Introduction
وقد استخدمت نماذج الفئران على نطاق واسع في أبحاث الدماغ 1. وقد تم التحقيق الارتباط الوراثي، النمط الظاهري في الماوس والفئران العقول من خلال دراسة التعبير الجيني في الحمض النووي الريبي و / أو مستويات البروتين من جهة، والظواهر المورفولوجية والوظيفية، الكهربية و / أو السلوكية على الآخرين 2-6. ومع ذلك، لنفهم تماما الآليات التي تربط بين النمط الظاهري إلى التركيب الوراثي، لا بد من التحقيق في الأحداث الجزيئية المصب التعبير بروتين، مثال. عملية التمثيل الغذائي للركائز البيوكيميائية التي تعمل على الانزيمات 7. هذا الشرط أدى، على مدى 10 إلى 15 سنة الماضية، إلى نهضة أبحاث الأيض في العديد من فروع علم الأحياء 8،9. بينما غالبا ما تركز الدراسات الأيضية الكلاسيكية على تفاصيل مسارات محددة، ويهدف النهج الجديد metabolomic نحو تحقيق شامل للوضع العالمي الأيض الأنسجة قيد النظر.واحد نتيجة لهذا المفهوم هو حاجة واضحة لالأدوات التحليلية التي تقلل من التحيز نحو مسارات و / أو فئات معينة من المركبات الأيضية. ومع ذلك، يستند مقايسة البيوكيميائية الكلاسيكية على تفاعل كيميائي معين من تحليلها محددة التي تحتاج إلى أن تكون محددة قبل إجراء الفحص. على النقيض من ذلك، تعتمد التقنيات الطيفية مثل الرنين المغناطيسي النووي (NMR) مطياف ومطياف الكتلة (MS) (ط) على وجه الخصوص الجزيئية (المادية) الخصائص من المركبات الكيميائية الحيوية، كل منها يؤدي إلى واحد أو عدة إشارات متميزة في الطيف الكشف في سياق تجربة واحدة؛ و (ثانيا) كشف عدد كبير من مركبات مختلفة في التجربة.
وهكذا، كل الطيف يحتوي على معلومات مشتركة من مجموعة كاملة من نواتج الأيض. لهذا السبب، الطرق الطيفية هي الأدوات المناسبة لالايض، كما لا يحتاج إلى اختيار قبل أن تتخذ بشأن طبيعة الحليلة المراد قياسها 8
على الرغم من أن التحليل الطيفي NMR MS ويمكن أن تستخدم بالتبادل لتحليل العديد من نواتج الأيض، كل طريقة يمتلك مزايا وعيوب التي تم استعراضها مؤخرا 10 محددة. باختصار، يمكن عادة NMR الطيفي أن يؤديها من استخراج النفط الخام و لا يتطلب الفصل الكروماتوغرافي لمركبات العينة قبل التحليل. على النقيض من ذلك، تعمل بالغاز أو MS اللوني السائل (GC أو LC) فصل، باستثناء معينة التطورات الأخيرة مثل التصوير الطيف الكتلي. في بعض الحالات الخاصة مثل تحليل السكريات، قد تصبح فصل LC ضرورة لNMR الطيفي كذلك، لأن خطوط صدى من السكريات المختلفة تتداخل بشكل كبير في بروتون (H 1) NMR الأطياف. ومع ذلك، 1 H NMR الطيفي دون مركز حقوق الإنسانيبقى الفصل omatographic الأكثر شعبية، تقريبا التطبيقية عالميا طريقة NMR metabolomic. عموما، وإعداد العينات هو أكثر تستغرق وقتا طويلا ومعقدا لMS مما هو عليه لNMR الطيفي. مشاكل خطيرة بسبب الآثار مصفوفة هي أقل شيوعا بكثير في NMR الطيفي في MS من حيث أنها قد تؤدي إلى إشارات الموهنة كبير. ويمكن تحقيق المستقلب الكميات إما الأسلوب. ومع ذلك، هناك حاجة إلى مركبات متعددة لمعيار MS بسبب الاختلافات في الآثار مصفوفة والكفاءة التأين بين نواتج الأيض. على النقيض من ذلك، هناك حاجة إلى معيار واحد فقط لكل عينة للتحليل الطيفي NMR لأنه في ظل الظروف القياس المناسبة، والأسلوب الأخير هو جوهريا بفضل الكمية لاستجابة NMR الخطية بدقة نواة لوحظ. والعيب الرئيسي هو من NMR لها حساسية منخفضة نسبيا. MS، ولا سيما LC-MS، هو أكثر حساسية من NMR عدة أوامر من حجمها؛ لهذا السبب، MS هو أن يفضل على NMR للتحليل المركبات التي تحدث في تركيزات منخفضة للغاية. من ناحية أخرى، فإن الطبيعة غير تدميري التجربة NMR هي ميزة واضحة على MS. بهذه الطريقة، NMR يمكن القيام بها مرارا وتكرارا على نفس العينة، على سبيل المثال، لمختلف نوى-NMR النشطة مثل 1 H، الفوسفور-31 (31 P)، الكربون 13 (C 13)، الفلور-19 (19 F) الخ، كما لا يتم استهلاك المواد بواسطة NMR خلافا لقياسات MS.
كلا NMR وMS يمكن استخدامها في أوضاع مختلفة، كل واحد يجري الأمثل للكشف عن مركبات ذات خصائص كيميائية معينة. على سبيل المثال، 31 P NMR غالبا ما يكون أكثر ملاءمة من 1 H NMR لتحليل المركبات فسفرته بتركيز معتدل، على الرغم من نواتج الأيض تقريبا كل فسفرته تحتوي أيضا على بروتونات. ومع ذلك، قد يكون غامضا من 1 إشارات H NMR بحلول 1 H NMR إشارات من المركبات الأخرى، غير فسفرته، في حين أن الأخيرةبالطبع لا تسبب إشارات خلفية في 31 P NMR الأطياف. في الوضع التمثيلي، 19 F تحليل NMR هو أن المفضل للمركبات المفلورة، على سبيل المثال، والمخدرات المفلورة (لا توجد اشارات الخلفية من نواتج الأيض الذاتية)، في حين أن حالة خاصة من 13 C NMR ذات أهمية على وجه الحصر تقريبا إذا كان مصير 13 ج السلائف الأيضية الخارجية المسمى يحتاج إلى أن يتبع، بسبب وفرة الطبيعية منخفضة للغاية من النظير 13 C (حوالي 1٪). العديد من الطيف الجماعية تعمل إما في وضع الأيونات السالبة أو وضع ايون ايجابية. ولذلك، فمن المهم أن نعرف قبل تحليل ما إذا كانت أيونات التي يتعين مراعاتها واتهم سلبا أو إيجابا. نركز هنا على بروتوكول للتحليل metabolome أنسجة المخ بنسبة 1 H و 31 P NMR الطيفي لأن هذا الأسلوب ينتج عدد كبير من تركيزات المستقلب مهمة بتكلفة منخفضة من حيث (ط) الوقت اللازم لإعداد عينة لالثانية (ب) الجهد المطلوب لالمستقلب الكميات. جميع التجارب يمكن القيام بها باستخدام معدات مختبر الكيمياء الرطبة القياسية ومنشأة NMR الطيفي عالية الدقة. يتم وصف متطلبات إضافية في القسم بروتوكول أدناه.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: الحيوان الأخلاق بيان
وجاءت الدراسات على الحيوانات على الفئران المبادئ التوجيهية صالحة في فرنسا، وتمت الموافقة من قبل اللجنة المحلية الأخلاق (# 40.04، جامعة إيكس مرسيليا مدرسة الطبية، مارسيليا، فرنسا).
1. حصاد وتجميد الدماغ الجرذ
- إعداد المواد المطلوبة: النيتروجين السائل (N 2liq.) في ديوار التي هي كبيرة بما يكفي للحفاظ على المشبك تجميد (على الأقل 2-3 حجم L). مخدر (على سبيل المثال، الأيزوفلورين، أو الكيتامين / زيلازين). غرفة التخدير. أدوات تشريح معقمة: مقص جراحي، مشرط، ملقط. مناديل الأنسجة وتنظيف زجاجة مع الكحول (الإيثانول). الإبر (25 G). 1 مل و 10 مل المحاقن. صفائح الألومنيوم التسمية (حوالي 10 × 10 سم) مع شريط لاصق. استخدام ورقة التفاف الفردية أدمغة الفئران تجميد فرضت.
ملاحظة: دائما ارتداء قفازات واقية ونظارات حماية العين أو قناع عند التعامل مع النيتروجين السائل! - ملء ديوار مع N 2liq. ومكان مجاناالمشبك زينغ في ديوار. تأكد من أن كمية N 2liq في ديوار يكفي لتكرار إجراءات تجميد المشبك (عدة لترات، وكمية من N 2liq تبخر خلال تجميد كل لقط يعتمد على حجم المشبك).
- تخدير الحيوانات (على سبيل المثال، من خلال الأيزوفلورين، أو عن طريق الحقن داخل الصفاق من الكيتامين / زيلازين خليط). الشروع في القتل الرحيم من ثقب في القلب لمنع النزيف عند إزالة فروة الرأس وفتح الجمجمة. خطوات 1،4-1،7 أدناه وصف هذا الإجراء القياسي.
ملاحظة: في بروتوكولات خاصة تتطلب الحفاظ على أقصى قدر من الجلوكوز والطاقة العالية الأيض، الفئران التضحية من دماغ الحيوان تخدير مع N-تجميد قمع 2liq 11 بعد التراجع من فروة الرأس. ثم، تشريح الدماغ من الجمجمة تحت متقطعة N 2liq لتقليل الأيض بعد الوفاة 12. - بلل رئيس الفئران مع الكحول التنظيف. استخدام مقص جراحي إلى (ط) REMاوفه فروة الرأس، و (ب) الجمجمة مفتوحة على طول الغرز في الجمجمة.
- استخدام ملقط لفتح الجمجمة أبعد من ذلك، وإزالة المخ بأكمله من تحت الجمجمة مفتوحة، وتحديد المواقع رئيس رأسا على عقب. بسرعة إزالة أي آثار مرئية من الدم باستخدام مناديل الأنسجة. إذا نصفي الدماغ هي عملية الأيض ومتماثل شكليا، وأنها مريحة لاستخدام واحد من نصفي الكرة الأرضية لتحليل الأيض بعد فصله من نصف الكرة الأخرى عن طريق شق مع مشرط. إذا لزم الأمر، استخدم نصف الكرة المتبقية للدراسات الدماغ الأخرى مثل الأنسجة.
- بسرعة إزالة تجميد المشبك من N 2liq -تعبئة ديوار، ضع كامل أو نصف دماغ الفئران على سطح واحد داخلي، المشبك، وعلى الفور تجميد إدراج المشبك إلى N 2liq -تعبئة ديوار في حين عقد المشبك ضغط بحزم. ضمان أن الخطوات 1.3-1.6 اتخاذ أي أطول من 60 ثانية.
- بعد 1-2 دقيقة إزالة تجميد المشبك من ديوار، المشبك مفتوح، وتخفيف أنسجة المخ المجمدة من المشبك، والتفافالأنسجة المجمدة في ورقة الألمنيوم وصفت بشكل مناسب (انظر 1.1 أعلاه). تأكد من أن التسمية مقروءة ويبقى ثابتا في مكانه بعد ملفوفة العينة. وضع عينة بسرعة ملفوفة في N 2liq. تنفيذ الإجراء بأكمله في أسرع وقت ممكن لتجنب ذوبان أنسجة المخ المجمدة.
- تخزين العينات المجمدة في 2liq N أو في الثلاجة عند -80 درجة مئوية حتى استخراج المستقلب.
ملاحظة: كلما عينة بيولوجية هي ليتم تخزينها لأكثر من سنة واحدة، والتخزين في درجة حرارة N 2liq هو أن يفضل على -80 درجة مئوية. هذا ينطبق أيضا على ما تبقى من هذا البروتوكول.
2. إعداد المستقلب استخراج الداخلي
- إعداد الخالط الأنسجة ومطابقة أنابيب الاختبار (على سبيل المثال، 10 مم القطر الداخلي، اعتمادا على القطر من رمح الخالط، عادة ما تكون مصنوعة من البلاستيك). استخدام المجانسة الكهربائية بدلا من المجانسة مدفوعة يدويا (المطاحن الأنسجة). قبلحلج vortexer والتوازن المختبر.
- إعداد دلو مملوء الثلج المجروش. إبقاء quantitites كافية من الميثانول، والكلوروفورم والماء على الجليد (4 مل في كل 250-350 ملغ أنسجة المخ المجمدة).
- إعداد الماصات نقل وقوارير.
- إعداد قارورة زجاج (≥20 حجم مل) مع قبعات المسمار ومكان على الجليد (واحد لكل قنينة استخراج الأنسجة). المسمار قبعات مناسبة مع تفلون حواجز مقاومة للالكلوروفورم.
- إعداد 5 مل الماصات البلاستيكية لتوزيع الميثانول والمياه، والماصات الزجاج أو المحاقن هاميلتون للاستغناء الكلوروفورم. إعداد الماصات البلاستيكية إضافية (5 أو 10 حجم مل) لنقل خليط من جناسة الأنسجة والميثانول.
- تأكد من شطف جميع الأواني الزجاجية جيدا بالماء المقطر وتجفف بعناية قبل الاستخدام لإزالة آثار الشوائب، ولا سيما فورمات NMR للكشف وخلات.
- ملء هاون الخزف مع N 2liq، مكان الخزف في مدقة الهاون وإعادة ملء مع 2L Nالذكاء. سوف النيتروجين تتبخر حتى درجة حرارة هاون ومدقة منخفضة بما فيه الكفاية. إبقاء كمية صغيرة من N 2liq في الهاون.
3. استخراج الأيضية
- إزالة عينة من أنسجة المخ المجمدة التخزين (N خزان 2liq أو الفريزر -80 درجة مئوية). ثم، ونقل على الفور عينة الأنسجة لالهاون مملوءة جزئيا مع N 2liq.
- استخدام N 2liq مدقة -cold لكسر أنسجة المخ إلى أجزاء أصغر المجمدة التي تناسب بسهولة في أنابيب اختبار تستخدم لتجانس الأنسجة. لمنع قطع من الأنسجة المجمدة من أن المتوقع من هاون في عملية وتفتيت النسيج في حين لا يزال يجري ملفوفة في ورقة الألمنيوم. لا طحن الأنسجة المجمدة إلى مسحوق وهذا من شأنه أن يجعل نقل إلى أنبوب اختبار أكثر صعوبة (زيادة خطر تكثيف الماء). هام: خلال الإجراء بأكمله، إضافة إلى N 2liq هاون حسب الحاجة للحفاظ على عينة عمق المجمدة.
- مزيج ققطع مول أنسجة المخ المجمدة تماما، تزن من 250-350 ملغ ونقل إلى أنبوب اختبار مليئة الميثانول الجليد الباردة (4 مل لأنسجة المخ 250-350 ملغ). تضاف في كل مرة قطعة من الأنسجة المجمدة، وهذه التجانس على الفور مع الخالط الأنسجة.
ملاحظة: إكمال هذا الإجراء بأكمله بسرعة لتجنب (ط) التكثيف كبيرة من المياه على العينة التي من شأنها أن تؤدي إلى المبالغة في تقدير وزن العينة، و (ثانيا) التدفئة وذوبان الجليد من العينة. يجب أن تكون قطعة نسيج الفردية في حالة تجمد في بداية عملية التجانس. - بعد تمت إضافة آخر قطعة من العينة دماغ الفئران المجمدة إلى أنبوب اختبار والمتجانس، ونقل جناسة إلى ≥20 مل قارورة زجاجية حجم، على مقربة سقف المسمار واسمحوا الوقوف على الجليد لمدة 15 دقيقة. إذا كان حجم أنبوب الاختبار ليست كبيرة بما فيه الكفاية ل≥4 مل الميثانول، واستخدام حجم أصغر الميثانول إلى التجانس جزء من أنسجة المخ المجمدة، ونقل الخليط إلىتستمر زجاج القارورة والمجانسة قطع الأنسجة المتبقية مع الميثانول النقي. تأكد من إجمالي حجم الميثانول هو 4 مل لكل 250-350 ملغ أنسجة المخ.
- إضافة نفس الحجم من الجليد الباردة الكلوروفورم (أي 4 مل لكل أنسجة المخ 250-350 ملغ) لجناسة، دوامة بدقة واسمحوا الوقوف على الجليد لمدة 15 دقيقة.
ملاحظة: دائما استخدام التهوية غطاء الكيميائية عند التعامل مع المذيبات المتطايرة، وخاصة الكلوروفورم! - إضافة نفس حجم الماء (أي 4 مل لكل أنسجة المخ 250-350 ملغ) لجناسة، دوامة بدقة واسمحوا الوقوف في -20 درجة مئوية خلال الليل.
4. إعداد فصل المرحلة وتبخر المذيبات
- إعداد أجهزة الطرد المركزي الباردة (4 درجات مئوية، 13،000 XG في أقصى نصف قطر) وأنابيب الطرد المركزي. تأكد من أن الأخيرة هي ≥20 حجم مل، ومقاومة للالكلوروفورم، ويمكن أن تحمل القوى النابذة من 13،000 ز س. استخدام أنابيب زجاجية مخصصة الطرد المركزي ولكن شطف (كما كل الزجاج وير) مع الماء المقطر يكوناستخدام الصدارة (انظر 2.3).
- إعداد تشطف جيدا الماصات الزجاج باستور وpropipettor الاقتضاء (لمبة، دليل مضخة ماصة، ماصة المساعدات التلقائي / pipettor، الخ).
- إعداد أنبوبين إضافية تشطف جيدا (≥15 حجم مل) لكل عينة الدماغ، واحدة منها يجب أن تكون مقاومة للالكلوروفورم (مصنوعة من الزجاج أو التيفلون)، والآخر إلى الميثانول (مصنوعة من مقاومة للميثانول، أو الزجاج البلاستيك).
- إعداد جهاز تبخر المذيبات (متوفر تجاريا أو homebuilt). تأكد من أن هذا الجهاز يوفر تيار تسيطر بدقة من غاز النيتروجين الجاف التي يتم توجيهها على سطح حلا استخراج تحتوي على المذيبات المتطايرة (الميثانول، والكلوروفورم).
- إعداد اثنين من الصواني إضافية أو دلاء مملوءة الجليد: واحدة لنقل العينات على الجليد، وآخر لحفظ عينات الباردة أثناء عملية التبخر.
- إعداد مجفاد (مجفف بالتجميد) والمواد اللازمة لتجفيد: (ط) واحد 50مل أنبوب الطرد المركزي أو فراغ قارورة جولة القاع في استخراج، و (ثانيا) N 2liq لتجميد المرحلة المائية من عينات (L ≤0.3 لكل عينة). إذا تم استخدام أنبوب الطرد المركزي، أيضا بإعداد واسعة عنق الزجاجة فلتر فراغ مناسبة لمجفاد.
5. المرحلة الانفصال وتبخر المذيبات
- لفصل كامل المرحلة، ونقل الأنسجة جناسة الميثانول / الكلوروفورم / المياه / الدماغ (انظر 3.6) إلى أنبوب الطرد المركزي مقاومة للالكلوروفورم (حجم ≥20 مل) وأجهزة الطرد المركزي في 13،000 x ج و 4 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة.
ملاحظة: سوف تشكل مرحلتين يفصل بينهما طبقة من البروتين عجلت. تتكون (أثقل) المرحلة الدنيا من الميثانول، والكلوروفورم والدهون الذائبة، في حين أن (أخف) المرحلة العليا تتكون من الماء والميثانول والأيض للذوبان في الماء المذاب. - استخدام ماصة باستور لنقل المرحلة العليا لمناسبة ≥15 مل أنبوب (مقاومة للالميثانول البلاستيك أو الزجاج). الحفاظ على طم.
- استخدام ماصة باستور جديدة لنقل المرحلة السفلى لأنبوب ≥15 مل المناسب (الزجاج أو التيفلون). الحفاظ على الجليد.
- تخزين طبقة من البروتين عجلت في -80 درجة مئوية إذا كان ذلك لاستخدامها لتحديد البروتين الكلي. أو تجاهل آخر.
- الحفاظ على أنبوب مع المرحلة الثلج / الميثانول (انظر 5.2) على الجليد وتتبخر الميثانول من خلال توجيه تيار النيتروجين الجاف على سطح الحل استخراج. بدلا من ذلك، بلطف النيتروجين فقاعة من خلال الحل استخراج. إنهاء عملية التبخر عندما فقاعات النيتروجين لم يعد يؤدي تخفيض حجم في الحل استخراج. في هذا الوقت، تواصل مع تجفيد (انظر 5.7)، أو تجميد والحفاظ على العينة في -80 درجة مئوية مع أنبوب مغلق (سقف المسمار أو Parafilm) لتصبح جاهزة للتجفيد.
- وضع أنبوب مع المرحلة الميثانول / الكلوروفورم (انظر 5.3) على الجليد وتتبخر الميثانول من خلال توجيه تيار النيتروجين الجاف على سوrface من الحل استخراج. عندما يبخر المذيب جميع، إنهاء العملية والحفاظ على العينة في -80 درجة مئوية مع أنبوب مغلق (سقف المسمار أو Parafilm) لتصبح جاهزة للتحليل NMR.
- إعداد المرحلة المائية لتجفيد
- بعد انتهاء عملية تبخر الميثانول (انظر 5.5)، ونقل العينة إلى تشطف جيدا أنبوب 50 مل الطرد المركزي (إذا كان يتم تجميد العينة، ذوبان الجليد قبل نقل). بدلا من ذلك، ونقل إلى فراغ قارورة جولة القاع.
- تجميد استخراج حل عن طريق تناوب أنبوب الطرد المركزي (أو مستديرة قاع القارورة) إدراجها جزئيا في N 2liq مثل أن السطح الداخلي للأنبوب أو قارورة تغطي تدريجيا من السائل المجمد. تأكد من عدم N 2liq. يمكن أن تدخل في وعاء.
- عندما يتم تجميد كل السائل، تغطية أنبوب مع غطاء ثقب المسمار أو غطاء للسماح للبخار من الفرار، ووضع أنبوب في زجاجة فلتر فراغ واسعة الرقبة.
- بدء تجفيد بعد عطاتشينغ قارورة أو زجاجة إلى مجفف التجميد.
- إنهاء عملية تجفيد عندما العينة جافة تماما. تبقي العينة في -80 درجة مئوية في أنبوب مغلق (مع غطاء ضيق!) حتى استخدامها لتحليل NMR.
وهناك حاجة عادة لا تزيد عن 24 ساعة لتجفيد: ملاحظة. يمكن مجفف بالتجميد عدة عينات في وقت واحد، اعتمادا على تصميم مجفاد، وحول ما إذا كان يتم استخدام أنابيب الطرد المركزي في زجاجات واسعة الرقبة أو أسفل قوارير مستديرة.
6. إعداد العينات NMR
- متجر المجففة ومقتطفات مجفف بالتجميد في درجة حرارة منخفضة جدا (≤-80 ° C). إعادة حل lyophilizates لإعداد عينات NMR NMR فورا قبل التجربة.
ملاحظة: تخزين العينات في محلول و / أو درجة حرارة الغرفة القريب قد يؤدي إلى تدهور عينة! - إعداد مائي 200 ملي حل عامل خالب، حمض العابرة لل1،2-cyclohexyldiaminetetraacetic (CDTA)، على النحو التالي:
- يضاف الماء النقي (على سبيل المثال، 20 مل) إلى أنبوب اختبار أو أنبوب الطرد المركزي، وإضافة كمية من مسحوق CDTA الضروري لتوليد ملي حل 200.
ملاحظة: وهناك نسبة كبيرة من CDTA لا تكون قابلة للذوبان، لأن درجة الحموضة منخفضة جدا منذ أن تم استخدام الحمض من CDTA بدلا من الملح CDTA. - إضافة بعناية، خطوة خطوة، وزيادة كميات من مسحوق CsOH إلى حل CDTA، ودوامة جيدا بعد كل إضافة.
ملاحظة: سيتم CDTA ذوبان جزء زيادة مع زيادة محتوى CsOH في محلول مائي. تجنب "overtitration"، أي أقل من إضافة كمية متكافئة من CsOH إلى حل CDTA. - عندما تم حل ما يقرب من جميع مسحوق CDTA، بدء قياس درجة الحموضة بعد كل إضافة CsOH vortexing لوشامل. إنهاء CsOH بالإضافة عند الوصول إلى درجة الحموضة النهائية (الجدول 1).
ملاحظة: في هذا الوقت، سيتم حل جميع CDTA. استخدام جيم + باعتباره counterion إلى CDTA هو GENERفضل حليف على نا + أو K +. CS + هو حمض لويس لينة بسبب دائرة نصف قطرها كبير في الأيونية، بدلا من نا و+ K + التي لها أنصاف أقطار الأيونية هي أصغر والأحماض الصعبة. بالتالي، CS + أشكال المجمعات مع الفوسفات (القواعد الصلبة) أقل من القيام بسهولة ونا + K +. هذا هو مفيد ل31 P NMR الطيفي من نواتج الأيض فسفرته لcomplexation يميل إلى زيادة linewidths NMR، لا سيما في ظل ظروف بطيئة في التبادل الأيوني وسيطة.
- يضاف الماء النقي (على سبيل المثال، 20 مل) إلى أنبوب اختبار أو أنبوب الطرد المركزي، وإضافة كمية من مسحوق CDTA الضروري لتوليد ملي حل 200.
- 31 P تحليل الدهون الفوسفاتية (PL) NMR، ويحل الدهون المجففة (انظر 5.6) في 700 ميكرولتر من خليط المذيبات تتألف من كلوروفورم بالديوتيريوم (اداه 3)، والميثانول والحل CDTA أعد كما هو موضح في 6.2 (5: 4: 1 نسبة حجم). نقل العينة إلى أنبوب microcentrifuge. استخدام التهجير المباشر (أو إيجابيا التشريد) micropipette مع كلوروفورم مقاومةنصائح النمل في كل الخطوات.
ملاحظة: نضع في اعتبارنا أن تغيير أي من المعلمات التالية سوف تؤثر على مظهر (التحول الكيميائي وعرض الخط) من PL 31 P NMR الأطياف 13-17:
(ط) نسبة حجم اداه 3: MeOH: CDTA الحل
(ب) تستخدم إجمالي حجم المذيبات
(ج) الرقم الهيدروجيني للعنصر مائي من المذيب
(د) التركيز CDTA العنصر مائي من المذيب.
ملاحظة: في العام، وصقل هذه المعلمات عينة (الجدول 1) ليست ضرورية، ويجب أن يتم تنفيذ مع الحذر الشديد إذا رغبت في حالات خاصة. تغيير نسبة حجم بين المذيبات يؤدي بسهولة في تشكيل نظام يتكون من مرحلتين بدلا من مرحلة واحدة متجانسة! تم العثور على نظام المرحلة الأولى لتكون أكثر عملية من النظام على مرحلتين في معظم التطبيقات 13،14. - ل1 تحليل H NMR الأيض للذوبان في الماء، ويحل lyophilizate (انظر 5.8) في 700 ميكرولتر أكسيد الديوتيريوم (D 2 O) التي تحتوي على 3- (trimethylsilyl) البروبيونيك-2،2،3،3-D4 ملح الصوديوم حمض (TSPd 4) في نطاق millimolar (D 2 O تحتوي على 0.05٪ TSPd 4 متاح تجاريا) . نقل العينة إلى أنبوب microcentrifuge.
- ضبط الرقم الهيدروجيني للمحلول مائي مما أدى استخراج إلى 7.3 بإضافة كميات صغيرة (حوالي 2 ميكرولتر) من كلوريد الديوتيريوم (DCL) وdeuteroxide الصوديوم (NaOD) الحلول. أولا، نبدأ مع 0.02 N DCL أو NaOD الحلول. إذا 2 أو 3 إضافات لاحقة لا تسبب تغيير درجة الحموضة كافية، مع مواصلة 0.2 N DCL أو NaOD الحلول. يجب الحرص على عدم overtitrate.
ملاحظة: المبلغ الإجمالي من مختبر دبي المركزي أو NaOD الحل اللازمة تعتمد على كمية من أنسجة المخ المستخرج. ملاحظة هذه القيمة لدقة الكميات الأيض. في معظم الحالات يجب أن تكون وحدات تخزين مشتركة من مكتب الارتباط وأضاف NaOD حلول يذكر تقريبا (ما يقرب من 1٪ من حجم العينة NMR).
- للحصول على أفضل النتائج، استخدم عالية الدقة مطياف الرنين النووي المغناطيسي متعدد النوى (≥9.4 تسلا قوة الحقل، الموافق 31 P 162 ميغاهيرتز، 400 ميغاهيرتز أو 1 ترددات الرنين H). إلى جانب لفائف 31 P، تأكد من أن 31 P NMR التحقيق يمتلك 1 H لفائف لفصل البروتون. وضع تنظيم درجة الحرارة من المسبار NMR إلى القيمة المستهدفة المطلوب (عادة 25 درجة مئوية).
ملاحظة: مسبار درجة الحرارة قد تحتاج 10-20 دقيقة لتحقيق الاستقرار! - الطرد المركزي PL استخراج الحل في أنبوب microcentrifuge (انظر 6.3) في 4 درجات مئوية و11،000 x ج لمدة 30 دقيقة لتدور أسفل مخلفات الصلبة في العينة. نقل 600 ميكرولتر من طاف لأنبوب NMR عالية الجودة (5 ملم القطر الخارجي).
- إعداد المناسب الجذعية إدراج المحورية شغل مائي مع 20 ملي methylenediphosphonate (MDP) حل في درجة الحموضة 7.0 ل كيميائية تحول المرجعيةوالكميات. وضع هذا إدراج في أنبوب NMR مليئة استخراج PL الحل.
- تناسب أنبوب NMR مع الدوار والنقل المناسب إلى المغناطيس NMR. الآن تدور العينة في 15-20 هرتز والانتظار حتى تعديل العينة إلى درجة حرارة مجموعة (حوالي 10 دقيقة).
- تقليل بعناية التجانس الحقل المغنطيسي عبر عينة عن طريق تعديل على محور وخارج المحور التيارات فائف الرقائق 18.
- تعيين المعلمات NMR الطيف لاكتساب القيم المثلى، والتي قد تختلف بوصفها وظيفة من قوة المجال المغناطيس (لنظام 9.4 T، انظر الجدول رقم 1 للقيم المعلمة مستحسن).
- تعيين عدد من العابرين في التجربة (= NS).
- تعيين NS إلى حوالي 80 (المدة الإجمالية لجمع البيانات حوالي 20 دقيقة) فقط إذا الثابتة والمتنقلة الأكثر انتشارا هي أن quantitated بدقة (فسفاتيديل (PtdCho)، فسفاتيديل إيثانولامين (PtdEtn)، إيثانولامين بلازمالوجين).
- تعيين NS إلى حوالي 100-200 (المدة الإجمالية دإذا الثابتة والمتنقلة أقل تركيزا أن تكون quantitated اكتساب آتا 1-2 ساعة) (ألكيل-أسيل-فسفاتيديل، فوسفتيدلينوستول، فسفاتيديل، حمض الفسفاتيديك).
- تعيين NS إلى حوالي 1،500-2،000 (المدة الإجمالية لجمع البيانات 7-10 ساعة، التجربة بين عشية وضحاها) إذا الثابتة والمتنقلة قليلة جدا التركيز هي أن quantitated، مثل أحادية فوسفتيدلينوستول وdiphosphates (PtdIP وPtdIP 2)، كارديوليين، lyso، الثابتة والمتنقلة ، ألكيل أسيل-فسفاتيديل إيثانولامين، وأحيانا غيرها.
- بعد انتهاء اكتساب الطيف، عملية خالية تسوس التحريض (ااا) باستخدام معلمات الأمثل. قيم هذه المعايير تختلف بوصفها وظيفة من قوة الحقل المغنطيسي، جودة الرقاقة، وإشارة إلى أن PL كميا.
- للحصول على أفضل النتائج لمجموعة كاملة من الثابتة والمتنقلة، وتكرار المعالجة باستخدام متعددة (اثنين على الأقل) إجراءات التصفية مختلفة. استخدام قرار تعزيز قوي للإشارات متداخلة بقوة، على سبيل المثال، لPtdCho وPtdEtnالمناطق.
- استخدام تصفية قوية (ضعيفة أو معدومة قرار تعزيز) للإشارات ضعيفة.
- تصفية إشارات ضعيفة جدا وواسعة دون تداخل كبير من apodization (على سبيل المثال، LB = 3 هرتز) لزيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء، مثل PtdIP وPtdIP 2. انظر الجدول رقم 1 لتجهيز المعلمات مميزة.
- تحديد مساحة كل إشارة PL فيما يتعلق المنطقة تحت إشارة من مجمع المرجعية (MDP) في نفس الطيف.
- معايرة إشارة من مجمع المرجعية (MDP) في تجربة منفصلة، وذلك باستخدام 5 ملم أنبوب NMR مليئة (ط) وهو مركب من تركيز الفوسفور معروفة، و (ب) نفس محوري إدراج الجذعية المستخدمة في التجارب P PL 31 NMR ( نرى 7.3 و 7.9).
- حساب تركيزات PL الفردية على أساس المناطق النسبية إشارات PL من جهة (انظر 7.9)، وحصلت على قيمة المعايرة لMDP منإدراج المحورية من جهة أخرى (انظر 7.10). تأخذ في الاعتبار أن عدد النوى الفوسفور المساهمة في إشارة معينة 31 P NMR قد تختلف بوصفها وظيفة من أصل الجزيئي لتلك الاشارة.
ملاحظة: إشارة فسفونات MDP (المشار إليها عادة إلى 19.39 جزء من المليون) تمثل نواتين الفوسفور، كما يفعل إشارة كارديوليين الفوسفات. كل الإشارات NMR PL 31 P أخرى اكتشفت في مقتطفات الدماغ تمثل نواة الفسفور واحد لكل منهما. - استخدام البرمجيات إحصاءات حسب الحاجة لمقارنة مستويات الدماغ PL بين مجموعات من الحيوانات.
8. أداء تجربة 1 H NMR لتحليل استقلاب الدماغ للذوبان في الماء
- وضع تنظيم درجة الحرارة من المسبار 1 H NMR لقيمة الهدف المطلوب (عادة 25 درجة مئوية). تصريحات انظر أيضا 7.1.
- أجهزة الطرد المركزي الحل المستخلص المائي في أنبوب microcentrifuge (انظر 6.5) في 4 درجات مئوية و11،000x ج لمدة 30 دقيقة لتدور أسفل مخلفات الصلبة في العينة. نقل 600 ميكرولتر من طاف لأنبوب NMR عالية الجودة (5 ملم القطر الخارجي).
- نقل NMR NMR أنبوب إلى المغناطيس، ووضع الرقائق NMR الطيف المعلمات لاكتساب القيم المثلى كما هو موضح في 7،4-7،6. انظر أيضا الجدول 1 للقيم المعلمة الموصى بها.
- تعيين عدد من العابرين في التجربة إلى حوالي NS = 32 (المدة الإجمالية من الحصول على البيانات حوالي 13 دقيقة). للحصول على نسب جيدة إشارة إلى الضجيج لإشارات ضعيفة جدا، ولا سيما في المنطقة العطرية، استخدم NS = 64 (المدة الإجمالية من الحصول على البيانات حوالي 26 دقيقة) أو أكثر.
- بعد انتهاء اكتساب الطيف، عملية خالية تسوس التحريض (ااا) باستخدام معلمات الأمثل. قيم هذه المعايير تختلف قليلا بوصفها وظيفة من قوة مغناطيسية المجال، جودة الرقاقة، وإشارة إلى أن المستقلب كميا.
ملاحظة: في معظم الحالات، يكفي لمعالجة كل الطيف مرة واحدةوتوظف مجموعة من المعلمات معالجة تقديم حلا وسطا جيدا لجميع إشارات الأيض. انظر الجدول رقم 1 لتجهيز المعلمات مميزة. - تحديد مساحة كل إشارة الأيض (غالبا ما تكون multiplet، وتداخل أحيانا مع singlets أو multiplets الأخرى الناجمة عن جزيئات مختلفة) فيما يتعلق المنطقة تحت إشارة من مجمع المرجعية (TSP-4 د) في نفس الطيف.
- حساب تركيزات المستقلب الفردية على أساس TSP-4 د تركيز (انظر 6.4). تأخذ في الاعتبار أن عدد البروتونات المساهمة في إشارة معينة 1 H NMR قد تختلف بوصفها وظيفة من أصل الجزيئي لتلك الاشارة. إشارة ثلاثي ميثيل TSP-4 د (الإشارة إلى 0.0 جزء في المليون) تمثل تسعة البروتونات.
- استخدام البرمجيات إحصاءات حسب الحاجة لمقارنة مستويات الأيض في المخ بين مجموعات من الحيوانات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
للحصول على أفضل قرار في أطياف الرنين المغناطيسي للدماغ الأيض ومقتطفات الأنسجة الأخرى، فقد كان منذ فترة طويلة ممارسة شائعة لإزالة أو الأيونات المعدنية قناع (الأهم: أيونات ممغطس) موجودة في استخراج الحلول. وقد تحقق ذلك إما بإضافة عامل خالب مثل EDTA أو CDTA إلى استخراج 19، أو عن طريق تمرير مستخلص من خلال راتنج التبادل الأيوني مثل Chelex-100 20. النتائج المقدمة في الشكل 1 تثبت أن هذه الخطوة ليست ضرورية ل1 H NMR التحليل الطيفي إذا تم إعداد مقتطفات الدماغ بعناية وفقا للبروتوكول المذكور أعلاه. هنا، تم الحصول على خطوط طيفية ضيقة للغاية لجميع المناطق الطيفية تحليلها. حتى في المناطق المزدحمة جدا، على سبيل المثال، لالجلوتامين / الغلوتامات وميو -inositol / الجلايسين، قمم على مسافة <0.01 جزء في المليون هي تقريبا للانفصال تماما في 400 ميغاهيرتز (الشكل 1، أسفل). ونتيجة لذلك، النوعية،والتحليل الكمي من العديد من الصغيرة، ولكن غير المعينة حاليا، قمم واضحة في لوحات مركز والسفلية من الشكل 1 يمكن تصور في المستقبل.
الرقم 1. المناطق دون الإقليمية في نموذجي 1 H NMR الطيف (400 ميغاهيرتز) من المرحلة المائية لاستخراج أنسجة المخ من الفئران لويس الإناث. تظهر جميع الألواح الثلاثة عالية جدا قرار الحصول عليها باستخدام بروتوكول المقدمة في هذه الورقة. وقد استخدم أيا عامل خالب ولا التبادل الأيوني الراتنج أثناء إعداد العينة. مركز والألواح السفلية تظهر وجود العديد من القمم المنخفضة الحدة غير المعينة التي تلمح في النطاق الديناميكي الهائل من عالية الدقة 1 H NMR الطيفي مقتطفات النسيج المغطاة إذا أجريت باستخدام المعلمات التجريبية الأمثل. هذه ضعيفة ولكن أيضايحتمل أن يتم تحديد الإشارات التي يمكن اكتشافها وكميا في المستقبل. الكشف عن العديد من الأيض محددة من أنسجة المخ، على سبيل المثال، NAA الخلايا العصبية علامة أو GABA العصبي؛ ومع ذلك، تشارك معظم المركبات في مجموعة واسعة من المسارات الأيضية التي هي مشتركة بين خلايا الثدييات، مثل الأحماض الأمينية، والأحماض العضوية متفرعة السلسلة، البوليول، (الفوسفات) الدهون واستقلاب الطاقة وكذلك في تحلل وglutaminolysis، و وظائف مثل التنظيم الأسموزي، نمو الخلايا وانتشارها. النجمة يدل على صدى الميثيل النابعة من النجاسة الميثانول. الاختصارات: علاء، ألانين. أمريكا اللاتينية والكاريبي، لاكتات. threo، ثريونين. BHB، β-hydroxybutyrate. فال، حمض أميني أساسي. إيل، آيسولوسين. ليو، ليسين. AAB، α-أمينو بوتيرات. AHB، α-hydroxybutyrate. تاو، التورين، scy -Ins، scyllo -inositol، -Ins ميو، ميو -inositol. المؤتمر الشعبي العام، glycerophosphocholine. PC، phosphocholine. تشو، الكولين. CRN، الكرياتينين. كر، الكرياتين. GABA،47؛ -aminobutyrate. آسيا والمحيط الهادئ، اسبارتاتي. ناه، N -acetylaspartate. GLN، الجلوتامين. حمض الغلوتاميك، الغلوتامات. يمث، سكسينات. NANA، N -acetylneuraminate. ميلان، خلات، الغليسين، الجلايسين. قمم صغيرة عند قاعدة جذع علاء صدرة من اللاكتات 13 C صدرة الأقمار الصناعية (اللوحة العلوية). وأعيد طبعه تحت رخصة المشاع الإبداعي (واله) حيث من وتز NW وآخرون (2013) المسارات البيوكيميائية الدماغي التجريبي في المناعة الذاتية التهاب الدماغ والتهاب المفاصل مساعد: دراسة metabolomic المقارنة. بلوس وان 8 (2): e56101 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
في 31 P NMR الطيفي، إخفاء أو إزالة الكاتيونات ممغطس (ومعظمهم من الحديد) مما لا شك فيه ضرورة لأن الفوسفات تشكل المجمعات مع ثنائي التكافؤ والثلاثي التكافؤ أيونات بسهولة. بالإضافة إلى مقتطفات من CDTA يؤثر على كل خط طيفي بعرض لالتحولات الكيميائية د. مقارنة الشكل 2، أعلى وأسفل اليسار. خط تضييق باختيار 1،000 ملم (أسفل اليسار) بدلا من 200 ملي (أعلى اليسار) والمطلوب CDTA، ولكن أدى إلى تراكب الإشارات PL التي ينبغي كميا بشكل منفصل (أعلى اليسار). لذا، يوصى 200 ملي CDTA للمكون مائي من المذيب PL، جميع الظروف الأخرى متساوية. وعلاوة على ذلك، فإن درجة حرارة العينة خلال قياس تؤثر بعرض سطر الطيفية والتحولات الكيميائية؛ مقارنة الشكل 2، أعلى وأسفل اليمين. وقد رغب خط تضييق باختيار 277 K (أسفل اليمين) بدلا من 297 K (أعلى اليمين)، ولكن أدى إلى تراكب الإشارات PL التي ينبغي كميا بشكل منفصل (أعلى اليمين). لذا، يوصى 297 K درجة الحرارة القياس، جميع الظروف الأخرى متساوية. مقارنة بين اثنين من كبار وحات تبين أن انخفاض تركيز CDTA من 200 ملي (أعلى اليسار) إلى 50 مم (أعلى اليمين) ينتج عنه فقطزيادة متواضعة في خط العرض، وفي أي تغيير تقريبا في التحولات الكيميائية. ومع ذلك، لاحظ أن تركيز الأنسجة في استخراج 50 ملي CDTA هو نصف مرتفعا كما هو في 200 ملي CDTA استخراج، شرح خطوط ضيقة نسبيا في أعلى اللوحة اليمنى 13.
الشكل 2. فسفاتيديل إيثانولامين (PtdE) مناطق فسفوليبيد 31 P NMR الأطياف (162 ميغاهيرتز) من الدماغ مقتطفات من أنسجة الفئران الإناث لويس (لوحة أعلى اليسار) تركيز أنسجة المخ، 236 ملغ / مل؛ CDTA تركيز ودرجة الحموضة في مكون مائي من المذيب، 200 ملي و7.33، على التوالي؛ قياس درجة الحرارة، يتم حلها 297 K. PtdE بلازما وSM إشارات جيدا (أسفل اليسار) تركيز أنسجة المخ، 236 ملغ / مل؛ CDTA بغية دراسته واقرارهntration ودرجة الحموضة في مكون مائي من المذيب، 1،000 ملم و 7.36، على التوالي؛ قياس درجة الحرارة، 297 ك. PtdE بلازما وSM إشارات تتداخل تماما. لا يمكن حلها على الرغم من انخفاض عرض الخط، مقارنة مع كبار الطيف الأيسر (أعلى يمين) تركيز أنسجة المخ، 118 ملغ / مل؛ CDTA تركيز ودرجة الحموضة في مكون مائي من المذيب، 50 ملي و7.14، على التوالي؛ قياس درجة الحرارة، يتم حلها بشكل جيد 297 K. PtdE وSM إشارات تركيز (أسفل اليمين) أنسجة الدماغ، 118 ملغ / مل؛ CDTA تركيز ودرجة الحموضة في مكون مائي من المذيب، 50 ملي و7.14، على التوالي؛ قياس درجة الحرارة، 277 ك. PtdE وSM إشارات تتداخل تماما. لا يمكن حلها، على الرغم من انخفاض عرض الخط مقارنة مع كبار الطيف الصحيح. الاختصارات: PtdE بلازما، بلازمالوجين إيثانولامين؛ PtdE، فسفاتيديل إيثانولامين؛ SM، سفينغوميالين. PtdS، phosphatidylserine. PTDC، فسفاتيديل. أعيد طبعها بإذن من لوتز NW وآخرون (2010) الأمثل Multiparametric 31 P التحليل الطيفي NMR من الدهون الفوسفاتية في مقتطفات الأنسجة الخام. 1. التحول الكيميائية وفصل الإشارة. الشرج علم 82 (13): 5433-5440. حقوق الطبع والنشر 2010 الجمعية الكيميائية الأمريكية. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
باستخدام بروتوكول أعلاه (نظام المرحلة الأولى 14؛ الشكل 3، أعلى اليسار)، تم الكشف عن عدد كبير من الثابتة والمتنقلة قياس الكمي (الشكل 3، أعلى اليمين)، التي تغطي مجموعة وتركيز كبير (لاحظ إشارات عالية الكثافة اقتطاع). بعض هذه الإشارات هي كما غير مخصص بعد (U1، U2، U6). إذا تم تنفيذ إعداد العينات وقياس ومعالجة NMR الطيف كما هو مبين في هذا البروتوكول، القرار الطيفي، بل هو كاف لد روتينيetect تقسيم جزئي لبعض القمم (PtdS، PtdE، PtdE بلازما، AAPtdE، أسفل اليسار). . نتيجة لذلك، نوعي وتحليل كمي لمزيد من المجموعات الفرعية PL يمكن المتوخاة في المستقبل الشكل 3، أسفل اليمين، يوضح قوة معالجة المعلمات اختيار بحكمة جزئيا إلى إشارات منفصلة من المركبات منخفضة التركيز (هنا: PtdC1u، مستمدة من PL من PTDC التي لم يتم تحديدها تماما، وPTDC بلازما) صدى بالقرب من إشارات قوية جدا (هنا: PTDC).
الرقم 3. الفوسفوليبيدية 31 P NMR الطيفي (162 ميغاهيرتز) مقتطفات من أنسجة المخ من الفئران لويس الإناث. (لوحة أعلى اليسار) ونظام المرحلة الأولى (يسار) كان يفضل على النظام على مرحلتين (يمين). النظام المستخدم عادة على مرحلتين يعيق الصحيحPL الكميات لأن معظم المرحلة العليا يقع خارج حجم حساسية في لفائف. (لوحة أعلى اليمين) الكامل 31 P PL NMR الطيف من دماغ الفئران. لرؤية أفضل من الإشارات الضعيفة (PtdIP، PtdG)، خط توسيع الأسي (LB = 3 هرتز) تم تطبيق. في هذا التمثيل، وعدة إشارات PL لم تحل جيدا، لا سيما في المناطق PTDC وPtdE. الثابتة والمتنقلة لتوليد أكثر من 31 إشارة P NMR، وأكد نواة لاحظ (P tdIP، PtdI P، P tdIP 2، PtdI P 2). حاليا يتم الرمز إشارات غير المعينة من قبل "يو ن" (حيث n = 1، 2، ...). (لوحة أسفل اليسار) PtdE وPtdS المناطق من نفس الطيف. لأفضل قرار الذروة، تم تطبيق Lorentzian-جاوس شكل خط التحول (LB = -1 هرتز، GB = 0.3). بسبب هذه المعايير المعالجة، العديد من الإشارات PL ضعيفة جدا يصعب اكتشافها. ومع ذلك، يمكن أن اثنين على الأقل القممأن يستشف لكل PtdE، PtdE بلازما، AAPtdE، وRa. (اللوحة اليمنى أسفل) المنطقة PTDC حصل مع المعلمات معالجة نفس المنطقة PtdE. تم الكشف عن عدة إشارات في قاعدة PTDC بالرنين المسيطر بشكل لا لبس فيه، في حين أنها لا يمكن تمييزها في الطيف العلوي ولدت مع خط توسيع الأسي (AAPtdC، PTDC بلازما، PtdC1u). إلى جانب PTDC التناظرية غير المعينة حاليا، PtdC1u، قد يكون المزيد من الأصداء الطفيفة الحالي من أول الملعب PTDC. الاختصارات: PtdIP، فوسفتيدلينوستول الفوسفات. PtdIP 2، فوسفتيدلينوستول ثنائي فسفات. PtdA، حمض الفسفاتيديك. PtdG، phosphatidylglycerol. CL، كارديوليين. PtdE ..، مجموع PtdE، PtdE بلازما وAAPtdE. PtdI، فوسفتيدلينوستول. لمزيد من الاختصارات يرى أسطورة إلى الشكل 2. أعيد طبعها بإذن من لوتز NW وآخرون (2010) الأمثل Multiparametric 31 P التحليل الطيفي NMR من phospholipiس في مقتطفات الأنسجة الخام. 1. التحول الكيميائية وفصل الإشارة. الشرج علم 82 (13): 5433-5440. حقوق الطبع والنشر 2010 الجمعية الكيميائية الأمريكية. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
| الحصاد وتجميد الدماغ الجرذ | |||
| ديوار لN 2liq؛ تجميد المشبك (مثل ملقط Wollenberger محلية الصنع، الحكام 1 و 2، أسفل الجدول)؛ غرفة التخدير. مقص جراحي. مشرط. 500 مل زجاجة مع التنظيف الكحول | 1 من كل | ||
| ملقط | 2 | ||
| 1 مل حقنة، حقنة 10 مل | 1 من كل حيوان الواحد | ||
| 25 الإبر G | 2 لكل حيوان | ||
| عينة Preparأوجه | |||
| كمية نموذجية من أنسجة المخ في استخراج | 250-350 ملغ | ||
| حجم MeOH تستخدم في التجانس 250 - 350 ملغ أنسجة المخ | 4 مل | ||
| 5 مل ماصة بلاستيكية | 3 في استخراج | ||
| 10 مل ماصة بلاستيكية | 1 في استخراج | ||
| قنينة زجاجية (≥20 حجم مل) | 1 في استخراج | ||
| مقاومة للالكلوروفورم أنبوب الطرد المركزي | 1 في استخراج | ||
| فترة الانتظار بعد تجانس الأنسجة في MeOH (الخليط في 4 ° C) | 15 دقيقة | ||
| المياه وCHCL 3 حجم تضاف إلى أنسجة المخ المتجانس في 4 مل MeOH | 4 مل كل | ||
| فترة الانتظار بعد خلط النسيج المتجانس مع الماء وCHCL 3 (خليط في -20 ° C) | بين عشية وضحاها | ||
| الطرد المركزي لفصل سو مائي من مرحلة استخراج العضوية (الزجاج أنبوب الطرد المركزي) | 13،000 × ز، لمدة 40 دقيقة على 4 ° C | ||
| تركيز CDTA الحل (المرحلة المائية من خليط المذيبات لإذابة الدهون المستخرجة) | 200 ملي | ||
| درجة الحموضة من المرحلة المائية من خليط المذيبات لإذابة الدهون المستخرجة | 7.4 | ||
| نسبة حجم الدهون في مذيب وتستخدم لمدة 31 P PL تحليل (اداه 3: MeOH: حل CDTA) | 5: 4: 1 | ||
| كمية المذيبات وتستخدم لإذابة الدهون المستخرجة من 250 - 350 ملغ أنسجة المخ | 700 ميكرولتر | ||
| الطرد المركزي لأسفل الغزل الجزيئات الصلبة في العينة NMR (أنبوب microcentrifuge) | 11،000 x ج لمدة 30 دقيقة على 4 ° C | ||
| الرقم الهيدروجيني للعينة NMR تحتوي على الأيض للذوبان في الماء | 7.3 | ||
| حجم العينة نقلها إلى أنبوب الرنين المغناطيسي، وبعد centrifugation | 600 ميكرولتر | ||
| تركيز MDP الجذعية في إدراج المحورية لل31 P NMR | 20 ملي | ||
| تجارب الرنين المغناطيسي النووي | |||
| درجة حرارة العينة خلال التجربة NMR (لتعديلها لتقليل التداخل الذروة) | 25 ° C | ||
| الغزل تردد خلال التجربة NMR | 15-20 هرتز | ||
| 1 معلمات H NMR شراء | |||
| مذيب توفير 2 H إشارة القفل | D 2 O | ||
| الإثارة عرض النبض، P1 | 11 μsec | ||
| نبض الإثارة، توهين مكبر للصوت، PL1 | 0 ديسيبل | ||
| حجم ااا، TD | 32 ك | ||
| ااا اكتساب تيمه، عبد القدير | 3.283 ثانية | ||
| تأخير الاسترخاء، D1 | 15 ثانية | ||
| المذيبات تأخير قمع، D4 | 6 ثانية | ||
| إجمالي وقت التكرار، TR | 24.3 ثانية | ||
| العرض الطيفي في جزء في المليون، SWP | 12.47 جزء من المليون | ||
| العرض الطيفي في هرتز، SW | 4،990 هرتز | ||
| كسب المتلقي، RG | 512 | ||
| قمع المذيبات (موجة مستمرة) | CW | ||
| قمع المذيبات، توهين مكبر للصوت، PL9 | 50 ديسيبل | ||
| عدد العابرين، NS | 32 أو 64 | ||
| 31 معلمات P NMR شراء | |||
| مذيب توفير 2 H إشارة القفل | اداه 3 | ||
| الإثارة نبض وايDTH، P1 | 9.5 μsec | ||
| نبض الإثارة، توهين مكبر للصوت، PL1 | 4 ديسيبل | ||
| حجم ااا، TD | 16 ك | ||
| ااا اكتساب الوقت، عبد القدير | 2.019 ثانية | ||
| تأخير الاسترخاء، D1 | 15 ثانية | ||
| إجمالي وقت التكرار، TR | 17 ثانية | ||
| العرض الطيفي في جزء في المليون، SWP | 25 جزء في المليون | ||
| العرض الطيفي في هرتز، SW | 4،058 هرتز | ||
| كسب المتلقي، RG (كحد أقصى) | 16،384 | ||
| بروتون فصل (مركب نبض فك الارتباط) | CPD | ||
| بروتون الفصل، توهين مكبر للصوت، PL13 | 19 ديسيبل | ||
| عدد العابرين، NS | 1،500 أو 2،000 | ||
| معالجة البيانات NMR | 1 H قرار تعزيز، جاوس-Lorentzian Lineshape التحول | ||
| تقييم شامل لطيف (إذا لزم الأمر، وتحسين منفصل عن المناطق الطيفية الفردية، وذلك باستخدام 0.1 <GB <0.4 و -0.6 <LB <-0.2 هرتز) | GB = 0.15، LB = -0.2 هرتز | ||
| اشارات ضعيفة جدا، مثل الأحماض العطرية (بدلا من ذلك إلى apodization مع LB ≥ 0.5 هرتز) | GB = 0.015، LB = -0.3 هرتز | ||
| المناطق الخاضعة لقمم: استخدام lineshape يناسب تداخل الأصداء | |||
| 31 P قرار التعزيز، جاوس-Lorentzian lineshape التحول | |||
| تقييم شامل لطيف (تحسين منفصل للمناطق طيفية الفردية، وذلك باستخدام 0.05 <GB <0.2، و -3.0 <LB <60. -1.0 هرتز) | GB = 0.05، LB = -1.0 هرتز | ||
| اشارات ضعيفة جدا، على سبيل المثال، PtdIP 2، PtdA: apodization | LB = 3 هرتز | ||
| المناطق الخاضعة لقمم: استخدام lineshape يناسب تداخل الأصداء | |||
| المراجع | |||
| 1. بالادينو GW، الخشب JJ، بروكتر HJ. تعديل المشبك تقنية تجميد لفحص الأنسجة. مجلة البحوث الجراحية 289، 188-190 (1980). | |||
| 2. Wollenberger A، Ristau O، Schoffa G. [A تقني بسيط للتجميد السريع للغاية من قطع كبيرة من الأنسجة]. Pflugers أرشيف الفراء يموت gesamte Physiologie قصر Menschen اوند دير Tiere 270، 399-412 (1960). | |||
الجدول 1. المعلمات التجريبية لارتفاع القرار H-1 و 31 P NMR الطيفي للدماغوتعرض مقتطفات الأنسجة. القيم النموذجية للحجم ونسب تركيزات المذيبات والكواشف المستخدمة في استخراج أنسجة المخ وإعداد العينات NMR. قيم أوصت كذلك تتعلق عينة الرقم الهيدروجيني ودرجة الحرارة قياس، فضلا عن NMR اقتناء وتجهيز المعلمات. قد يكون من الضروري إجراء تعديلات طفيفة، وخاصة إذا تم تطبيق البروتوكول إلى الأنسجة الأخرى من الدماغ. وقد تم تحسين المعايير لقياس الرنين المغناطيسي النووي في 9.4 T، ولابد من تعديل حسب الحاجة لقياس الطيف تعمل في مختلف نقاط القوة الحقل المغنطيسي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
NMR الطيفي هو وسيلة فعالة لقياس تركيزات المركبات الكيميائية في محلول بطريقة استنساخه جدا ودقيقة. ومع ذلك، للحصول على بيانات عالية الجودة من الضروري أن تلتزم قواعد معينة بشأن إعداد العينات وتحليلها. في تحديد تركيزات المستقلب بواسطة الرنين المغناطيسي الطيفي، ولا جيل ولا استقبال إشارة NMR يهيمن على خطأ الكميات، إلا شدة إشارة لوحظ اقتراب عتبة الكشف (إشارة ضعيفة بشكل خاص). في جميع الحالات الأخرى التغير البيولوجي، وتقنية إعداد العينات (كفاءة الاستخراج، والاستقرار المادي والكيميائي للمركبات، pipetting لوزنها الأخطاء الخ)، و / أو اختيار إشارة شراء وتجهيز المعلمات ستحدد الدقة ودقة النتائج. من الواضح، كما أن تنعكس أية تغييرات الأيضية التي تحدث أثناء الحصاد الأنسجة في الحصول على تركيزات المستقلبأد. لذا، من المهم جدا لاستكمال الحصاد الأنسجة في أسرع وقت ممكن، وتطبيق تقنيات تجميد أنسجة معينة مثل قمع تجميد إذا دقيقة في تركيزات المركبات استقلاب الجسم الحي بسرعة هي مهمة (خاصة الجلوكوز، اللاكتات، ولها catabolites ATP، ADP و AMP).
حتى في قوة الحقل المغنطيسي المتوسطة (9.4 T) لعالية الدقة مطياف الرنين المغناطيسي النووي الأطياف ممتاز روتينية يمكن الحصول عليها. على سبيل المثال، في 1 H NMR الأطياف من المرحلة المائية من مستخلصات دماغ الفئران، والإشارات التي الفرق في التحول الكيميائي، Δδ، يصل إلى حوالي 0.005 جزء في المليون (الموافق 2.0 هرتز في 400 ميغاهيرتز تردد صدى) يمكن تمييزها وquantitated على حدة. ويتضح ذلك من الفصل الجزئي لل(ط) من لاكتات والحلل ثريونين، و (ثانيا) على صدرة ألانين من قمم صغيرة عند قاعدته (اكتات 13 C صدرة الساتلية؛ الشكل 1،أعلى). أن الطيف تعمل في حقول أعلى (14.1 أو حتى 18.8 T) قرار زيادة والحساسية علاوة على ذلك، على الرغم من أن هذه الصكوك هي أقل شيوعا في المختبرات الرنين المغناطيسي النووي بسبب التكلفة الشرائية العالية.
باستخدام 1 H NMR الطيفي، ويمكن تحليل مجموعة واسعة من نواتج الأيض في وقت واحد، أي في اقتناء واحد. حساسية التجربة يمكن تحسينها من خلال زيادة عدد العابرين المتراكمة، على الرغم من أن هذا الخيار يزيد قياس الوقت بشكل متناسب. (نسبة الإشارة إلى الضوضاء يتناسب مع الجذر التربيعي للعدد العابرين.) ومع ذلك، فإن الحد الأقصى لإجمالي وقت الاستحواذ الواردة في البروتوكول المذكور أعلاه (20 - 30 دقيقة) يجب أن تكون كافية لجميع الأغراض تقريبا، إلا إذا كمية من النسيج المتاحة لاستخراج محدودة جدا. إلى جانب الاستفادة من النواة الأكثر حساسية الرنين النووي المغناطيسي (بروتون)، metabolomic 1 H NMR الطيفي له ميزة شاملةقواعد البيانات المتاحة لكونها القوة الميدانية المختلفة ودرجة الحموضة عينة تقدر 10. وعلاوة على ذلك، أصبح البرنامج للحصول على التلقائي أو شبه التلقائي تقييم الطيف المتاح 10.
بينما 1 H NMR أطياف مقتطفات الأنسجة يمكن حلها بشكل جيد دون إضافة وكلاء مخلبية، وهذا لم يعد صحيحا ل31 P NMR الأطياف. في الواقع، فإن تركيز عامل خالب تستخدم (على سبيل المثال، أو CDTA EDTA) لديه تأثير كبير على كل من عرض الخط والتحول الكيميائي لل31 إشارات P NMR النابعة من نواتج الأيض فسفرته. زيادة تركيز CDTA في مقتطف ينخفض 31 بعرض سطر P NMR، ولكن قد تكون هذه ميزة تفوق الاختلافات الصغيرة بين التحولات الكيميائية، Δδ، من القمم المجاورة. لذا، فإن كمية عامل خالب وقد تستخدم ليكون الأمثل لكل من عرض الخط والتحول الكيميائي معا. في مقتطفات الدهون، هذه المعايير الطيفية هما الهامة فيأثرت ntly من تركيز العينة الإجمالي، أي كمية الأنسجة المستخرجة، ولكن أيضا من قيمة الرقم الهيدروجيني ودرجة حرارة العينة خلال قياس NMR. ونتيجة لذلك، أي تحسين الظروف القياس يجب النظر في الآثار المشتركة لجميع المعلمات التجريبية المعنية، بعض هذه لا يجري المضافة. ويتضح مدى تعقيد هذا الوضع من خلال سلوك PL 31 P NMR الأطياف هو مبين في الشكل 2. على الرغم من أن تركيز أقل الأنسجة (118 ملغ / مل)، وأدنى درجة حرارة (277 K) وأعلى تركيز CDTA (1،000 ملم) اختبار سيؤدي إلى أدنى عرض الخط، يوصي بروتوكول اقترح استخدام تركيز معتدل النسيج (236 ملغ / مل)، وتركيز CDTA المتوسط (200 ملم) ودرجة حرارة الغرفة (297 K) لتجنب إشارة التداخل.
على الرغم من أن ظروف إعداد العينات واكتساب الطيف ذات أهمية قصوى، وينبغي عدم التقليل من دور المعلمات معالجة الطيف في استخراج الحد الأقصى من المعلومات من البيانات الخام المكتسبة. مجموعة معينة من المعلمات تجهيز ي كنت مثاليا للكشف عن وquantitating الثابتة والمتنقلة التي تحدث في تركيزات منخفضة؛ ومع ذلك، فإن نفس المجموعة من المعلمات قد تخفي قمم الفردية في "مزدحمة" المناطق الطيفية (الشكل 3، أعلى اليمين). على العكس، فإن المعلمات معالجة توفير قرار تعزيز الأمثل في مناطق الأصداء المتداخلة بقوة (الشكل 3، القاع) تجعل قمم منخفضة الحدة غير قابلة للكشف. التطورات الأخيرة، بما في ذلك أيضا شاملة PL 31 P NMR قاعدة بيانات 13،14، يسهل إلى حد كبير تحليل NMR الأطياف 13،14.
في نهاية المطاف، يجب أن أهداف التطبيقات الأساسية تحديد معايير لتعظيم الاستفادة، أي التوازن المنشود قرار الطيفي، والحساسية والدقة من المستقلب quantification، والسرعة، وعوامل أخرى. على سبيل المثال، أوصى نظام المرحلة الأولى لPL تصاريح تحليل أكثر موثوقية وكفاءة من أنظمة القياس الكمي PL-المرحلة الثانية (الشكل 3، أعلى اليسار)، وينص قرار الطيفي عالية وكذلك حساسية كافية لتحديد الكميات من الثابتة والمتنقلة أقل وفرة . ومع ذلك، في الحالات التي يكون فيها أفضل فصل إشارة هو من أولوية أعلى بكثير من الكميات فعالة ودقيقة، واستخدام نسبة مئوية أعلى من كلوروفورم د في خليط المذيبات قد حاول، على الرغم من أن ذلك يؤدي بسهولة للتخلص الفصل في العينة. إذا كان هذا هو الحال، لا بد من تحديد حجم المرحلة الدنيا إلى الحصول على كميات المطلقة PL (PL ملغ، ز في الأنسجة أو البروتين الكلي ملغ).
في heteronuclear التجارب NMR-تنفصل بروتون، يمكن تغيير شدة إشارة من آثار Overhauser النووية (NOE)، بالإضافة إلى التشبع بسبب خطط الاستحواذ السريعة. إذا لم يعالج هذه الآثار تؤدي إلى المستقلب غنى عنهأخطاء ntitation. هناك نوعان من الاستراتيجيات البديلة للتعامل مع هذا التحدي. في المقاربة الأولى، يتم فصل الأفراد العابرين من اكتساب تأخيرات طويلة. هذه الطريقة يتجنب أي التشبع أو NOE لكن النتائج في تجارب طويلة نسبيا. كان ينبغي ان تستخدم اذا كان هناك حاجة لنتائج دقيقة ودقيقة. في بعض الحالات، قد يكون إعطاء الأولوية لاكتساب الطيف سريع، ولا سيما بالنسبة للعينات المخففة جدا التي لا يمكن قياسها باستخدام عدد كبير من العابرين. في مثل هذه الحالات، إضافة إلى عوامل الاسترخاء ممغطس العينة تسمح الحصول على البيانات السريع دون التشبع أو NOE. بدلا من ذلك، الحصول على البيانات بسرعة دون إضافة وكلاء ممغطس يمكن استخدام. يتطلب الأسلوب الأخير تصحيح المناطق إشارة عن طريق تصحيح العوامل التي يجب تحديدها لكل الرنين NMR، في حين وجود وكلاء الاسترخاء يسبب بعض الإشارات توسيع NMR التي قد تقلل من دقة المستقلب الكميات لالطيفية المناطق المزدحمة. عموما، فإن الاختيار الأمثل للظروف تجريبية لا تمليها فقط حسب نوع العينة، ولكن أيضا من المعلومات التي يتم استخراجها من تجربة 13. إذا أولوية قصوى يجب أن تعطى للتحليل السريع للمستقلبات وفيرة إلى حد ما، دون الحاجة إلى دقة عالية ودقة، قد تكون كافية لقياس عينات عالية التركيز وتوظيف مرات تكرار قصيرة، وربما مع وكيل الاسترخاء ممغطس تضاف إلى العينة. على النقيض من ذلك، إذا الكميات الدقيقة لعدد كبير من المركبات هي أكثر أهمية من سرعة، فمن الأفضل استخدام مقتطفات أقل تركيزا، واستعرض طويلة مرات الاستحواذ الرنين المغناطيسي النووي، كما يتبين من بروتوكول المقدمة هنا. وعلاوة على ذلك، إذا يؤكد مشروع بحثي معين نواتج محددة، الظروف التجريبية يمكن تعديلها لتحقيق قرار الطيفي الأمثل للمناطق طيفية في السؤال. بروتوكول والمناقشة المقدمة هنا قد تكون بمثابة دليل للسptimization التحليل metabolomic مقتطفات الأنسجة الخام بواسطة الرنين المغناطيسي الطيفي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Virbac | Vetflurane | Anesthetic for animals |
| Isoflurane vaporizer | Ohmeda | Isotec 3 | Newer model available: Isotec 4 |
| Scalpel, scissors, forceps, clamps | Harvard Apparatus Fisher Scientific |
various various |
Surgical equipment for animals |
| Freeze-clamp tool | homebuilt | n/a | Tong with aluminium plates, to be inserted in liquid nitrogen for cooling |
| Dewar | Nalgene | 4150-4000 | |
| Liquid nitrogen | Air Liquide | n/a | |
| Nitrogen gas | Air Liquide | n/a | |
| Nitrogen evaporator | Organomation Associates | N-EVAP 111 | Can be replaced by homebuilt device |
| Mortar | Sigma-Aldrich | Z247472 | |
| Pestle | Sigma-Aldrich | Z247510 | |
| Tissue homogenizer | Kinematica | Polytron | With test tubes fitting homogenizer shaft |
| Electronic scale | Sartorius | n/a | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | M3641 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 366910 | |
| Glass centrifuge tubes | Kimble | 45500-15, 45500-30 | Kimax 15 ml, 30 ml tube |
| Microcentrifuge tubes | Kimble | 45150-2 | Kimax 2 ml tube; should replace "Eppendorf" tube if compatible with centrifuge rotor |
| Polystyrene pipettes | Costar Corning | Stripettes | 5 and 10 ml volumes |
| Deuterochloroform | Sigma-Aldrich | 431915 | 99.96% deuterated |
| Deuterium oxide | Sigma-Aldrich | 423459 | 99.96% deuterated |
| Deuterium chloride | Alpha Aesar | 42406 | 20% in deuterium oxide |
| Sodium deuteroxide | Sigma-Aldrich | 164488 | 30% in deuterium oxide |
| Lyophilizer | Christ | Alpha 1-2 | |
| Cold centrifuge | Heraeus | Megafuge 16R | |
| pH meter | Eutech Cybernetics | Cyberscan | |
| CDTA | Sigma-Aldrich | D0922 | |
| Cesium hydroxide | Sigma-Aldrich | 516988 | |
| NMR tubes | Wilmad | 528-PP | |
| NMR stem coaxial insert | Sigma-Aldrich | Z278513 | By Wilmad |
| NMR pipettes | Sigma-Aldrich | Z255688 | |
| Pipettes | Eppendorf | Research | With tips for volumes from 0.5 to 1,000 μl |
| Pipet-Aid | Drummond | XP | |
| NMR spectrometer | Bruker | AVANCE 400 | including probe and other accessories |
| NMR software | Bruker | TopSpin 1.3 | newer version available: Topspin 3.2 |
| Water-soluble standard compounds | Sigma-Aldrich | various | |
| Phospholipid standard compounds | Avanti Polar Lipids Doosan Serdary Sigma-Aldrich |
various various various |
Source for plasmalogens, but may be <70 - 80% purity |
| Methylenediphosphonate | Sigma-Aldrich | M9508 | |
| TSP-d4 | Sigma-Aldrich | 269913 |
References
- Manger, P. R., et al. Is 21st century neuroscience too focused on the rat/mouse model of brain function and dysfunction. Front Neuroanat. 2, 5 (2008).
- Buxbaum, J. D., et al. Optimizing the phenotyping of rodent ASD models enrichment analysis of mouse and human neurobiological phenotypes associated with high-risk autism genes identifies morphological, electrophysiological, neurological, and behavioral features. Mol Autism. 3, 1 (2012).
- Papaioannou, V., Behringer, R. R. Mouse Phenotypes A Handbook of Mutation Analysis. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Woodbury. (2004).
- Yu, F. H., et al. Reduced sodium current in GABAergic interneurons in a mouse model of severe myoclonic epilepsy in infancy. Nat Neurosci. 9, 1142-1149 (2006).
- Mallolas, J., et al. A polymorphism in the EAAT2 promoter is associated with higher glutamate concentrations and higher frequency of progressing stroke. The Journal of Experimental Medicine. 203, 711-717 (2006).
- Crusio, W. E., Sluyter, F., Gerlai, R. T., Pietropaolo, S. Behavioral Genetics of the Mouse Genetics of Behavioral Phenotypes. Vol. 1, Cambridge University Press. New York. (2013).
- Viola, A., Saywell, V., Villard, L., Cozzone, P. J., Lutz, N. W. Metabolic fingerprints of altered brain growth, osmoregulation and neurotransmission in a Rett syndrome model. PLoS ONE. 2, e157 (2007).
- Lutz, N. W., Sweedler, J. V., Wevers, R. A. Methodologies for Metabolomics. , Cambridge University Press. New York. (2013).
- Rabinowitz, J. D., Purdy, J. G., Vastag, L., Shenk, T., Koyuncu, E.
- Wishart, D. S. Methodologies for Metabolomics. Wevers, R. A., Lutz, N. W., Sweedler, J. V., et al. , Cambridge University Press. New York. (2013).
- Ponten, U., Ratcheson, R. A., Salford, L. G., Siesjo, B. K. Optimal freezing conditions for cerebral metabolites in rats. Journal of Neurochemistry. 21, 1127-1138 (1973).
- Henry, P. G., Oz, G., Provencher, S., Gruetter, R. Toward dynamic isotopomer analysis in the rat brain in vivo automatic quantitation of 13C NMR spectra using LCModel. NMR Biomed. 16, 400-412 (2003).
- Lutz, N. W., Cozzone, P. J. Multiparametric optimization of (31)P NMR spectroscopic analysis of phospholipids in crude tissue extracts 2 Line width and spectral resolution. Anal Chem. 82, 5441-5446 (2010).
- Lutz, N. W., Cozzone, P. J. Multiparametric optimization of (31)P NMR spectroscopic analysis of phospholipids in crude tissue extracts. 1. Chemical shift and signal separation. Anal Chem. 82, 5433-5440 (2010).
- Lutz, N. W., Cozzone, P. J. Methodologies for Metabolomics. Lutz, N. W., Sweedler, J. V., Wevers, R. A. , Cambridge University Press. New York. (2013).
- Lutz, N. W., Fernandez, C., Pellissier, J. F., Cozzone, P. J., Beraud, E. Cerebral biochemical pathways in experimental autoimmune encephalomyelitis and adjuvant arthritis a comparative metabolomic study. PLoS ONE. 8, e56101 (2013).
- Lutz, N. W., Cozzone, P. J. Principles of multiparametric optimization for phospholipidomics by 31P NMR spectroscopy. Biophys Rev. 5, 295-304 (2013).
- Pearson, G. A. Shimming an NMR magnet. , University of Iowa. Iowa City. (1991).
- Lane, A. N., Fan, T. W. M., Higashi, R. M. Biophysical tools for biologists. Correia, J. J., Detrich, H. W. Vol. 1, In vitro techniques, Academic Press. Waltham. (2008).
- Peeling, J., Wong, D., Sutherland, G. R. Nuclear magnetic resonance study of regional metabolism after forebrain ischemia in rats. Stroke. 20, 633-640 (1989).
