवल मापदंडों प्रतिरक्षी एकाग्रता और फ्लोरोफोरे पारा दीपक के संपर्क में है कि समय की लंबाई हैं. अनुकूलन के लिए इस सीमित क्षमता समस्याओं को प्रस्तुत कर सकते हैं जब काम कर अप उपयोगकर्ता परिभाषित मार्करों सीएसएस पर. इस पांडुलिपि में प्रस्तावित एक समाधान (पहले 16 विस्तार से वर्णित) FITC और एक कम प्रतिजन घनत्व के साथ मार्कर के बेहतर दृश्य के लिए अनुमति पीई फ्लोरोसेंट चैनल स्विच जो कम प्रतिजन घनत्व सीटीसी किट का इस्तेमाल होता है. बेपरवाहकिट उचित मार्कर संवेदनशीलता, विशिष्टता, और अनुकूलन करने के लिए सुनिश्चित किया जाना चाहिए कि कई आवश्यक कदम उठाए हैं (पारंपरिक या कम प्रतिजन घनत्व सीटीसी किट) का उपयोग किया जाता है जो की. सबसे पहले, परख संवेदनशीलता उपयोगकर्ता के (हित के मार्कर व्यक्त कि सेल की आबादी में कोशिकाओं का प्रतिशत यानी) उम्मीद पता लगाने के स्तर के निर्धारण की अनुमति देगा कि इस तरह के प्रवाह cytometry के रूप में एक अच्छी तरह से मान्य विधि, की तुलना में मूल्यांकन किया जाना चाहिए परिभाषित मार्कर. दूसरे, परख अभिव्यक्ति के विभिन्न स्तरों (यानी उच्च और निम्न प्रतिजन घनत्व) और अपनी विशिष्टता के साथ सेल लाइनों में रुचि के मार्कर का पता लगाने की क्षमता के लिए मूल्यांकन किया जाना चाहिए हित के मार्कर के लिए नकारात्मक है कि एक सेल लाइन में मान्य होना चाहिए . सभी मामलों में, सभी सेल लाइनों मो निर्धारित करने के लिए एक सेल ही नियंत्रण (कोई एंटीबॉडी जोड़ा), उचित आईजीजी नियंत्रण, और विभिन्न सांद्रता और जोखिम समय पर ब्याज की एंटीबॉडी का उपयोग कर परीक्षण किया जाना चाहिएउपयोगकर्ता परिभाषित मार्कर का अनुकूलन सुनिश्चित करेंगे कि सेंट उपयुक्त सेटिंग्स. हालांकि, यह CTCs के लक्षण वर्णन सीएसएस पर संभव है, वर्तमान में केवल ब्याज की एक प्रयोक्ता परिभाषित मार्कर प्रत्येक नमूने में पता लगाया है, और हो सकता है कि ध्यान दिया जाना चाहिए प्रणाली बहुत कारण कठोर प्रसंस्करण के बहाव के अनुप्रयोगों के संबंध के साथ सीमित है नमूनों की.

सीटीसी अनुसंधान में उपयोग अनूठा बिस्तर से benchtop दृष्टिकोण नैदानिक ​​सेटिंग में इस उपयोगी परख के त्वरित प्रविष्टि के लिए अनुमति दी गई है. हालांकि, यह इन दुर्लभ कोशिकाओं के बुनियादी जीव विज्ञान की एक अपर्याप्त समझ में हुई है. इसलिए कैंसर के vivo माउस मॉडल में preclinical में CTCs के आकलन के लिए अनुमति देते हैं कि assays के विकास और अनुकूलन की जरूरत है. इस पांडुलिपि CTCs आदर्श धारावाहिक सीटीसी संग्रह प्रयोगात्मक मॉडल के लिए उपयुक्त माउस रक्त का 50 μl संस्करणों में मूल्यांकन किया जा करने के लिए अनुमति देता है कि एक अनुकूलित सीएसएस प्रोटोकॉल का वर्णन करता है. इस पांडुलिपि डीइस प्रोटोकॉल का उपयोग सीटीसी गणन स्वचालित और मैन्युअल जुदाई तकनीक के बीच सीटीसी कब्जा दक्षता में कोई महत्वपूर्ण अंतर के साथ पारंपरिक सीटीसी किट के साथ संयोजन में सीएसएस का उपयोग कर प्राप्त परिणामों के बराबर है कि emonstrates. इसके अलावा, इस परख के विकास के दौरान यह पहले से साहित्य 25 में वर्णित के रूप में मान्यता प्राप्त किया गया था, कि माउस स्क्वैमस उपकला सेल संदूषण CTCs की सटीक पहचान और अधिक कठिन और कभी कभी असंभव बना सकते हैं. उचित CTCs के रूप में सौंपा जा रहा है इसलिए इस मुद्दे पर एक प्रयोक्ता परिभाषित एचएलए एलेक्सा Fluor 488 का मुकाबला करने के लिए ही मानव कोशिकाओं (- - एचएलए एलेक्सा Fluor 488 + सी + DAPI + CD45) यह सुनिश्चित करने के लिए इस प्रोटोकॉल के लिए जोड़ा गया है. यह इस पांडुलिपि में इस्तेमाल LNCaP सेल लाइन HLAlow है और इसलिए एचएलए एलेक्सा Fluor 488 बदलती एचएलए अभिव्यक्ति के साथ सेल लाइनों के लिए titrated होना पड़ सकता है कि नोट करना महत्वपूर्ण है. हम एक एचएलए एलेक्सा Fluo गयी है हालांकिआर हमारे प्रोटोकॉल को 488 CTCs की सटीक पहचान सुनिश्चित करने के लिए, यह माउस स्क्वैमस उपकला कोशिकाओं के विशाल बहुमत आकारिकी द्वारा आसानी से पहचाना जा रहे थे और सेल संख्या में सीमित थे उल्लेखनीय है कि (0.33 ± 0.24 events/50 μl, n = 9). (हृदय गति समस्या) के माध्यम से रक्त संग्रह मुश्किल साबित हुआ और कई बार प्रयास आवश्यक थे जब हायर सेल नंबर (अप करने के लिए 11 events/50 μl) ही मनाया गया. इसलिए हम अगर वांछित, CTCs की पर प्रणाली लक्षण वर्णन इस मार्कर को छोड़ते द्वारा पूरा किया जा सकता है कि प्रस्ताव. इसके अलावा, यहां वर्णित नहीं है, हम पहले से सीएसएस 27,28 का उपयोग कर के रूप में प्रदर्शन CTCs और अन्य तरीकों का उपयोग CTCs की आगे डाउनस्ट्रीम लक्षण वर्णन का संग्रह आसानी से प्राप्त किया जा सकता है कि आशा.

सीएसएस प्रभावी ढंग से metastatic स्तन, प्रोस्टेट और कोलोरेक्टल कैंसर के रोगियों 4,10,29 के रक्त में CTCs का पता लगाने के लिए चिकित्सकीय उपयोग किया गया है, यद्यपि यह कई ली हैmitations. विभिन्न metastatic कैंसर के साथ रोगियों के ऊपर से 35% में, CTCs व्यापक प्रणालीगत रोग 30 की उपस्थिति के बावजूद undetectable हैं. पता लगाने की यह कमी उपकला करने वाली mesenchymal संक्रमण, कैंसर आक्रमण, मेटास्टेसिस बढ़ाने के लिए जाना जाता है एक अच्छी तरह से प्रलेखित प्रक्रिया, और समग्र आक्रामकता 31 का एक परिणाम के रूप में किए जाने का प्रस्ताव किया गया है. इस संक्रमण ऐसे EpCAM रूप उपकला मार्कर, में एक महत्वपूर्ण कमी के साथ संबद्ध किया गया है, और mesenchymal में एक इसी वृद्धि 32 मार्करों. कई अध्ययनों से हाल ही में CTCs में इन mesenchymal मार्कर की उपस्थिति गरीब रोग का निदान का संकेत कर रहे हैं और इन कोशिकाओं के कई सीएसएस 24,33-38 का उपयोग कर उनकी पहचान के लिए आवश्यक होगा कि उपकला मार्करों की अभिव्यक्ति की कमी है कि प्रदर्शन किया है. इस मानक सीएसएस परिभाषा सबसे आक्रामक CTCs की कुछ याद आ रही हो सकता है.

वर्णित सीमाओं के बावजूद, यह अनुमान वें हैइस पांडुलिपि में वर्णित ई प्रोटोकॉल विवो preclinical माउस मॉडल में उपयोग करते हुए उपन्यास सीटीसी टेक्नोलॉजीज, उपयोगकर्ता परिभाषित मार्करों के अनुकूलन, और सीटीसी जीव विज्ञान की बेहतर समझ के सीएसएस, विकास के प्रयोग से उन्नत सीटीसी विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण उपकरण किया जाएगा. साथ में ले ली, इन प्रोटोकॉल मेटास्टेसिस और CTCs से संबंधित preclinical और नैदानिक ​​अनुसंधान में रुचि इस मंच के उपयोगकर्ताओं के लिए एक उपयोगी संसाधन प्रदान करेगा.

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Disclosures

लेखक (ALA) जिसका मूल कंपनी जॉनसन एंड जॉनसन भी इस लेख में इस्तेमाल किया अभिकर्मकों और उपकरणों का उत्पादन जो जैनसेन निदान LLC, मालिक जैनसेन कैंसर विज्ञान, द्वारा प्रदान किया गया है कि धन प्राप्त किया.

Acknowledgments

इस काम के कैंसर रिसर्च के ओंटारियो संस्थान (# 08NOV230), अभिनव के लिए कनाडा फाउंडेशन (# 13,199), प्रोस्टेट कैंसर कनाडा, जैनसेन कैंसर विज्ञान, लंदन रीजनल कैंसर कार्यक्रम, और जॉन और डोना ब्रिस्टल से दाता समर्थन के माध्यम से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया (ALA के लिए) लंदन स्वास्थ्य विज्ञान फाउंडेशन. लेल एक फ्रेडरिक Banting और चार्ल्स सर्वश्रेष्ठ कनाडा ग्रेजुएट छात्रवृत्ति डॉक्टरेट पुरस्कार द्वारा समर्थित है. ALA एक CIHR नई अन्वेषक पुरस्कार और अनुसंधान और नवाचार के ओंटारियो मंत्रालय से एक प्रारंभिक शोधकर्ता पुरस्कार के द्वारा समर्थित है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 M EDTA
Anti-human CD44-FITC BD Pharmigen 555478
Anti-human CD44-PE BD Pharmigen 555479
Anti-human HLA-Alexa Fluor 488 BioLegend 311415
Anti-mouse CD45-APC eBioscience 17-0451-82
Bond Primary Antibody Diluent Leica AR9352
CellSave Preservative Tubes Veridex 952820 (20 pack) 79100005 (100 pack)
CellSearch CTC Control Kit Veridex 7900003
CellSearch CTC Kit Veridex 7900001
CellSearch CXC Control Kit Veridex 7900018RUO
CellSearch CXC Kit Veridex 7900017RUO
Instrument Buffer Veridex 7901003
Streck Cell Preservative (aka CytoChex) Streck 213350
1 ml Syringe
10 ml Serological pipette
1,000 µl Pipette
1,000 µl Pipette tips
12 mm x 75 mm Flow tubes
200 µl Gel loading tips
200 µl Pipette
22 G Needle
5 3/4 in Disposible Pasteur pipet VWR 14672-200
5 ml Serological pipette
Automated pipettor
Capillary Blood Collection Tube (EDTA) BD Microtainer 365974
CellSearch Analyzer II Veridex 9555 Includes magnests and verification cartirdges
CellSearch AutoPrep System Veridex 9541
Centrifuge
MagCellect Magnet  R&D Systems MAG997
Small Latex Bulb VWR 82024-550
Vortex

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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चिकित्सा अंक 84 मेटास्टेसिस ट्यूमर कोशिकाओं (CTCs) CellSearch प्रणाली उपयोगकर्ता परिभाषित मार्कर लक्षण वर्णन परिसंचारी, Preclinical माउस मॉडल नैदानिक ​​अनुसंधान
नैदानिक ​​और preclinical अनुसंधान अनुप्रयोगों के लिए ट्यूमर सेल (सीटीसी) Assays घूम semiautomated का अनुकूलन
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Lowes, L. E., Hedley, B. D., Keeney, M., Allan, A. L. Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell (CTC) Assays for Clinical and Preclinical Research Applications. J. Vis. Exp. (84), e51248, doi:10.3791/51248 (2014).

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