Summary
Zirkulierenden Tumorzellen (CTC) in mehreren metastatischen Krebsprognos. Dieses Manuskript beschreibt den Goldstandard Cellsearch System (CSS) CTC Aufzählung Plattform und Highlights gemeinsame Fehlklassifikation Fehler. Darüber hinaus werden zwei angepasste Protokolle für benutzerdefinierte Marker Charakterisierung von CTC und CTC Aufzählung in präklinischen Mausmodellen der Metastasierung mit dieser Technologie beschrieben.
Abstract
Die Mehrheit der durch Krebs verursachten Todesfälle treten im Anschluss an die Entwicklung von Metastasen. Diese hoch tödliche Krankheit Stufe mit dem Vorhandensein von zirkulierenden Tumorzellen (CTC) zugeordnet ist. Diese seltenen Zellen wurde gezeigt, dass der klinische Bedeutung bei metastasierendem Brust-, Prostata-, und Darmkrebs sein. Der aktuelle Gold-Standard in der klinischen CTC Nachweis und die Zählung ist die FDA-Zulassung Cellsearch System (CSS). Dieses Manuskript beschreibt die Standard-Protokoll, das von dieser Plattform genutzt sowie zwei zusätzliche angepasste Protokolle, die den detaillierten Prozess von benutzerdefinierten Marker-Optimierung für die Protein-Charakterisierung von Patienten CTC und einem vergleichbaren Protokoll für CTC Erfassung in sehr geringen Mengen an Blut zu beschreiben, mit Standard- CSS Reagenzien zur Untersuchung von in vivo präklinischen Mausmodellen der Metastasierung. Darüber hinaus Unterschiede in der Qualität zwischen CTC gesunden Spenderblut, versetzt mit Zellen aus Gewebekultur gegenüber Patienten Blut samples werden hervorgehoben. Schließlich werden mehrere häufig abweichende Positionen, die CTC Fehlklassifikation Fehlern führen kann skizziert. Zusammengenommen werden diese Protokolle eine nützliche Ressource für die Nutzer dieser Plattform interessiert in der präklinischen und klinischen Forschung im Zusammenhang mit der Metastasierung und CTC werden.
Introduction
Im Jahr 2013 wird geschätzt, dass 580.350 Menschen an Krebs sterben und dass 1.660.290 neue Fälle dieser Krankheit wird allein in den USA 1 diagnostiziert werden. Die meisten dieser Todesfälle treten im Anschluß an die Entwicklung von Metastasen 2. Der derzeitige Mangel an wirksamen Therapien in der Behandlung von Metastasen und eine begrenzte Verständnis der metastatischen Kaskade macht dieses Stadium der Erkrankung sehr tödlich. Das Vorhandensein von zirkulierenden Tumorzellen (CTC) in die Blutbahn wurde gezeigt, dass mit Metastasen 3 korrelieren. Diese Zellen sind extrem selten und ihr Nachweis bei metastasierendem Brust 4, 5 Prostata bezeichnend für das Gesamtüberleben und kolorektalem Krebs 6. Bei diesen Patienten ≥ 5 (Brust-und Prostatakrebs) oder ≥ 3 (kolorektalen) CTC in 7,5 ml Blut ist das Vorhandensein von bezeichnend für schlechtere Prognose im Vergleich zu den Patienten mit weniger oder ohne nachweisbare CTC in der same Blutvolumen. Außerdem wurde die Änderung der Anzahl CTC während oder nach der therapeutischen Intervention nachgewiesen, die als Prädiktor für die Behandlung angesprochen, oft früher als gegenwärtig verwendeten Techniken 7-10 sein.
Es wurde geschätzt, dass in metastatischen Krebspatienten, CTC treten mit einer Häufigkeit von etwa 1 pro CTC 10 5 -10 7 mononukleären Blutzellen und bei Patienten mit lokalisierter Erkrankung kann diese Frequenz auch niedriger sein (1 ~ 10 in 8). Die seltene Art dieser Zellen kann es schwierig machen, genau und zuverlässig zu erfassen und zu analysieren, CTC 11. Mehrere Verfahren (vorher 12-14 prüft) verwendet worden, um durch Ausnutzung Eigenschaften, die sie von den umgebenden Blutkomponenten unterscheiden bereichern und erkennen diese Zellen. Im allgemeinen ist CTC Aufzählung ein zweiteiliges Verfahren, das sowohl eine Anreicherungsschritt und einen Erfassungsschritt erfordert. Traditionell verlassen Anreicherungsschritte auf Unterschiede in phys.schen Eigenschaften von CTC (Zellgröße, Dichte, Verformbarkeit) oder Protein-Marker-Expression (dh Epithelial Cell Adhesion Molecule [EpCAM], Cytokeratin [CK]). Nach Anreicherung kann CTC Detektion in einer Reihe von verschiedenen Möglichkeiten, von denen die häufigsten sind Nukleinsäure-basierte Assays und / oder durchflusszytometrische Ansätze durchgeführt werden. Jede dieser Strategien sind einzigartig, mit unterschiedlichen Vor-und Nachteile, aber sie alle nicht standardisiert, eine Notwendigkeit für den Eintritt in die klinische Einstellung. Das Cellsearch System (CSS) wurde daher entwickelt, um eine standardisierte Methode zum Nachweis und zur Zählung von seltenen CTC in menschlichem Blut unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie und Antikörper-basierte Techniken 4-6 bereitzustellen. Diese Plattform wird derzeit als der Goldstandard in der CTC-Enumeration und ist der einzige von der US Food and Drug Administration (FDA) für den Einsatz in der Klinik 15 bewährte Technik.
Die CSS ist ein Zwei-Komponenten-Plattform consisting, (1) die CellTracks AutoPrep System (nachstehend als Präparationsinstrument bezeichnet), welche die Herstellung von menschlichen Blutproben, und (2) die CellTracks Analyzer II (nachstehend als Analyseinstrument bezeichnet), die diese Scans automatisiert Proben nach der Vorbereitung. Um CTC verunreinigen Leukozyten die Vorbereitung Instrument unterscheiden beschäftigt ein Antikörper vermittelt wird, Ferrofluid-basierten Ansatz, magnetische Trennung und Differenzfluoreszenzfärbung. Zunächst markiert der CTC-System mit Anti-EpCAM-Antikörper gegen Eisen-Nanopartikel konjugiert. Die Probe wird dann in einem Magnetfeld inkubiert und alle unmarkierten Zellen abgesaugt. Ausgewählte Tumorzellen resuspendiert und inkubiert in einem Differenz Fluoreszenz-Färbung, bestehend aus fluoreszenzmarkierten Antikörpern und eine Kernfärbung Reagenz. Schließlich wird die Probe einem magnetischen Kassette übertragen, genannt magnest (nachfolgend als Magneteinrichtung bezeichnet) und scanned mit dem Analyseinstrument.
Das Analysegerät wird verwendet, um mit unterschiedlichen Fluoreszenz-Filter, die jeweils mit der geeigneten Fluoreszenzpartikel optimiert, mit einem 10x-Objektiv vorbereiteten Proben scannen. CTCs als Zellen, die durch Anti-EpCAM-, Anti-Pan-CK-Phycoerythrin (PE) gebunden sind (CK8, 18 und 19) und die Kernfärbung 4 ',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) identifiziert. Umgekehrt werden die kontaminierenden Leukozyten Zellen, die durch Anti-CD45-Allophycocyanin (APC) und DAPI gebunden werden identifiziert. Nach dem Abtasten werden Computer-definierten potentiellen Tumorzellen, die dem Benutzer präsentiert. Aus diesen Bildern, muss der Benutzer die qualitative Analyse zu verwenden mit den definierten Parametern und Differenzialfärbungs oben erörtert, um zu bestimmen, welche Ereignisse CTC.
Zusätzlich zur Bereitstellung einer standardisierten Methode zur CTC Aufzählung ermöglicht molekulare Charakterisierung von CTCs bezogen auf Protein-Marker von Interesse der CSS. Diese Abfrage cauf Einzelzellebene eine durchgeführt werden, wobei ein Fluorescein (FITC) Fluoreszenzkanal nicht für CTC Identifikations 16 erforderlich. Obwohl diese Plattform bietet die Fähigkeit zur molekularen Charakterisierung, der detaillierte Prozess der Entwicklung von Protokollen und Optimierung nicht gut definiert. Drei kommerziell erhältlichen Markern wurden vom Hersteller zur Verwendung mit der CSS, einschließlich epidermalen Wachstumsfaktorrezeptor (EGFR), den humanen epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor 2 (HER2) und Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor-1 Rezeptor (IGF-1R) entwickelt. HER2-Analyse, in Kombination mit der CSS, wurde von mehreren Gruppen genutzt werden, um das Potenzial für CTC Charakterisierung veranschaulichen, um die klinische Entscheidungsfindung zu informieren und eventuell vorhandenen Behandlungsrichtlinien zu ändern. Zum Beispiel Fehm et al. Zeigten, dass 17 etwa ein Drittel der Brustkrebs-Patientinnen mit HER2-Primärtumoren hatten HER2 + CTC. Zusätzlich Liu et al.18 vor kurzem berichtet, dass bis zu 50% der Patienten mit HER + metastasierendem Brustkrebs nicht haben HER2 + CTC. Herceptin, ein HER2-Rezeptor stören monoklonalen Antikörper nachgewiesen, dass Patienten, deren Tumore HER2 ausreichend, ist ein häufig genutzt Behandlung für Patienten mit HER2 + Primärtumoren 19-21 stark profitieren. Allerdings deuten diese Studien, dass Herceptin kann als Sub-optimal genutzt und das CTC Charakterisierung kann bei der Vorhersage Ansprechen auf die Behandlung zu unterstützen. Letztlich kann CTC Charakterisierung haben das Potenzial, individuelle Betreuung zu verbessern.
CTC Forschung ist einzigartig, es ist weitgehend eine Nacht-zu-Tisch-Ansatz verwendet. Diese Methode, die im Gegensatz zu Tisch-zu-Bett Forschung, die oft Jahre kann die Patientenversorgung auswirken, hat CTC schnellen Einstieg in die klinischen Einstellung erlaubt. Allerdings sind Ärzte zögern, die Ergebnisse von CTC-Analyse in der Patientenbehandlung Entscheidungs mak verwendenten durch einen Mangel an Verständnis der zugrunde liegenden Biologie. Daher geeigneten präklinischen Mausmodellen der Metastasierung und komplementäre Analysetechniken CTC müssen, um diese offenen Fragen untersuchen genutzt werden. Im Allgemeinen gibt es zwei Arten von Tiermodellen verwendet werden, um die metastatischen Kaskade untersuchen: (1) spontane Metastasierung Modelle, die für die Untersuchung aller Schritte in der metastatischen Kaskade zu ermöglichen, und (2) experimentelle Metastasierung Modellen, die nur ermöglichen, das Studium der späteren Schritte in der metastatischen Prozess wie Extravasation und sekundären Tumorbildung 22. Spontane Metastasierung Modelle beinhalten Tumorzellinjektionen in geeignete orthotopen Stellen (zB Injektion von Prostata-Krebszellen in der Prostata für die Untersuchung von Prostatakrebs). Die Zellen werden dann Zeit, um Primärtumoren bilden und spontan auf sekundären Standorten wie der Knochen, Lunge und Lymphknoten metastasieren gegeben. InDagegen experimentellen Metastasierung Modelle direkte Injektion von Tumorzellen in die Blutbahn (z. B. über Schwanzvene oder intrakardiale Injektion, um Zellen gezielt an bestimmte Stellen) und damit die ersten Schritte Intravasation und Verbreitung zum sekundären Organe 22. So weit die Mehrheit der CTC-Analyse in in vivo Modellsystemen durchgeführt wurde entweder mit Durchflusszytometrie-basierte 23 oder angepasst menschlichen CTC-basierte Techniken (zB AdnaTest) 24. Obwohl nützlich, keine dieser Techniken angemessen widerspiegeln CTC Aufzählung mit dem Gold-Standard CSS. Bezogen auf die klinische Zulassung standardisierte Art und weit verbreiteten Nutzung des CSS wäre die Entwicklung eines CTC Fänger-und Nachweisverfahren für die in vivo-Modellierung, die äquivalent der Probenvorbereitung, die Verarbeitung verwendet, und Identifizierungskriterien vorteilhaft als Ergebnis wäre vergleichbar mit denen aus Patientenproben erhalten. Jedoch aufgrund der Volumen requirements des Präparationsinstruments ist es nicht möglich, kleine Mengen an Blut mit diesen automatisierten Plattform verarbeitet. . Außerdem früheren Arbeit von Eliane et al 25 hat gezeigt, dass eine Kontamination der Proben mit der Maus Epithelzellen (die auch die Standard-CTC Definition [EpCAM + CK + DAPI + CD45 -] erfüllen) kann zu Fehlklassifikation von Maus Plattenepithel Epithelzellen führen CTC. Um diese Probleme anzugehen eine angepasste Technik, die die Nutzung der CSS-CTC-Kit-Reagenzien in Kombination mit einem manuellen Isolationsverfahren wurde entwickelt, ermöglicht. Die Zugabe eines FITC-markierten humanen Leukozyten-Antigen (HLA)-Antikörpers zu dem Assay ermöglicht menschlichen Tumorzellen aus Maus Plattenepithelzellen unterscheiden.
Dieses Manuskript beschreibt die Standard-, kommerziell entwickelte und optimierte CSS-Protokoll für die Verarbeitung von Patientenblutproben und Fallstricke, die auftreten können, einschließlich Abweit Elemente, die CTC Fehlklassifikation Fehlern führen kann. Zusätzlich Anpassung der CSS-Test, benutzerdefinierte Proteineigenschaften von CTC erfasst und vergleichbarer angepasst CSS-Technik, die für die Anreicherung und den Nachweis von CTC von kleinen Blutvolumina in präklinischen Mausmodellen von Metastasen ermöglicht untersuchen beschrieben.
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Protocol
Alle in diesem Manuskript beschrieben Humanstudien wurden unter Protokolle durch Western University Human Research Ethics Board genehmigt durchgeführt. Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Empfehlungen des Canadian Council on Animal Care unter Protokolle, die von der Western University Einsatz von Tieren Unterausschuss genehmigt, durchgeführt.
1. Standard-CTC Enumeration von Patientenblutproben Mit der CSS
1. Menschliches Blut Probenahme und Probenvorbereitung für die Verarbeitung auf der Vorbereitung Instrument
- Mit Standard-aseptischen Aderlass Techniken zeichnen ein Minimum von 8,0 ml von menschlichem Blut in ein 10 ml Cellsave Röhre, die Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und eine proprietäre Zellkonservierungsmittel enthält (im Folgenden als die CTC Konservierungsrohr bezeichnet). Das Röhrchen 5x bis Blutgerinnung verhindern. Proben können sofort weiterverarbeitet oder bei Raumtemperatur für bis zu 96 Stunden gelagert werden.
- RemovE CSS Reagenzien aus dem Kühlschrank und lassen Sie sie auf Raumtemperatur erwärmen, bevor Sie.
- Mit einer Pipette 10 ml Einweg-und automatisierte Pipette, sammeln 7,5 ml Blut aus der CTC Konservierungsrohr und langsam verzichten Blut in einem entsprechend gekennzeichneten Vorbereitung Instrumentenaufbereitung Röhre.
- Hinzufügen von 6,5 ml Verdünnungspuffer zu jeder Probe. Mischen durch Umdrehen Probe 5x. Centrifuge Probe bei 800 g für 10 min mit der Bremse in der "Aus"-Position. Folgen Sie den Anweisungen auf dem Bildschirm auf die Vorbereitung Instrument, um alle Patientenproben auf das System für die Verarbeitung zu laden. Die Proben müssen innerhalb 1 Stunde der Vorbereitung verarbeitet werden.
2. Kontrolle Vorbereitung für die Verarbeitung auf der Vorbereitung Instrument
- Vortexen Sie vorsichtig die Kontrollfläschchen und invertieren 5x zu mischen.
- Den Deckel vorsichtig aus dem Kontrollfläschchen und legen eine umgekehrte Zubereitung Instrumentenaufbereitung Rohr auf der Oberseite des nicht verschlossenen Röhrchen. In einer schnellen Bewegung, kehren dieKontrolle Fläschchen, und gießen Sie den Inhalt in die Verarbeitung Röhre. Während umgekehrt ist, vorsichtig blättern Sie die Seiten der Kontrollfläschchen, um alle verbleibenden Inhalt freigeben.
- Entfernen Sie vorsichtig das invertierte Steuer Fläschchen aus der Verarbeitung Röhre, so dass keine Flüssigkeit verloren geht und legen sie beiseite. Mit einer 1000 ul Pipette, sammeln alle restlichen Inhalt aus der Flasche und Deckel und sanft in die Verarbeitung Röhrchen zu pipettieren.
- Folgen Sie den Anweisungen auf dem Bildschirm, auf dem Instrument, um die Vorbereitung auf das Steuersystem für die Verarbeitung zu laden.
3. Beispiel Scannen über die Analyse-Instrument
- Folgen Sie den Anweisungen auf dem Bildschirm auf die Vorbereitung Instrument, um alle Proben aus dem System zu entladen. Lose Kappe jedes magnetische Vorrichtung Patrone und tippen Sie auf die Magnetvorrichtung mit Händen oder Labortisch, alle Blasen, die an den Kanten der Patrone stecken freizugeben. Nachdem alle Blasen entfernt worden sind, fest verschließen die Patrone, lag die magnetische Vorrichtung flach, und ichncubate im Dunkeln für mindestens 20 min bei Raumtemperatur. Die Proben müssen innerhalb von 24 Stunden der Vorbereitung gescannt werden.
- Schalten Sie das Analyseinstrument und initialisieren Sie die Lampe. Sobald erwärmt (~ 15 min), laden Sie die System-Verifikation Patrone auf die Analyseinstrument und wählen Sie die Registerkarte Test QC. Folgen Sie den Anweisungen auf dem Bildschirm, um die notwendigen Maßnahmen zur Qualitätskontrolle durchzuführen.
- Legen Sie eine Probe auf die Analyseinstrument und wählen Sie die Registerkarte Test Patient. Alle gespeicherten Informationen von der Präparationsinstrument angezeigt. Klicken Sie auf Start, um Abtastung zu initialisieren. Das System wird eine Groborientierung und Kantenerkennung auf der Magnetvorrichtung Patrone durchzuführen.
- Stellen Sie alle Kanten, wie erforderlich, mit den Richtungstasten. Wählen Sie OK. Das System wird eine Feinfokus durchführen und beginnen Abtastung.
- Nach dem Scannen der Kontrollergebnisse sollten anhand der festgelegten Kriterien für die Zellen bei hohen (CK + DA versetzt validiert werdenPI + CD45 - APC +) und niedriger (CK + DAPI + CD45 - FITC +)-Konzentrationen. Nach dem Scannen der Patientenprobe Ergebnisse sollten für aufgenommene CTC CTC über die definierten Kriterien (CK + DAPI + CD45 -) überprüft werden.
2. CTC Charakterisierung für benutzerdefinierte Markierungen mit der CSS-
1. Vorbereitung der benutzerdefinierten Marker und Instrument Initialisierung
- Verdünnte den Antikörper von Interesse unter Verwendung Bond Primärantikörperverdünnung auf die gewünschte Konzentration in einem Marker Reagenzienbecher unter Verwendung der folgenden Formel, wobei die Arbeitskonzentration ist die Konzentration des Antikörpers nach der Zugabe zu der Probe und der Stoffkonzentration ist die Konzentration des Antikörpers in der Reagenz Tasse. Für mehrere Proben, stellen die Antikörper-Mengen wie in Tabelle 1 beschrieben. Setzen Sie die Markierung Reagenzienbecher in Position 1 in der Reagenzienkartusche und load die Patrone auf CSS.
Auf Konzentration = (Arbeits Konzentration x 850 ul) / 150 ul - Blutentnahme, bereiten Proben, und laden Sie die Vorbereitung Instrument wie in der obigen Aufzählung von Standard-CTC Patient Blutproben mit der CSS-Protokoll beschrieben. Um benutzerdefinierte Marker zusätzlich zu aktivieren, wählen Sie Benutzerdefiniert Assay, wenn sie von der Vorbereitung Instrument aufgefordert werden. Geben Sie die Markierungsnamen und wählen Sie Speichern. Als Proben werden auf das Gerät geladen, wird der Bediener aufgefordert, anzugeben, welche kundenspezifische Marker mit Ja oder Nein wie nötig erhalten sollten.
2. Beispiel Scannen von benutzerdefinierten Markierungen auf der Analyse-Instrument
- Schalten Sie das Analyseinstrument, initialisieren Sie die Lampe, und führen Sie die Qualitätskontrolle und Systemverifikation, wie in Abschnitt 3.2 der Standard-CTC Enumeration von Patient Blutproben mit Hilfe der CSS beschrieben
- Legen Sie eine Probe auf die Analyseinstrument, und wählen Sie die Registerkarte Setup. Um die FITC Kanal initialisieren, wählen Cellsearch CTC als Kit-ID, unter der Rubrik Testprotokolle. Von diesem Menü CTC Forschung, klicken Sie auf die Schaltfläche Bearbeiten, und stellen Sie die Belichtungszeit nach Wunsch. Es wird empfohlen, eine Belichtungszeit von 1,0 Sekunden bei Verwendung der CSS-CTC-Kit, da dies zu Durchbluten in andere Kanäle für die Fluoreszenz CTC Identifizierung genutzt erhöhen nicht überschritten werden.
3. Anpassung der Standard-CSSProtocol für den Einsatz in präklinischen Mausmodellen
** Aus Veridex Maus / Ratte CellCapture Kit angepasst (nicht mehr im Handel erhältlich)
1. Maus Blutentnahme und Lagerung
- Vor der Blutentnahme, führen ~ 30 ul 0,5 M EDTA durch eine 22 G-Nadel hin und her, so dass eine kleine Menge von EDTA in der Nabe.
- Sammeln ein Minimum von 50 ul Blut von Mäusen, Maus über orthotopen, Schwanzvene oder intra Routen zuvor mit menschlichen Tumorzellen injiziert. Blutentnahme aus der Vena saphena magna (für serielle CTC-Analyse) oder durch Herzpunktion (für Terminal-CTC-Analyse). Entfernen Sie die Nadel und verzichten Blut in eine 1 ml EDTA Microtainer Blutentnahmeröhrchen. Mischen durch Umdrehen oder sanft Röhrchen klopfen, um Blutgerinnung verhindern. Blut kann sofort für bis zu 48 h nach der Zugabe von einem gleichen Volumen CytoChex Zellkonservierungsverarbeitet oder bei Raumtemperatur gelagert werden.
2. CTC-Anreicherung
- Entfernen CSS Reagenzien aus dem Kühlschrank und lassen Sie sie auf Raumtemperatur erwärmen, bevor Sie.
- Übertragen das Äquivalent von 50 &mgr; l Vollblut auf eine 12 mm x 75 mm Durchflusszytometrie Rohr. Gib 500 ul Verdünnungspuffer, zu jeder Probe, Abwaschen kein Blut, die auf den Seiten der Röhre verbleibt. Wenn nötig, eine kurze Zentrifugenspinnkann verwendet werden, um alle verbleibenden Blut zu sammeln.
- Vortexen Sie vorsichtig die anti-EpCAM Ferrofluid und fügen Sie 25 ul zu jeder Probe, indem Sie die Spitze der Pipette direkt in die Probe. In 25 ul Capture-Enhancement-Reagenz und Wirbel sanft zu mischen. Proben Inkubieren bei Raumtemperatur für 15 min.
- Zeigen Probenröhrchen in den Magneten und Inkubation für 10 min. Während die Probenröhrchen befinden sich noch in dem Magneten, mit einem Glaspipette sorgfältig absaugen Restflüssigkeit ohne Berührung der Wand der Röhre neben dem Magneten und entsorgen.
3. CTC-Färbung
- Die Probenröhrchen aus dem Magneten und Resuspension in 50 ul Nucleic Acid Dye 50 ul Färbereagenz, 1,5 ul Anti-Maus-CD45-APC, 5,0 ul Anti-Human-HLA-Alexa Fluor 488, und 100 ul Permeabilisierung entfernen Reagenz. Für mehrere Proben können diese Reagenzien vorgemischt werden und 206,5 ul der Mischung kann zu jedem Röhrchen hinzugefügt. Vortex vorsichtig mischenund Inkubation für 20 min bei Raumtemperatur im Dunkeln.
- In 500 ul Verdünnungspuffer, Wirbel sanft, Platz Probenröhrchen in den Magneten, und Inkubation für 10 min. Während die Probenröhrchen befinden sich noch in dem Magneten, mit einem Glaspipette sorgfältig absaugen Restflüssigkeit ohne Berührung der Wand der Röhre neben dem Magneten und entsorgen. Die Probenröhrchen entfernen aus dem Magneten und resuspendieren in 350 ul Verdünnungspuffer. Vortex vorsichtig mischen.
4. Magnetische Geräte Loading
- Verwendung eines Gel-Ladespitze sorgfältig das gesamte Volumen aus dem Probenröhrchen übertragen in eine Patrone in der magnetischen Vorrichtung. Beginnen an der Unterseite der Patrone und langsam zurückzuziehen der Spitze, während die Probe abgegeben wird.
- Sobald die gesamte Probe übertragen worden ist, lose Kappe der Magnetvorrichtung Patrone und tippen Sie auf die Magnetvorrichtung mit Händen oder Labortisch, alle Blasen, die an den Kanten der Patrone stecken wie in Sectio beschrieben frein 3.1 der Standard-CTC Enumeration von Patient Blutproben mit Hilfe der CSS.
- Pop alle Blasen mit einer sterilen 22 G Nadel, indem er sie zwischen der Abschrägung und dem Rand der Patrone. Nachdem alle Blasen entfernt worden sind, fest verschließen die Patrone, lag die magnetische Vorrichtung flach, und Inkubation im Dunkeln für mindestens 10 min. Die Proben müssen innerhalb von 24 Stunden der Vorbereitung gescannt werden.
5. Scannen manuell getrennter Proben auf der Analyse-Instrument
- Schalten Sie das Analyseinstrument, initialisieren Sie die Lampe, und führen Sie die Qualitätskontrolle und Systemverifikation, wie in Abschnitt 3.2 der Standard-CTC Enumeration von Patientenblutproben mit der CSS-Protokoll beschrieben.
- Legen Sie die Probe auf die Analyseinstrument, und wählen Sie die Registerkarte Setup. Löschen Sie alle vorhandenen Daten auf dem Magnetgerätedaten durch Klicken auf die Schaltfläche Format Probe-Taste. Aktivieren Sie die FITC-Kanal einnd stellen Sie die Belichtungszeit auf 1,0 Sekunden, wie in Abschnitt 2.2 der CTC Charakterisierung für benutzerdefinierte Markierungen mit Hilfe der CSS beschrieben.
- Klicken Sie auf die Registerkarte Test Patient und wählen Sie Bearbeiten zur Eingabe der Probeninformationen. Wählen Cellsearch CTC als Kit-ID und CTC Forschung als Testprotokoll. Geben Sie die restlichen notwendigen Informationen, wie angegeben, wie der Stern. Speichern Sie die Probe Informationen und klicken Sie auf Start.
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Representative Results
Standard-CTC Enumeration Assay
Die Empfindlichkeit und Spezifität des CSS wurde in der Literatur gut dokumentiert. Allerdings gleichwertige CTC Erholung bestätigen, Stachel (1.000 LNCaP menschlichen Prostata-Krebszellen) und undotierten menschlichen Blutproben von gesunden freiwilligen Spendern wurden auf der CSS mit dem Standard-Protokoll CSSCTC verarbeitet. Wie erwartet, waren undotierten Proben frei von CTC, 0,00 ± 0,00% und CTC Erholung wurde gezeigt, dass 86,9 ± 4,71% für die dotierten Proben (Abbildung 1A) sein. CSS Galerie Bilder von dotierten Proben erhalten wurden, waren der optimalen Qualität und CTC waren einfach von Nicht-CTC zu unterscheiden. Bei der Verarbeitung von Proben aus Krebspatienten erhalten wird, ist jedoch Identifizierung CTC geringfügig schwieriger, mit vielen Zellen erscheinen kleiner und weniger leicht von nicht-CTC (Abbildung 1B). Darüber hinaus bei der Überprüfung der Patientenproben sechs Kategorien von Ereignissen waren Identifikationed, die häufig abweichende Elemente zwischen Rezensenten (Abbildung 1C) waren. Diese 6 Kategorien enthalten: (1) kleine Ereignisse, die die 4 um Größenanforderung für CTC Klassifizierung nicht erfüllten, (2) Gegenstände mit dim CK und / oder DAPI-Färbung, (3) gegenüber ungerechtfertigten gerechtfertigt (sollte als CTC gezählt werden) (sollte nicht als CTC gezählt werden), durch bluten in die CD45-APC-Kanal durch helle CK-PE-Färbung verursacht, (4) FITC + Veranstaltungen, (5) verpixelten Bilder im CK und / oder DAPI Kanäle, und (6) Veranstaltungen mit DAPI-Färbung, die größer als CK Bilder oder solche mit DAPI-Färbung, die mit den CK-Bild überlappt> 50% ist. Für die Kategorien (2) und (5) bestimmte Kriterien gibt es für CTC-Klassifizierung. Für die Kategorie (2), Gegenstände mit dim CK / DAPI klassifiziert als CTC vorgesehen, dass eine intakte Membran kann in der CK-Kanal beobachtet werden kann und eineBild geeigneter Größe DAPI wird notiert. Für die Kategorie (5), Gegenstände mit pixelig CK / DAPI kann nicht als CTC eingestuft werden, wenn eine Verpixelung ist in der CK-Kanal beobachtet. Allerdings ist pixelation akzeptabel in der DAPI-Kanal vorgesehen, dass es nicht zu schwer (dh Bild ist auf einem Hintergrund ganz weiß, keine Grauzonen - von Janssen Diagnostics (früher Veridex) als weiße Farbe auf einem schwarzen Hintergrund beschrieben) oder diffus (Muss noch erscheint oval und passen im CK).
Benutzerdefinierte Markierung Assay-Entwicklung
Anpassung der CSS CTC für benutzerdefinierte Markierungen kennzeichnen erfordert erhebliche Aufarbeitung mit strengen Kontrollen und hat vorher 16 beschrieben. Als allgemeine Regel gilt, geeignete Optimierungs jeder benutzerdefinierten Marker erfordert, dass negative Kontrollen verwendet, um sicherzustellen, dass die Ergebnisse spezifischer werden. Die besten Ergebnisse werden erhalten, wenn aufgestockte Proben mit sowohl verarbeiteteneine unspezifische IgG Kontrolle anstelle des Zielantikörpers und der Antikörperverdünnung allein, wie zuvor beschrieben. Verschiedene Zielantikörperkonzentrationen und Belichtungszeiten sollten auch bewertet und validiert mit Zelllinien mit hohen, niedrigen und abwesend (Negativ)-Antigen Dichten werden. Optimale Protokoll Bedingungen werden erreicht, wenn der Test zeigt, sowohl eine hohe Empfindlichkeit für das Zielantigen und geringem Hintergrundrauschen von unspezifischen Bindung 16.
Ein Beispiel für diese Aufarbeitung unter Verwendung eines Krebsstammzellmarker CD44, wird hier vorgestellt. Erste Tests mit diesem Marker begann mit dem Standard-CSS-CTC-Kit (im Folgenden als die traditionelle CTC-Kit genannt), die die FITC Kanal für benutzerdefinierte Markerentwicklung nutzt. Mit dem traditionellen CTC-Kit wurde gezeigt, dass nach signifikanten Optimierung, war die maximale Anzahl von CTC, die als CD44 + klassifiziert werden konnten 69,3 ± 2,67% unter Verwendung von Proben gespickt mit 1.000 MDA-MB-468 human Brustkrebszellen, die eine hohe CD44-Expression mit der Mehrzahl von Zellen zeigen (98,4 ± 0,90%, wie durch Durchflusszytometrie bestimmt) dieses Proteins (2A) exprimieren. Basierend auf diesen Ergebnissen wurde vermutet, dass die im Handel erhältlichen CSS CXC Kit kann verbesserte Ergebnisse zu erzielen. Dieses Kit ermöglicht eine verbesserte Visualisierung von Markern mit einer geringeren Antigendichte (~ 50.000 Antigene / Zelle) im Vergleich mit dem herkömmlichen CTC Satz durch Umkehren der Fluoreszenzkanal, in dem die CK8 / (für Markierungen mit einer Dichte von ~ 100.000 Antigene / Zelle optimiert) 18/19 (traditionell in der PE-Kanal dargestellt) und Marker von Interesse (traditionell in der FITC Kanal dargestellt) des Benutzers zu vertreten sind (daher im Folgenden der CXC-Kit wird als die niedrigen Antigendichte CTC Satz bezeichnet) 26. Nachdem deutliche Optimierung wurde gezeigt, dass diese Veränderung erlaubt eine verbesserte CD44-Färbung, mit 98,8 ± 0,51% der CTCs als CD44 + <eingestuft/ Sup> mit CD44-PE in einer Konzentration von 1,0 g / ml und einer Belichtungszeit von 0,6 s (Abbildung 2A). Entsprechende Optimierung aller benutzerdefinierten Marker erfordert auch Validierung mit hoher Antigendichte (MDA-MB-468) niedrigen Antigendichte (21 NT) und negativen (LNCaPs)-Zelllinien für die Markierung von Interesse (Abbildung 2B).
CTC-Analyse in präklinischen Mausmodellen
Um die Empfindlichkeit und Spezifität der angepasst Maus CSS-Protokoll zu bestimmen, versetzt (1000 LNCaP menschlichen Prostatakrebszellen) und undotierten Maus Blutproben wurden manuell auf dem Analysegerät verarbeitet und abgetastet und mit den Ergebnissen unter Verwendung der gleichen Zelllinie unter Verwendung des Standard verarbeitet automatisierte CSS-Protokoll über die Vorbereitung Gerät (Abbildung 3A). Wie erwartet, waren undotierten Proben frei von CTC mit beiden Assays, 0,00 ± 0,00% und CTC Wiederherstellung mit dem angepasst Maus-Set (90,8 ± 5,18%) war nicht significantly anders Ergebnisse mit dem Standard automatisiertes System erhalten (86,9 ± 4,71%, p> 0,05). Bilder mit der manuellen Maus angepasst Protokoll erhaltenen nicht von denen unter Verwendung des Standard automatisierte Technik beobachtet unterscheiden, mit der Ausnahme der Zugabe des HLA-FITC-Markierung. Zusätzlich Maus Plattenepithelzellen positiv färben nicht für HLA-FITC (3B). Um zu bestätigen, dass diese Technik war so empfindlich wie die Standard-CSS-Protokoll für die Isolierung der geringen Anzahl von CTC wurden serielle Verdünnungen mit Stachel Blutproben durchgeführt, und die Korrelation der erwarteten Anzahl von Zellen gegenüber erholt Anzahl der Zellen wurde untersucht (Abbildung 3C). Ergebnisse zeigen, dass CTCs effektiv bis zu einer Empfindlichkeit von 5 Zellen/50 &mgr; l Vollblut unter Verwendung dieses Tests gewonnen werden. Diese Werte mit den erwarteten Ergebnissen mit einem r 2 = 0,99 korreliert.
2. Charakterisierung von CTC für benutzerdefinierte Markierungen mit Hilfe der CSS. (A) Prozentsatz der Zellen als CD44 + mit der CTC und CXC-Kits auf dem CSS klassifiziert (n = 3). Daten sind als Mittelwert ± SEM dargestellt. *** = Signifikant (P <0,0005). (B) Vertreter CSS Galerie Bilder von Blut von einem gesunden Freiwilligen Spender (7,5 ml), versetzt mit ~ 1000 Zellen aus der Zelllinie identifiziert, mit 1,5 g / ml Anti inkubiert -CD44-PE und bei einer Belichtungszeit von 0,2 sec abgetastet. Orange Quadrate zeigen CD44 + </ Sup> CTC, wie CK + / DAPI + / CD45 identifiziert - / CD44 -. PE + Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
3. Anpassung der CSS-Verfahren für den Einsatz in der präklinischen Mausmodellen der Metastasierung. (A) CTC Wiederherstellung mit dem als Prozentsatz der Anzahl der Stachelzellen gemessen und mit den Ergebnissen unter Verwendung des Standardprotokolls erhaltenen menschlichen CSS angepasst Maus CSS-Protokoll. Zellen wurden mit einem Hämocytometer gezählt und ~ 1.000 LNCaP menschlichen Prostatakrebszellen wurden in 7,5 ml Humanblut versetzt. Undotierten menschlichen Blutproben wurden als negative Kontrolle verwendet (n = 3). Daten sind als Mittelwert ± SEM dargestellt. ns = nicht signifikant. (B) (C) Analyse der Korrelation und lineare Regression der erwarteten gegen erholt Anzahl der ährentragenden Tumorzellen in verschiedenen Konzentrationen . LNCaP menschlichen Prostatakrebszellen wurden zunächst durch Hämocytometer gezählt und anschließend in Mäuseblut in einer Konzentration von ~ 1.000 Tumor Zellen/50 ul Blut versetzt. Spitz Maus Blut wurde dann seriell zu einer Konzentration von 5 Tumor Zellen/50 ul verdünnt und mit Hilfe der Maus angepasst CSS-Protokoll (n = 3). Verarbeitet Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
| Anzahl der Proben, die mit benutzerdefinierten Marker hinzugefügt | Insgesamt Volumich zu Reagenz Cup hinzufügen (ul) |
| 1 | 450 |
| 2 | 600 |
| 3 | 750 |
| 4 | 900 |
| 5 | 1050 |
| 6 | 1200 |
| 7 | 1350 |
| 8 | 1500 |
Tabelle 1. . Volumenanforderungen Summe für die CSS bei der Verarbeitung unterschiedlicher Anzahl von Proben mit einer benutzerdefinierten Marker ** aus Veridex White Paper (: Angepasst an http://www.veridex.com/pdf/CXC_Application_Guideline.PDF ).
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Discussion
Trotz der Entwicklung vieler neuer Technologien CTC seit der Einführung der CSS im Jahr 2004, ist diese Technik immer noch die einzige klinisch bewährte Technologie auf dem Markt, und deshalb wird es als der aktuelle Goldstandard für die CTC-Nachweis und die Zählung. Diese Handschrift hat gezeigt, dass, obwohl die CSS hat strenge Qualitätskontrollen kann es für die Auslegung Bias sein und das CTC-Identifikation in Patientenproben ist in dotierten Proben viel anders als Identifikation. Sechs Kategorien von häufig abweichende Elemente identifiziert, die dazu führen können CTC Fehlklassifikationen auftreten. Diese abweichenden Elemente unterstreichen die Notwendigkeit für mehrere Rezensenten bei jeder Patientenprobe auf diesem Instrument bearbeitet. Darüber hinaus sind die in Stachelgegen Patienten beobachteten Unterschiede erhaltene CTC zeigt, dass es eine Notwendigkeit für neue Technologien CTC in beiden versetzt und Patientenproben validiert. Zusätzlich müssen die neuen Technologien be im Vergleich zum Goldstandard CSS mit Split Stichproben von beiden Stachel und Patientenproben, so effizient CTC-Abscheidung aus dotierten Proben nur nicht unbedingt CTC Fangeffizienz in Patientenproben.
Obwohl die CSS hat die Fähigkeit, die Charakterisierung der aufgenommenen CTC durchzuführen, wird es ganz in Bezug auf hoch anpassbare Optimierungs beschränkt. Im allgemeinen sind die einzigen Parameter, die mit diesem Instrument zur Optimierung der benutzerdefinierten Markierungen geändert werden können, die Antikörperkonzentration und die Länge der Zeit, die das Fluorophor an der Quecksilberlampe ausgesetzt. Diese begrenzte Kapazität für die Optimierung kann Probleme bereiten, wenn Aufarbeitung benutzerdefinierte Markierungen auf der CSS. In diesem Manuskript vorgeschlagene Lösung (zuvor im Detail beschriebenen 16) ist die Verwendung der geringen Antigendichte CTC-Kit, das die FITC-und PE-Fluoreszenzkanälen, die für eine bessere Visualisierung von Markern mit geringer Antigendichte schaltet. Ungeachtetvon denen Satz verwendet wird (traditionelle oder niedriger Antigendichte CTC-Kit) sind mehrere Schritte notwendig, die eingegangen werden, müssen geeignete Marker Sensitivität, Spezifität und Optimierung zu gewährleisten. Erstens muss die Empfindlichkeit des Assays im Vergleich zu einer gut validierten Verfahren, wie Durchflusszytometrie, die die Bestimmung der erwarteten Erfassungspegel (dh der Anteil der Zellen in der Zellpopulation, die den Marker von Interesse exprimieren) ermöglichen wird der Benutzer beurteilen Marker definiert. Zweitens muss der Test für seine Fähigkeit, den Marker von Interesse in Zelllinien mit verschiedenen Expressionsniveaus (dh hohe und niedrige Antigendichte) und seine Spezifität zu detektieren beurteilen ist in einer Zelllinie, die negativ für die Markierung von Interesse ist validiert . In allen Fällen müssen alle Zelllinien unter Verwendung eines einzigen Zellen Kontrolle (kein Antikörper zugegeben), die entsprechende Steuer IgG und die Antikörper von Interesse bei verschiedenen Konzentrationen und Einwirkungszeiten, die mo bestimmen prüfendenst entsprechenden Einstellungen, die eine Optimierung des benutzerdefinierten Marker gewährleisten. Allerdings ist zu beachten, dass, obwohl Charakterisierung von CTC ist auf dem CSS möglich, derzeit nur eine benutzerdefinierte Marker von Interesse kann in jeder Probe untersucht werden, und das werden das System sehr in Bezug auf die Downstream-Anwendungen aufgrund der rauen Verarbeitung beschränkt der Proben.
Die einzigartige Nacht-zu-Tisch-Ansatz in der Forschung genutzt CTC hat zur schnellen Eingabe dieses nützlichen Test in der klinischen Einstellung erlaubt. Es hat sich jedoch in einer unzureichenden Verständnisses der Grundlagen der Biologie dieser seltenen Zellen führte. Deshalb ist die Entwicklung und Optimierung von Assays, die für die Beurteilung der CTC in präklinischen in vivo Mausmodellen von Krebs ermöglichen benötigt. Dieses Manuskript beschreibt eine angepasste CSS-Protokoll, das für CTC in 50 ul Volumen der Maus Blut, ideal für Serien CTC Sammlung experimentelle Modelle geeignet beurteilt werden können. Dieses Manuskript demonstrates dass CTC Aufzählung mit diesem Protokoll ist vergleichbar mit den Ergebnissen unter Verwendung der CSS in Kombination mit der traditionellen CTC-Kit, wobei keine signifikanten Unterschiede in der CTC-Capture-Effizienz zwischen den automatisierten und manuellen Trennverfahren, erhalten. Zusätzlich wird während der Entwicklung des Assays wurde erkannt, wie zuvor in der Literatur 25 beschrieben, kann die Maus-Plattenepithelkarzinom Epithelzellen Verunreinigungen machen genaue Identifizierung der CTC schwieriger und manchmal unmöglich. Daher, um dieses Problem zu bekämpfen, eine benutzerdefinierte HLA-Alexa Fluor 488 wurde diesem Protokoll hinzugefügt, um sicherzustellen, dass nur menschliche Zellen (CK + DAPI + CD45 - HLA - Alexa Fluor 488 +) werden entsprechend als CTC zugeordnet. Es ist wichtig zu beachten, dass die LNCaP-Zelllinie in dieser Handschrift verwendet wird, ist HLAlow und deshalb HLA-Alexa Fluor 488 müssen möglicherweise für die Zelllinien mit unterschiedlichen HLA-Expression titriert werden. Obwohl wir ein HLA-Alexa Fluo hinzugefügtr 488 bis unser Protokoll, um eine genaue Identifizierung der CTC gewährleisten, ist es bemerkenswert, dass die große Mehrheit der Maus Plattenepithel Epithelzellen waren von Morphologie leicht erkennbar und wurden in Zellzahl begrenzt (0,33 ± 0,24 events/50 ul, n = 9). Höhere Zellzahlen (bis zu 11 events/50 ul) wurden nur beobachtet, wenn die Blutentnahme (über Herzpunktion) erwies sich als schwierig und wiederholte Versuche notwendig waren. Daher schlagen wir vor, dass, wenn gewünscht, könnte auf System Charakterisierung von CTCs durch Weglassen dieses Markers erreicht werden. Darüber hinaus, obwohl hier nicht beschrieben, erwarten wir, dass Sammlung von CTC und weiter stromabwärts Charakterisierung von CTC mit anderen Methoden könnte leicht erreicht, wie zuvor mit der CSS 27,28 nachgewiesen werden.
Obwohl das CSS ist klinisch verwendet worden, um CTC im Blut von metastasierendem Brust-, Prostata-und Darmkrebs-Patienten 4,10,29 effektiv zu erkennen, hat sie mehrere limitations. In bis zu 35% der Patienten mit verschiedenen metastatischen Krebserkrankungen sind CTCs trotz der Gegenwart von verbreiteten systemische Erkrankung 30 nicht nachweisbar. Dieser fehlende Nachweis wurde vorgeschlagen, als ein Ergebnis der epithelial-zu-mesenchymale Transition, einer gut dokumentierten Verfahren bekannt, Krebsinvasion, Metastasenbildung zu verbessern, und die allgemeine Aggressivität 31 sein. Dieser Übergang ist mit einer signifikanten Reduktion der epithelialen Marker, wie EpCAM Verbindung gebracht worden, und eine entsprechende Erhöhung der mesenchymalen Marker 32. Mehrere Studien haben kürzlich gezeigt, dass das Vorhandensein dieser mesenchymalen Marker in CTCs sind bezeichnend für schlechtere Prognose und dass viele dieser Zellen fehlt die Expression von epithelialen Marker, die für die Erfassung erforderlich wäre mit der CSS 24,33-38. Dies deutet darauf hin, dass die Standard-CSS-Definition fehlen möglicherweise einige der aggressivsten CTC.
Trotz der beschriebenen Einschränkungen ist es erwartende thin diesem Manuskript beschrieben e Protokolle wichtige Werkzeuge für verbesserte CTC-Analyse unter Verwendung des CSS Entwicklung neuartiger Technologien CTC, Optimierung von benutzerdefinierten Marker und ein besseres Verständnis der Biologie CTC mit präklinischen in vivo Maus-Modelle sein. Zusammengenommen werden diese Protokolle eine nützliche Ressource für die Nutzer dieser Plattform interessiert in der präklinischen und klinischen Forschung im Zusammenhang mit der Metastasierung und CTC werden.
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Disclosures
Der Autor (ALA) erhielt Mittel, die von Janssen Onkologie, dessen Mutterunternehmen Johnson & Johnson besitzt auch Janssen Diagnostics LLC, die Reagenzien und Instrumente in diesem Artikel verwendet produziert wurde bereitgestellt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem Ontario Institute of Cancer Research (# 08NOV230), der Canada Foundation for Innovation (# 13199), Prostatakrebs Kanada, Janssen Onkologie, dem London Regional Cancer Program, und die Unterstützung der Geber von John und Donna Bristol unterstützt durch die London Health Sciences Foundation (ALA). UEG wird von einem Frederick Banting und Charles Best Canada Graduate Scholarship-Doktorandenpreis unterstützt. ALA wird von einem CIHR New Investigator Award und einer früh Researcher Award von der Ontario Ministerium für Forschung und Innovation unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M EDTA | |||
| Anti-human CD44-FITC | BD Pharmigen | 555478 | |
| Anti-human CD44-PE | BD Pharmigen | 555479 | |
| Anti-human HLA-Alexa Fluor 488 | BioLegend | 311415 | |
| Anti-mouse CD45-APC | eBioscience | 17-0451-82 | |
| Bond Primary Antibody Diluent | Leica | AR9352 | |
| CellSave Preservative Tubes | Veridex | 952820 (20 pack) 79100005 (100 pack) | |
| CellSearch CTC Control Kit | Veridex | 7900003 | |
| CellSearch CTC Kit | Veridex | 7900001 | |
| CellSearch CXC Control Kit | Veridex | 7900018RUO | |
| CellSearch CXC Kit | Veridex | 7900017RUO | |
| Instrument Buffer | Veridex | 7901003 | |
| Streck Cell Preservative (aka CytoChex) | Streck | 213350 | |
| 1 ml Syringe | |||
| 10 ml Serological pipette | |||
| 1,000 µl Pipette | |||
| 1,000 µl Pipette tips | |||
| 12 mm x 75 mm Flow tubes | |||
| 200 µl Gel loading tips | |||
| 200 µl Pipette | |||
| 22 G Needle | |||
| 5 3/4 in Disposible Pasteur pipet | VWR | 14672-200 | |
| 5 ml Serological pipette | |||
| Automated pipettor | |||
| Capillary Blood Collection Tube (EDTA) | BD Microtainer | 365974 | |
| CellSearch Analyzer II | Veridex | 9555 | Includes magnests and verification cartirdges |
| CellSearch AutoPrep System | Veridex | 9541 | |
| Centrifuge | |||
| MagCellect Magnet | R&D Systems | MAG997 | |
| Small Latex Bulb | VWR | 82024-550 | |
| Vortex |
References
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