Introduction
Мышиные модели были использованы широко в исследовании мозга 1. Генотип-фенотипа были исследованы в мышей и крыс мозга при изучении генной экспрессии в РНК и / или уровней белка, с одной стороны, и морфологические, функциональные, электрофизиологические и / или поведенческие фенотипы с другой 2-6. Однако, чтобы полностью понять механизмы, связывающие фенотип генотипа, необходимо исследовать молекулярные события после экспрессии белка, т.е.. Метаболизм биохимических субстратов, на которых ферменты действуют 7. Это требование привело, в течение последних 10 до 15 лет, к возрождению метаболического исследования во многих отраслях биологии 8,9. В то время как классические метаболические исследования часто были сосредоточены на деталях конкретных путей, новый метаболомики подход ориентирован на всеохватывающей исследования глобального метаболического профиля ткани рассматриваемой.Одним из следствий этой концепции является очевидная потребность в аналитических инструментов, которые минимизируют уклон в сторону конкретных метаболических путей и / или классов соединений. Тем не менее, классические биохимические анализ основан на определенной химической реакции конкретного анализируемого вещества, которое должно быть указано до того, как анализ проводят. Напротив, спектроскопические методы, такие как ядерного магнитного резонанса (ЯМР) и масс-спектрометрии (MS) (я) основаны на конкретных молекулярных (физических) свойств биохимических соединений, каждое из которых порождает одного или нескольких различных сигналов в спектре обнаружены в ходе одного эксперимента; и (II) обнаруживает большое количество различных соединений в эксперименте.
Таким образом, каждый спектр содержит комбинированную информацию целого ряда метаболитов. По этой причине, спектроскопические методы адекватные средства для метаболомики, а не до выбора не должно быть сделано в отношении природы аналита, подлежащего измерению 8
Хотя ЯМР-спектроскопии и масс могут быть использованы как взаимозаменяемые для анализа многих метаболитов, каждый метод обладает специфическими преимуществами и недостатками, которые недавно были рассмотрены 10. Вкратце, ЯМР-спектроскопии, как правило, могут быть выполнены из неочищенных экстрактов и не требует хроматографического разделения образцов соединений перед анализом. Напротив, MS работает с газовой или жидкостной хроматографии (ГХ или ЖХ) разделения, для конкретных недавних событиях, таких как изображения масс-спектрометрии исключением. В нескольких особых случаях, таких как анализ сахара, разделение LC может стать необходимостью для ЯМР-спектроскопии, а также, потому что резонансные линии различных сахаров значительно перекрываются в протон (1Н) спектров ЯМР. Тем не менее, 1 Н ЯМР-спектроскопии без CHRomatographic разделение остается самым популярным, почти повсеместно прикладное метод метаболомики ЯМР. Как правило, подготовка образца является более трудоемким и сложным для MS, чем для ЯМР-спектроскопии. Серьезные проблемы, связанные с матричных эффектов гораздо менее распространены в ЯМР-спектроскопии, чем в MS, где они могут привести к значительно ослабленных сигналов. Метаболит количественный может быть достигнуто при любом способе. Тем не менее, несколько стандартных соединений, необходимых для MS вследствие различий в матричных эффектов и эффективности ионизации между метаболитов. В противоположность этому, только один стандарт на образец необходим для ЯМР спектроскопического анализа, потому что при соответствующих условиях измерения, последний способ является внутренне количественные благодаря строго линейного отклика ЯМР на наблюдаемых ядер. Основным недостатком ЯМР является его относительно низкая чувствительность. MS, в частности LC-MS, является более чувствительным, чем ЯМР на несколько порядков; По этой причине, МС должна быть более предпочтительным, чем ЯМР дляАнализ соединений, возникающих при очень низких концентрациях. С другой стороны, неразрушающего характер эксперимента ЯМР является явным преимуществом по сравнению с МС; таким образом, ЯМР может быть выполнена повторно на том же образце, например, для разных ЯМР-активных ядер, таких как 1 H, фосфор-31 (31 P), углерод-13 (13С), фтор-19 (19 F) и т.д.., а материал не потребляется ЯМР, в отличие от измерений МС.
Оба ЯМР и МС могут быть использованы в различных режимах, каждый из которых является оптимальным для выявления соединений с конкретными химическими характеристиками. Например, 31 P ЯМР часто лучше подходит, чем 1 Н ЯМР для анализа умеренно концентрированных фосфорилированных соединений, хотя почти все фосфорилированные метаболиты также содержат протоны. Тем не менее, их сигналы 1Н ЯМР может маскироваться 1 сигналов ЯМР H от других, не фосфорилированными соединений, в то время как последнийочевидно, не вызывают фоновые сигналы в 31 спектров ЯМР Р. В аналоговой ситуации, 19-ЯМР-анализ F является предпочтительным для фторированных соединений, например, фторированных препаратов (не фоновых сигналов от эндогенных метаболитов), в то время как частный случай 13 С ЯМР представляет интерес почти исключительно, если судьба 13 С- меченые экзогенные метаболические предшественники должна быть дополнена, в связи с крайне низким естественным изобилием 13 С изотопом (около 1%). Многие масс-спектрометры работают в любом отрицательном режиме ионного или режиме положительных ионов. Таким образом, важно знать заранее, анализа ли ионы, которые должны соблюдаться отрицательно или положительно заряженные. Мы сосредоточимся на протокол для анализа мозговой ткани метаболом по 1 H и 31 P ЯМР-спектроскопии, потому что этот метод дает большое количество важных концентрации метаболитов при низкой стоимости в терминах (I) время, необходимое для пробоподготовки ай (II) усилие, необходимое для количественного определения метаболита. Все эксперименты могут быть выполнены с использованием оборудования стандартной влажной химической лаборатории и высокого разрешения ЯМР спектроскопии центр. Дополнительные требования описаны в разделе протокола ниже.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: ANIMAL ЭТИКА ЗАЯВЛЕНИЕ
Исследования на животных на крысах в соответствии с руководящими действительные во Франции, и они были одобрены местным комитетом по этике (# 40.04, Университет Экс-Марсель медицинской школы, Марсель, Франция) по.
1 Сбор и замораживание мозга крысы
- Подготовьте компоненты требуются: жидкий азот (N 2liq.) В сосуд Дьюара, что является достаточно большим, чтобы держать зажим замерзания (по крайней мере, 2-3 громкости L); анестетик (например, ИФ, или кетамин / ксилазина); анестезия камера; стерильные инструменты рассечение: хирургические ножницы, скальпель, пинцет; тканевые салфетки и бутылка с чистки спирт (этанол); иглы (25 G); 1 мл и 10 мл шприцев. Этикетка алюминиевые листы (около 10 х 10 см) с клейкой лентой. Используйте листы обернуть отдельные зафиксированные-зажаты крыс мозги.
ПРИМЕЧАНИЕ: При обращении с жидким азотом всегда надевайте защитные перчатки и очки защиты глаз или маску! - Заполните Дьюара с N 2liq., И разместить бесплатноЗин зажим в сосуд Дьюара. Убедитесь, что количество N 2liq в сосуде Дьюара достаточно для повторных процедур замораживания-зажим (несколько литров; количество N 2liq испаряющейся в течение каждого сублимационной зажима зависит от размера зажима).
- Обезболить животного (например, по изофлураном или внутрибрюшинной инъекции кетамина / ксилазина смеси). Перейдите к эвтаназии путем сердечной пункции для предотвращения кровотечения, когда кожа головы удаляется и череп открыт. Шаги 1.4-1.7 ниже описания этого стандартную процедуру.
ПРИМЕЧАНИЕ: В особых протоколов, требующих максимально сохранить глюкозы и высоких энергий метаболитов, жертву крысы по воронке-морозильной мозг анестезированной животного с N 2liq 11 после втягивания кожи головы. Тогда, препарировать мозг из черепа с переменной N 2liq минимизировать посмертную метаболизм 12. - Смочите голову крысы с очистки спирта. Используйте хирургические ножницы в (I) бэрОве головы, и (II) с открытым черепа вдоль черепных швов.
- Используйте пинцет, чтобы открыть череп дальше, и, чтобы удалить весь мозг из под открытым черепа, позиционирования головки с ног на голову. Удалить быстро видимых следов крови, используя ткани салфетки. Если полушарий мозга метаболически и морфологически симметрично, то удобно использовать один из полушарий метаболического анализа после отделения его от другого полушария надреза скальпелем. При необходимости, использовать оставшееся полушарие для других исследований мозга, таких как гистологии.
- Быстро удалить замораживания зажим с N 2liq наполнением Дьюара, разместить весь или половину мозг крысы на одной внутренней поверхности, зажима и сразу вставить замораживания зажим в N 2liq наполнением Дьюара, удерживая зажим прочно сжаты. Убедитесь, что шаги 1.3-1.6 занимать не более 60 сек.
- После 1-2 мин удалить морозильной клеммы из Дьюара, открытой зажим, ослабить замороженные ткани мозга от зажима и обертываниезамороженной ткани в соответствующей маркировкой алюминиевого листа (см 1,1 выше). Убедитесь, что этикетка является четким и остается твердо на месте после того, как образец завернут. Быстро разместить завернутый образец в N 2liq. Выполните всю процедуру как можно быстрее, чтобы избежать размораживания замороженных тканях головного мозга.
- Хранить замороженный образец в N 2liq или в морозильной камере при -80 ° С до экстракции метаболитов.
Примечание: Всякий раз, когда биологический образец должен быть сохранен в течение более чем одного года, хранение при температуре 2liq N должно быть более предпочтительным, чем -80 ° C. Это также относится к оставшейся части этого протокола.
2 Получение процедуры экстракции метаболитов
- Подготовка ткани гомогенизатора и сопоставления пробирки (например, 10 мм внутренний диаметр, в зависимости от диаметра вала гомогенизатор; как правило, сделаны из пластмассы). Используйте электрические гомогенизаторы, а не управляемые вручную гомогенизаторы (тканевые шлифовальные). Preсрезать Вортекс и лабораторных весов.
- Подготовьте ведро с колотым льдом. Держите достаточные quantitites метанола, хлороформа и воды на льду (4 мл каждого за 250-350 мг замороженные ткани мозга).
- Подготовьте передачи пипетки и флаконов.
- Подготовить стеклянные флаконы (≥20 громкости мл) с винтовой крышкой и место на льду (один флакон за экстракт ткани). Fit винт крышки с тефлоновым перегородками, стойкой к хлороформом.
- Подготовка 5 мл пластиковых пипеток для дозирования метанол и воду, и стеклянные пипетки или шприцы Hamilton для дозирования хлороформ. Подготовьте дополнительные пластиковые пипетки (5 или 10 мл объема) для передачи смеси гомогената ткани и метанола.
- Убедитесь, что все изделия из стекла тщательно промывают дистиллированной водой и тщательно высушивают перед использованием, чтобы удалить следы примесей, в частности ЯМР-обнаруживаемый формиат и ацетат.
- Заполните фарфоровой ступке с N 2liq, место фарфорового пестика в раствор и залейте N 2 лIQ. Азот будет испаряться, пока температура ступки и пестика не станет достаточно низкой. Держите небольшое количество N 2liq в ступке.
3 Добыча метаболитов
- Удалить замороженный образец мозговую ткань от хранения (N 2liq танка или -80 ° C морозильник). Затем сразу же перенести образец ткани на минометный частично заполнена N 2liq.
- Используйте русской 2liq Холодная пестик сломать замороженные ткани мозга на более мелкие куски, которые легко вписываются в пробирках, используемых для ткани гомогенизации. Чтобы предотвратить кусочки замороженной ткани с проецируются из раствора в процессе, разбить ткани в то же время заворачивали в алюминиевую листа. Не молоть замороженной ткани в порошок, так как это сделает трансфер в пробирке сложнее (увеличивается риск конденсации воды). ВАЖНО: На протяжении всей процедуры, добавить N 2liq на минометный мере необходимости держать образец глубокой заморозке.
- Mix сторговый центр куски замороженного мозговой ткани тщательно взвесить 250-350 мг и перенести в пробирку, наполненную ледяной метаноле (4 мл на 250-350 мг ткани головного мозга). Каждый раз, когда кусочки замороженной ткани добавляются, гомогенизации них сразу с гомогенизаторе тканей.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните всю процедуру быстро, чтобы избежать (I) значительное конденсации воды на образце, которые привели бы к завышению веса образца, и (II) отопления и оттаивания образцов. Отдельные куски ткани должны быть в замороженном состоянии в начале процесса гомогенизации. - После того, как последний фрагмент из замороженного образца головного мозга крысы была добавлена в пробирку и гомогенизируют, перевод гомогената к ≥20 мл стеклянный флакон объемом, близко винтовой крышкой и выдержать на льду в течение 15 мин. Если объем в пробирке не является достаточно большим для ≥4 мл метанола, использовать меньший объем метанола для гомогенизации часть замороженных ткани головного мозга, передавать смеси достеклянный пузырек и продолжить гомогенизации части остаточных тканей свежим метанолом. Убедитесь, что общий объем метанола составляет 4 мл на 250-350 мг ткани мозга.
- Добавить такой же объем охлажденного льдом хлороформе (то есть, 4 мл на 250-350 мг ткани головного мозга) в гомогенате, вихря тщательно и оставьте на льду в течение 15 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: При работе с летучими растворителями, в частности хлороформ Всегда используйте проветриваемом химической капот! - Добавить такой же объем воды (то есть, 4 мл на 250-350 мг ткани головного мозга) в гомогенате, вихря тщательно и выдержать при -20 ° С в течение ночи.
4 Получение расслоению, и испарения растворителя
- Подготовьте холодный центрифуги (4 ° C, 13000 XG на максимальном вылете) и центрифужные пробирки. Убедитесь, что последние являются ≥20 объем мл, устойчивы к хлороформом, и может выдерживать центробежные силы 13000 х г. Используйте специальные стекла с пробирками, но промыть (как и все стеклянной посуде) с дистиллированной водой бытьпередние использование (см 2.3).
- Подготовить тщательно промыть стекло пипетки Пастера и соответствующий propipettor (лампа, ручной пипетки насос, автоматический пипетки аппарата / пипетки и т.д..).
- Приготовьте два дополнительных тщательно промыть трубы (≥15 громкости мл) на образец мозга, один из которых должен быть устойчив к хлороформом (из стекла или тефлона), другую к метанола (из пластика, устойчивого к метанол, или стекла).
- Подготовьте испарения аппарат растворителя (имеющийся в продаже или самодельных). Убедитесь, что это устройство обеспечивает точно контролируемый поток сухого газа азота, который направлен на поверхность раствора экстракта, содержащего летучие растворители (метанол, хлороформ).
- Приготовьте два дополнительных лотков или ведра, наполненные льдом: один для образца на лед, а другая служит для хранение проб холодные в процессе испарения.
- Подготовка лиофилизатор (лиофильной сушки) и материалы, необходимые для лиофилизации: (I) один 50мл центрифужную пробирку или вакуум круглодонную колбу в экстракте, и (II) N 2liq заморозить водную фазу выборок (L ≤0.3 на образец). При использовании центрифужную пробирку, также готовят широкий шеи вакуум-фильтра бутылку, подходящий для лиофилизации.
5 Разделение фаз и испарения растворителя
- Для полного разделения фаз, передавать тканевого гомогената метанол / хлороформ / вода / мозга (смотри 3,6) в хлороформе устойчивостью центрифужную пробирку (объем ≥20 мл) и центрифугируют при 13000 х г и 4 ° С в течение 40 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Две фазы будет формировать, разделенных слоем осажденного белка. Нижний (тяжелее) фаза состоит из метанола, хлороформа и растворенных липидов, в то время как верхняя (зажигалки) фаза состоит из воды, метанола и растворенных водорастворимых метаболитов. - С помощью пипетки Пастера перенести верхнюю фазу в соответствующем ≥15 мл пробирку (пластик устойчив к метанол или стекло). Держите на Iсе.
- С помощью пипетки Пастера свежий передавать нижней фазы в соответствующую пробирку ≥15 мл (стекло или тефлона). Держите на льду.
- Хранить слой осажденного белка при -80 ° С, если это будет использоваться для определения общего белка; либо отказаться.
- Хранить трубку с фазой вода / метанол (5,2 см) на льду и выпаривают метанол, направляя потоке сухого азота на поверхность раствора экстракта. С другой стороны, плавно пузырьков азота через предназначенную для раствора экстракта. не Завершить процесс испарения при пропускании азота больше не вызывает уменьшение объема в раствор экстракта. В это время, по-прежнему с лиофилизации (см 5.7), или заморозить и держать образец при -80 ° С с трубка закрыта (винтовой крышкой или Парафильмом) до готовности к лиофилизации.
- Поместите пробирку с фазой метанол / хлороформ (см 5.3) на льду и испаряются метанол, направляя сухой потока азота на суrface из раствора экстракта. При упаривают весь растворитель, завершить процесс, а не держать образец при -80 ° С с трубка закрыта (винтовой крышкой или Парафильмом) до готовности к ЯМР-анализа.
- Готовят водную фазу для лиофилизации
- После окончания процесса испарения метанола (5,5 см), переноса образца в тщательно промывают 50 мл центрифужную пробирку (если образец замораживают, оттепели до передачи). В качестве альтернативы, передача в вакууме круглодонную колбу.
- Замораживание раствора экстракта путем поворота центрифужную пробирку (или круглодонную колбу), частично вставленной в N 2liq таким образом, что внутренняя поверхность трубки или колбе постепенно покрывается замороженной жидкостью. Убедитесь, что нет N 2liq. Может войти в сосуд.
- Когда вся жидкость замерзает, покрыть трубу с проколотой крышкой или крышкой, чтобы пар бежать, и поместить трубку в широкоэкранном шеи вакуум-фильтре бутылки.
- Начните лиофилизации после аттацзин колбу или бутылку с сублимационной сушилке.
- Завершение процесса лиофилизации, когда образец является совершенно сухой. Хранить образца при -80 ° С в закрытой трубке (с плотной крышкой!), Пока не использовали для анализа ЯМР.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно не более 24 часа в сутки, необходимых для лиофилизации. Несколько образцов может быть лиофилизировали одновременно, в зависимости от конструкции лиофилизатор, и от того, используются в центрифужные пробирки с широким шеи бутылки или круглодонных колб.
6 Получение образцов ЯМР
- Магазин сушат и лиофилизированные экстракты при очень низкой температуре (≤ -80 ° С). Re-растворить лиофилизатов для подготовки проб ЯМР непосредственно перед экспериментом ЯМР.
Примечание: Хранение образцов в растворе и / или близкой к комнатной температуре может привести к деградации образца! - Готовят водную 200 мМ раствора хелатирующего агента, транс-1,2-cyclohexyldiaminetetraacetic кислоты (CDTA), следующим образом:
- Добавить чистую воду (например, 20 мл) в пробирке или центрифужную пробирку, и добавить количество CDTA порошка, необходимого для генерации решение 200 мм.
Примечание: Значительная часть CDTA не будет растворимым, так как рН очень низка, так как кислота CDTA форма была использована вместо соли CDTA. - Осторожно добавить, шаг за шагом, все большее количество CsOH порошка в раствор CDTA, и вихрь тщательно после каждого добавления.
Примечание: растворимая фракция CDTA будет возрастать с увеличением содержания CsOH в водном растворе. Избежать "overtitration", т.е. добавить меньше, чем стехиометрическое количество CsOH к решению CDTA. - Когда почти весь порошок CDTA растворяется, начать измерения рН после каждого добавления CsOH и тщательного встряхивания. Завершить CsOH дополнение, когда конечный рН достигается (Таблица 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: В это время, все CDTA будет распущен. Использование Cs + в качестве противоиона к CDTA является Generсоюзником предпочтительнее Na + или K +. Cs + является мягкая кислота Льюиса за большим ионным радиусом, в отличие от Na + и K +, которые имеют меньшие ионные радиусы и твердые кислоты. Следовательно, Cs + образует комплексы с фосфатами (жестких баз) меньше степени, чем Na + и K +. Это выгодно в течение 31 P ЯМР-спектроскопии фосфорилированных метаболитов, потому что комплексообразование приводит к увеличению ширины линий ЯМР, в частности, в условиях медленно промежуточного ионного обмена.
- Добавить чистую воду (например, 20 мл) в пробирке или центрифужную пробирку, и добавить количество CDTA порошка, необходимого для генерации решение 200 мм.
- Для 31 P ЯМР-анализ фосфолипидов (ФЛ), растворить липиды сушат (см 5,6) в 700 мкл смеси растворителей, состоящей из дейтерированном хлороформе (CDCl 3), метанола и полученный раствор CDTA полученного, как описано в 6.2 (5: 4: 1 объемное соотношение). Передача образца в микроцентрифужных трубки. Используйте прямой-смещение (или объёмные) микропипетку хлороформом-сопротивлятьсямуравей советы в обеих стадий.
ПРИМЕЧАНИЕ: Имейте в виду, что изменение любой из следующих параметров повлияет на внешний вид (химический сдвиг и ширины линий) из PL 31 Р ЯМР-спектров 13-17:
(I) объемное соотношение CDCl 3: Раствор CDTA: МеОН
(II) Общий объем растворителя используется
(III) рН водного компонента растворителя
(IV) Концентрация CDTA водного компонента растворителя.
ПРИМЕЧАНИЕ: В общем, точная настройка этих параметров пробы (таблица 1) не является необходимым, и должна быть выполнена с особой осторожностью при желании в особых случаях. Изменение объемное соотношение между растворителей легко приводит к образованию системы, состоящей из двух фаз вместо одной гомогенной фазе! Один-фазная система оказалась более практичным, чем двухфазной системе в большинстве приложений 13,14. - Для ЯМР 1 H анализа водорастворимых метаболитов, растворить лиофилизат (п.5.8) в 700 мкл оксида дейтерия (D 2 O), содержащий 3- (триметилсилил) пропионовой-2,2,3,3-d4 натриевой соли кислоты (TSPD 4) в диапазоне миллимолярной (D 2 O, содержащим 0,05% TSPD 4 является коммерчески доступным) . Передача образца в микроцентрифужных трубки.
- Доводят рН полученного водного раствора экстракта до 7,3 путем добавления небольших количеств (около 2 мкл) хлорид дейтерия (DCL) и тяжёлой натрия (NaOD) решений. Во-первых, начнем с 0,02 N DCL или NaOD решений. Если 2 или 3 последующие дополнения не вызывают достаточного изменения рН, продолжить 0,2 N DCL или NaOD решений. Будьте осторожны, чтобы не overtitrate.
Примечание: общее количество ДКЛ или NaOD раствора необходимо зависит от количества мозговой ткани, извлеченной; обратите внимание, это значение для точного метаболита количественного. В большинстве случаев объединенные объемы добавленных DCL и NaOD решений должны быть практически незначительна (около 1% от объема образца ЯМР).
- Для получения наилучших результатов используйте многоядерный ЯМР спектрометр высокого разрешения (≥9.4 Tesla напряженность поля, соответствующая 162 МГц 31 P, или 400 МГц 1 Н резонансных частот). Кроме того, 31 P катушки, убедитесь, что Р-ЯМР зонд 31 обладает 1 H катушку для протонов развязки. Заданная температура регулирование зонда ЯМР до желаемого целевого значения (обычно 25 ° C).
ПРИМЕЧАНИЕ: Температура датчика может потребоваться 10-20 минут для стабилизации! - Центрифуга PL раствор экстракта в микроцентрифужных трубки (см 6,3) при 4 ° С и 11000 мкг в течение 30 мин, чтобы вращаться вниз твердых остатков в образце. Передача 600 мкл супернатанта к высококачественным ЯМР трубы (5 мм наружный диаметр).
- Подготовить соответствующий шток коаксиальный вставки наполненный водным 20 мМ methylenediphosphonate решение (MDP) при рН 7,0 для химического сдвига ссылоки количественный. Поместите эту вставку в ЯМР пробирку, заполненную раствором экстракта PL.
- Установите трубку ЯМР с соответствующим блесны и передачи к магниту ЯМР. Теперь спина образца при 15-20 Гц и ждать, пока образец не скорректировала до заданной температуры (около 10 мин).
- Тщательно минимизировать неоднородности магнитного поля через образец, регулируя на оси и вне оси прокладка токов катушки 18.
- Установите ЯМР параметры измерения спектра оптимальных значений, которые могут варьироваться в зависимости от силы магнита поля (для системы с 9,4 T, см таблицу 1 для рекомендуемых значений параметров).
- Установить количество переходных на эксперимент (= NS).
- Установка NS до примерно 80 (общей продолжительности сбора данных примерно 20 мин), если только наиболее распространенные ЯП должны быть количественно с точностью (фосфатидилхолин (PtdCho), фосфатидилэтаноламин (PtdEtn), этаноламин plasmalogen).
- Установите NS до 100-200 (общей продолжительностью гПриобретение ата 1-2 ч), если менее концентрированные ЯП должны быть количественно (алкил-ацил-фосфатидилхолин, фосфатидилинозитол, фосфатидилсерин, фосфатидна кислота).
- Установите NS до 1500-2000 (общей продолжительностью сбора данных 7-10 ч; ночной эксперимент), если очень низкой концентрации PLs должны быть количественно, например фосфатидилинозит моно и дифосфаты (PtdIP и PtdIP 2), кардиолипин, лизо-PLS , алкил-ацил-фосфатидилэтаноламин, а иногда и другие.
- После окончания приобретения спектра, процесса спада свободной индукции (FID), используя оптимизированные параметры. Значения этих параметров изменяются в зависимости от напряженности магнитного поля, качество прокладки, и сигнала ФЛ быть количественно.
- Для получения наилучших результатов для всего спектра ЯП, повторить обработку использования нескольких (не менее двух) различных процедур фильтрации. Используйте сильный повышение разрешения для сильно перекрывающихся сигналов, например., Для PtdCho и PtdEtnрегионы.
- Используйте сильный фильтрацию (слабая или нет повышение разрешения) для слабых сигналов.
- Фильтр очень слабые и широкие сигналы без существенных перекрытия по аподизации (например, LB = 3 Гц), чтобы увеличить сигнал-шум, например PtdIP и PtdIP 2. В Таблице 1 характерных параметров обработки.
- Количественная площадь каждого сигнала PL по отношению к площади под сигнала контрольного соединения (MDP) в том же спектра.
- Калибровка сигнала опорного соединения (MDP) В отдельном эксперименте, с использованием 5 мм трубку, заполненную ЯМР (I), соединения фосфора в известной концентрации, и (II) тем же ствола вставки коаксиального, используемого в экспериментах, PL 31 Р-ЯМР ( см 7.3 и 7.9).
- Расчет концентраций отдельных PL на основе относительных площадей сигналов PL, с одной стороны (см 7.9), так и на калибровочной значением, полученным для MDP откоаксиальный вставка с другой (см 7,10). Следует учитывать, что число ядер фосфора, способствующих конкретного сигнала ЯМР 31 P может изменяться в зависимости от молекулярной происхождения этого сигнала.
ПРИМЕЧАНИЕ: Фосфонат сигнал MDP (обычно ссылаются на 19,39 промилле) представляет собой два ядра фосфора, как и кардиолипин фосфата сигнал. Все другие сигналы ЯМР PL 31 P обнаруженные в экстрактах мозга представляют одно ядро фосфора каждый. - Используйте статистическая программа по мере необходимости, чтобы сравнить уровни мозга PL между группами животных.
8 Выполнение эксперимента 1Н ЯМР для анализа водорастворимых Brain Метаболиты
- Заданная температура регулирование зонда 1 ЯМР к желаемой целевой стоимости (обычно 25 ° C). Смотрите также замечает в 7,1.
- Центрифуга водного раствора экстракта в микроцентрифужных трубки (см 6,5) при 4 ° С и 11000мкг в течение 30 мин для замедления вращения твердых остатков в образце. Передача 600 мкл супернатанта к высококачественным ЯМР трубы (5 мм наружный диаметр).
- Передача ЯМР трубка ЯМР магнит, прокладки и установленных параметров сбора ЯМР спектра до оптимальных значений, как было описано в 7.4-7.6. Смотрите также таблицу 1 для рекомендуемых значений параметров.
- Установите количество переходных на эксперимент, чтобы о NS = 32 (общая продолжительность сбора данных примерно 13 мин). Для получения хороших отношения сигнал-шум очень слабые сигналы, в частности, в ароматической области, использовать NS = 64 (общая продолжительность сбора данных примерно 26 мин) или более.
- После окончания приобретения спектра, процесса спада свободной индукции (FID), используя оптимизированные параметры. Значения этих параметров слегка изменяться в зависимости от напряженности магнитного поля, качества прокладки, и сигнала метаболита, чтобы быть количественно.
ПРИМЕЧАНИЕ: В большинстве случаев, достаточно для обработки каждого спектр раз, Используя набор параметров обработки, представляющих собой хороший компромисс для всех метаболитов сигналов. В Таблице 1 характерных параметров обработки. - Количественная площадь каждого метаболита сигнала (часто мультиплета, иногда перекрывается с другими синглеты или мультиплетов, вытекающих из различных молекул) по отношению к площади под сигнала контрольного соединения (TSP-D 4) в той же спектра.
- Рассчитать отдельные концентрации метаболитов на основе TSP-д 4 концентрации (см 6.4). Следует учитывать, что число протонов, способствующих конкретного сигнала ЯМР 1 H может изменяться в зависимости от молекулярной происхождения этого сигнала. Триметил сигнал TSP-д 4 (по отношению к 0,0 промилле) представляет девять протоны.
- Используйте статистическая программа по мере необходимости, чтобы сравнить уровни мозга метаболитов между группами животных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Для получения наилучшего разрешения в метаболической спектров ЯМР головного мозга и других тканевых экстрактов, она уже давно распространенная практика, чтобы удалить или ионы маска металлические (что наиболее важно: парамагнитные ионы), присутствующие в экстракте решений. Это было достигнуто либо путем добавления хелатирующего агента, такого как ЭДТА или CDTA выписке 19, или пропусканием экстракта путем ионообменной смолой, такой как Chelex-100 20. Результаты, представленные на рисунке 1, показывают, что этот шаг не является необходимым для 1 H-ЯМР-спектроскопического анализа, если экстракты мозга тщательно получены в соответствии с приведенной выше протокола. Здесь чрезвычайно узкие спектральные линии были получены для всех спектральных областях анализируемых. Даже в очень людных районах, например, для глутамина / глутамата и мио -inositol / глицин, пики на расстоянии <0,01 промилле почти полностью разъемные на частоте 400 МГц (рис.1, внизу). Как следствие, качественное,и количественный анализ многочисленных небольшой, но в настоящее время не назначенных, пиков видимых в центре и нижней панелях рисунке 1 можно предусмотреть в будущем.
Рисунок 1 Субрегионы типичного 1 H ЯМР-спектр (400 МГц) водной фазы экстракта ткани мозга от женского Льюиса крысы. Все три панели демонстрируют чрезвычайно высокое разрешение можно получить, используя протокол, представленный в этой статье. Ни хелатирующий агент, ни ионообменной смолы была использована при подготовке пробы. Центр и нижние панели показывают существование многих назначенных пиков низкой интенсивности, которые намекают на огромный динамический диапазон охватываемых высокого разрешения ЯМР 1 Н спектроскопии тканевых экстрактах, если осуществляется с использованием оптимизированных параметров эксперимента. Они слабы, но хорошодетектируемые сигналы, потенциально могут быть определены количественно, и в будущем. Несколько обнаруженные метаболиты являются специфическими мозговой ткани, например, нейрон маркер НАА или нейротрансмиттер ГАМК.; Тем не менее, большинство соединений участвуют в широком спектре метаболических путей, которые являются общими для клеток млекопитающих, таких как аминокислоты, с разветвленной цепью органической кислоты, многоатомного спирта, (фосфо) липидов и энергетический метаболизм, а также в гликолиза и glutaminolysis, и в функции, такие как осморегуляции, роста и пролиферации клеток. Звездочка обозначает метил резонанс, проистекающим из метанола примеси. Сокращения: аля, аланин; лаковые, лактат; трео-, треонин; BHB, β-оксибутират; вал, валин; Иль, изолейцин; лей, лейцин; AAB, α-аминобутират; АОБ, α-гидроксибутирата; Тау, таурин; SCY -ins, сцилло -inositol; мио -ins, мио -inositol; GPC, glycerophosphocholine; PC, фосфохолин; чо, холин; CRN, креатинина; Cr, креатин; ГАМК,47; аминобутират; жерех, аспартат; НАА, N -acetylaspartate; Gln, глутамин; Glu, глутамат; сах, сукцинат; Нана, N -acetylneuraminate; переменного тока, ацетат; Gly глицин. Небольшие пики на базе аля дублетного стебля от лактата 13 C спутниковым дублета (верхняя часть). Печатается под Creative Commons Attribution License (ккал) термины из Lutz NW др (2013) головного мозга биохимических путей в экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит и адъювантного артрита:. Сравнительного метаболомики исследования. PLoS ONE 8 (2):. E56101 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
В 31 ЯМР P спектроскопии, маскируя или удаления парамагнитные катионы (в основном железа), несомненно, является необходимостью, поскольку фосфаты легко образуют комплексы с двухвалентных и трехвалентных ионов. Добавление CDTA чтобы экстрактов влияет как спектральная линия ширинойд химические сдвиги; сравнить рисунок 2, верхнюю и нижнюю левую. Линия сужение, выбрав 1000 мм (внизу слева) вместо 200 мм (верхний левый) CDTA было лучшего, но в результате суперпозиции сигналов ФЛ, которые должны быть количественно отдельно (вверху слева). Поэтому, 200 мМ CDTA рекомендуется для водного компонента растворителя PL, все при прочих равных условиях. Кроме того, температура образца во время измерения влияет спектральные ширины линий и химические сдвиги; сравнить рисунок 2, верхнюю и нижнюю право. Линия сужение, выбрав 277 K (внизу справа) вместо 297 К (вверху справа) был лучшего, но в результате суперпозиции сигналов ФЛ, которые должны быть количественно отдельно (вверху справа). Поэтому 297 K рекомендуется в качестве измерения температуры, все при прочих равных условиях. Сравнение двух верхних панелей показывает, что снижение концентрации CDTA от 200 мм (вверху слева) до 50 мМ (вверху справа) только приводит кнезначительное увеличение ширины линии, и в почти неизменном химических сдвигов. Тем не менее, обратите внимание, что концентрация ткани в экстракте 50 мМ CDTA в полтора раза выше, чем это в 200 экстрактом мМ CDTA, объясняя относительно узкие линии в верхней правой панели 13.
Рисунок 2 Фосфатидилэтаноламин (PtdE) регионы фосфолипидов спектров 31 P ЯМР (162 МГц) мозговой ткани выписок из самок крыс Льюиса (верхней левой панели) концентрации мозговой ткани, 236 мг / мл.; Концентрация CDTA и рН в водном компоненте растворителе, 200 мМ и 7,33 соответственно; Измерение температуры, 297 К. PtdE плазмы и SM сигналы хорошо разрешены (внизу слева) концентрация Мозговая ткань, 236 мг / мл.; CDTA Concentration и рН в водном компоненте растворителе, 1000 мм и 7,36 соответственно; измерение температуры, 297 К. PtdE плазмы и SM сигналы перекрываются полностью; они не могут быть решены, несмотря на сокращение ширины линии, по сравнению с верхней левой спектра (вверху справа) концентрация Мозговая ткань, 118 мг / мл.; Концентрация CDTA и рН в водном компоненте растворителе, 50 мМ и 7,14 соответственно; Измерение температуры, 297 К. PtdE и SM сигналы хорошо решены концентрация (Внизу справа) Мозговая ткань, 118 мг / мл.; Концентрация CDTA и рН в водном компоненте растворителе, 50 мМ и 7,14 соответственно; измерение температуры, 277 К. PtdE и SM сигналы перекрываются полностью; они не могут быть решены, несмотря на сокращение ширины линии по сравнению с правом верхнем спектре. Сокращения: PtdE плазма, этаноламин plasmalogen; PtdE, фосфатидилэтаноламина; SM, сфингомиелин; PtdS, phosphatidylserine; СИЗО, фосфатидилхолин. Печатается с разрешения Lutz NW и др. (2010) Многопараметрическая оптимизация 31 P ЯМР спектроскопического анализа фосфолипидов в экстрактах сырой ткани. 1 Химический сдвиг и разделение сигналов. Анал Chem 82 (13): 5433-5440. Copyright 2010 American Chemical Society. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Используя вышеупомянутый протокол (однофазный системы 14; Рисунок 3, вверху слева), большое количество количественному СТМ были обнаружены (Рисунок 3, вверху справа), охватывающих значительную диапазон концентраций (обратите внимание, усеченные сигналы высокой интенсивности). Некоторые из этих сигналов пока еще не назначен (U1, U2, U6). Если пробоподготовки, измерение ЯМР и обработка спектр выполняются, как указано в этом протоколе, спектральное разрешение даже достаточно D обычноetect частичное расщепление некоторых пиков (PtdS, PtdE, PtdE плазмы, AAPtdE; внизу слева). . Как следствие, качественного и количественного анализа дальнейших подгрупп PL можно предусмотренных в будущем Рисунок 3, в правом нижнем углу, иллюстрирует силу рассудительно выбранных параметров обработки частично отдельные сигналы соединений с низкой концентрацией (здесь: PtdC1u, PL, полученный от СИЗО, что не полностью определены, и СИЗО плазмы) резонирующей близко к очень сильных сигналов (здесь: СИЗО).
Рисунок 3 Phospholipid 31 P ЯМР-спектроскопии (162 МГц) мозговой ткани выписок из самок крыс Льюиса. (Верхней левой панели) один-фазная система (слева) был предпочтительнее двухфазной системе (справа). Обычно используется двухфазная система затрудняет правильноеPL количественного потому что большинство из верхней фазы находится за пределами чувствительного объема катушки. (Топ правая панель) Полный 31 P ЯМР спектр ФЛ мозга крысы. Для лучшей видимости слабых сигналов (PtdIP, PtdG), экспоненциальное расширение линии (LB = 3 Гц) была применена. В этом представлении, несколько сигналов PL не хорошо решены, в частности, в регионах СИЗО и PtdE. Для PLs генерирующих более одного сигнала 31 P ЯМР, наблюдаемые ядра подчеркнуты (P ТНП, ВДСД P, P ТНП 2, ВДСД P 2). В настоящее время не присвоенные сигналы обозначаются "U п" (где п = 1, 2, ...). (Нижняя левая панель) PtdE и PtdS регионах же спектра. Для лучшего пикового резолюции, лоренцевы-Gaussian преобразование форма линии был применен (LB = -1 Гц, GB = 0,3). Из этих параметров обработки, многие очень слабые сигналы PL трудно обнаружить. Тем не менее, по крайней мере, два пика могутразличить для каждого PtdE, PtdE плазма, AAPtdE, и PtdS. (Нижняя правая панель) СИЗО области, полученной с теми же параметрами обработки как региона PtdE. Несколько сигналов на базе доминирующей СИЗО резонанса были обнаружены однозначно, в то время как они не могут быть обнаружены в верхнем спектре генерируемого с экспоненциальной уширение линии (AAPtdC, СИЗО плазмы, PtdC1u). Кроме того, в настоящее время неназначенной СИЗО аналоговых, PtdC1u, дальнейшие незначительные резонансы могут присутствовать в сильное поле от СИЗО. Сокращения: PtdIP, фосфатидилинозит фосфатные; PtdIP 2, фосфатидилинозит дифосфат; PTDA, фосфатидная кислота; PtdG, фосфатидилглицерин; CL, кардиолипин; PtdE .., сумма PtdE, PtdE плазмы и AAPtdE; ВДСД, фосфатидилинозит. Для дальнейших сокращений приводится в легенду на рисунке 2. Печатается с разрешения Lutz NW соавт. (2010) Многопараметрическая оптимизация 31 P ЯМР спектроскопического анализа phospholipiDS в экстрактов сырых тканей. 1 Химический сдвиг и разделение сигналов. Анал Chem 82 (13): 5433-5440. Copyright 2010 American Chemical Society. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
| Заготовка и Замораживание мозга крысы | |||
| Дьюар для N 2liq.; морозильные зажим (например, домашние клещи Wollenberger, ссылки 1 и 2, нижней части таблицы.); анестезия камера; Хирургические ножницы; скальпель; 500 мл бутылка с чистящей алкоголя | 1 друг | ||
| Пинцет | 2 | ||
| 1 мл шприц, 10 мл шприц | 1 друг на животное | ||
| 25 G иглы | 2 на одно животное | ||
| Образец ДГОвания | |||
| Типичный объем ткани головного мозга в добыче | 250-350 мг | ||
| Объем MeOH используется в гомогенизации 250 - 350 мг ткани головного мозга | 4 мл | ||
| 5 мл пластиковых пипеток | 3 за экстракта | ||
| 10 мл пластиковая пипеток | 1 за экстракта | ||
| Стекло флакона (≥20 объем мл) | 1 за экстракта | ||
| Хлороформ устойчивостью центрифуги трубки | 1 за экстракта | ||
| Время ожидания после гомогенизации ткани в МеОН (смесь при 4 ° С) | 15 мин | ||
| Вода и CHCl 3 объема добавлен в ткани головного мозга гомогенизировали в 4 мл МеОН | 4 мл каждый | ||
| Время ожидания после смешивания гомогенизированного ткани с водой и CHCl 3 (смесь при -20 ° С) | ночь | ||
| Центрифугирование для разделения Oе водный из органических фаз экстракт (стеклянной трубки центрифуги) | 13000 × г, в течение 40 мин при 4 ° C | ||
| Концентрация раствора (CDTA водной фазы смеси растворителей для растворения извлеченные липиды) | 200 мм | ||
| рН водной фазы смеси растворителей для растворения извлеченные липиды | 7.4 | ||
| Соотношение объема в липида растворитель используется для 31 P анализа PL (CDCl 3: MeOH: решение CDTA) | 5: 4: 1 | ||
| Сумма растворителя А для растворения липидов, извлеченные из 250 - 350 мг ткани мозга | 700 мкл | ||
| Центрифугирование для прядения вниз твердые частицы в образце ЯМР (микроцентрифуга трубка) | 11000 мкг в течение 30 мин при 4 ° C | ||
| рН образца, содержащего ЯМР водорастворимые метаболиты | 7.3 | ||
| Объем пробы переданы ЯМР трубы, после Центробежнаяugation | 600 мкл | ||
| Концентрация MDP в стебле коаксиального вставки для 31 Р-ЯМР | 20 мМ | ||
| ЯМР эксперименты | |||
| Температура пробы во время эксперимента ЯМР (быть скорректированы для минимизации пиковой перекрытие) | 25 ° С | ||
| Спиннинг частоту во время эксперимента ЯМР | 15-20 Гц | ||
| 1 Параметры ЯМР с приобретением | |||
| Растворитель обеспечивая 2 H сигнал блокировки | D 2 O | ||
| Возбуждение ширина импульса, P1 | 11 мкс | ||
| Возбуждение импульсов, усилитель затухание, PL1 | 0 дБ | ||
| Размер FID, TD | 32 к | ||
| FID приобретение Тиме, AQ | 3,283 сек | ||
| Релаксация задержка, D1 | 15 сек | ||
| Задержка подавления растворителя, D4 | 6 сек | ||
| Общее время следования, TR | 24,3 сек | ||
| Ширина спектра в промилле, SWP | 12,47 млн | ||
| Ширина спектра в Гц, SW | 4990 Гц | ||
| Приемник усиления, RG | 512 | ||
| Растворитель подавление (непрерывный) | CW | ||
| Растворитель подавление, усилитель затухание, PL9 | 50 дБ | ||
| Количество переходных, NS | 32 или 64 | ||
| 31 Параметры P ЯМР с приобретением | |||
| Растворитель обеспечивая 2 H сигнал блокировки | CDCl 3 | ||
| Возбуждение импульсов WiDTH, P1 | 9,5 мкс | ||
| Возбуждение импульсов, усилитель затухание, PL1 | 4 дБ | ||
| Размер FID, TD | 16 к | ||
| FID время приобретения, AQ | 2,019 сек | ||
| Релаксация задержка, D1 | 15 сек | ||
| Общее время следования, TR | 17 сек | ||
| Ширина спектра в промилле, SWP | 25 частей на миллион | ||
| Ширина спектра в Гц, SW | 4058 Гц | ||
| Усиления приемника, RG (максимальная) | 16384 | ||
| Протон развязки (композитный развязки импульсов) | CPD | ||
| Протон развязка, усилитель затухание, PL13 | 19 дБ | ||
| Количество переходных, NS | 1500 или 2000 | ||
| ЯМР Обработка данных | 1 H Resolution Enhancement, Gaussian-лоренцевы LineShape Трансформация | ||
| Общая оценка спектра (при необходимости, оптимизировать отдельно для отдельных спектральных областях, используя 0,1 <ГБ <0,4, и -0,6 <LB <-0,2 Гц) | GB = 0,15, LB = -0,2 Гц | ||
| Очень слабые сигналы, например, ароматические кислоты (в качестве альтернативы аподизации с LB ≥ 0,5 Гц) | GB = 0,015, LB = -0,3 Гц | ||
| Посевные площади пиков: использование форма линии подходит для перекрытия резонансов | |||
| 31 P улучшения разрешения, Gaussian-лоренцианом LineShape преобразование | |||
| Общая оценка спектра (оптимизировать отдельно для отдельных спектральных областях, используя 0,05 <ГБ <0,2, и -3,0 <LB <60; -1,0 Гц) | GB = 0,05, LB = -1,0 Гц | ||
| Очень слабые сигналы, например, PtdIP 2, PTDA: аподизация | LB = 3 Гц | ||
| Посевные площади пиков: использование форма линии подходит для перекрытия резонансов | |||
| Ссылки | |||
| 1 Палладино GW, Дерево JJ, Проктор HJ. Изменен замораживания техника зажим для ткани анализа. Журнал хирургического исследования 289, 188-190 (1980). | |||
| 2 Wollenberger, Ристау O, Schoffa Г. [Простая техника для чрезвычайно быстрого замораживания больших кусков ткани]. Pflugers Архив мех умереть gesamte Physiologie де Menschen унд дер Tiere 270, 399-412 (1960). | |||
Таблица 1 Экспериментальные параметры для высокого разрешения 1 H и 31 P ЯМР-спектроскопия мозгапредставлены экстракты тканей. Типичные значения для объемных соотношениях и концентрации паров растворителей и реагентов, используемых в добыче мозговой ткани и подготовки проб ЯМР. Кроме того рекомендуемые значения относятся к образцу рН и температуру измерения, а также сбора и обработки параметров ЯМР. Незначительные изменения могут быть необходимы, в частности, если протокол применены к другим, чем тканях головного мозга. Параметры ЯМР были оптимизированы для измерений на 9,4 Т, и должна быть скорректирована по мере необходимости для спектрометров работающих на различных сильных магнитных полей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ЯМР-спектроскопия является эффективным методом для измерения концентрации химических соединений в растворе в очень воспроизводимым и точным образом. Однако, чтобы получить качественную данные необходимо придерживаться определенных правил, связанных с подготовкой и анализ проб. При определении концентрации метаболитов с помощью спектроскопии ЯМР, ни генерации, ни прием сигнала ЯМР доминирует ошибку подсчета, если интенсивность наблюдаемого сигнала не подходит порог обнаружения (особенно слабого сигнала). Во всех остальных случаях биологическая изменчивость, техники пробоподготовки (эффективность экстракции, физической и химической стабильности соединений, пипеток и весом ошибки и т.д.), и / или выбор сбора и обработки сигнала параметров будет определять точность и достоверность результатов. Очевидно, любые метаболические изменения, происходящие во время сбора урожая ткани также будут отражены в метаболита концентрации полученияред. Таким образом, очень важно, чтобы завершить урожай ткани так быстро, как это возможно, и применять конкретные методы замораживания тканей, таких как замораживание воронкой, если точным в естественных концентрациях быстро метаболизирующих соединений важны (в частности, глюкозы, лактата, АТФ и его катаболитов, АДФ и AMP).
Даже на промежуточной напряженности магнитного поля (9,4 Т) рутинной высокого разрешения ЯМР спектрометра отличной спектров можно получить. Например, в 1 Н ЯМР-спектров в водную фазу экстрактов мозга крысы, сигналы которых разница в химическом сдвиге, Δδ, составляет до около 0,005 частей на миллион (соответствующий 2,0 Гц на частоте 400 МГц резонансной частоты) можно выделить и количественно отдельно. Это показано на частичном отделении (I), в лактат и треонина дублетов, и (II) аланина дублета от небольших пиков на его основе (лактат 13 С спутниковой дублета, рисунок 1,сверху). Спектрометры, работающие при более высоких полей (или даже 14,1 18,8 Т) будет увеличить разрешение и чувствительность Кроме того, хотя эти инструменты менее распространены в лаборатории ЯМР вследствие их высокой стоимости продукции.
Использование 1 Н-ЯМР-спектроскопии, широкий спектр метаболитов могут анализироваться одновременно, то есть в одном приобретения. Чувствительность эксперимента может быть улучшена путем увеличения количества накопленных переходных, хотя этот выбор увеличивает время измерения пропорционально. (Отношение сигнал-шум пропорционален корню квадратному из числа переходных процессов.) Тем не менее, общее максимальное время сбора приведены в приведенном выше протоколе (20 - 30 мин) не должно быть достаточно для практически всех целей, если только в количестве из ткани, доступной для извлечения очень ограничено. Кроме того, используя наиболее ЯМР-чувствительного ядра (протона), метаболомики 1 H-ЯМР-спектроскопии имеет то преимущество, что комплексноебазы данных будут доступны для различных напряженностей поля и образец рН значения 10. Кроме того, программное обеспечение для автоматического или полуавтоматического оценки спектра стала доступна 10.
В то время как 1 Н ЯМР спектры тканевых экстрактах может быть также решена без того хелатообразователей, это уже не актуально для 31 спектров ЯМР Р. В самом деле, концентрация хелатирующего агента (например, ЭДТА или CDTA) оказывает существенное влияние как на ширину линии и химического сдвига 31 Р ЯМР-сигналов, вытекающих из фосфорилированных метаболитов. Повышение концентрации CDTA в экстракте уменьшается 31 P ЯМР ширины линий, но это преимущество, может быть важнее мелких различий между химическими сдвигами, Δδ, соседних пиков. Таким образом, количество хелатирующего агента должна быть оптимизирована для ширины линии и химического сдвига вместе. В липидных экстрактов, эти два спектральные параметры являются significantly зависит от общей концентрации образца, т.е. количество ткани, извлеченной, но также от величины рН и температуры образца во время измерения ЯМР. Следовательно, любая оптимизация условий измерения должны учитывать комбинированные эффекты всех экспериментальных параметров, участвующих, некоторые из этих не будучи добавки. Сложность этой ситуации иллюстрируется поведением спектров PL 31 P ЯМР показано на рисунке 2. Хотя концентрация низкая ткани (118 мг / мл), самая низкая температура (277 К) и самая высокая концентрация CDTA (1000 мм) испытания приведет к низкой ширины линии, предложил протокол рекомендует использовать концентрации умеренной ткани (236 мг / мл), промежуточной концентрации CDTA (200 мм) и комнатной температуре (297 К), чтобы избежать дублирования сигнала.
Хотя условия пробоподготовки и приобретения спектра имеют первостепенное значение,Роль параметров обработки спектров в извлечении максимум информации от приобретенных необработанных данных, не следует недооценивать. Конкретный набор параметров обработки мой быть идеально подходит для обнаружения и количественного PLS, которые происходят при низких концентрациях; Однако, тот же набор параметров может скрывать отдельные пики "переполненных" спектральных областях (рисунок 3, вверху справа). И наоборот, параметры обработки, обеспечивающие оптимальное усиление разрешения в регионах сильно перекрывающихся резонансов (рис 3, внизу) сделает пики низкой интенсивности обнаружить. Последние события, в том числе и комплексной PL 31 Р базе данных ЯМР 13,14, значительно облегчит анализ спектров ЯМР 13,14.
В конечном счете, цели базового приложения должны определить критерии оптимизации, то есть желаемого баланса спектральным разрешением, чувствительностью, точностью метаболита quantification, скорость и другие факторы. Например, рекомендуется один-фазная система для PL анализ позволяет более надежными и эффективными PL количественного чем двухфазных системах (рисунок 3, вверху слева), и обеспечивает высокую спектральную разрешением, а также достаточную чувствительность для количественного определения менее обильными ЯП . Тем не менее, в тех случаях, когда лучше разделения сигналов имеет гораздо более высокий приоритет, чем эффективного и точного количественного определения, использование более высокий процент хлороформ-D в смеси растворителей может быть предпринято, хотя это легко приводит к разделению фаз в образце. Если это так, то объем нижней фазы должны быть определены для получения абсолютных количеств PL (PL мг, за г ткани или мг общего белка).
В протонных развязкой экспериментов гетероядерными ЯМР, интенсивность сигнала может быть изменено ядерных Оверхаузера эффектов (НЭ), в дополнение к насыщению вследствие быстрых схем приобретения. Если не принять эти эффекты приводят к метаболита кваОшибки ntitation. Есть два альтернативных стратегии борьбы с этой проблемой. В рамках первого подхода, отдельные переходные процессы приобретения разделены большими задержками. Этот метод позволяет избежать насыщения или НЭ, но приводит к относительно долгих экспериментов; его следует использовать, если точные и точные результаты необходимы. В некоторых случаях, может иметь приоритет следует уделять быстрого сбора спектра, в частности, для очень разбавленных образцов, которые могут быть измерены с помощью только большое количество переходных процессов. В таких случаях добавление парамагнитной релаксации агентов к образцу позволило бы быстрое получение данных без насыщения или NOE. Кроме того, могут быть использованы быстрого сбора данных без добавления парамагнитных агентов. Последний метод требует коррекции областей сигнала путем поправочных коэффициентов, которые должны быть определены для каждого резонанса ЯМР, тогда как присутствие релаксационных агентов вызывает некоторое расширение сигналов ЯМР, которые могут уменьшить точность количественного метаболита дляпереполненные областях спектра. Как правило, оптимальный выбор условий эксперимента не только определяется типом образца, но также и информацию, чтобы извлечь из эксперимента 13. Если высокий приоритет должен быть дан к быстрому анализу, а обильными метаболитов, без необходимости в высокой точностью и аккуратностью, это может быть достаточным для измерения высококонцентрированные образцы и использовать короткое время повторения, возможно, с парамагнитный агент релаксации, добавленной к образцу. В отличие от этого, если точное количественное определение большого количества метаболитов является более важным, чем скорость, то предпочтительно использовать менее концентрированные экстракты и принимает длинные ЯМР раза приобретения, как показано с помощью протокола, представленной здесь. Кроме того, если тот или иной исследовательский проект подчеркивает конкретные метаболиты, экспериментальные условия можно регулировать для достижения оптимального спектрального разрешения для спектральных областях в вопросе. Протокол и обсуждение представлены здесь может служить в качестве руководства для Optimization из метаболомики анализа сырой тканевых экстрактов с помощью спектроскопии ЯМР.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Virbac | Vetflurane | Anesthetic for animals |
| Isoflurane vaporizer | Ohmeda | Isotec 3 | Newer model available: Isotec 4 |
| Scalpel, scissors, forceps, clamps | Harvard Apparatus Fisher Scientific |
various various |
Surgical equipment for animals |
| Freeze-clamp tool | homebuilt | n/a | Tong with aluminium plates, to be inserted in liquid nitrogen for cooling |
| Dewar | Nalgene | 4150-4000 | |
| Liquid nitrogen | Air Liquide | n/a | |
| Nitrogen gas | Air Liquide | n/a | |
| Nitrogen evaporator | Organomation Associates | N-EVAP 111 | Can be replaced by homebuilt device |
| Mortar | Sigma-Aldrich | Z247472 | |
| Pestle | Sigma-Aldrich | Z247510 | |
| Tissue homogenizer | Kinematica | Polytron | With test tubes fitting homogenizer shaft |
| Electronic scale | Sartorius | n/a | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | M3641 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 366910 | |
| Glass centrifuge tubes | Kimble | 45500-15, 45500-30 | Kimax 15 ml, 30 ml tube |
| Microcentrifuge tubes | Kimble | 45150-2 | Kimax 2 ml tube; should replace "Eppendorf" tube if compatible with centrifuge rotor |
| Polystyrene pipettes | Costar Corning | Stripettes | 5 and 10 ml volumes |
| Deuterochloroform | Sigma-Aldrich | 431915 | 99.96% deuterated |
| Deuterium oxide | Sigma-Aldrich | 423459 | 99.96% deuterated |
| Deuterium chloride | Alpha Aesar | 42406 | 20% in deuterium oxide |
| Sodium deuteroxide | Sigma-Aldrich | 164488 | 30% in deuterium oxide |
| Lyophilizer | Christ | Alpha 1-2 | |
| Cold centrifuge | Heraeus | Megafuge 16R | |
| pH meter | Eutech Cybernetics | Cyberscan | |
| CDTA | Sigma-Aldrich | D0922 | |
| Cesium hydroxide | Sigma-Aldrich | 516988 | |
| NMR tubes | Wilmad | 528-PP | |
| NMR stem coaxial insert | Sigma-Aldrich | Z278513 | By Wilmad |
| NMR pipettes | Sigma-Aldrich | Z255688 | |
| Pipettes | Eppendorf | Research | With tips for volumes from 0.5 to 1,000 μl |
| Pipet-Aid | Drummond | XP | |
| NMR spectrometer | Bruker | AVANCE 400 | including probe and other accessories |
| NMR software | Bruker | TopSpin 1.3 | newer version available: Topspin 3.2 |
| Water-soluble standard compounds | Sigma-Aldrich | various | |
| Phospholipid standard compounds | Avanti Polar Lipids Doosan Serdary Sigma-Aldrich |
various various various |
Source for plasmalogens, but may be <70 - 80% purity |
| Methylenediphosphonate | Sigma-Aldrich | M9508 | |
| TSP-d4 | Sigma-Aldrich | 269913 |
References
- Manger, P. R., et al. Is 21st century neuroscience too focused on the rat/mouse model of brain function and dysfunction. Front Neuroanat. 2, 5 (2008).
- Buxbaum, J. D., et al. Optimizing the phenotyping of rodent ASD models enrichment analysis of mouse and human neurobiological phenotypes associated with high-risk autism genes identifies morphological, electrophysiological, neurological, and behavioral features. Mol Autism. 3, 1 (2012).
- Papaioannou, V., Behringer, R. R. Mouse Phenotypes A Handbook of Mutation Analysis. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Woodbury. (2004).
- Yu, F. H., et al. Reduced sodium current in GABAergic interneurons in a mouse model of severe myoclonic epilepsy in infancy. Nat Neurosci. 9, 1142-1149 (2006).
- Mallolas, J., et al. A polymorphism in the EAAT2 promoter is associated with higher glutamate concentrations and higher frequency of progressing stroke. The Journal of Experimental Medicine. 203, 711-717 (2006).
- Crusio, W. E., Sluyter, F., Gerlai, R. T., Pietropaolo, S. Behavioral Genetics of the Mouse Genetics of Behavioral Phenotypes. Vol. 1, Cambridge University Press. New York. (2013).
- Viola, A., Saywell, V., Villard, L., Cozzone, P. J., Lutz, N. W. Metabolic fingerprints of altered brain growth, osmoregulation and neurotransmission in a Rett syndrome model. PLoS ONE. 2, e157 (2007).
- Lutz, N. W., Sweedler, J. V., Wevers, R. A. Methodologies for Metabolomics. , Cambridge University Press. New York. (2013).
- Rabinowitz, J. D., Purdy, J. G., Vastag, L., Shenk, T., Koyuncu, E.
- Wishart, D. S. Methodologies for Metabolomics. Wevers, R. A., Lutz, N. W., Sweedler, J. V., et al. , Cambridge University Press. New York. (2013).
- Ponten, U., Ratcheson, R. A., Salford, L. G., Siesjo, B. K. Optimal freezing conditions for cerebral metabolites in rats. Journal of Neurochemistry. 21, 1127-1138 (1973).
- Henry, P. G., Oz, G., Provencher, S., Gruetter, R. Toward dynamic isotopomer analysis in the rat brain in vivo automatic quantitation of 13C NMR spectra using LCModel. NMR Biomed. 16, 400-412 (2003).
- Lutz, N. W., Cozzone, P. J. Multiparametric optimization of (31)P NMR spectroscopic analysis of phospholipids in crude tissue extracts 2 Line width and spectral resolution. Anal Chem. 82, 5441-5446 (2010).
- Lutz, N. W., Cozzone, P. J. Multiparametric optimization of (31)P NMR spectroscopic analysis of phospholipids in crude tissue extracts. 1. Chemical shift and signal separation. Anal Chem. 82, 5433-5440 (2010).
- Lutz, N. W., Cozzone, P. J. Methodologies for Metabolomics. Lutz, N. W., Sweedler, J. V., Wevers, R. A. , Cambridge University Press. New York. (2013).
- Lutz, N. W., Fernandez, C., Pellissier, J. F., Cozzone, P. J., Beraud, E. Cerebral biochemical pathways in experimental autoimmune encephalomyelitis and adjuvant arthritis a comparative metabolomic study. PLoS ONE. 8, e56101 (2013).
- Lutz, N. W., Cozzone, P. J. Principles of multiparametric optimization for phospholipidomics by 31P NMR spectroscopy. Biophys Rev. 5, 295-304 (2013).
- Pearson, G. A. Shimming an NMR magnet. , University of Iowa. Iowa City. (1991).
- Lane, A. N., Fan, T. W. M., Higashi, R. M. Biophysical tools for biologists. Correia, J. J., Detrich, H. W. Vol. 1, In vitro techniques, Academic Press. Waltham. (2008).
- Peeling, J., Wong, D., Sutherland, G. R. Nuclear magnetic resonance study of regional metabolism after forebrain ischemia in rats. Stroke. 20, 633-640 (1989).
