Metabolomic Analys av råtthjärna genom högupplöst NMR-spektroskopi av vävnadsextrakt

Introduction

Murina modeller har använts i stor utsträckning i hjärnforskning ^1. Genotyp-fenotyp korrelationer har undersökts i mus och råtta hjärnor genom att studera genuttryck på RNA och / eller proteinnivåer, å ena sidan, och morfologiska, funktionella, elektrofysiologiska och / eller beteende fenotyper på den andra ^2-6. Men att helt förstå de mekanismer som kopplar fenotyp till genotyp, är det absolut nödvändigt att undersöka de molekylära händelser nedströms av proteinuttryck, dvs. metabolismen av de biokemiska substrat på vilka enzymer verkar ^7. Detta krav ledde, under de senaste 10 till 15 åren, till en renässans för metabolisk forskning inom många grenar av biologin ^8,9. Medan klassiska metaboliska studier har ofta fokuserat på detaljer i specifika vägar, är den nya metabolomic metod som är inriktad mot en allomfattande undersökning av den globala metabola profilen av vävnaden i fråga.En konsekvens av detta koncept är ett uppenbart behov av analytiska verktyg som minimerar inriktning mot specifika metaboliska vägar och / eller klasser av föreningar. Emellertid är en klassisk biokemisk analys baserad på en särskild kemisk reaktion av en specifik analyt som behöver specificeras innan analysen utförs. Däremot är spektroskopiska tekniker såsom kärnmagnetisk resonans (NMR)-spektroskopi och masspektrometri (MS) (i) baserat på särskilda molekylära (fysiska) egenskaper hos biokemiska föreningar, som vardera ger upphov till ett eller flera distinkta signaler i ett spektrum detekteras under loppet av ett försök; och (ii) detektera ett stort antal olika föreningar per försök.

Således varje spektrum innehåller det kombinerade information av en hel rad av metaboliter. Därför spektroskopiska metoder är lämpliga verktyg för metabolomik, eftersom ingen tidigare val måste göras när det gäller typen av analyten som skall mätas ⁸

Även om NMR-spektroskopi och MS kan användas omväxlande för analys av många metaboliter, varje metod besitter specifika fördelar och nackdelar som nyligen har granskats ^10. I korthet kan NMR-spektroskopi vanligtvis utföras från råextrakt och inte kräver kromatografisk separation av provföreningar före analysen. Däremot MS fungerar med gas eller vätskekromatografi (GC eller LC) separation, förutom för särskilda senaste utvecklingen såsom masspektrometri avbildning. I ett fåtal speciella fall, t.ex. analys av socker, kan LC separationen blivit en nödvändighet för NMR-spektroskopi också, eftersom resonanslinjer olika sockerarter överlappar kraftigt i proton ^(1H) NMR-spektra. Icke desto mindre, ^ett 'H NMR-spektroskopi utan chromatographic separation fortfarande den mest populära, nästan universellt tillämpad metabolomic NMR-metoden. Generellt är provberedningen mer tidskrävande och komplex för MS än för NMR-spektroskopi. Allvarliga problem på grund av matriseffekter är mycket mindre vanliga i NMR-spektroskopi än i MS där de kan leda till kraftigt försvagade signaler. Metabolit kvantifiering kan uppnås med endera metoden. Emellertid är flera standardföreningar behövs för MS beror på variationer i matriseffekter och jonisering effektivitets mellan metaboliter. Däremot har endast en standard per prov som behövs för en NMR-spektroskopisk analys på grund under lämpliga förhållanden mätning, är den senare metoden i sig kvantitativa tack vare strikt linjär NMR svar från de observerade kärnor. En stor nackdel med NMR är dess relativt låg känslighet. MS, särskilt LC-MS, är känsligare än NMR med flera storleksordningar; av denna anledning, är MS att föredra framför NMR föranalys av föreningar som förekommer vid mycket låga koncentrationer. Å andra sidan, är den icke-förstörande karaktär NMR experiment en klar fördel över MS; på detta sätt, kan NMR utföras upprepade gånger på samma prov, t.ex. för olika NMR-aktiva kärnor såsom ^1H, fosfor-31 ⁽³¹ P), kol-13 ^(13C), fluor-19 ⁽¹⁹ K) osv. eftersom inget material förbrukas genom NMR i motsats till MS-mätningar.

Både NMR och MS kan användas i olika lägen, var och en att vara optimal för detektion av föreningar med särskilda kemiska egenskaper. Till exempel är ³¹ P NMR ofta bättre lämpade än ^1H NMR för analys av måttligt koncentrerade fosforylerade föreningar, även om nästan alla fosforylerade metaboliter innehåller också protoner. Emellertid kan deras ¹ H NMR signaler skymmas av ^ett H-NMR-signaler från andra, icke-fosforylerade föreningar, medan den senareuppenbarligen inte orsakar bakgrundssignaler i ³¹ P NMR-spektra. I en analog situation är ^19F NMR-analys att föredra för fluorföreningar, t.ex., fluorerade läkemedel (inga bakgrundssignaler från endogena metaboliter), medan det speciella fallet med ^13C NMR är av intresse nästan uteslutande om ödet för ¹³ C märkta exogena metaboliska prekursorer måste följas, på grund av den extremt låga naturliga överflödet av ^13C isotopen (ca 1%). Många masspektrometrar arbetar i antingen negativ jon-läge eller positiv jon-läge. Därför är det viktigt att veta i förväg av analysen om de joner som skall observeras är negativt eller positivt laddade. Vi fokuserar här på ett protokoll för analys av hjärnvävnaden Metabolome med ^1H och ³¹ P NMR-spektroskopi, eftersom denna metod ger ett stort antal viktiga metabolitkoncentrationer till låg kostnad i form av (i) tid som behövs för provberedning and (ii) ansträngning som krävs för metabolit kvantifiering. Alla experiment kan genomföras med användning av utrustning av en standard våt-kemilaboratorium och en högupplösande NMR-spektroskopi anläggning. Ytterligare krav beskrivs i protokollet nedan.

Protocol

OBS: Djuretik UTTALANDE
Djurstudier på råttor följde de riktlinjer som gäller i Frankrike, och har godkänts av den lokala etiska kommittén (# 40.04, Högskolan i Aix-Marseille Medical School, Marseille, Frankrike).

1 Skörd och Frysråtthjärna

1. Förbered artiklar krävs: flytande kväve (N _2liq.) I Dewar som är tillräckligt stor för att hålla en frysklämma (minst 2-3 L volym); bedövningsmedel (t.ex. isofluran eller ketamin / xylazin); anestesi kammare; sterila dissektion verktyg: kirurgisk sax, skalpell, tång; vävnads våtservetter och flaska med rengörings alkohol (etanol); nålar (25 g); 1 ml och 10 ml sprutor. Etikett aluminiumplåtar (ca 10 x 10 cm) med tejp. Använd lakan att linda individuella fryst klämda råtthjärnor.
   OBS: Använd alltid skyddshandskar och skyddsglasögon skyddsglasögon eller mask vid hantering av flytande kväve!
2. Fyll Dewar med N _2liq. Och placera gratiszing klämma i en Dewar. Se till att den mängd N _2liq i Dewar är tillräcklig för upprepade frysnings-klämförfaranden (flera liter; den mängd N _2liq indunstning under varje frysnings-kläm beror på storleken av klämman).
3. Bedöva djur (t.ex. med isofluran eller genom en intraperitoneal injektion av en ketamin / xylazin blandning). Gå vidare till dödshjälp från hjärtat för att förhindra blödning vid hårbotten avlägsnas och skallen öppnas. Steg 1,4-1,7 nedan beskriva detta standardförfarande.
   OBS: I särskilda protokoll som kräver maximal bevarande av glukos och hög energi metaboliter, offer råtta med tratt frysa hjärnan i sövda djuret med N _2liq ¹¹ efter indragning av hårbotten. Sedan dissekera hjärnan ur skallen vid varierande N _2liq att minimera efter slakt metabolism ^12.
4. Fukta chef för råtta med rengöringssprit. Använd kirurgisk sax till (i) remove hårbotten, och (ii) öppna skallen längs kraniala suturer.
5. Använd pincett för att öppna skallen ytterligare och ta bort hela hjärnan underifrån den öppna skallen, placera huvudet upp och ner. Avlägsna snabbt synliga spår av blod med hjälp av vävnads våtservetter. Om hjärnhalvorna är metaboliskt och morfologiskt symmetrisk, är det lämpligt att använda en av de halvkloten för metabolisk analys efter att separera den från den andra halvklotet genom snitt med skalpell. Om det behövs, använd den återstående halvklotet för andra hjärnstudier såsom histologi.
6. Snabbt ta bort frys klämman från N _2liq -filled Dewar, placera hela eller halva råtthjärna på en inre yta, klämma och omedelbart sätta in frys klämma in i N _2liq -filled Dewar medan du håller klämman ordentligt komprimerad. Se till att stegen 1.3-1.6 ta längre tid än 60 sekunder.
7. Efter 1-2 min bort frysning klämman från Dewar, öppna klämman, lossa frusen hjärnvävnad från klämman, och lindafryst vävnad i lämpligt märkt aluminiumplåt (se 1.1 ovan). Se till att etiketten är läsbar och hålls säkert på plats efter det att provet är lindad. Placera snabbt insvept provet i N _2liq. Utför hela proceduren så snabbt som möjligt för att undvika upptining av fryst hjärnvävnad.
8. Förvara frysta provet i N _2liq eller i en frys vid -80 ° C tills metabolit extraktion.
   OBS: När ett biologiskt prov skall lagras i mer än ett år, är förvaring vid N _2liq temperatur att föredra framför -80 ° C. Detta gäller även för resten av detta protokoll.

2 Beredning av Metabolite extraktionsmetod

1. Förbered vävnadshomogenisator och passande provrör (t.ex., 10 mm innerdiameter, beroende på diametern av homogenisatorn axel; vanligen tillverkade av plast). Använd elektriska homogenizers stället manuellt drivna homogeniseringsanordningar (vävnadskvarnar). Prepare virvel och laboratorie balans.
2. Förbered hink fylld med krossad is. Håll tillräckligt quantitites metanol, kloroform och vatten på is (4 ml vardera per 250-350 mg frusen hjärnvävnad).
3. Förbered överföringspipetter och flaskor.
   1. Förbered glasrör (≥20 ml volym) med skruvlock och plats på is (en flaska per vävnadsextrakt). Montera skruvlock med teflon septa resistent mot kloroform.
   2. Bered 5 ml plastpipetter för utmatning av metanol och vatten, och glaspipetter eller Hamilton sprutor för dispense kloroform. Förbered extra plastpipetter (5 eller 10 ml volym) för överföring av blandningar av vävnadshomogenatet och metanol.
   3. Se till att alla glas är noggrant sköljas med destillerat vatten och torkas noggrant före användning för att avlägsna spår av föroreningar, särskilt NMR-detekterbara formiat och acetat.
4. Fyll porslinsmortel med N _2liq, plats porslin mortelstöt i mortel och fyll på med N _2liq. Kväve kommer att avdunsta tills temperaturen av mortel och mortelstöt är tillräckligt låg. Håll liten mängd N _2liq i mortel.

3 Extraktion av metaboliter

1. Ta frysta provet hjärnvävnad från lagret (N _2liq tank eller -80 ° C frys). Sedan, omgående överlåta vävnadsprov för att murbruk delvis fylld med N _2liq.
2. Använd N _2liq -Kall mortelstöt för att bryta den frusna hjärnvävnad i mindre bitar som lätt passar in i provrören som används för vävnads homogenisering. För att förhindra att stycken av frusen vävnad från att projiceras av murbruket i processen, bryter upp vävnaden medan det fortfarande är insvept i aluminiumplåt. Slipa inte fryst vävnad till pulver eftersom detta skulle göra överföring till provröret svårare (ökad risk för kondens). VIKTIGT: Under hela proceduren, lägg N _2liq att murbruk som behövs för att hålla provet djupfrysta.
3. Mix arköpcentret stycken av fryst hjärnvävnad noggrant, väg upp 250-350 mg och överför till ett provrör fylld med iskallt metanol (4 ml för 250-350 mg hjärnvävnad). Varje gång stycken av fryst vävnad sätts, homogenisera dem omedelbart med vävnadshomogenisator.
   OBS: Slutför hela denna procedur snabbt för att undvika (i) betydande kondensation av vatten på provet som skulle leda till en överskattning av provvikten, och (ii) kyla och upptining av provet. Enskilda vävnadsbitar bör vara i ett fryst tillstånd vid början av homogeniseringsprocessen.
4. Efter den sista biten i den frusna råtthjäma provet har tillsatts till provröret och homogeniserades, överföra homogenatet till en ≥20 ml volym glasflaska, nära skruvlock och låt stå på is under 15 min. Om volymen av provröret inte är tillräckligt stor för ≥4 ml metanol, använda en mindre metanol volym för att homogenisera en del av den frusna hjärnvävnad, för över blandningen tillglasflaska och fortsätta homogenisering restvävnadsbitar med färsk metanol. Se till att den totala metanolvolymen är 4 ml per 250-350 mg hjärnvävnad.
5. Tillsätt samma volym av iskall kloroform (dvs, 4 ml per 250 till 350 mg hjärnvävnad) till homogenatet, vortexa grundligt och fick stå på is under 15 min.
   OBS: Använd alltid ventilerat dragskåp vid hantering flyktiga lösningsmedel, särskilt kloroform!
6. Tillsätt samma volym vatten (dvs., 4 ml per 250 till 350 mg hjärnvävnad) och homogenatet, vortexa grundligt och låt stå vid -20 ° C över natten.

4 Beredning av Phase Separation och lösningsmedelsförångning

1. Förbered kallt centrifug (4 ° C, 13.000 xg vid maximal radie) och centrifugrör. Se till att de senare är ≥20 ml volym, resistent mot kloroform, och kan motstå centrifugalkrafter av 13.000 x g. Använd dedikerade glas centrifugrör men skölj (som alla glas ware) med destillerat vatten varadärför används (se 2.3).
2. Förbered noga sköljda glas Pasteur pipetter och en lämplig propipettor (bulb, manuell pipett pump, automatisk pipett stöd / pipett, osv.).
3. Bered två ytterligare sköljdes noggrant rör (≥15 ml volym) per hjärna provet, en av som måste vara resistent till kloroform (gjord av glas eller Teflon), den andra en till metanol (gjord av plast resistent mot metanol, eller glas).
4. Förbered lösningsmedelsförångning apparat (finns i handeln eller hembyggda). Se till att denna anordning tillhandahåller en fint kontrollerad ström av torr kvävgas, som är riktad mot ytan av en extraktlösning innehållande flyktiga lösningsmedel (metanol, kloroform).
5. Förbered ytterligare två brickor eller hinkar fyllda med is: en för provtransport på is, och en annan för att hålla prover kallt under indunstningsprocessen.
6. Förbered lyofiliseringsanordning (frystork) och material som behövs för frystorkning: (i) en 50ml centrifugrör eller vakuum rundkolv per extrakt, och (ii) N _2liq att frysa den vattenhaltiga fasen av prover (≤0.3 L per prov). Om centrifugröret används också förbereda wide-neck vakuumfilterflaska lämplig för frystorkning.

5. Phase Separation och lösningsmedelsförångning

1. För fullständig fasseparation, överföra metanol / kloroform / vatten / hjärnvävnadshomogenat (se 3,6) till en kloroform-resistent centrifugrör (≥20 ml volym) och centrifugera vid 13.000 xg och 4 ° C under 40 min.
   OBS: Två faser bildas, åtskilda av ett lager av utfällt protein. Den undre (tyngre) fasen består av metanol, kloroform och lösta lipider, medan den övre (ljusare) fasen består av vatten, metanol och lösta vattenlösliga metaboliter.
2. Använd en Pasteur-pipett för att överföra den övre fasen till ett lämpligt ≥15 ml rör (plast resistent mot metanol, eller glas). Hålla på ice.
3. Använd en färsk pasteurpipett för att överföra den undre fasen till ett lämpligt ≥15 ml rör (glas eller Teflon). Håll på is.
4. Förvara skikt av utfällt protein vid -80 ° C om den skall användas för bestämning av total protein; annars kasta.
5. Håll röret med vatten / metanolfasen (se 5,2) på is och indunsta metanol genom att rikta en ström av torr kvävgas på ytan av extraktlösningen. Alternativt försiktigt bubbla kväve genom extraktlösning. Avsluta indunstningsprocessen när kvävebubbling inte längre orsakar minskad volym i extraktlösningen. Vid denna tid, fortsätter med frystorkning (se 5.7), eller frysa och håller provet vid -80 ° C med röret stängt (skruvlock eller Parafilm) tills klar för frystorkning.
6. Placera röret med metanol / kloroform fasen (se 5,3) på is och indunsta metanol genom att rikta en ström av torr kvävgas på surface av den extraktlösning. När all vätska förångas, avsluta processen och hålla provet vid -80 ° C med röret stängt (skruvlock eller Parafilm) tills klar för NMR-analys.
7. Förbered vattenfas för Lyofilisering
   1. Efter utgången av metanolen avdunstning processen (se 5,5), överföra provet till en grundligt sköljdes 50 ml centrifugrör (om provet är fryst, tina före överföring). Alternativt, för över till en vakuumrundkolv.
   2. Freeze extraktlösningen genom att rotera centrifugrör (eller rundkolv) delvis införd i N _2liq så att den inre ytan av röret eller kolven progressivt täckt av frusen vätska. Se till att ingen N _2liq. Kan komma in i behållaren.
   3. När all vätska är frusen, täcka röret med ett punkterat lock eller skruvlock för att låta ångan att fly, och placera röret i en wide-neck vakuumfilterflaska.
   4. Börja lyofilisering efter attaching kolven eller flaska till frystork.
8. Terminate lyofiliseringsförfarandet när provet är helt torrt. Håll provet vid -80 ° C i ett slutet rör (med en snäv cap!) Tills de användes för NMR-analys.
   OBS: Vanligtvis inte mer än 24 timmar behövs för frystorkning. Flera prover kan lyofiliseras samtidigt, beroende på utformningen av den lyofilisator, och på huruvida centrifugrör i wide-neck flaskor eller rundkolvar användes.

6 Beredning av NMR-prover

1. Store torkat och frystorkade extrakt vid mycket låg temperatur (≤-80 ° C). Åter upplösa lyofilisaten för beredning av NMR-prover omedelbart före NMR experiment.
   OBS: Lagra prov i lösning och / eller nära rumstemperatur kan resultera i prov nedbrytning!
2. Bered en vattenhaltig 200 mM lösning av det kelatbildande medlet, träns-1,2-cyclohexyldiaminetetraacetic syra (CDTA), enligt följande:
   1. Lägg rent vatten (t.ex. 20 ml) till ett provrör eller centrifugrör och tillsätt mängden CDTA pulver nödvändigt att ta fram en 200 mM lösning.
      ANMÄRKNING: En betydande del av CDTA kommer inte vara löslig, eftersom pH-värdet är mycket lågt eftersom syraformen av CDTA användes snarare än en CDTA salt.
   2. Försiktigt, steg för steg, ökande mängder CsOH pulver till CDTA lösningen och skaka noggrant efter varje tillsats.
      OBS: Det lösliga CDTA fraktion kommer att öka med ökande CsOH innehållet i den vattenhaltiga lösningen. Avoid "overtitration", dvs lägga till mindre än den stökiometriska mängden av CsOH till CDTA-lösning.
   3. När nästan all CDTA pulvret löses, börja mäta pH efter varje CsOH tillägg och grundlig vortex. Terminate CsOH tillsats när det slutliga pH-värde uppnås (tabell 1).
      OBS: Vid denna tid, kommer alla CDTA upplösas. Användningen av Cs ⁺ som motjon till CDTA är geneallierad föredra framför Na ⁺ eller K ^+. Cs ⁺ är en mjuk Lewis-syra på grund av dess stora jonisk radie, i motsats till Na ⁺ och K ⁺ som har mindre joniska radier och är hårda syror. Följaktligen Cs ⁺ bildar komplex med fosfater (hårda baser) mindre lätt än gör Na ⁺ och K ^+. Detta är fördelaktigt för ³¹ P NMR-spektroskopi av fosforylerade metaboliter eftersom komplex tenderar att öka NMR linjebredder, särskilt under förhållanden med låg till mellan jonbyte.
3. För ³¹ P NMR-analys av fosfolipider (PL), lös torkade lipiderna (se 5,6) i 700 | il av en lösningsmedelsblandning bestående av deutererad kloroform _(CDCI3), metanol och CDTA-lösning framställd såsom beskrivs i 6,2 (5: 4: 1 volymförhållande). Överför provet till ett mikrocentrifugrör. Använd direkt förskjutning (eller förträngnings) mikropipett med kloroform-resistant tips i båda stegen.
   OBS: Tänk på att ändra något av följande parametrar kommer att påverka utseendet (kemiskt skift och linjebredder) i PL ³¹ P NMR-spektra ^13-17:
   (I) volymförhållande _CDCI3: MeOH: CDTA-lösning
   (Ii) den totala lösningsvolymen används
   (Iii) pH-värdet i den vattenhaltiga komponenten av lösningsmedlet
   (Iv) CDTA koncentrationen av den vattenhaltiga komponenten av lösningsmedlet.
   OBS: I allmänhet finjustering av exempelparametrar (Tabell 1) är inte nödvändigt, och bör utföras med stor försiktighet om så önskas i speciella fall. Ändra volymförhållandet mellan lösningsmedlen lätt resulterar i bildandet av ett system bestående av två faser i stället för en homogen fas! Den en-fas systemet visade sig vara mer praktiskt än de två-fas system i de flesta applikationer ^13,14.
4. För ^1H NMR-analys av vattenlösliga metaboliter, lös lyofilisat (se 5.8) i 700 pl deuteriumoxid (D ₂ O) innehållande 3 (trimetylsilyl) propionsyra-2,2,3,3-d4-natriumsalt (TSPd ₄₎ i millimolära intervall (D ₂ O innehållande 0,05% TSPd ₄ är kommersiellt tillgänglig) . Överför provet till ett mikrocentrifugrör.
5. Justera pH-värdet för den resulterande vattenhaltiga extraktlösningen till 7,3 genom tillsats av små mängder (cirka 2 pl) av deuterium-klorid (DCI) och natrium deuteroxide (NaOD) lösningar. Först börja med 0.02 N DCl eller NaOD lösningar. Om 2 eller 3 efterföljande tillsatser inte orsakar tillräckligt med pH-förändring, fortsätt med 0.2 N DCl eller NaOD lösningar. Var noga med att inte overtitrate.
   OBS: Det totala beloppet för DCl eller NaOD lösning som behövs beror på hur mycket av hjärnvävnad extraherade; Notera detta värde för exakt metabolit kvantifiering. I de flesta fall de kombinerade volymerna av de tillsatta DCL och NaOD lösningarna bör vara så gott som försumbar (nära 1% av NMR-provvolym).

AVDELNING "> 7. Performance av ³¹ P NMR experiment för Brain Phospholipid Analys ^13,14

1. För bästa resultat, använd en multinuclear högupplösande NMR-spektrometer (≥9.4 Tesla fältstyrka, vilket motsvarar 162 MHz ³¹ P, eller 400 MHz ¹ H resonansfrekvenser). Förutom ^31p polen, se till att ³¹ P NMR-sond har en ^1H slinga för proton frikoppling. Ställ temperaturreglering av NMR-sond till önskat målvärde (vanligen 25 ° C).
   OBS: Probe temperaturen kan behöva 10-20 min för att stabilisera!
2. Centrifug PL extraktlösning i mikrocentrifugrör (se 6.3) vid 4 ° C och 11.000 xg under 30 minuter för att snurra ner fasta rester i provet. Överför 600 l av supernatanten till en högkvalitativ NMR-rör (5 mm ytterdiameter).
3. Förbered lämplig koaxial insats stam fylld med en vatten 20 mM metylendifosfonat (MDP)-lösning vid pH 7,0 för kemisk-shift referenseroch kvantifiering. Placera insatsen i NMR rör fyllt med PL extraktlösning.
4. Montera NMR-rör med lämplig spinnaren och överföring till NMR-magneten. Nu snurrar provet vid 15-20 Hz och vänta tills provet har anpassat sig till den inställda temperaturen (ca 10 min).
5. Försiktigt minimera magnetisk fält homogen över provet genom att justera på-axeln och off-axis shim spolströmmar ^18.
6. Ställ NMR förvärv spektrumparametrar till optimala värden, som kan variera som en funktion av magnetfältstyrka (för en 9,4 T-systemet, se tabell 1 för rekommenderade parametervärden).
7. Ange antal transienter per försök (= NS).
   1. Ställ NS till ca 80 (total varaktighet av datainsamling ca 20 min) om bara de vanligaste PL ska kvantifieras med precision (fosfatidylkolin (PtdCho), fosfatidyletanolamin (PtdEtn), etanolamin plasmalogen).
   2. Ställ NS till ca 100-200 (total varaktighet på data förvärvet 1-2 h) Om mindre koncentrerade PL är att kvantifieras (alkyl-acyl-fosfatidylkolin, fosfatidylinositol, fosfatidylserin, fosfatidinsyra).
   3. Ställ NS till ca 1500-2000 (total varaktighet av datainsamling 7-10 h; natten experiment), om mycket låg koncentration PL ska kvantifieras, t.ex. fosfatidylinositol mono och difosfater (PtdIP och PtdIP _2), kardiolipin, lyso-PL , alkyl-acyl-fosfatidyletanolamin, och ibland andra.
8. Efter utgången av spektrumet förvärvet process fri induktion sönderfall (FID) med optimerade parametrar. Värdena av dessa parametrar varierar som en funktion av magnetiskt fältstyrka, shim kvalitet, och PL-signalen som skall kvantifieras.
   1. För att uppnå bästa resultat för hela skalan av PL, upprepa bearbetning med hjälp av flera (minst två) olika filtreringsförfaranden. Använd kraftfulla förslag förbättring för kraftigt överlappande signaler, t ex., För PtdCho och PtdEtnregioner.
   2. Använd starka filtrering (svag eller ingen upplösningsförbättring) för svaga signaler.
   3. Filtrera mycket svaga och breda signaler utan betydande överlappning med apodization (t.ex. LB = 3 Hz) för att öka signal-till-brus-förhållande, t.ex. PtdIP och PtdIP _2. Se tabell 1 för karakteristiska processparametrar.
9. Kvantifiera området varje PL-signal med avseende på området under signalen för referensföreningen (MDP) i samma spektrum.
10. Kalibrera signalen av referensföreningen (MDP) i ett separat experiment med användning av en 5 mm NMR-rör fyllt med (i) en fosforförening med känd koncentration, och (ii) samma koaxialinsatsskaftet används i PL ³¹ P NMR-experiment ( se 7.3 och 7.9).
11. Beräkna enskilda PL koncentrationer baserade på relativa områden i PL signaler på ena sidan (se 7.9), och kalibreringsvärde erhålls för MDP frånkoaxial insats på den andra (se 7.10). Ta hänsyn till att antalet fosforkärnor som bidrar till en viss ³¹ P NMR-signalen kan variera som en funktion av den molekylära ursprunget av denna signal.
    OBS: MDP fosfonat signal (vanligen refererade till 19,39 ppm) representerar två fosforkärnor, liksom gör kardiolipin fosfat signalen. Alla andra PL ³¹ P NMR-signaler upptäckts i hjärnan extrakt representerar en fosfor kärna vardera.
12. Använd statistik programvara som krävs för att jämföra hjärnan PL nivåer mellan djurgrupper.

8 Utförande av ^1H NMR experiment för analys av vattenlösliga Brain Metaboliter

1. Ställ temperaturreglering av ^ett H-NMR-sond till önskat målvärde (vanligen 25 ° C). Se även kommentarer i 7.1.
2. Centrifugera vattenextraktlösningen i mikrocentrifugrör (se 6.5) vid 4 ° C och 11.000xg under 30 minuter för att snurra ner fasta rester i provet. Överför 600 l av supernatanten till en högkvalitativ NMR-rör (5 mm ytterdiameter).
3. Transfer NMR röret till NMR magnet, shims och som NMR spektrum ackvisitionsparametrar till optimala värden som förklaras i 7,4-7,6. Se även tabell 1 för rekommenderade parametervärden.
4. Ange antalet transienter per försök till ungefär NS = 32 (total längd datainsamling ca 13 min). För att få bra signal-till-brus-förhållanden för väldigt svaga signaler, särskilt i den aromatiska regionen använder NS = 64 (total längd datainsamling ca 26 min) eller mer.
5. Efter utgången av spektrumet förvärvet process fri induktion sönderfall (FID) med optimerade parametrar. Värdena för dessa parametrar varierar något som funktion av magnetisk fältstyrka, shim kvalitet och metaboliten signal som skall kvantifieras.
   OBS: I de flesta fall räcker det med att behandla varje spektrum gång, Som sysselsätter en uppsättning processparametrar som utgör en bra kompromiss för alla metabolit signaler. Se tabell 1 för karakteristiska processparametrar.
6. Kvantifiera området varje metabolit signal (ofta en multiplett, ibland överlappande med andra sing eller multipletter härrör från olika molekyler) med avseende på området under signalen för referensföreningen (TSP-d ₄₎ i samma spektrum.
7. Beräkna individuella metabolitkoncentrationer baserade på TSP-d ₄ koncentration (se 6.4). Ta hänsyn till att antalet protoner som bidrar till en viss ^1H NMR-signalen kan variera som en funktion av den molekylära ursprunget av denna signal. Den TSP-d ₄ trimetyl signal (referens 0,0 ppm) representerar nio protoner.
8. Använd statistik programvara som krävs för att jämföra hjärnan metabolitnivåer mellan djurgrupper.

Representative Results

För att få bästa upplösning i metabolisk NMR-spektra för hjärnan och andra vävnadsextrakten, har det länge varit vanligt att ta bort eller mask metalljoner (viktigast: paramagnetiska joner) som finns i extraktlösningar. Detta har uppnåtts antingen genom att tillsätta ett kelateringsmedel, såsom EDTA eller CDTA till extraktet ^19, eller genom att passera extraktet genom ett jonbytarharts såsom Chelex-100 ^20. Resultaten som presenteras i Figur 1 visar att detta steg är inte nödvändigt för ^en H-NMR-spektroskopisk analys om hjärnextrakt är noggrant framställd enligt ovanstående protokoll. Här var extremt smala spektrallinjer erhållas för alla spektrala regioner som analyserats. Även i mycket trånga områden, till exempel, för glutamin / glutamat och myo-inositol / glycin, toppar på ett avstånd av <0,01 ppm är nästan helt separerbara vid 400 MHz (figur 1, nederst). Som en följd av kvalitativa,och kvantitativ analys av de många små, men för närvarande ej tilldelade, toppar synliga i mitten och bottenpaneler i figur 1 kan man tänka sig i framtiden.

Figur 1. delregioner av en typisk ¹ H-NMR-spektrum (400 MHz) av den vattenhaltiga fasen i en hjärnvävnadsextrakt från en kvinnlig Lewis råtta. Alla tre panelerna demonstrera den extremt höga upplösningen som kan erhållas med användning av protokollet som presenteras i detta dokument. Varken kelatbildare eller jonbytarharts har använts under beredningen av proverna. Center och bottenpanelerna visar att det finns många oanvända lågintensiva toppar som antyder det stora dynamiska området som täcks av högupplösta ^1H NMR-spektroskopi av vävnadsextrakt om de utförs med hjälp av optimerade experimentella parametrar. Dessa svaga men väldetekterbara signaler kan potentiellt kan identifieras och kvantifieras i framtiden. Flera upptäckta metaboliter är specifika för hjärnvävnad, t.ex. neuron markör NAA eller neurotransmittorn GABA. Dock är de flesta föreningar involverade i ett brett spektrum av metaboliska vägar som är gemensamma för däggdjursceller, såsom aminosyra, grenad organisk syra, polyol, (fosfo) lipid och energimetabolism samt i glykolysen och glutaminolysis, och i funktioner såsom osmoreglering, celltillväxt och proliferation. Asterisken betecknar metyl resonans härrör från en metanol orenhet. Förkortningar: ala, alanin; lac, laktat; treo, treonin; BHB, β-hydroxibutyrat; Val, valin; lie, isoleucin; Leu, leucin; AAB, α-aminobutyrat; AHB, α-hydroxibutyrat; tau, taurin, scy -Ins, scyllo inositol, myo -Ins, myo-inositol; GPC, glycerophosphocholine; PC, fosfokolin; cho, kolin; CRN, kreatinin; Cr, kreatin; GABA,47; -aminobutyrat; asp, aspartat; NAA, N -acetylaspartate; Gin, glutamin; Glu, glutamat; suc, succinat; NANA, N -acetylneuraminate; ac, acetat; Gly, glycin. De små toppar på basen av ala dubb stammen från laktat ^13C satellitdubb (övre panelen). Omtryckt under Creative Commons Attribution License (ccal) termer från Lutz NW et al (2013) Cerebral biokemiska vägar i experimentell autoimmun encefalomyelit och adjuvant artrit:. En jämförande metabolomic studie. PLOS ONE 8 (2):. E56101 Klicka här för att se en större version av denna siffra.

I ³¹ P NMR-spektroskopi, maskera eller ta bort paramagnetiska katjoner (främst järn) är utan tvekan en nödvändighet eftersom fosfater lätt bildar komplex med tvåvärda och trevärda joner. Tillsats av CDTA till utdrag påverkar både spektrallinje bredder end kemiska skift; jämför figur 2, övre och nedre vänstra. Linje förträngning genom att välja 1,000 mM (nederst till vänster) istället för 200 mM (överst till vänster) CDTA önskades, men resulterade i överlagring av PL-signaler som ska kvantifieras separat (uppe till vänster). Därför är 200 mM CDTA rekommenderas för den vattenbaserade komponenten i PL lösningsmedel, allt annat lika. Dessutom provtemperaturen under mätningen påverkar spektrala linjebredder och kemiska skift; jämför figur 2, upptill och nedtill till höger. Linje förträngning genom att välja 277 K (nere till höger) i stället för 297 K (överst till höger) önskades, men resulterade i överlagring av PL-signaler som ska kvantifieras separat (överst till höger). Därför är 297 K rekommenderas som temperaturmätning, allt annat lika. Jämförelse mellan de två övre panelerna visar att en minskning i CDTA koncentrationen från 200 mM (överst till vänster) till 50 mM (överst till höger) enbart resulterar ien blygsam ökning av linjebredd, och nästan ingen förändring i kemiska skift. Observera dock att vävnadskoncentrationen i 50 mM CDTA extrakt är hälften så hög som den är i 200 mM CDTA extrakt, förklarar de relativt smala linjer i det övre högra panelen ^13.

Figur 2 Fosfatidyletanolamin (PtdE) regioner av fosfolipid ³¹ P NMR-spektra (162 MHz) av hjärnvävnadsextrakt från kvinnliga Lewis-råttor (Högst till vänster) Hjärnvävnad koncentration, 236 mg / ml. CDTA koncentration och pH i den vattenhaltiga komponenten av lösningsmedlet, 200 mM och 7,33, respektive; temperaturmätning är 297 K. PtdE _plasma och SM-signaler väl löst (nederst till vänster) Hjärnvävnad koncentration, 236 mg / ml. CDTA concentration och pH i den vattenhaltiga komponenten av lösningsmedlet, 1000 mM och 7,36, respektive; temperaturmätning, 297 K. PtdE _plasma och SM-signaler överlappar helt; de kan inte lösas trots minskad linjebredd, jämfört med det övre vänstra spektrum (överst till höger) Hjärnvävnad koncentration, 118 mg / ml. CDTA koncentration och pH i den vattenhaltiga komponenten av lösningsmedlet, 50 mM och 7,14, respektive; temperaturmätning, 297 K. PtdE och SM-signaler är väl löst (Nederst till höger) Hjärnvävnad koncentration, 118 mg / ml. CDTA koncentration och pH i den vattenhaltiga komponenten av lösningsmedlet, 50 mM och 7,14, respektive; temperaturmätning, 277 K. PtdE och SM-signaler överlappar helt; De kan inte lösas, trots minskad linjebredd jämfört med den övre högra spektrumet. Förkortningar: PtdE _plasm, etanolplasmalogen; PtdE, fosfatidyletanolamin; SM, sfingomyelin; PtdS, phosphatidylserine; PTDC, fosfatidylkolin. Återges med tillstånd från Lutz NW et al. (2010) multiparameter optimering av ³¹ P NMR-spektroskopisk analys av fosfolipider i råvävnadsextrakt. 1. Kemisk förskjutning och signalseparation. Anal Chem 82 (13): 5433-5440. Copyright 2010 American Chemical Society. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Med användning av ovanstående protokoll (en-fas system ^14, fig 3, överst till vänster), ett stort antal kvantifierbara PLs detekterades (figur 3, överst till höger), som täcker en avsevärd koncentrationsintervall (not stympade högintensiva signaler). Några av dessa signaler är enligt ännu otilldelad (U1, U2, U6). Om provberedning, NMR mätning och bearbetning spektrum utförs som anges i detta protokoll är ännu tillräcklig för att rutinmässigt d spektral upplösningetect partiell delning av vissa toppar (PtdS, PtdE, PtdE _plasm, AAPtdE, nere till vänster). . Som en följd av kvalitativ och kvantitativ analys av ytterligare PL undergrupper kan förutses i framtiden Figur 3, längst ner till höger, belyser kraften i gillt utvalda processparametrar för att delvis separata signaler med låg koncentrations föreningar (här: PtdC1u, härlett en PL från PTDC som inte är helt identifierad, och PTDC _plasm) resonans nära mycket starka signaler (här: PTDC).

Figur 3 Phospholipid ³¹ P NMR-spektroskopi (162 MHz) av hjärnvävnadsextrakt från kvinnliga Lewis råttor. (Högst till vänster) En en-fas-system (till vänster) var att föredra framför ett två-fassystem (höger). Den vanligen använda två-fas system hindrar korrektPL kvantifiering eftersom de flesta av den övre fasen är placerad utanför den känsliga volymen av spolen. (Övre högra panelen) Komplett ³¹ P NMR PL spektrum av råtthjärna. För bättre synlighet för svaga signaler (PtdIP, PtdG), exponentiell linjebreddning (LB = 3 Hz) tillämpades. I denna representation, flera PL-signaler inte är väl löst, särskilt inom PTDC och PtdE regioner. För PL genererar mer än en ³¹ P NMR-signal, observeras kärnor strukna (P TDIP, PtdI P, P TDIP _2, PtdI P _2). För närvarande ej tilldelade signaler betecknas med "U n" (där n = 1, 2, ...). (Nedre vänstra panelen) PtdE och PtdS regioner i samma spektrum. För bättre upplösning av toppar, var Lorentz-Gaussian linje form transformation tillämpas (LB = -1 Hz, GB = 0,3). På grund av dessa processparametrar, många mycket svaga PL signaler är svåra att upptäcka. Men åtminstone två toppar kanskönjas för varje PtdE, PtdE _plasm, AAPtdE och PtdS. (Nedre högra panelen) PTDC region som erhållits med samma processparametrar som PtdE regionen. Flera signaler vid basen av dominerande PTDC resonans upptäcktes otvetydigt, medan de inte kan urskiljas i den övre spektrat genereras med exponentiell linjebreddning (AAPtdC, PTDC _plasm, PtdC1u). Förutom den nu lediga PTDC analog, PtdC1u kan ytterligare mindre resonanser vara närvarande upfield från PTDC. Förkortningar: PtdIP, fosfatidylinositol fosfat; PtdIP _2, fosfatidylinositol difosfat; Ptda, fosfatidinsyra; PtdG, fosfatidylglycerol; CL, kardiolipin; PtdE .., summan av PtdE, PtdE _plasm och AAPtdE; PtdI, fosfatidylinositol. För ytterligare förkortningar, se texten till figur 2. Återges med tillstånd från Lutz NW et al. (2010) multiparameter optimering av ³¹ P NMR-spektroskopisk analys av phospholipids i råvävnadsextrakt. 1. Kemisk förskjutning och signalseparation. Anal Chem 82 (13): 5433-5440. Copyright 2010 American Chemical Society. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Skörd och Frysråtthjärna
Dewar för N 2liq.; frysning klämma (t.ex. hemlagad Wollenberger tänger, ref 1 och 2, botten av tabellen.); anestesi kammare; kirurgisk sax; skalpell; 500 ml flaska med rengöringsalkohol	1 av varje
Tång	2
1 ml spruta, 10 ml spruta	En av varje per djur
25 G nålar	2 per djur
Prov preparation
Typisk mängd hjärnvävnad per extraktion	250-350 mg
MeOH volym som används i homogenisering 250-350 mg hjärnvävnad	4 ml
5 ml plast pipett	3 per extrakt
10 ml plast pipett	1 per extrakt
Glasflaska (≥20 ml volym)	1 per extrakt
Kloroform beständigt centrifugrör	1 per extrakt
Väntetid efter vävnads homogenisering i MeOH (blandningen vid 4 ° C)	15 minuter
Vatten och CHCI3 volym adderas till hjärnvävnad homogeniseras i 4 ml MeOH	4 ml vardera
Väntetid efter blandning homogeniserades vävnaden med vatten och CHCI3 (blandningen vid -20 ° C)	över natten
Centrifugering för separation of Vatten från ekologiska extrakt fasen (glas centrifugrör)	13.000 x g, under 40 min vid 4 ° C
Koncentration av CDTA (vattenfas av lösningsmedelsblandning för upplösning extraherade lipider)	200 mM
pH i vattenfasen i lösningsmedelsblandning för upplösning extraherade lipider	7,4
Volym-förhållandet i lipidlösningsmedlet A används för 31p PL analys (CDCl3: MeOH: CDTA-lösning)	5: 4: 1
Mängden lösningsmedel A används för att lösa lipider extraherade 250-350 mg hjärnvävnad	700 | il
Centrifugering för spinning ned fasta partiklar i NMR prov (mikrocentrifugrör)	11.000 xg, 30 min vid 4 ° C
pH i NMR prov som innehåller vattenlösliga metaboliter	7,3
Provvolym fördes till NMR-rör, efter centrifugeugation	600 | il
MDP-koncentrationen i koaxial insats skaft för 31 P NMR	20 mM
NMR-experiment
Provtemperaturen under NMR experiment (justeras för att minimera topp överlappning)	25 ° C
Spinning frekvens under NMR experiment	15-20 Hz
1 H-NMR ackvisitionsparametrar
Lösningsmedel ge 2H lås signal	D2O
Excitation pulsbredd, P1	11 ^ sek
Excitationspuls, förstärkare dämpning, PL1	0 dB
FID storlek, TD	32 k
FID förvärv time, AQ	3,283 sek
Avkoppling dröjsmål D1	15 sek
Lösningsmedel undertryckande dröjsmål D4	6 sek
Total repetitionstid, TR	24,3 sek
Spektral bredd i ppm, SWP	12,47 ppm
Spectral bredd i Hz, SW	4990 Hz
Mottagare vinst, RG	512
Lösningsmedel suppression (kontinuerlig våg)	CW
Lösningsmedel förtryck, förstärkare dämpning, PL9	50 dB
Antal transienter, NS	32 eller 64
31 P NMR ackvisitionsparametrar
Lösningsmedel ge 2H lås signal	CDCI3
Excitationspuls width, P1	9,5 ^ s
Excitationspuls, förstärkare dämpning, PL1	4 dB
FID storlek, TD	16 k
FID anskaffningstiden, AQ	2,019 sek
Avkoppling dröjsmål D1	15 sek
Total repetitionstid, TR	17 sek
Spektral bredd i ppm, SWP	25 ppm
Spectral bredd i Hz, SW	4058 Hz
Mottagare vinst, RG (max)	16.384
Proton frikoppling (sammansatt puls frikoppling)	CPD
Proton frikoppling, förstärkare dämpning, PL13	19 dB
Antal transienter, NS	1500 eller 2000
NMR databehandling		1H Resolution Enhancement, Gauss-Lorentzlineshape Transformation
Övergripande utvärdering av spektrum (vid behov, optimera separat för enskilda spektralområden, med hjälp av 0,1 <GB <0,4 och -0,6 <LB <-0,2 Hz)	GB = 0,15, LB = -0,2 Hz
Mycket svaga signaler, t.ex., aromatiska syror (alternativt apodization med LB ≥ 0,5 Hz)	GB = 0,015, LB = -0,3 Hz
Områden under toppar: användning Lineshape passar för överlappande resonanser
31 P upplösningsförbättring, Gauss-Lorentzlineshape förvandling
Övergripande utvärdering av spektrum (optimera separat för enskilda spektralområden, använder 0,05 <S <0,2 och -3,0 <LB <60; -1,0 Hz)	GB = 0,05, LB = -1,0 Hz
Mycket svaga signaler, t.ex. PtdIP 2, Ptda: apodization	LB = 3 Hz
Områden under toppar: användning Lineshape passar för överlappande resonanser
Referenser
1. Palladino GW, Trä JJ, Proctor HJ. Modifierad fryst clamp-tekniken för vävnadsanalysen. The Journal of kirurgiska forskning 289, 188-190 (1980).
2. Wollenberger A, Ristau O, Schoffa G. [Ett enkelt tema teknik för extremt snabb nedfrysning av stora bitar av vävnad]. Pflugers Archiv fur die Gesamte Physiologie des Menschen und der Tiere 270, 399-412 (1960).

Tabell 1 Experimentella parametrar för högupplösta ¹ H och ³¹ P NMR-spektroskopi av hjärnanvävnadsextrakt. Typiska värden för volymförhållanden och koncentrationer av lösningsmedel och reagenser som används i hjärnvävnad utvinning och NMR-provberedning presenteras. Vidare rekommenderade värden avser prov pH och temperaturmätning, samt NMR förvärv och processparametrar. Smärre justeringar kan vara nödvändiga, särskilt om protokoll tillämpas på andra än hjärnan vävnader. NMR-parametrar har optimerats för mätningar på 9,4 T, och bör justeras efter behov för spektrometrar som arbetar vid olika magnetiska-fältstyrkor.

Discussion

NMR-spektroskopi är en effektiv metod för mätning av koncentrationer av kemiska föreningar i lösning i ett mycket reproducerbart och noggrant sätt. Men är det nödvändigt att hålla sig till vissa regler som gäller beredning och analys prov för att erhålla uppgifter av hög kvalitet. Vid bestämning av koncentration av metaboliter genom NMR-spektroskopi, varken generering eller mottagning av den NMR-signal dominerar kvantifiering fel såvida intensiteten av en observerad signal närmar sig tröskeln detektering (särskilt svag signal). I alla andra fall biologisk variabilitet, provberedningen teknik (extraktionseffektivitet, fysiska och kemiska stabilitet av föreningar, pipettering och väger fel etc.), och / eller valet av signalinsamlingen och processparametrar kommer att avgöra precision och noggrannhet av resultat. Självklart kommer alla metabola förändringar som inträffar under vävnads skörden också att återspeglas i metaboliten koncentrationer fåred. Därför är det mycket viktigt att slutföra vävnads skörden så fort som möjligt, och att tillämpa särskilda vävnadsfrystekniker såsom tratt frysa om exakt in vivo koncentrationer av snabbt metaboliserande föreningar är viktiga (särskilt glukos, laktat, ATP och dess kataboliter, ADP och AMP).

Även vid den mellanliggande magnetiskt fältstyrka (9,4 T) för en rutin högupplösande NMR-spektrometer utmärkt spektra kan erhållas. Till exempel i ^ett H-NMR-spektra för den vattenhaltiga fasen av råtthjärnextrakt, signaler, vars skillnad i kemiska skift, Δδ, uppgår till ca 0,005 ppm (motsvarande 2,0 Hz vid 400 MHz resonansfrekvens) kan urskiljas och kvantifierades separat. Detta illustreras genom partiell separation av (i) laktat och treonin dubletter, och (ii) den alanin dublett från de små toppar vid dess bas (laktat ¹³ C satellit dublett, fig 1,överst). Spektrometrar verksamma vid högre fält (14.1 eller till 18,8 T) skulle öka upplösningen och känsligheten ytterligare, även om dessa instrument är mindre vanliga i NMR-laboratorier på grund av deras höga inköpskostnaden.

Använda ^1H NMR-spektroskopi, kan ett brett spektrum av metaboliter analyseras samtidigt, dvs i ett enda förvärv. Känsligheten av experimentet kan förbättras genom att öka antalet ackumulerade transienter, även om detta val ökar mättid proportionellt. (Signal-till-brusförhållandet är proportionell mot kvadratroten av antalet transienter.) Emellertid den maximala totala förvärvstiden ges i ovanstående protokoll (20-30 min) bör vara tillräcklig för praktiskt taget alla ändamål, såvida inte mängden av vävnad för utvinning är mycket begränsad. Förutom att använda de flesta NMR-känslig kärna (proton), har metabolomic ^ett 'H NMR-spektroskopi fördelen av omfattandedatabaser som är tillgängliga för olika fältstyrkor och prov pH-värden ^10. Dessutom har programvara för automatisk eller halvautomatisk utvärdering spektrum blir tillgängligt ^10.

Medan ^1H NMR-spektra av vävnadsextrakt kan väl lösas utan tillsats av kelatbildare, är detta inte längre sant för ³¹ P NMR-spektra. Faktum är att koncentrationen av kelatbildare som används (t.ex. EDTA eller CDTA) har en betydande inverkan på både linjebredd och kemiskt skift av ³¹ P NMR-signaler som härrör från fosforylerade metaboliter. Ökande CDTA koncentrationen i ett extrakt minskar ³¹ P NMR-linjebredder, men denna fördel kan uppvägas av mindre skillnader mellan kemiska skift, Δδ, granntoppar. Därför mängden kelatbildare som används har optimeras för både linjebredd och kemiskt skift tillsammans. I lipid extrakt, dessa två spektrala parametrar är significantly påverkas av den totala provkoncentration, dvs den mängd vävnad heras, utan även av pH-värdet och temperaturen hos provet under NMR-mätning. Följaktligen måste varje optimering av mätförhållanden beakta de kombinerade effekterna av alla experimentella parametrar inblandade, en del av dessa inte är additiva. Komplexiteten i denna situation illustreras av beteendet hos PL ³¹ P NMR-spektra visas i fig 2. Även det lägsta vävnad koncentration (118 mg / ml), den lägsta temperaturen (277 K) och den högsta CDTA koncentration (1000 mM) testades skulle resultera i lägsta linjebredd, rekommenderar föreslagna protokoll användningen av måttlig vävnadskoncentration (236 mg / ml), mellan CDTA koncentration (200 mM) och rumstemperatur (297 K) för att undvika signal överlappning.

Även villkoren för provberedning och förvärvs spektrum är av yttersta vikt, attroll processspektrumparametrar utvinna maximalt information från de förvärvade rådata bör inte underskattas. En särskild uppsättning processparametrar min vara idealisk för att detektera och kvantifiera PLs som inträffar vid låga koncentrationer; dock kan samma uppsättning parametrar skymma individuella toppar i "trångt" spektralområden (Figur 3, överst till höger). Omvänt skulle behandlingsparametrar som ger optimal upplösning förbättring i regioner av starkt överlappande resonanser (Figur 3, botten) gör lågintensiva toppar omöjlig att upptäcka. Den senaste tidens utveckling, bland annat också ett omfattande PL ³¹ P NMR-databasen ^13,14, i hög grad underlätta analysen av NMR-spektra ^13,14.

I slutändan måste målen för den underliggande ansökan fastställa kriterier för optimering, dvs den önskade balansen av spektral upplösning, känslighet, precision metabolit quantifcation, hastighet och andra faktorer. Till exempel, det rekommenderade enfassystem för PL analystillstånd mer pålitlig och effektiv PL kvantifiering än tvåfassystem (Figur 3, överst till vänster), och ger hög spektral upplösning samt tillräcklig känslighet för kvantifiering av mindre rikliga PL . Men i fall där bästa signalseparation av mycket högre prioritet än effektiv och noggrann kvantifiering, användning av en högre procentandel av kloroform-d i lösningsmedelsblandningen kan prövas, även om detta lätt leder till fasseparation i provet. Om så är fallet, måste volymen av den undre fasen bestämmas för att erhålla absoluta PL mängder (mg PL, per g vävnad eller mg totalt protein).

I proton-avskild hetero NMR-experiment, kan signalintensiteter förändras genom nukleära Overhauser effekter (NOE), utöver mättnad på grund av snabba förvärvsplaner. Om korrigerade dessa effekter leda metabolit quantitation fel. Det finns två alternativa strategier för att hantera denna utmaning. I den första metoden är individuella transienter en förvärvs åtskilda av stora förseningar. Denna metod undviker mättnad eller NOE men resulterar i relativt långa experiment; det bör användas om precisa och korrekta resultat behövs. I vissa fall kan prioritet måste ges till snabba förvärvsspektrum, särskilt för mycket utspädda prover som bara kan mätas med hjälp av ett stort antal transienter. I sådana fall skulle tillägg av paramagnetiska avslappningsmedel till provet medge snabb datainsamling utan mättnad eller NOE. Alternativt kan utnyttjas snabb datainsamling utan tillsats av paramagnetiska medel. Den senare metoden kräver korrigering av signalområden genom korrektionsfaktorer som måste fastställas för varje NMR resonans, medan närvaron av avslappningsmedel orsakar viss breddning av NMR-signaler som kan minska precisionen i metabolit kvantifiering förtrångt spektralområden. I allmänhet är det optimala valet av experimentella förhållanden inte bara bestäms av den provet, men också av de uppgifter som ska extraheras från ett experiment ^13. Om hög prioritet måste ges till snabb analys av ganska rikliga metaboliter, utan behov av hög precision och noggrannhet, kan det vara lämpligt att mäta högkoncentrerade prover och anställa korta repetitionstider, eventuellt med paramagnetisk relaxamedel till provet. Om däremot exakt kvantifiering av ett stort antal metaboliter är viktigare än hastighet, är det bättre att använda mindre koncentrerade extrakt och accepterar långa NMR hämtningstider, vilket framgår av det protokoll som presenteras här. Dessutom, om ett särskilt forskningsprojekt betonar specifika metaboliter, experimentella betingelser kan justeras för att uppnå optimal spektral upplösning för de spektrala regionerna i fråga. Protokollet och diskussion presenteras här kan tjäna som vägledning för optimization av metabolomic analys av råvävnadsextrakt med NMR-spektroskopi.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane	Virbac	Vetflurane	Anesthetic for animals
Isoflurane vaporizer	Ohmeda	Isotec 3	Newer model available: Isotec 4
Scalpel, scissors, forceps, clamps	Harvard Apparatus Fisher Scientific	various various	Surgical equipment for animals
Freeze-clamp tool	homebuilt	n/a	Tong with aluminium plates, to be inserted in liquid nitrogen for cooling
Dewar	Nalgene	4150-4000
Liquid nitrogen	Air Liquide	n/a
Nitrogen gas	Air Liquide	n/a
Nitrogen evaporator	Organomation Associates	N-EVAP 111	Can be replaced by homebuilt device
Mortar	Sigma-Aldrich	Z247472
Pestle	Sigma-Aldrich	Z247510
Tissue homogenizer	Kinematica	Polytron	With test tubes fitting homogenizer shaft
Electronic scale	Sartorius	n/a
Methanol	Sigma-Aldrich	M3641
Chloroform	Sigma-Aldrich	366910
Glass centrifuge tubes	Kimble	45500-15, 45500-30	Kimax 15 ml, 30 ml tube
Microcentrifuge tubes	Kimble	45150-2	Kimax 2 ml tube; should replace "Eppendorf" tube if compatible with centrifuge rotor
Polystyrene pipettes	Costar Corning	Stripettes	5 and 10 ml volumes
Deuterochloroform	Sigma-Aldrich	431915	99.96% deuterated
Deuterium oxide	Sigma-Aldrich	423459	99.96% deuterated
Deuterium chloride	Alpha Aesar	42406	20% in deuterium oxide
Sodium deuteroxide	Sigma-Aldrich	164488	30% in deuterium oxide
Lyophilizer	Christ	Alpha 1-2
Cold centrifuge	Heraeus	Megafuge 16R
pH meter	Eutech Cybernetics	Cyberscan
CDTA	Sigma-Aldrich	D0922
Cesium hydroxide	Sigma-Aldrich	516988
NMR tubes	Wilmad	528-PP
NMR stem coaxial insert	Sigma-Aldrich	Z278513	By Wilmad
NMR pipettes	Sigma-Aldrich	Z255688
Pipettes	Eppendorf	Research	With tips for volumes from 0.5 to 1,000 μl
Pipet-Aid	Drummond	XP
NMR spectrometer	Bruker	AVANCE 400	including probe and other accessories
NMR software	Bruker	TopSpin 1.3	newer version available: Topspin 3.2
Water-soluble standard compounds	Sigma-Aldrich	various
Phospholipid standard compounds	Avanti Polar Lipids Doosan Serdary Sigma-Aldrich	various various various	Source for plasmalogens, but may be <70 - 80% purity
Methylenediphosphonate	Sigma-Aldrich	M9508
TSP-d4	Sigma-Aldrich	269913