Introduction
Murin modeller beyin araştırması 1 yaygın olarak kullanılmıştır. Genotip-fenotip, diğer korelasyon 2-6 üzerinde, bir yandan, RNA ve / veya protein seviyelerde gen ifadesinin inceleyerek fare ve sıçan beyinleri incelenmiş ve morfolojik fonksiyonel elektrofizyolojik ve / veya davranış fenotipleri edilmiştir. Ancak, tamamen genotipi ile fenotipi bağlayan mekanizmalarını anlamak için, o aşağı protein ifadesi, yani moleküler olayları araştırmak için zorunludur. enzimler 7 hareket bunun üzerine biyokimyasal substratların metabolizması. Bu gereklilik biyoloji 8,9 birçok dalında metabolik araştırma rönesans için, son 10 ila 15 yıl içinde, yol açtı. Klasik metabolik çalışmalar genellikle belirli yolların ayrıntıları odaklanmış olsa da, yeni metabolomic yaklaşım göz altında dokusunun küresel metabolik profilinin her şeyi kapsayan bir soruşturma yönelikse.Bu kavram bir sonucu özel metabolik yolları ve / veya bileşiklerin sınıflarına karşı verevi en aza indirmek analitik araçlar için açık bir ihtiyaç vardır. Bununla birlikte, klasik biyokimyasal analizi deneyi gerçekleştirilir önce belirtilmesi gereken belirli bir analit bir kimyasal reaksiyona dayanır. Bunun aksine, nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopi ve kütle spektrometrisi (MS) (i) spektroskopik teknikler biyokimyasal bileşiklerin, özellikle molekül (fiziksel) özelliklerine dayanır her biri bir spektrum içinde bir ya da birden fazla farklı sinyal yol açar bir deney sırasında tespit edilmiştir; ve (ii), deney başına farklı bileşiklerin çok sayıda tespit eder.
Böylece, her bir spektrum metabolitlerin bir dizi kombine bilgileri içerir. Önceden seçme analitin doğası ile ilgili 8 ölçülecek yapılması gereken Bu nedenle, spektroskopik yöntemler, metabolitler için uygun araçlardır
NMR ve MS spektroskopi birçok metabolitlerin analizi için birbirlerinin yerine kullanılabilir, ancak her iki yöntemle de avantaj ve yakın zamanda gözden geçirilmiştir 10 dezavantajları da vardır. Kısaca, NMR spektroskopi, genellikle kaba özütündeki gerçekleştirilebilir ve analizden önce örnek bileşiklerin kromatografik ayırmaya gerek yoktur. Buna göre, MS gibi kütle spektrometresi görüntüleme gibi belirli son gelişmelerin dışında, gaz veya sıvı kromatografisi (GC veya LC) ayrılması ile çalışır. Farklı şekerlerin rezonans hatları (1H) NMR spektrası, proton aktif rol oynamaktadır, çünkü bu tür şekerlerin analizi bir kaç özel durumda, LC ayırma, hem de NMR spektroskopi için bir zorunluluk olabilir. CHR olmadan Bununla birlikte, 1H-NMR spektroskopisiomatographic ayırma en popüler, neredeyse evrensel uygulamalı metabolomic NMR yöntemi kalır. Genel olarak, bu numune hazırlama NMR spektroskopisi için olduğu gibi, MS daha zaman alıcı ve karmaşıktır. Matriks etkileri nedeniyle ciddi sorunlar çok onlar oldukça zayıflatılmış sinyallerine neden olabilir nerede MS daha NMR spektroskopisi az yaygındır. Metabolit niceleme Her iki yöntem ile elde edilebilir. Bununla birlikte, çoklu standart bileşiklerin, metabolitleri arasında matriks etkileri ve iyonizasyon verimliliği varyasyonlara MS için gereklidir. Buna karşılık, numune başına sadece bir standart için uygun ölçüm koşulları altında, bir NMR spektroskopisi ile analiz için gerekli olan, ikinci yöntem ise esas olarak gözlenen çekirdekleri tarafından kesinlikle lineer tepki NMR nicel sayesinde. NMR önemli bir dezavantajı nispeten düşük hassasiyettir. MS, özellikle LC-MS, büyüklük birkaç emir tarafından NMR daha duyarlıdır; Bu nedenle, MS için NMR fazla tercih edilmelidirçok düşük konsantrasyonlarda meydana gelen bileşiklerin analizi. Öte yandan, bir NMR deneyinde bozulmayan doğası MS üzerinde açık bir avantaj olan; Bu şekilde, örneğin 1 H-NMR, fosfor-31 (31 p), karbon-13 (13 ° C), farklı NMR aktif çekirdekleri için, örneğin, aynı numune üzerinde tekrar tekrar yapılabilir flor-19 (19 C) vb., MS ölçümleri karşı önemli bir NMR ile tüketilir gibi.
NMR ve MS hem farklı modlarda kullanılabilir, her biri özel bir kimyasal özelliklere sahip bileşiklerin tespit edilmesi için uygun olan. Hemen hemen tüm fosforlu metabolitleri de protonlar ihtiva eden, ancak, örneğin, 31P NMR, genellikle orta konsantre fosforlu bileşiklerin analizi için 1H NMR göre daha uygundur. Ancak, 1H NMR sinyalleri ise ikinci, diğer fosforilatlanmamış bileşiklerinden 1H NMR sinyallerinin tarafından gizlenmiş edilebilirAçıkçası 31P NMR spektrumlarda arka plan sinyallerini neden olmaz. 13C NMR özel durum neredeyse sadece ilgi ise analog durumda, 19 NMR analizi, florlanmış bileşikler, örneğin, florinlenmiş ilaçlar (endojen metabolit herhangi bir arka plan sinyalleri) için tercih edilecek ise 13 C kaderi Eksojen etiketli metabolik ön yüzünden 13 C izotopu (yaklaşık% 1), son derece düşük bir doğal bolluğu, takip edilmelidir. Birçok kütle spektrometreleri da negatif iyon modunda ya pozitif iyon modunda ya da çalışır. Bu nedenle önümüzdeki iyonlar negatif veya pozitif yüklü hale gelen dikkat edilmesi olup analiz bilmek önemlidir. Bu yöntem örnek hazırlama a için gerekli (I) 'in zaman açısından düşük maliyetle önemli metabolit konsantrasyonları çok sayıda verir çünkü 1H ve31P NMR spektroskopi ile beyin dokusu metabolome analizi için bir protokol burada odaknd, (ii) bir çaba metabolit miktarının belirlenmesi için gerekli. Bütün deneyler, standart bir ıslak-kimya laboratuvar ekipman ve yüksek resolüsyon NMR spektroskopisi odası kullanılarak da gerçekleştirilebilir. Bundan başka değişiklikler aşağıdaki protokol kısmında açıklanmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: HAYVAN ETİK BEYANI
Sıçanlarda Hayvan çalışmaları Fransa'da geçerli yönergeleri takip ve Yerel Etik Kurulu (# 40.04, Aix-Marseille Üniversitesi Tıp Fakültesi, Marsilya, Fransa) tarafından onaylanmıştır.
1. Hasat ve Rat Beyin Donma
- Gerekli öğeleri hazırlayın: Sıvı azot (N 2liq.) Dewar bir dondurma kelepçe (en azından 2-3 L hacim) tutmak için yeterince büyük olduğunu; anestetik (örneğin, izofluran, ya da, ketamin / ksilazin); anestezi bölmesi; Steril diseksiyon araçları: cerrahi makas, neşter, forseps; doku mendil ve alkol (etanol) temizliği ile şişe; iğneler (25 g); 1 ve 10 ml şırıngalar. Yapışkan bant ile etiket alüminyum levhalar (yaklaşık 10 x 10 cm). Bireysel donuk-kenetli sıçan beyinleri sarmak için yapraklarını kullanın.
NOT: Sıvı azot tutarken her zaman koruyucu eldiven ve göz koruyucu gözlük takılmalıdır! - N 2liq ile Dewar doldurun. Ve ücretsiz yerBir Dewar vınlama kelepçe. Dewar N 2liq miktarı, tekrarlanan donma-kelepçe işlem için yeterli olduğundan emin olun (birkaç litre, her dondurarak toplanma esnasında buharlaşan K 2liq miktarı kelepçenin boyutuna bağlıdır).
- (Izofloran ile, örneğin, ya bir ketamin / ksilazin karışımın peritoneal içi enjeksiyon ile) hayvan anestezisi. Kafa derisi kaldırılır ve kafatası açıldığında kanamayı önlemek için kalp ponksiyonu ile ötanazi geçin. Adımlar 1.4-1.7 aşağıdaki Bu standart prosedürü açıklar.
NOT: huni-dondurma N ile anestezi hayvanın beyin glikoz ve yüksek enerjili metabolitler, kurban sıçan maksimum korunmasını gerektiren özel protokollerde kafa derisi geri çekilmeden sonra, 11 2liq. Sonra, otopsi metabolizmasını 12 aza indirmek için aralıklı N 2liq altında kafatası dışarı beynini incelemek. - Alkol temizliği ile sıçan başını nemlendirin. (I) rem cerrahi makas kullanınove kafa derisi, kafatası ve dikişler boyunca (ii) açık kafatası.
- Daha kafatasını açmak için forseps kullanın ve baş aşağı kafa konumlandırma, açık kafatası altından tüm beyin kaldırmak için. Hızlı doku mendil kullanarak herhangi bir kan izlerini çıkarın. Beyin hemisfer metabolik ve morfolojik simetrik iseniz, neşter ile kesi ile diğer yarımkürede ayıran sonra metabolik analiz için yarıkürelerinin birini kullanmak daha uygun olur. Gerekirse, bu histoloji gibi diğer beyin çalışmalar için kalan yarımkürede kullanın.
- Çabuk kaldırmak Dewar N 2liq gelen kelepçe -filled dondurma, bir iç yüzeyi, kelepçe üzerine tüm veya yarım sıçan beyin yerleştirin ve hemen N 2liq içine kelepçe dondurma yerleştirin sıkıca sıkıştırılmış kelepçe tutarken Dewar -filled. O 1.3-1.6 60 saniye daha uzun sürer adımları emin olun.
- Dewar, açık kelepçe 1-2 dk kaldır dondurma kelepçe sonra, dondurulmuş beyin kelepçe doku ve şal gevşetinşekilde etiketlenmiş alüminyum levha dondurulmuş doku (yukarıda 1.1). Etiket okunaklı ve numune sarılır sonra sıkıca kalır emin olun. Hızla N 2liq sarılı örnek yerleştirin. Dondurulmuş beyin dokusu çözülme önlemek için mümkün olduğunca çabuk tüm prosedürü uygulayın.
- K 2liq bölgesi veya metabolit ekstre kadar -80 ° C'de bir dondurucuda donmuş numune saklayın.
Not: bir biyolojik numune birden fazla yıl boyunca saklanabilir olduğunda, K 2liq sıcaklıkta depolama -80 ° C den daha çok tercih edilir. Bu da bu protokolün kalanı için de geçerlidir.
Metabolizma Ekstraksiyon Usulü 2. Hazırlık
- Doku homojenleştirici ve uygun test tüpleri (, genelde plastikten yapılan bir homojenleştirici şaftının çapına bağlı olarak, örneğin, 10 mm iç çap) hazırlayın. Elektrik homojenizatörlerinin ziyade elle tahrik homojenizatörlerinin (doku öğütücüler) kullanın. Önvortexer ve laboratuvar dengesini pare.
- Ezilmiş buz dolu kova hazırlayın. Buz (4 mi 250-350 mg dondurulmuş beyin doku başına her biri) ile, metanol, kloroform ve su arasında yeterli quantitites tutun.
- Transferi pipetler ve şişeleri hazırlayın.
- Cam buz üzerinde vidalı kapakları ve yer ile şişeleri (≥20 ml hacim) (doku özü başına bir flakon) hazırlayın. Fit vida kloroform dayanıklı Teflon septumlarla bereler.
- Kloroform, metanol ve dağıtmak için su ve cam pipetler ya da şırıngalar Hamilton dağıtmak için 5 mi plastik pipet hazırlayın. Doku homojenatı ve metanol karışımları aktarılması için ilave bir plastik pipet (5 veya 10 ml hacim) hazırlayın.
- Tüm emin cam damıtılmış su ile iyice durulanmış ve dikkatli bir şekilde küçük miktarda yabancı maddeler, özellikle NMR tespit format ve asetat giderilmiş, kullanılmadan önce kurutuldu olduğundan emin olun.
- Harç N 2liq, yer porselen havan tokmağı ile porselen havan doldurun ve N 2l ile dolduruniq. Havan ve tokmak sıcaklığı yeterince düşük olana kadar azot buharlaşır. Harç N 2liq az miktarda tutunuz.
METABOLİTLERİN 3. Ekstraksiyon
- Depolama (N 2liq tank veya -80 ° C derin dondurucuda) dondurulmuş beyin doku örneği kaldırmak. Daha sonra, hemen N 2liq kısmen doldurulmuş bir harç doku örneği aktarın.
- Kolayca doku homojenizasyon için kullanılan test tüpleri içine sığacak küçük parçalar halinde dondurulmuş beyin dokusu kırmak için N 2liq Soğuk havan tokmağı kullanarak. , Süreç içinde harcın dışarı yansıtılan dondurulmuş doku parçalarını engellemek hala alüminyum levha sarılı olurken doku kırmak için. Bu test tüpü daha zor (Su yoğunlaşması riski) transfer yapmak gibi toz dondurulmuş doku eziyet etmeyin. ÖNEMLİ: bütün prosedür boyunca, derin dondurulmuş örneği tutmak için gerekli harç N 2liq ekleyin.
- Mix sİyice dondurulmuş beyin dokusu merkezi parçalar, 250-350 mg tartılır ve buz soğukluğunda metanol (250-350 mg beyin dokusu boyunca 4 mi) ile dolu bir deney tüpüne aktarılır. Dondurulmuş doku parçaları her zaman doku homojenleştirici ile homojenize, sözkonusu ilave edilir.
NOT: numune ağırlığının hesaplanmasına yol açar ve numunenin (ii) ısıtma ve çözme olurdu numune üzerinde önemli su yoğunlaşmasını (i) kaçınmak için hızlı tüm bu yordamı tamamlayın. Bağımsız doku parçaları homojen hale getirme işleminin başlangıcında donmuş bir halde olması gerekir. - Donmuş sıçan beyin numunesinden son parçası test tüpüne homojenize eklenmiş sonra, ≥20 ml hacimli bir cam şişe, mevcut vidalı kapağa Homojenat transferi ve 15 dakika boyunca buz üzerinde bekletilir. Test tüpünün hacmi ≥4 ml metanol için yeterince büyük değilse, için karışımın transfer dondurulmuş beyin dokusu homojenize bir parçası için daha küçük bir metanol hacmi kullanınCam şişe ve taze metanol ile kalan doku parçaları homojenize devam etmektedir. Toplam metanol hacmi 250-350 mg beyin dokusu başına 4 mi olduğundan emin olun.
- İyice homojenat, girdaba buzla soğutulmuş kloroform (örneğin, 250-350 mg beyin dokusu başına 4 mi) aynı hacimde eklenir ve 15 dakika boyunca buz üzerinde bekletilir.
NOT: özellikle kloroform, uçucu solventler tutarken her zaman havalandırılmış kimyasal kaputu kullanın! - Su aynı hacimde ekleme (örneğin, 250-350 mg beyin doku başına 4 mi) homojenat, girdaba iyice ve -20 ° C sıcaklıkta gece boyunca bekletildi.
Faz Ayırma ve Solvent Buharlaşma 4. hazırlanması
- Soğuk santrifüj (4 ° C, maksimum yarıçap 13.000 xg) ve santrifüj tüplerini hazırlayın. Kloroformda dirençli ≥20 ml hacim vardır ve 13,000 x g santrifüj kuvvetlerine dayanabilmesini sağlamak. Olmak damıtılmış su ile özel cam santrifüj tüplerini kullanın ama (bütün cam eşya gibi) durulamaön kullanım (2.3).
- Iyice durulanır cam Pasteur pipetler ve uygun bir propipettor hazırlayın (ampul, manuel pipet pompası, otomatik pipet yardımı / pipeti, vb.).
- (Cam veya teflon), kloroform dayanıklı olması gerekir ki, bir beyin ve numune başına iki ek tüp iyice çalkalandı (≥15 ml hacim), metanol (ya da cam dayanıklı plastikten yapılmış), metanol diğer bir hazırlayın.
- (Ticari olarak temin edilebilir ya da homebuilt) çözücü buharlaştırma aparatı hazırlayın. Bu cihaz, uçucu çözücüler (metanol, kloroform) ihtiva eden bir ekstre çözeltisinin yüzeyine doğru yönlendirilir, kuru bir nitrojen gazı son derece kontrollü akışını sağlar emin olun.
- Buz dolu iki ek tepsileri veya kova hazırlayın: bir örnek buz üzerinde taşıma, ve buharlaşma esnasında soğuk örnekleri tutmak için başka biri için.
- , Liyofilizasyon için gerekli dondurarak kurutucunun (dondurarak-kurutucu) ve malzemelerin hazırlanması: (i) bir 50ml santrifüj tüpüne ya da vakum yuvarlak tabanlı bir şişe başına özü, ve (ii) K 2liq numune sulu fazın (numune başına ≤0.3 L), dondurulur. Santrifüj tüpü kullanıldığı takdirde, aynı zamanda liyofilizatör için müsait geniş boyunlu bir vakum filtre şişesi hazırlayın.
5. Faz Ayırma ve Solvent Buharlaşma
- Tam faz ayrılması için 13,000 x g'da bir kloroform-dirençli bir santrifüj tüpüne (≥20 ml hacim) ve santrifüj (3.6) metanol / kloroform / su / beyin dokusu Homojenat transferi ve 40 dakika boyunca 4 ° C'de.
Not: iki faz çöken protein, bir katman ile ayrılmış oluşturacaktır. Üst (açık) faz, su, metanol ve çözünmüş suda çözünür metabolitlerin yapı göstermiştir düşük (ağır) faz, metanol, kloroform ve eritilmiş lipid içerir. - Uygun bir ≥15 ml tüp (metanol dirençli plastik veya cam) için üst faz transfer etmek için bir Pasteur pipeti kullanılır. I devamce.
- Uygun bir ≥15 ml tüp (cam ya da Teflon) için alt faz transfer etmek için yeni bir Pasteur pipeti kullanarak. Buz üzerinde tutun.
- Toplam proteinin belirlenmesi için kullanılacak ise, -80 ° C de çökelmiş protein tabakası saklayın; ya da başka atın.
- Buz üzerinde su / metanol fazı (5.2) ile birlikte tüpü tutmak ve ekstrakt çözeltisinin yüzeyi üzerine, kuru bir azot akımının yönlendirilmesi ile metanol buharlaştırılır. Seçenek olarak, özüt çözeltisi içinden kabarcık yavaşça azot. Nitrojen kabarması, artık ekstrakt çözeltisi hacmi düşüşe neden olduğu buharlaştırma işlemini iptal eder. Şu anda, liyofilizasyon ile devam eder (5.7), ya da dondurarak ve tüp kapatılmış liyofilizasyon için kadar (vidalı kapak veya Parafilm ™), -80 ° C'de örnek hazır tutar.
- Buz üzerinde metanol / kloroform faz (5.3) ile tüp yerleştirin ve su'nun üzerine bir kuru azot akışı yönlendirerek metanol buharlaşmasıEkstre çözeltisi rface. Tüm çözücü buharlaştırılmış, işlemi sona erdirmek ve tüp kapatılmış NMR analizi için hazır oluncaya kadar (vidalı kapak veya Parafilm ™), -80 ° C'de örnek tutun.
- Liyofilizasyon için sulu faz hazırlanır
- Metanol buharlaştırma işleminin sonunda (5.5) sonra, iyice durulandı, 50 ml bir santrifüj tüpüne örnek aktarmak (örnek donmuş ise, çözülme aktarım işlemi). Alternatif olarak, manyetik olarak karıştırılan bir vakuma aktarılır.
- Kısmen tüp veya şişenin iç yüzeyi kademeli dondurulmuş, sıvı tarafından örtülecek kadar K 2liq eklenir santrifüj tüpü (ya da yuvarlak bir şişeye) çevirerek özüt çözeltisi dondurun. Emin hayır N 2liq olun. Yuvasını girebilirsiniz.
- Bütün sıvı donduğunda buhar çıkışına imkan vermek için bir kapak veya delinmiş vidalı kapaklı tüp kapak ve geniş boyunlu bir şişede vakum filtre tüpü yerleştirin.
- Atta liyofilizasyondan sonra Başlangıçching dondurarak kurutma için şişe veya şişe.
- Numune tamamen kuruduktan sonra liyofilizasyon işlemi iptal eder. Kapalı bir tüp içinde -80 ° C'de örnek tutun (sıkı bir kapaklı!) NMR analizi için kullanılana kadar.
NOT: Genellikle en fazla 24 saat iyofilleşme ihtiyaç vardır. Çeşitli örnekler liyofilizatör tasarımına bağlı olarak, aynı zamanda liyofilize, geniş boyunlu yuvarlak tabanlı bir şişe veya şişeler içinde santrifüj tüpleri kullanılmaktadır konusunda edilebilir.
NMR örnekleri 6. hazırlanması
- Mağaza kurutuldu ve çok düşük bir sıcaklıkta liyofilize ekstreleri (≤-80 ° C). NMR hemen önce deney NMR numunelerin hazırlanması için liyofilizatlar yeniden çözülür.
Not: çözeltisi ve / veya oda sıcaklığı civarında numune numune saklama düşmesine neden olabilir! - Aşağıdaki gibi, kenetleme maddesi, trans-1,2-cyclohexyldiaminetetraacetic asit (CDTA) sulu 200 mM'lik çözelti hazırlayın:
- Bir test tüpü veya bir santrifüj tüpüne saf su (örneğin, 20 mi) ilave edilir ve 200 mM'lik bir çözelti oluşturmak için gerekli olan CDTA toz miktarını ekleyin.
Not: CDTA asit formu CDTA tuz yerine kullanılmıştır çünkü pH değeri çok düşük olması nedeniyle CDTA önemli bir kısmı, çözünür olmayacaktır. - Dikkatlice ilave CDTA çözeltisine CsOH tozu artan miktarlarda, adım adım ve iyice vorteks her ilaveden sonra.
Not: Çözünür CDTA fraksiyon, sulu çözelti içinde CsOH içeriği arttıkça artacaktır. Yani CDTA çözeltisine CsOH bir stoykiometrik miktarından daha az ekle "overtitration" kaçının. - Neredeyse bütün CDTA toz eritilir, her ek CsOH ve tam bir vorteks sonra pH derecesi ölçülerek başlar. Nihai pH (Tablo 1) ulaşıldığında CsOH ilave sona erdirebilir.
NOT: Bu anda, tüm CDTA eritilecektir. CDTA için bir karşı iyon olarak Cs + `nin kullanımı olup Jeneratörortağı, Na + veya K + fazla tercih edilir. Daha küçük iyonik yarıçapına sahiptir ve sert asitlerdir, Na + ve K + 'ya karşı Cs +, geniş iyonlu yarıçapı nedeniyle yumuşak bir Lewis asididir. Sonuç olarak, Cs + form fosfatlar (sert bazlar) ile kompleksler daha az kolaylıkla Na + ve K +, yok. Kompleks, özellikle ara ürün iyon değişimi için yavaş koşulları altında, NMR Çizgi genişlikleri artırma eğilimi olduğundan, bu metabolitlerin fosforlu 31P NMR spektroskopisi için avantajlıdır.
- Bir test tüpü veya bir santrifüj tüpüne saf su (örneğin, 20 mi) ilave edilir ve 200 mM'lik bir çözelti oluşturmak için gerekli olan CDTA toz miktarını ekleyin.
- 31P NMR fosfolipid analizi (PL) için, lipitler, kurutuldu (CDCI3) deuteratlanmış kloroform içeren bir çözelti maddesi karışımının 700 ul (5.6) çözülür, metanol ve tarif edildiği gibi hazırlanan CDTA çözelti, 6.2 (5: 4: 1 hacim oranında). Bir mikrosantrifüj tüp örnek aktarın. Direkt deplasman (veya pozitif-deplasman) mikropipet kullanın kloroform-karşıHer iki aşamada da karınca ipuçları.
NOT: Aşağıdaki parametrelerden herhangi değişen PL 31 P NMR spektrumları 13-17 görünümünü (kimyasal kayma ve çizgi genişlikleri) etkileyeceğini unutmayın:
(I) hacim oranı CDCI3: MeOH çözeltisi CDTA
(Ii) toplam çözücü hacmi kullanılan
Çözücünün sulu bileşen (iii) pH,
Çözücünün sulu bileşen (iv) CDTA konsantrasyonu.
NOT: Bu örnek parametrelerinin genel, ince ayar (Tablo 1) gerekli değildir, ve özel durumlarda istenirse çok dikkatli yapılmalıdır yılında. Çözücü arasındaki hacim oranının değiştirilmesi kolaylıkla iki aşamada yerine homojen bir faz içeren bir sistemin oluşumuyla sonuçlanan! Tek fazlı sistem pek çok uygulamada 13,14 iki fazlı bir sisteme göre daha kullanışlı olduğu bulunmuştur. - Suda çözünür metabolitlerin 1 * H NMR analizi için, içinde liyofilizatı (5.8) çözülür 700 ul döteryum oksit 3-(trimetilsilil) ihtiva eden (D 2 O)-propionik asit 2,2,3,3-d4-sodyum tuzu milimolar aralığında (TSPd 4), (D 2% 0.05 TSPd 4 ihtiva eden ticari olarak temin edilebilir Ç) . Bir mikrosantrifüj tüp örnek aktarın.
- Döteryum klorür (DCI) ve sodyum deuteroxide (NaOD) çözeltilerinin az miktarda (yaklaşık 2 | il) ilave edilerek 7.3 edilen sulu ekstre çözeltisinin pH ayarlayın. Öncelikle, 0.02 N DCI veya NaOD çözümleri ile başlar. 2 veya 3 sonraki eklemeler yeterli pH değişimine neden yoksa, 0.2 N DCI veya NaOD çözümleri ile devam ediyor. Overtitrate için dikkatli olun.
NOT: Gerekli DCI veya NaOD çözeltinin toplam miktarı, ekstre edilmiş beyin dokusunun miktarına bağlıdır; hassas metaboliti kantitasyonunu bu değeri not alın. Çoğu durumda ilave DCI ve NaOD çözeltilerinin bir arada hacimleri (NMR numune hacmi yakın şekilde% 1), hemen hemen yok denecek kadar azdır.
- En iyi sonuçları elde etmek için, (162 MHz 31 P veya 400 MHz 1H rezonans frekanslarının tekabül eden ≥9.4 Tesla alan gücü), bir çok çekirdekli yüksek çözünürlüklü NMR spektrometre kullanılır. 31P bobin yanı sıra, 31P NMR sistemi proton ayırmayla bir 1H bobin sahip olması. İstenen hedef değere (genellikle 25 ° C) NMR sonda ayarlayın sıcaklık ayarı.
NOT: Sonda sıcaklığı dengelemek için 10-20 dakika gerekebilir! - Santrifüj PL ekstre, 4 ° C de bir mikrosantrfuj tübünde çözeltisi (6.3) ve 30 dakika boyunca 11,000 x g, numunedeki katı artıkları aşağı doğru dönmeye. Yüksek kaliteli bir NMR tüpü (5 mm dış çap) 600 ul süpernatan aktarın.
- (MDP) çözümü kimyasal kayma referans için pH 7.0 sulu 20 mM metilendifosfonat dolu uygun koaksiyel uç kök hazırlayınve kantitasyon. PL ekstrakt çözeltisi ile doldurulmuş NMR tüpü içinde bu ekleme yerleştirin.
- NMR mıknatısa uygun döndürücü ve transferi ile NMR tüpü takın. Şimdi 15-20 Hz örnek dönmeye ve örnek ayarlanan sıcaklık (yaklaşık 10 dakika) ayarlanabilir kadar bekleyin.
- Dikkatle şim bobin akımları 18 ekseni ve off-eksen ayarlayarak numûnesindeki manyetik alan homojen olmayan minimize.
- Bir manyetik alan gücü (9.4 tesla için, tavsiye edilen parametre değerleri için Tablo 1 'e bakınız) bir fonksiyonu olarak değişebilir optimum değerlere NMR spektrum elde etme parametrelerini ayarlar.
- Deneyin (= NS) başına geçici Set sayısı.
- Ancak en yaygın PL hassas ile hesaplanır edilmesi durumunda yaklaşık 80 (verilerin elde edilmesi yaklaşık 20 dakika toplam süresi) NS ayarlayın (fosfatidilkolin (PtdCho), fosfatidiletanolamin (PtdEtn), etanolamin, plazmalojen).
- D yaklaşık 100-200 (toplam süresi NS Setata alıcı 1-2 saat) (alkil-asil-fosfatidilkolin, fosfatidilinositol, fosfatidilserin, fosfatidik asit) kantifiye edilmesi, daha az konsantre PL ise.
- Yaklaşık 1,500-2,000 kadar ayarlayın NS (veri toplama, 7-10 saat arasında toplam süresi gece boyunca deneyi) çok düşük konsantrasyon PL kantifiye edilmesi durumunda, örneğin, mono ve fosfatidilinositol difosfat (PtdIP ve PtdIP 2), kardiyolipin, lizo-PL , alkil-asil-fosfatidiletanolamin ve bazen diğerleri.
- Spektrum elde edilmesi, iyileştirilmiş işlem parametreleri kullanılarak serbest indüksiyon bozulması (FID) 'nin sona ermesinden sonra. Manyetik alan kuvveti, ayar kalitesi ve PL sinyalinin bir fonksiyonu olarak ölçülebilir, bu parametrelerin değerleri değişir.
- Işleme birden kullanarak (en az iki) farklı filtreleme işlemlerini tekrarlayın, PL tüm aralığı için en iyi sonuçları elde etmek için. , Şiddetle örtüşen sinyaller için güçlü kararlılık geliştirmesini kullanın, örneğin., PtdCho ve PtdEtn içinbölgeleri.
- Zayıf sinyaller güçlü filtreleme (zayıf ya da hiç çözünürlük artışı) kullanın.
- Sinyal-gürültü oranını, örneğin, PtdIP ve PtdIP 2 geliştirmek için önemli miktarda apodization üst üste (ör: LB = 3Hz) olmadan çok zayıf, geniş sinyaller Filtre. Karakteristik işleme parametreleri için Tablo 1'e bakınız.
- Aynı spektrumda referans bileşiği (MDP) 'de sinyal altında alana göre her PL sinyalin alanını ölçmek.
- ((I) bilinen bir konsantrasyonda bir fosfor bileşiği ve PL 31P NMR deneylerinde kullanılan (ii) aynı eksenli uç sapı ile doldurulmuş bir 5 mm'lik NMR tüpü kullanılarak bir deneyde referans bileşik (MDP) 'sinyalini kalibre görmek 7.3 ve 7.9).
- Bir yandan (7.9) üzerine PL sinyallerin göreli alanlarına göre bireysel PL konsantrasyonları hesaplayın, ve gelen MDP için elde kalibrasyon değeridiğer koaksiyel insert (7.10). Belirli bir 31P NMR sinyalinin katkıda fosfor çekirdeklerin sayısı, bu sinyalin moleküler kökenli bir fonksiyonu olarak değişebilir dikkate alın.
NOT: kardiyopilin fosfat sinyalini yaptığı gibi MDP fosfonat sinyali (genellikle 19.39 ppm başvurulan), iki fosfor çekirdekleri temsil eder. Beyin ekstreleri içinde tespit edilen tüm diğer PL 31P NMR sinyalleri bir fosfor çekirdeği, her temsil eder. - Hayvan grupları arasındaki beyin PL düzeylerini karşılaştırmak için gerektiği gibi istatistik yazılımı kullanın.
Beyin Metabolitler Suda çözünür Analizi için 1H NMR Deneyi 8. Performans
- İstenen hedef değere (genellikle 25 ° C) 1H NMR sonda ayarlayın sıcaklık ayarı. Ayrıca bkz 7.1 belirtiyor.
- 4 ° C ve 11000 de mikrosantrifüj tüpüne (6.5), sulu ekstre çözeltisi santrifüj30 dakika boyunca x g, numunedeki katı artıkları aşağı doğru dönmeye. Yüksek kaliteli bir NMR tüpü (5 mm dış çap) 600 ul süpernatan aktarın.
- NMR mıknatıs, pabucun ve 7,4-7,6 açıklandığı gibi uygun değerlere ayarlanır NMR spektrum satın alma parametreleri Transfer NMR tüpü. Önerilen parametre değerleri için ayrıca Tablo 1'e bakınız.
- NS 32 (veri toplama yaklaşık 13 dk toplam süresini) = yaklaşık deney başına Transientlerin sayısını ayarlayın. Özellikle aromatik bölgede, çok zayıf sinyaller için iyi sinyal-gürültü oranları elde etmek için, NS veya daha fazla 64 (veri toplama yaklaşık 26 dk toplam süresini) = kullanın.
- Spektrum elde edilmesi, iyileştirilmiş işlem parametreleri kullanılarak serbest indüksiyon bozulması (FID) 'nin sona ermesinden sonra. Manyetik alan kuvveti, ayar kalitesi ve metabolit sinyalinin bir fonksiyonu olarak ölçülebilir, bu parametrelerin değerleri biraz değişebilir.
NOT: Bir çok durumda, bir kez, her bir spektrum işlemek için yeterlidir, Tüm sinyaller için metabolit iyi bir denge gösteren işlem parametreleri kullanılarak bir dizi. Karakteristik işleme parametreleri için Tablo 1'e bakınız. - Aynı spektrumda referans bileşiği (TSP-d4) sinyaline altındaki alana göre (bazen farklı moleküllerden sonucu diğer tekli ya da çoklu ile üst üste, genellikle çoklu), her bir metabolit sinyalin alanını ölçmek.
- TSP-d 4 konsantrasyonuna dayanan bireysel metaboliti konsantrasyonları (6.4) hesaplayın. Belirli 1H NMR sinyalinin katkıda proton sayısı, bu sinyalin moleküler kökenli bir fonksiyonu olarak değişebilir dikkate alın. (0.0 ppm başvurulan) TSP-d 4 trimetil sinyal dokuz protonları temsil eder.
- Hayvan grupları arasındaki beyin metabolit düzeylerini karşılaştırmak için gerektiği gibi istatistik yazılımı kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Özü çözümler mevcut: beyin ve diğer doku özleri metabolik NMR spektrumları iyi çözünürlük elde etmek için, uzun kaldırmak veya (paramanyetik iyonlar en önemlisi) maske metal iyonları yaygın bir uygulama olmuştur. Bu, ya da Chelex-100 20 gibi bir iyon alışveriş reçinesi ile özü geçirilerek, ekstre 19, EDTA veya CDTA gibi bir kenetleme maddesinin ilave edilmesi yoluyla elde edilmiştir. Şekil 1'de sunulan sonuçlar, beyin ekstreleri dikkatli bir şekilde, yukarıdaki protokole göre hazırlanmaktadır Bu adım, 1H NMR spektroskopik analizi için gerekli olmadığını göstermektedir. Burada, son derece dar spektral hatları analiz tüm spektral bölgelerden elde edildi. Hatta glutamin / glutamat ve miyo-Inositol-/ glisin için çok kalabalık bölgelerde, örneğin, içinde, <0.01 ppm bir mesafede tepe değeri yaklaşık 400 MHz (Şekil 1, alt) tamamen ayrılabilir. Bunun bir sonucu olarak, nitelikselve Şekil 1 'deki orta ve alt panellerdeki görülebilir, çok sayıda küçük, ancak şu anda atanmamış tepe kantitatif analiz gelecekte düşünülebilir.
Şekil, bir dişi Lewis sıçanın beyin dokusu ekstraktı sulu fazın tipik 1H NMR spektrum (400 MHz) 1. Alt bölgeler. Üç panel son derece yüksek bir çözünürlük elde Bu çalışmada sunulan protokol kullanılarak göstermektedir. Ne kenetleme maddesi veya bir iyon değişim reçinesi, örnek hazırlama sırasında kullanılmıştır. Merkezi ve alt paneller optimize deneysel parametreleri kullanılarak yapılır eğer doku özleri yüksek çözünürlüklü 1 NMR spektroskopi ile kaplı büyük bir dinamik aralık ipucu birçok atanmamış düşük yoğunluklu zirvelerin varlığını göstermektedir. Bu zayıf ama iyisaptanabilir sinyaller potansiyel tespit ve gelecekte belirlenebilir. Birkaç tespit metabolitler, beyin dokusunun özgü, örneğin NAA nöron işaretleyici ya da nörotransmiter GABA.; Bununla birlikte, pek çok bileşik bu tür bir amino asit, dallı zincirli bir organik asit, bir poliol, (fosfo) ve lipit enerji metabolizması gibi glikoliz ve glutaminolysis olarak, ve memeli hücreleri için ortak olan metabolik yollar, çok geniş bir yelpazede katılmaktadırlar Bu Osmoregülasyon, hücre büyümesi ve proliferasyonu olarak görev yapar. Yıldız işareti bir metanol kirlilikten kaynaklanan metil rezonans gösterir. Kısaltmalar: Ala, alanin; lak, laktat; treo, treonin; BHB, β-hidroksibutirat; val, valin; ile, izolösin; leu, lösin; AAB, α-aminobütirat; AHB, α-hidroksibutirat; Tau, taurin, scy -eklentileri, scyllo-Inositol-; myo -eklentileri, miyo-Inositol-; GPC, Glycerophosphocholine; PC, fosfokolin; CHO, kolin; CRN, kreatinin; , Kreatin Cr; GABA47; -aminobutirat; asp, aspartat; NAA, N -acetylaspartate; Gln, Glutamin; Glu, glutamat; , suc sukinat; NANA, N -acetylneuraminate; AC, asetat; Giy, glisin. Laktat 13C uydu dublet (üst panel) için kök ala çifti tabanında küçük bir tepe noktasını gösterir. Creative Commons Attribution Lisansı altında yayımlanmaktadır (Ccal) Lutz KB ark deneysel otoimmün ensefalomiyelitin ve adjuvan artrit (2013) Serebral biyokimyasal yollar dan terimler:. Karşılaştırmalı metabolomic çalışmada. PLoS ONE 8 (2):. E56101 bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
31P NMR spektroskopisi olarak, paramanyetik katyonları (çoğunlukla demir) maskeleme veya kaldırma fosfatlar kolayca iki değerlikli ve üç değerlikli iyonları ile kompleksler oluşturmak için bir zorunluluk tartışmasız. Ekstrelerine CDtA eklenmesi hem spektral çizgi genişlikleri etkilerd kimyasal kaymalar; Şekil 2, üst ve alt sol karşılaştırın. MM (sol altta) 1,000 mM seçerek yerine 200 Çizgi darlık (sol üst) CDTA istenen, ancak (sol üst) ayrı ayrı yüklenmesi gerekir PL sinyallerin süperpozisyon sonuçlanmıştır. Bu nedenle, 200 mM CDTA PL çözücünün sulu bileşen için tavsiye edilir, diğer tüm şartlar eşittir. Ayrıca, ölçüm sırasında numune sıcaklık spektral çizgi genişlikleri ve kimyasal vardiya etkiler; Şekil 2, üst ve alt hakkına karşılaştırın. Yerine 297 K (sağ üst) (sağ alt) 277 K seçerek Çizgi daralması istenen, ancak (sağ üst) ayrı ayrı yüklenmesi gerekir PL sinyallerin süperpozisyon sonuçlanmıştır. Bu nedenle, 297 K, ölçüm sıcaklığı olarak tavsiye edilmektedir, diğer tüm şartlar eşittir. Iki üst paneller arasında karşılaştırma gösteriyor ki 50 mM (sağ üst) Sadece sonuçlanan 200 mM (sol üstte) gelen CDTA konsantrasyonunda bir azalmadoğrultusunda küçük bir artış genişliği ve kimyasal kaymalar neredeyse hiç değişiklik halinde gösterebilir. Bununla birlikte, sağ üst panel 13 içinde nispeten dar hatlarını açıklayan, 200 mM CDTA özü olduğu gibi, 50 mM CDTA, ekstre içindeki doku konsantrasyonu, yarısı kadar yüksek olduğuna dikkat ediniz.
Şekil 2. Fosfatidiletanolamin (PtdE) dişi Lewis farelerin beyin doku özlerinin fosfolipid 31 P NMR spektrumları (162 MHz) (Üst sol panel) Beyin dokusu konsantrasyonu bölgeleri, 236 mg / ml.; CDTA konsantrasyonu ve çözücünün sulu bileşen pH, 200 mM ve 7.33; Ölçüm sıcaklığı 297 K. PtdE plazma ve SM sinyalleri iyi çözümlenir (Sol alt) Beyin doku konsantrasyonu, 236 mg / ml.; CDTA konsanntration ve çözücünün sulu bileşen pH, 1.000 mM ve 7.36; Ölçüm sıcaklığı 297 K. PtdE plazma ve SM işaretleri tamamen örtüşüyor; Onlar sol üst spektrumu ile karşılaştırıldığında, düşük hat genişliği rağmen çözülemiyor (Sağ üst) Beyin doku konsantrasyonu, 118 mg / ml.; CDTA konsantrasyonu ve çözücünün sulu bileşen pH, 50 mM ve 7.14; Ölçüm sıcaklığı 297 K. PtdE ve SM sinyalleri iyi çözümlenir (Sağ alt) Beyin doku konsantrasyonu, 118 mg / ml.; CDTA konsantrasyonu ve çözücünün sulu bileşen pH, 50 mM ve 7.14; Ölçüm sıcaklığı 277 K. PtdE ve SM işaretleri tamamen örtüşüyor; Onlar sağ üst spektrumu ile karşılaştırıldığında azaltılmış çizgi genişliği rağmen çözülemez. Kısaltmalar: PtdE plazma, etanolamin plazmalojen; PtdE, fosfatidiletanolamin; SM, sfingomiyelin; PtdS, phosphatidylserine; PTDC, fosfatidilkolin. Lutz NW vd. (2010) ham doku özleri fosfolipid 31 P NMR spektroskopik analizi multiparametrik optimizasyonu izni ile yayımlanmaktadır. 1. Kimyasal kayma ve sinyal ayırma. Anal Chem 82 (13): 5433-5440. Copyright 2010 American Chemical Society. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Yukarıdaki protokol (tek fazlı sistem 14, Şekil 3, sol üst) kullanılarak önemli bir konsantrasyon aralığını kapsayan, ölçülebilir PL, çok sayıda tespit edilmiştir (Şekil 3, üst sağ) (kesik yüksek yoğunlukta sinyaller dikkat edin). Bu sinyallerin bazıları (U1, U2, U6) henüz atanmamış vardır. Bu protokolde belirtildiği gibi numune hazırlama, NMR ölçümü ve spektrum işleme yapılırsa, spektral çözünürlük rutin d bile yeterlidirBazı tepe kısmi bölünmesini etect (PtdS, PtdE, PtdE plazma, AAPtdE; sol alt). . PtdC1u, PL türetilmiş: Sonuç, nitel ve gelecekte öngörülebilir başka PL alt gruplarının kantitatif analizi gibi 3, sağ altta Şekil, kısmen burada düşük konsantrasyon bileşiklerin (ayrı sinyalleri sağduyulu seçilmiş işleme parametrelerinin gücünü göstermektedir rezonansa tam tespit değil PTDC ve PTDC plasm) burada çok güçlü sinyallere (yakın: PTDC).
Dişi Lewis farelerine beyin Doku özütlerinin Şekil 3. fosfolipid 31P NMR spektroskopisi (162 MHz). (Üst sol panel) bir tek fazlı sistem (solda), iki fazlı bir sistemi (sağ) göre tercih edilmiştir. Yaygın olarak kullanılan iki fazlı sistem, doğru engellemektedirÜst fazın en bobinin duyarlı hacmi dışında bulunan, çünkü PL niceleme. (En sağ panel) Sıçan beyni komple 31P NMR PL spektrumu. Zayıf sinyaller (PtdIP, PtdG), üstel hat genişlemesi (LB = 3 Hz) daha iyi görüş için uygulandı. Bu temsilde, birkaç PL sinyalleri özellikle PTDC ve PtdE bölgelerde, iyi bir çözüme değildir. Birden fazla 31P NMR sinyalinin üretilmesi ve PL için, gözlenen çekirdek (p tdIP, PtdI P, tdIP 2, PtdI p 2) altı çizilmiştir. Önceki atanmamış sinyalleri bir "U n" (ki buradaki n = 1, 2,, ...). Aynı spektrum (alt, sol panel) ve PtdE PtdS bölgeleri ile gösterilmiştir. Daha iyi pik çözünürlüğü için, Lorentz-Gauss satır şekli dönüşüm uygulandı (LB = -1 Hz, GB = 0.3). Çünkü bu işlem parametrelerinin, birçok çok zayıf PL sinyalleri algılamak zordur. Ancak, en az iki adet tepe noktası olabilirPtdE bölgesi olarak temelde aynı işlem parametreleri ile elde edilen her PtdE, PtdE plazma, AAPtdE ve PtdS. (Alt sağ panel) PTDC bölge için ayırt edilmesi. Bunlar üstel hattı genişlemesi (AAPtdC, PTDC plazmada, PtdC1u) oluşturulacak üst spektrumunda ayırt edilemez ise görünen PTDC rezonans tabanında bazı sinyaller, net bir şekilde tespit edildi. Şu anda atanmamış PTDC analog Bunun yanı sıra, PtdC1u, daha küçük rezonanslar PTDC ikinci yukarı alana mevcut olabilir. Kısaltmalar: PtdIP, fosfatidilinositol fosfat; PtdIP 2, fosfatidilinositol difosfat; PTDA, fosfatidik asit; PtdG, fosfatidilgliserol; CL, kardiyolipin; PtdE .. PtdE, PtdE plazmada ve AAPtdE toplamı; PtdI, fosfatidilinositol. Ayrıca kısaltmalar efsane için bakınız Şekil 2. Lutz NW ark izni ile yayımlanmaktadır. (2010) phospholipi 31 P NMR spektroskopik analizi multiparametrik optimizasyonuHam doku özlerinde DS. 1. Kimyasal kayma ve sinyal ayırma. Anal Chem 82 (13): 5433-5440. Copyright 2010 American Chemical Society. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| Hasat ve Rat Beyin Donma | |||
| N 2liq için Dewar.; Kelepçeyi dondurma (örneğin, ev yapımı Wollenberger maşa, refs 1 ve 2, tablonun alt.); anestezi bölmesi; cerrahi makas; neşter; Temizleme alkol ile 500 ml şişe | Her biri 1 | ||
| Forseps | 2 | ||
| 1 ml'lik şırınga, 10 mi şırınga | Her bir hayvan için 1 | ||
| 25 G iğneler | Hayvan başına 2 | ||
| Örnek Prepartirme | |||
| Ekstraksiyon başına beyin dokusu miktarı, tipik | 250-350 mg | ||
| 350 mg beyin dokusu - MeOH hacim Homojenizasyon 250 kullanılır | 4 mi | ||
| 5 ml'lik plastik pipet | Özü başına 3 | ||
| 10 ml plastik pipet | Özü başına 1 | ||
| Cam tüp (≥20 ml hacim) | Özü başına 1 | ||
| Kloroform dayanıklı santrifüj tüpü | Özü başına 1 | ||
| MeOH doku homojenize edildikten sonra bekleme sürelerine (4 ° C 'de karışım) | 15 dakika | ||
| Su ve CHCI3 hacim 4 ml MeOH içinde homojenize beyin dokusunun eklendi | 4 mL | ||
| Su ve CHCI3 ile homojenize doku karıştırıldıktan sonra bekleme sürelerine (karışım, -20 ° C) | gecede | ||
| Ayırma için o SantrifügasyonOrganik özüt fazı (cam santrifüj tüpüne) F, sulu | 4 ° C'de 40 dakika boyunca 13,000 x g, | ||
| (Ekstre lipitler eritmek için bir çözücü karışımının sulu faz) CDTA çözeltisinin sıkıştırılması | 200 mM | ||
| Ekstre edilen lipidler eritmek için bir çözücü karışımının sulu fazının pH'si | 7.4 | ||
| Lipid lik hacim oranında bir 31P PL analizi için kullanılan solvent (CDCI3: MeOH çözeltisi CDTA) | 5: 4: 1 | ||
| 350 mg beyin dokusu - çözücü A miktarı 250 çıkarılan lipidlere çözmek üzere kullanılan | 700 ul | ||
| NMR numunesinin katı maddeleri aşağı iplik için santrifüjleme (mikro-tüp) | 4 ° C'de 30 dakika boyunca 11,000 x g, | ||
| suda çözünür metabolitlerin ihtiva NMR numunenin pH | 7.3 | ||
| Numune hacmi Santrifüj sonrasında NMR tüpüne aktarılmıştırugation | 600 ul | ||
| 31 P NMR koaksiyel uç kök MDP konsantrasyonu | 20 mM | ||
| NMR deneyleri | |||
| NMR deney sırasında numune sıcaklık (pik üst üste en aza indirmek için ayarlanması) | 25 ° C | ||
| NMR deney sırasında frekans Spinning | 15-20 Hz | ||
| 1H NMR tedarik parametreleri | |||
| 2H kilit sinyalinin temin Çözücü | D2O | ||
| Uyarma darbe genişliği, P1 | 11 mikro-saniye | ||
| Uyarma nabız, amplifikatör zayıflama, PL1 | 0 dB | ||
| FID boyut, TD | K 32 | ||
| FID edinimi time, AQ | 3.283 sn | ||
| Gevşeme gecikmesi, D1 | 15 san | ||
| Çözücü bastırma gecikme D4 | 6 sn | ||
| Toplam tekrar zamanı, TR | 24.3 sn | ||
| Ppm, SWP spektral genişliği | 12.47 ppm | ||
| Hz, SW spektral genişliği | 4,990 Hz | ||
| Alıcı kazanç, RG | 512 | ||
| Çözücü bastırma (sürekli dalga) | CW | ||
| Solvent bastırma, amplifikatör zayıflama, PL9 | 50 dB | ||
| Transientlerin sayısı, NS | 32 veya 64 | ||
| 31 P NMR Toplama Parametreleri | |||
| 2H kilit sinyalinin temin Çözücü | CDCI3 | ||
| Uyarma darbe wiDTH, P1 | 9,5 mikro saniye olduğu | ||
| Uyarma nabız, amplifikatör zayıflama, PL1 | 4 dB | ||
| FID boyut, TD | 16 k | ||
| FID kazanım zamanı, AQ | 2.019 sn | ||
| Gevşeme gecikmesi, D1 | 15 san | ||
| Toplam tekrar zamanı, TR | 17 sn | ||
| Ppm, SWP spektral genişliği | 25 ppm | ||
| Hz, SW spektral genişliği | 4.058 Hz | ||
| Alıcı kazanç, RG (maksimum) | 16.384 | ||
| Proton çift bozma gerçekleştirildi (bileşik darbe ayrıştırma) | SMG | ||
| Proton kopması, amplifikatör zayıflama, PL13 | 19 dB | ||
| Transientlerin sayısı, NS | 1.500 veya 2.000 | ||
| NMR Veri İşleme | 1 H Çözünürlük Geliştirme, Gauss-Lorentz olarak doğrusal Dönüşüm | ||
| Yelpazenin Genel değerlendirme (gerekirse, 0.1 <GB <0,4 ve -0,6 kullanarak, bireysel spektral bölgeler için ayrı ayrı optimize <LB <-0.2 Hz) | GB = 0.15, LB = -0.2 Hz | ||
| Çok zayıf sinyaller, örneğin, aromatik asitler (alternatif LB ≥ 0,5 Hz ile apodization için) | GB = 0.015, LB = -0.3 Hz | ||
| Zirveleri altında Alanlar: kullanım olarak doğrusal rezonanslarını örtüşen için uyar | |||
| 31 P çözünürlük geliştirme, Gauss-Lorentz olarak doğrusal dönüşüm | |||
| Yelpazenin Genel değerlendirme (0.05 <GB <0,2 ve -3,0 <LB <kullanarak, bireysel spektral bölgeler için ayrı ayrı optimize60; -1.0 Hz) | GB = 0.05, LB = -1.0 Hz | ||
| Çok zayıf sinyaller, örneğin, PtdIP 2, PTDA: apodization | LB = 3Hz | ||
| Zirveleri altında Alanlar: kullanım olarak doğrusal rezonanslarını örtüşen için uyar | |||
| Referanslar | |||
| 1. Palladino GW, Ahşap JJ Proctor HJ. Doku bir deney için modifiye dondurularak klemp tekniği. Cerrahi araştırma 289 Dergisi, 188-190 (1980). | |||
| 2. Wollenberger A Ristau, O, Schoffa G [dokusunun büyük parça son derece hızlı bir şekilde dondurulması için basit bir teknik]. Pflügers Archiv fur die gesamte fizyolojik, des Menschen und der Tierde 270, 399-412 (1960). | |||
Tablo 1. Deneysel yüksek çözünürlüğe parametreleri 1 H ve beynin 31 P NMR spektroskopisihacim oranlarında ve beyin dokusu çıkarma ve NMR, örnek hazırlanmasında kullanılan solvent ve reaktiflerin konsantrasyonları için doku ekstreleri. Tipik değer sunulmaktadır. Bundan başka önerilen değerlerin pH ve ölçüm sıcaklığı, hem de NMR toplama ve işleme parametreleri örnek ile ilgilidir. Protokol beyin dışındaki dokularda uygulandığı zaman küçük ayarlamalar, özellikle, gerekli olabilir. NMR parametreleri 9.4 T ölçümler için optimize edilmiş, ve farklı manyetik alan kuvvetlerinde çalışan spektrometre için gerektiği gibi ayarlanmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
NMR spektroskopisi, bir çok yeniden üretilebilir ve doğru bir şekilde çözelti içinde kimyasal bileşiklerin konsantrasyonlarının ölçülmesi için etkili bir yöntemdir. Ancak, yüksek kalitede veri elde etmek için bu örnek hazırlama ve analizleri konusunda belirli kurallara uymak gereklidir. Gözlemlenen bir sinyalin yoğunluğu algılama eşiğini (özellikle zayıf sinyal) yaklaşımları edilmiştir, NMR spektroskopi ile metabolit konsantrasyonlarının belirlenmesinde, üretim ya NMR sinyalinin alım de, niceleme hata hakimdir. Diğer tüm durumlarda biyolojik değişkenliği, numune hazırlama tekniği (ekstraksiyon verimliliği, bileşiklerin fiziksel ve kimyasal kararlılık, pipet ve hataları vb ağırlığında), ve / veya hassasiyet ve sonuçların doğruluğunu belirleyecek sinyal toplama ve işleme parametrelerinin bir seçim. Açıkçası, doku hasat sırasında meydana gelen herhangi bir metabolik değişiklikler de konsantrasyonları elde metaboliti yansıyacaked. Bu nedenle, mümkün olduğunca hızlı doku hasat tamamlamak için, ve bu huni hızla metabolize bileşiklerin in vivo konsantrasyonlarda eğer doğru dondurma gibi belirli doku dondurma teknikleri uygulamak için (önemli çok önemli olduğunu özellikle glukoz, laktat, ATP ve onun katabolitler, ADP ve AMP).
Hatta rutin bir Yüksek çözünürlüklü NMR spektrometre üzerinde mükemmel spektrumlarının ara madde manyetik alan gücü (9.4 T) elde edilebilir. Örneğin, fare beyni özler sulu fazın 1 * H NMR spektrumları, aralarındaki fark kimyasal kayma bölgesindeki sinyallerin, Δδ (400MHz rezonans frekansı 2.0 Hz tekabül eder) olduğunda yaklaşık 0.005 ppm ayrı olarak görülür ve nicelendirilebilir tutarındadır. Şekil 1, bu tabanı (laktat 13C uydu çifti de küçük tepelerinden (i) laktat ve treonin çiftler, ve (ii) alanin dubletin kısmi ayrılması ile görüntülenmiştir) üst. Bu araçlar nedeniyle yüksek alım maliyet NMR laboratuvarlarında daha az yaygın olmasına rağmen yüksek alanlar (14,1 hatta 18,8 T) faaliyet Spektrometre, daha çözünürlük ve hassasiyet artacaktır.
1H NMR spektroskopisi kullanarak, metabolitlerin geniş bir alanda tek bir devir içinde, yani eş zamanlı olarak analiz edilebilir. Bu seçim orantılı ölçüm süresini artırır, ancak deney duyarlılığı, birikmiş geçici sayısını artırarak geliştirilebilir. (Sinyal-gürültü oranı, geçici sayısının kare kökü ile orantılıdır.) Ancak, yukarıdaki protokole verilen maksimum toplam alma süresi - miktarda sürece, hemen hemen her amaç için yeterli olmalıdır (20 ile 30 dakika) Ekstraksiyon için uygun bir doku çok sınırlıdır. En NMR duyarlı çekirdeğin (proton) yararlanarak Bunun yanı sıra, metabolomic 1H NMR spektroskopisi kapsamlı avantajına sahiptirveritabanları farklı alan kuvvetleri için mevcut olan ve örnek pH değerleri 10. Ayrıca, otomatik veya yarı otomatik spektrumu değerlendirme için program 10 mevcut hale gelmiştir.
Doku özütlerinin 1H NMR spektrumu, yanı kenetleme maddelerinin ilave edilmeden çözülebilir iken, bu artık 31P NMR spektrumları için de geçerlidir. Aslında, çelatlama maddesinin konsantrasyonu (örneğin, EDTA veya CDTA) çizgi genişliği ve fosforile metabolitleri kaynaklanan 31P NMR sinyallerinin kimyasal kaymanın her ikisi üzerinde önemli bir etkisi vardır kullandı. Bir özü artan CDTA konsantrasyonu 31 P NMR çizgi genişlikleri azalır, ancak bu avantajı komşu piklerin kimyasal kaymaları, Δδ arasındaki küçük farklar ile galip olabilir. Bu nedenle kenetleme maddesinin miktannın, çizgi genişliği ve hem de kimyasal kayma için optimize edilmiş olması olan kullanılan. Lipid özler, bu iki spektral parametreler vardır significadiğer yönden başkaları baskın değil, aynı zamanda, pH değeri ile, NMR ölçümü sırasında numunenin sıcaklığı ile ekstre doku miktarı, yani, genel olarak numune konsantrasyonundan etkilenmiştir. Sonuç olarak, ölçüm koşullardan herhangi bir optimizasyon katılan tüm deneysel parametreler, bu varlık değil katkı bazı kombine etkilerini dikkate almalıdır. Bu durumun karmaşıklığı, Şekil 2'de gösterilen PL 31P NMR spektrumlarının davranışı açıklanmaktadır. Düşük doku konsantrasyonu (118 mg / ml), en düşük sıcaklık (277 K) ve en yüksek konsantrasyon CDTA (1.000 mM) test edilmiş olmasına rağmen çizgi genişliğine düşük olmasına neden olur, önerilen protokol sinyal çakışmasını önlemek için orta derecede doku konsantrasyonu (236 mg / ml), ara madde CDTA konsantrasyonu (200 mM) ve oda sıcaklığında (297 K) kullanılmasını önermektedir.
Numune hazırlama ve spektrum elde etme koşullarına rağmen, büyük önem taşırElde edilen ham verilerden bilgi fazla ekstre spektrum işlem parametrelerinin rolü göz ardı edilmemelidir. Işlem parametrelerinin özel bir resim algılama ve düşük konsantrasyonlarda meydana PLS ölçülmesi için ideal My olarak bulunur; Ancak, parametreleri aynı set 'kalabalık' spektral bölgelerde (Şekil 3, sağ üst) bireysel zirveleri gizleyebilir. Tersine, güçlü örtüşen rezonanslarının (Şekil 3, alt) bölgelerinde optimal çözünürlük iyileştirme sağlayarak işleme parametreleri düşük yoğunluklu zirveleri belirlenemeyen kılacak. Kapsamlı bir PL 31 P NMR veri tabanında 13,14 da dahil olmak üzere son gelişmeler, büyük ölçüde NMR spektrumları 13,14 analizini kolaylaştırmak.
Sonuçta, altta yatan uygulamanın amaçları spektral çözünürlük, hassasiyet, metaboliti quantif hassasiyete istenen dengeye, yani optimizasyonu için kriterleri tanımlamak gerekirication, hız ve diğer faktörler. Örneğin, önerilen tek fazlı, iki fazlı sistemler (Şekil 3, sol üst) daha güvenilir ve daha etkin bir miktar PL PL analizine, sistem ve daha az bol PL nicelendirilmesi için yüksek spektral çözünürlüğe ve yeterli hassasiyet sağlar . Bu durum örnekte, faz ayrışmasına yol açar, ancak bununla birlikte, en iyi sinyal ayırma etkin ve kesin bir sayısallaştırma daha yüksek bir önceliğe sahip olduğu durumlarda, çözgen karışımı içinde, kloroform-d daha yüksek bir yüzdesinin kullanımı denenmelidir. Bu durumda, alt fazın hacmi mutlak PL miktarda elde etmek üzere belirlenmelidir (mg PL g doku ya da toplam proteinin mg başına).
Proton ayrılmış hetero-NMR deneylerinde, sinyal yoğunlukları, hızlı bir şekilde almasını şemalara bağlı doygunluk ek olarak, nükleer Overhauser etkilerin (NOE) ile değiştirilebilir. Düzeltilmemiştir Eğer bu etkiler metabolit nereye sebepntitation hataları. Bu sorun ile başa çıkmak için iki alternatif stratejiler vardır. Birinci yaklaşımda, bir satın alma bireysel geçişleri uzun gecikmeler ile ayrılır. Bu yöntem, herhangi bir doygunluğu ya da önleyen, NOE, ancak nispeten uzun deneylerinde neden olur; hassas ve doğru sonuçlar ihtiyaç varsa o kullanılmalıdır. Bazı durumlarda, sadece öncelikli geçici yüksek bir sayı kullanılarak ölçülebilir, çok seyreltik örnekler için, özellikle, hızlı bir spektrum satın verilmesi gerekebilir. Bu gibi durumlarda, numuneye paramanyetik gevşeme maddelerinin, doygunluk ve NOE, hızlı veri toplama izin verir. Seçenek olarak ise, para-manyetik maddeler kullanmadan yüksek veri elde etme kullanılabilir. İkinci yöntem, gevşeme maddelerin varlığı için metabolit kantitatif kesinliğini azaltır NMR sinyallerinin bir genişlemesini yol açmaktadır, her bir rezonans için NMR belirlenmelidir düzeltme faktörleri yoluyla sinyal alanların düzeltilmesini gerektirirkalabalık spektral bölgeler. Genel olarak, deney şartlarının uygun seçimi sadece numune türüne göre belirlenir değil, aynı zamanda bilgi ile bir deney 13 elde edilmesi. Yüksek öncelikli yüksek hassasiyet ve doğruluk için gerek kalmadan, daha bol metabolitlerin hızlı analiz verilecek olması durumunda, yüksek derecede konsantre edilmiş numunelerin ölçülmesi ve gevşeme paramanyetik madde numuneye eklenir muhtemelen ile arda kez kullanmak uygun olabilir. Metabolitlerin çok sayıda doğru sayılmasını hızından daha önemli ise, burada yer alan protokol ile gösterildiği gibi tersine, bu daha az konsantre edilmiş ekstrelerin kullanımı ve uzun toplama zamanı NMR kabul etmek tercih edilir. Belirli bir araştırma projesi belirli metabolitleri vurgular Ayrıca, eğer, deneysel koşullar, söz konusu spektral bölgeler için uygun spektral çözünürlük elde etmek için ayarlanabilir. Burada sunulan protokol ve tartışma o için bir rehber olarak hizmet edebilirNMR spektroskopi ile ham bir doku ekstrelerinin metabolomic analizi ptimizasyon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Virbac | Vetflurane | Anesthetic for animals |
| Isoflurane vaporizer | Ohmeda | Isotec 3 | Newer model available: Isotec 4 |
| Scalpel, scissors, forceps, clamps | Harvard Apparatus Fisher Scientific |
various various |
Surgical equipment for animals |
| Freeze-clamp tool | homebuilt | n/a | Tong with aluminium plates, to be inserted in liquid nitrogen for cooling |
| Dewar | Nalgene | 4150-4000 | |
| Liquid nitrogen | Air Liquide | n/a | |
| Nitrogen gas | Air Liquide | n/a | |
| Nitrogen evaporator | Organomation Associates | N-EVAP 111 | Can be replaced by homebuilt device |
| Mortar | Sigma-Aldrich | Z247472 | |
| Pestle | Sigma-Aldrich | Z247510 | |
| Tissue homogenizer | Kinematica | Polytron | With test tubes fitting homogenizer shaft |
| Electronic scale | Sartorius | n/a | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | M3641 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 366910 | |
| Glass centrifuge tubes | Kimble | 45500-15, 45500-30 | Kimax 15 ml, 30 ml tube |
| Microcentrifuge tubes | Kimble | 45150-2 | Kimax 2 ml tube; should replace "Eppendorf" tube if compatible with centrifuge rotor |
| Polystyrene pipettes | Costar Corning | Stripettes | 5 and 10 ml volumes |
| Deuterochloroform | Sigma-Aldrich | 431915 | 99.96% deuterated |
| Deuterium oxide | Sigma-Aldrich | 423459 | 99.96% deuterated |
| Deuterium chloride | Alpha Aesar | 42406 | 20% in deuterium oxide |
| Sodium deuteroxide | Sigma-Aldrich | 164488 | 30% in deuterium oxide |
| Lyophilizer | Christ | Alpha 1-2 | |
| Cold centrifuge | Heraeus | Megafuge 16R | |
| pH meter | Eutech Cybernetics | Cyberscan | |
| CDTA | Sigma-Aldrich | D0922 | |
| Cesium hydroxide | Sigma-Aldrich | 516988 | |
| NMR tubes | Wilmad | 528-PP | |
| NMR stem coaxial insert | Sigma-Aldrich | Z278513 | By Wilmad |
| NMR pipettes | Sigma-Aldrich | Z255688 | |
| Pipettes | Eppendorf | Research | With tips for volumes from 0.5 to 1,000 μl |
| Pipet-Aid | Drummond | XP | |
| NMR spectrometer | Bruker | AVANCE 400 | including probe and other accessories |
| NMR software | Bruker | TopSpin 1.3 | newer version available: Topspin 3.2 |
| Water-soluble standard compounds | Sigma-Aldrich | various | |
| Phospholipid standard compounds | Avanti Polar Lipids Doosan Serdary Sigma-Aldrich |
various various various |
Source for plasmalogens, but may be <70 - 80% purity |
| Methylenediphosphonate | Sigma-Aldrich | M9508 | |
| TSP-d4 | Sigma-Aldrich | 269913 |
References
- Manger, P. R., et al. Is 21st century neuroscience too focused on the rat/mouse model of brain function and dysfunction. Front Neuroanat. 2, 5 (2008).
- Buxbaum, J. D., et al. Optimizing the phenotyping of rodent ASD models enrichment analysis of mouse and human neurobiological phenotypes associated with high-risk autism genes identifies morphological, electrophysiological, neurological, and behavioral features. Mol Autism. 3, 1 (2012).
- Papaioannou, V., Behringer, R. R. Mouse Phenotypes A Handbook of Mutation Analysis. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Woodbury. (2004).
- Yu, F. H., et al. Reduced sodium current in GABAergic interneurons in a mouse model of severe myoclonic epilepsy in infancy. Nat Neurosci. 9, 1142-1149 (2006).
- Mallolas, J., et al. A polymorphism in the EAAT2 promoter is associated with higher glutamate concentrations and higher frequency of progressing stroke. The Journal of Experimental Medicine. 203, 711-717 (2006).
- Crusio, W. E., Sluyter, F., Gerlai, R. T., Pietropaolo, S. Behavioral Genetics of the Mouse Genetics of Behavioral Phenotypes. Vol. 1, Cambridge University Press. New York. (2013).
- Viola, A., Saywell, V., Villard, L., Cozzone, P. J., Lutz, N. W. Metabolic fingerprints of altered brain growth, osmoregulation and neurotransmission in a Rett syndrome model. PLoS ONE. 2, e157 (2007).
- Lutz, N. W., Sweedler, J. V., Wevers, R. A. Methodologies for Metabolomics. , Cambridge University Press. New York. (2013).
- Rabinowitz, J. D., Purdy, J. G., Vastag, L., Shenk, T., Koyuncu, E.
- Wishart, D. S. Methodologies for Metabolomics. Wevers, R. A., Lutz, N. W., Sweedler, J. V., et al. , Cambridge University Press. New York. (2013).
- Ponten, U., Ratcheson, R. A., Salford, L. G., Siesjo, B. K. Optimal freezing conditions for cerebral metabolites in rats. Journal of Neurochemistry. 21, 1127-1138 (1973).
- Henry, P. G., Oz, G., Provencher, S., Gruetter, R. Toward dynamic isotopomer analysis in the rat brain in vivo automatic quantitation of 13C NMR spectra using LCModel. NMR Biomed. 16, 400-412 (2003).
- Lutz, N. W., Cozzone, P. J. Multiparametric optimization of (31)P NMR spectroscopic analysis of phospholipids in crude tissue extracts 2 Line width and spectral resolution. Anal Chem. 82, 5441-5446 (2010).
- Lutz, N. W., Cozzone, P. J. Multiparametric optimization of (31)P NMR spectroscopic analysis of phospholipids in crude tissue extracts. 1. Chemical shift and signal separation. Anal Chem. 82, 5433-5440 (2010).
- Lutz, N. W., Cozzone, P. J. Methodologies for Metabolomics. Lutz, N. W., Sweedler, J. V., Wevers, R. A. , Cambridge University Press. New York. (2013).
- Lutz, N. W., Fernandez, C., Pellissier, J. F., Cozzone, P. J., Beraud, E. Cerebral biochemical pathways in experimental autoimmune encephalomyelitis and adjuvant arthritis a comparative metabolomic study. PLoS ONE. 8, e56101 (2013).
- Lutz, N. W., Cozzone, P. J. Principles of multiparametric optimization for phospholipidomics by 31P NMR spectroscopy. Biophys Rev. 5, 295-304 (2013).
- Pearson, G. A. Shimming an NMR magnet. , University of Iowa. Iowa City. (1991).
- Lane, A. N., Fan, T. W. M., Higashi, R. M. Biophysical tools for biologists. Correia, J. J., Detrich, H. W. Vol. 1, In vitro techniques, Academic Press. Waltham. (2008).
- Peeling, J., Wong, D., Sutherland, G. R. Nuclear magnetic resonance study of regional metabolism after forebrain ischemia in rats. Stroke. 20, 633-640 (1989).
