Introduction
マウスモデルは、脳研究1において広く利用されている。遺伝子型-表現型相関は、他2-6一方でRNAおよび/ またはタンパク質レベルでの遺伝子発現、及び形態学的、機能的、電気生理学的および/ または行動的表現型を研究することによって、マウスおよびラットの脳において研究されてきた。しかし、完全な遺伝子型と表現型の連結機構を理解するためには、下流のタンパク質の発現、 すなわち分子事象を調査するために不可欠である。酵素が7を作用する際の生化学的基質の代謝。この要件は、過去10〜15年間で、生物学8,9の多くの支店での代謝研究のルネサンスに、つながった。古典的な代謝の研究は、多くの場合、特定の経路の詳細に焦点を当ててきたが、新たなメタボロミクスアプローチが検討中の組織のグローバルな代謝プロファイルのすべての包括的な調査を目指している。この概念の1つの結果は、特定の代謝経路および/または化合物のクラスの偏りを最小限にする分析ツールが明らかに必要である。しかし、古典的な生化学的アッセイは、アッセイを行う前に指定する必要がある特定の分析物の特定の化学反応に基づいている。対照的に、核磁気共鳴（NMR）分光法および質量分析（MS）（i）のような分光技術は、生化学的化合物の特定の分子（物理的）特性に基づいて、それぞれがスペクトル中の1つまたはいくつかの別個の信号が生じる一つの実験の過程で検出された。および（ii）実験ごとに異なる多数の化合物を検出する。
このように、各スペクトルは、代謝物の全範囲を組み合わせた情報が含まれています。事前選択は測定されるべき分析物の性質について説明する必要がないので、このような理由から、分光学的方法は、メタボロミクスのための適切なツールである8
NMR分光法およびMSは、多くの代謝物の分析のために交換可能に使用することができますが、それぞれの方法は、最近10日された特定の長所と短所を持っています。簡潔には、NMR分光法は、通常、粗抽出物から行うことができ、分析の前にサンプル化合物のクロマトグラフ分離を必要としない。対照的に、MSは、質量分析イメージングのような特定の最近の発展を除いて、ガスまたは液体クロマトグラフィー（GCまたはLC）分離で動作する。異なる糖の共振線路は、プロトン（1 H）NMRスペクトルにおいて有意に重なるので、そのような糖の分析のようないくつかの特殊なケースでは、LC分離は、同様にNMR分光法のための必需品となってもよい。 CHRのないそれにもかかわらず、1 H NMR分光法omatographic分離は最も人気のある、ほぼ普遍的に適用されたメタボロミクスNMR法のまま。一般的に、サンプル調製は、NMR分光法の場合よりもMSのためのより多くの時間がかかり、複雑である。マトリックス効果に起因する深刻な問題は、彼らが大幅に減衰された信号につながる可能性があり、MSに比べてNMR分光法であまり一般的である。代謝産物の定量は、いずれの方法で達成することができる。しかし、複数の標準化合物に起因代謝産物間のマトリックス効果及びイオン化効率の変動にMSのために必要とされる。適切な測定条件で、後者の方法は本質的に観察された核によって厳密に線形NMR応答を定量的おかげであるため、これとは対照的に、試料ごとに1つの標準は、NMR分光分析に必要とされる。 NMRの主な欠点は、その比較的低い感度である。 MSは、特定のLC-MSで、数桁NMRよりも敏感である。この理由のために、MSは、NMRのために好まれるべきである非常に低い濃度で存在する化合物の分析。一方、NMR実験の非破壊的性質は、MSを超える明確な利点である。このように、NMRは、1 H、リン31（31 P）、炭素13（13 C）、フッ素-19（19 F）などの異なるNMR活性核のために、 例えば 、同じサンプルを繰り返し実行することができるなど 、MS測定とは対照的にない物質がNMRによって消費されないように。
NMRおよびMSの両方が異なるモードで使用することができ、それぞれが特定の化学的特性を有する化合物の検出のために最適である。ほとんど全てのリン酸化された代謝物はまた、プロトンを含んでいますが、例えば、31 P NMRは、多くの場合、適度に集中し、リン酸化化合物の分析のための1 H-NMRより適しています。後者はしかし、それらの1 H NMRシグナルは、他の、非リン酸化化合物の1 H NMRシグナルによって不明瞭にすることができる明らかに31 P NMRスペクトルにバックグラウンド信号は発生しません。 13 C NMRの特別な場合は、ほぼ独占的に重要である一方、アナログ状況では、19 F NMR分析は、フッ素化化合物、 例えば 、フッ素化剤（内因性代謝からのない背景信号）のために好ましいことがあるかの13 Cの運命により13 C同位体（ 約 1％）の非常に低い天然存在度に、続いする必要がある外因性の代謝前駆体を標識した。多くの質量分析計は、陰イオンモードまたは陽イオンモードのいずれかで動作します。したがって、観察されるイオンは正または負に帯電しているかどうかを先に分析知ることが重要である。この方法は、低コストで重要な代謝物濃度の多数を生じるので、私たちはサンプル調製aのに必要な（i）の時間的に1 Hおよび31 P NMR分光法による脳組織のメタボロームを分析するためのプロトコルに焦点を当てるND（ⅱ）の努力は、代謝物の定量のために必要。全ての実験は、標準的な湿式化学実験室の装置および高分解能NMR分光機能を用いて行うことができる。さらなる要件は、以下のプロトコルの項に記載されている。
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Protocol
注：ANIMAL倫理声明
ラットに対する動物研究は、フランスで有効なガイドラインに従って、地元の倫理委員会（＃40.04、エクス·マルセイユ大学医学部、マルセイユ、フランス）により承認された。
1収穫と凍結ラット脳
- 必要な項目を準備し、液体窒素（。のN 2liq）デュワー内の凍結クランプ（少なくとも2-3のLボリューム）を維持するのに十分な大きさである。麻酔薬（ 例えば 、イソフルラン、またはケタミン/キシラジン）;麻酔チャンバー;無菌解剖ツール：外科用ハサミ、外科用メス、鉗子;組織ワイプクリーニングアルコール（エタノール）とボトル;針（25 G）; 1ミリリットルと10ミリリットルの注射器。粘着テープとラベルアルミニウムシート（ 約 10×10センチ）。個別の凍結クランプされたラットの脳をラップするシートを使用してください。
注：液体窒素を取り扱う際は、必ず保護手袋および眼の保護ゴーグルやマスクを着用！ - N個の2liqとデュワーを満たします。、自由に置くデュワー内の熱意クランプ。デュワー内のN 2liqの量が（;各凍結クランプ中に蒸発するN個の2liqの量は、クランプの大きさに依存する数リットル）を繰り返し凍結クランプ手続きのために十分であることを確認してください。
- （ 例えば 、イソフルランによる、またはケタミン/キシラジン混合物の腹腔内注射により）、動物を麻酔。頭皮を除去し、頭蓋骨を開いたときに、出血を防ぐために心臓穿刺により安楽死に進みます。 手順以下の1.4から1.7には 、この標準的な手順について説明します。
注：漏斗凍結Nで麻酔動物の脳をすることによって、グルコースと高エネルギーの代謝物、犠牲ラットの最大保存を必要とする特別なプロトコルでは、頭皮の後退後に11 2liq。そして、死後の代謝12を最小化するために断続的なN個の2liq下頭蓋骨から脳を解剖。 - アルコールをクリーニングして、ラットの頭部を湿ら。 （ⅰ）レムに外科用ハサミを使用してくださいオベ頭皮と頭蓋縫合に沿って（ii）のオープン頭蓋骨。
- さらに頭蓋骨を開くために鉗子を使用し、上下逆さまにヘッドを位置決め、オープン頭蓋骨の下から脳全体を削除する。迅速組織ワイプを用いて血液の目に見える痕跡を削除します。脳半球の代謝的及び形態学的に対称である場合には、外科用メスで切開することにより、他の半球からそれを分離した後、代謝解析のための半球のいずれかを使用するのが便利である。必要であれば、そのような組織学などの他の脳研究のために、残りの半球を使用しています。
- すぐに削除デュワーがN 2liqからクランプを-filled凍結、1内面、クランプに全体またはハーフラット脳を置き、すぐにN個の2liqにクランプを凍結挿入しっかりと圧縮されたクランプを保持しながら、デュワーを-filled。それは1.3〜1.6は、もはや60秒よりかかる手順ないことを確認します。
- 1-2分後、デュワーからオープンクランプをクランプを凍結除去クランプから凍結した脳組織を緩め、ラップ適切に標識されたアルミニウムシートでの凍結組織（上記1.1参照）。ラベルが判読可能であり、サンプルがラップされた後、所定の位置にしっかりと留まることを確認してください。すぐにN個の2liqに包まれたサンプルを配置します。凍結した脳組織の融解を避けるために、可能な限り迅速に全体の手順を実行します。
- 代謝物抽出まで-80℃でのN 2liqまたは冷凍庫で凍結されたサンプルを保管してください。
注：生物学的サンプルは一年以上保存されるたびに、N個の2liq温度での貯蔵は-80℃よりも好ましいことである。また、これは、このプロトコルの残りの部分に適用されます。
代謝物の抽出手順の調製
- 組織ホモジナイザーと一致する試験管（、通常はプラスチック製のホモジナイザーシャフトの直径に応じて、例えば 、内径10mmなど）を準備する。電気ホモジナイザーではなく、手動で駆動さホモジナイザー（組織グラインダー）を使用します。前ボルテックスおよび実験室のバランスを削減する。
- 砕いた氷で満たされたバケツを用意します。 （250-350 mgの凍結した脳組織につき各4ミリリットル）氷上でメタノール、クロロホルムと水の十分なquantititesしてください。
- ホールピペット及びバイアルを準備します。
- 氷上でスクリューキャップと場所（組織抽出液ごとに1つのバイアル）でガラスバイアル（≥20容）を準備します。クロロホルムに耐性テフロンセプタムスクリューキャップを取り付けます。
- クロロホルムを分配するためのメタノールと水、そしてガラスピペットまたはハミルトンシリンジを分配するための5ミリリットルのプラスチックピペットを準備します。組織ホモジネートおよびメタノールの混合物を移送するための追加のプラスチックピペット（5または10ミリリットル容積）を準備。
- すべてのガラス器具は、蒸留水で十分にすすぎ、慎重に微量の不純物、特に、NMR検出可能なギと酢酸を除去するために、使用前に乾燥されていることを確認します。
- モルタル中のN 2liq、場所の磁器の乳棒で磁器モルタルを充填し、N個の2リットルを補充IQ。乳鉢と乳棒の温度が十分に低くなるまで窒素が蒸発する。乳鉢でN個の2liq少量にしてください。
代謝物の3。抽出
- ストレージ（N個の2liqタンクや-80℃の冷凍庫）から凍結した脳組織のサンプルを削除します。その後、すぐに部分的にN個の2liqで満たさ乳鉢に組織サンプルを移す。
- 簡単に組織の均質化のために使用した試験管に収まる小さな部分に凍結した脳組織を破壊するために、N 2liq -cold乳棒を使用してください。それでもアルミシートに包まれながら、プロセスでモルタルの外に投影されてから凍結した組織片を防止するために、組織を破壊する。 （結露のリスク増加）試験管への転送がより困難になるだろう。このような粉末に凍結組織を粉砕しないでください。重要：手順全体を通して、深い凍結したサンプルを維持するために必要な乳鉢にN個の2liqを追加します。
- ミックスS凍結した脳組織のモール片は完全に、氷冷メタノール（250-350 mgの脳組織のために4ml）で充填された試験管に250-350 mgの転送を量る。凍結組織片が追加されるたびに、組織ホモジナイザーで直ちにこれらを均質化する。
注：回避するために、すぐにこの全体の手順を実行します（i）のサンプルのサンプル重量、及び（ii）加熱融解を過大評価につながる試料上の水の著しい結露。個別の組織片は、均質化プロセスの開始時に凍結状態にあるべきである。 - 凍結ラット脳サンプルの最後のピースは、試験管、均質化に追加された後、≥20容のガラスバイアル、近いスクリューキャップにホモジネートを転送し、氷上で15分間放置。試験管の体積が≥4mlのメタノールために十分に大きくない場合、この混合物を移す、凍結脳組織の一部を均質化するために小さいメタノールボリュームを使用するガラスバイアルと、新鮮なメタノールで残留組織片をホモジナイズ続ける。総メタノール体積が250-350 mgの脳組織あたり4 mlであることを確認してください。
- 徹底的ホモジネート、渦への氷冷クロロホルム（ すなわち 、250〜350 mgの脳組織あたり4 ml）と同じボリュームを追加し、15分間氷上に放置。
注：特にクロロホルム、揮発性溶剤を取り扱う際には、必ず換気された化学フードを使用する！ - 同体積の水を追加します（ つまり 、250〜350 mgの脳組織あたり4 ml）のホモジネート、ボルテックスに徹底的に、-20℃で一晩放置する。
相分離し、溶媒を蒸発させる4。準備
- 冷たい遠心（4℃、最大半径で13000×g）で遠心管を準備します。後者はクロロホルムに耐性≥20容、であり、13000×gでの遠心力に耐えることができていることを確認してください。なり、専用のガラス製遠心管を使用したが、蒸留水で（すべてのガラス製品など）すすぎフォアの使用（2.3参照）。
- 十分に洗浄したガラスパスツールピペットおよび適切propipettor（電球、手動ピペットポンプ、自動ピペットエイド/ピペッター、 等 。）を準備します。
- クロロホルムに耐性である必要がある一方は脳試料、（ガラスまたはテフロン製）当たり2つの付加的な十分に洗浄チューブ（≥15容）を調製し、（メタノール、或いはガラスに対して耐性プラスチック製）メタノール他方。
- （市販または自家製）溶媒蒸発装置を準備します。この装置は、揮発性溶剤を含む抽出液の表面上に向けられる乾燥窒素ガス（メタノール、クロロホルム）の細かく制御ストリームを提供することを確認してください。
- 氷上でのサンプル輸送のための1、および蒸発プロセスの間に冷たいサンプルを維持するための別の1：氷で満たされた二つの追加トレイやバケツを用意します。
- 凍結乾燥機を準備します（凍結乾燥機）を、凍結乾燥のために必要な材料は、（i）1 50mlの遠心管または真空の丸底フラスコあたりエキス、及び（ii）Nの2liqは、サンプルの水相（試料当たり≤0.3L）を凍結した。遠心管を使用する場合、また凍結乾燥に適したワイドネック真空濾過瓶を準備。
5。相分離し、溶媒を蒸発させる
- 完全な相分離のために、13000×gで40分間、4℃のクロロホルム耐性遠心管（≥20容）と遠心分離機にメタノール/クロロホルム/水/脳組織ホモジネートを（3.6参照） を転送します。
注：2相は、沈殿したタンパク質の層によって分離され、形成することになる。アッパー（軽い）相は水、メタノール、溶解している水溶性の代謝物で構成され、一方、より低い（重い）相が、メタノール、クロロホルム、溶解させた脂質で構成されています。 - 適切な≥15mlチューブ（メタノールに耐性プラスチックまたはガラス）に上相を転送するためにパスツールピペットを使用してください。私にしてくださいCE。
- 適切な≥15mlのチューブ（ガラスまたはテフロン）に下相を転送するために、新鮮なパスツールピペットを使用してください。氷の上に保管してください。
- それは総タンパク質の決定のために使用される場合、-80℃で沈殿したタンパク質の層を保存;あるいは破棄します。
- 氷の上で水/メタノール相（5.2を参照）でチューブを保持し、抽出液の表面上に乾燥窒素流を流すことにより、メタノールを蒸発させる。代わりに、静かにバブル窒素抽出液を通して。窒素バブリングはもはや抽出液中の体積減少を引き起こしたときに蒸発プロセスを終了していない。この時、凍結乾燥を続行（5.7を参照）、またはチューブを-80℃でサンプルを凍結し、凍結乾燥の維持のための準備ができるまで（スクリューキャップまたはパラフィルム）を閉じた。
- 氷の上でメタノール/クロロホルム相（5.3参照）でチューブを配置し、suの上に乾燥窒素流を流すことにより、メタノールを蒸発させる抽出液のデータポート。すべての溶媒を蒸発すると、プロセスを終了し、チューブを閉じた状態でNMR解析のための準備ができるまで（スクリューキャップまたはパラフィルム）-80℃でサンプルを維持する。
- 凍結乾燥のための水相を調製
- メタノールの蒸発プロセスの終了（5.5を参照）した後、十分に洗浄した50ml遠心チューブにサンプルを移す（この試料を凍結した場合、解凍転写前）。別の方法として、真空丸底フラスコに移す。
- 部分的にチューブまたはフラスコの内面が漸次凍結された液体によって覆われるように、Nの2liqに挿入された遠心分離管（又は丸底フラスコ）を回転させることによって抽出液を凍結する。わからないN個の2liqを行います。レセプタクルを入力することができます。
- すべての液体が凍結されると、蒸気を逃がすためにパンクした蓋またはスクリューキャップ付きチューブをカバーし、広いネック真空フィルターボトルにチューブを配置します。
- アタ後に凍結乾燥を開始チン凍結乾燥機にフラスコまたはボトル。
- サンプルが完全に乾燥している時に、凍結乾燥プロセスを終了します。 NMR分析に使用するまで（タイトキャップ付き！）、閉じたチューブ内で-80℃でサンプルを保管してください。
注：通常せいぜい24時間、凍結乾燥のために必要とされる。いくつかのサンプルは、凍結乾燥機の設計に応じて、同時に凍結乾燥し、広口瓶または丸底フラスコ中で遠心管を使用するかどうかにすることができる。
NMR試料の6。準備
- 店舗で乾燥させ、非常に低温で凍結乾燥された抽出物（≤-80°C）。 直ちに NMR実験の前に、NMR試料を調製するための凍結乾燥物を再溶解させる。
注：溶液中および/または室温付近での保存サンプルは、サンプルの劣化を生じ得る！ - 以下のように、キレート剤、トランス-1,2 - cyclohexyldiaminetetraacetic酢酸（CDTA）の水性200mMの溶液を調製する。
- 試験管や遠心管に純水（ 例えば 、20 ml）を追加し、200 mM溶液を生成するのに必要なCDTA粉末の量を追加する。
注：CDTAの酸形態がCDTA塩ではなく、使用されたことから、pHが非常に低いので、CDTAのかなりの割合は、水溶性ではありません。 - 慎重に徹底的に各添加後CDTA溶液、および渦にCsOHを粉末の量を増加、段階的に追加する。
NOTE：CDTA可溶性画分は、水溶液中のCsOH含量の増加と共に増加する。 「overtitration」を避け、 すなわち CDTA溶液にCsOHを、化学量論量よりも少ないを追加します。 - ほぼすべてのCDTA粉末が解散されたときは、各CsOHを添加および徹底的なボルテックスした後のpHの測定を開始。最終的なpHは（ 表1）に達したときにCsOHを追加を終了します。
注：この時点では、すべてのCDTAは解散いたします。 CDTAに対する対イオンとしてのCs +を使用することはGENERです同盟国のNa +またはK +よりも好ましい。小さ いイオン半径を有し、硬い酸でのNa +とK +とは対照的に、Csの+は 、その大きなイオン半径によるソフトルイス酸である。あまり容易に行うことのNa +およびK +よりリン酸塩（ハード塩基）との結果として、CS +複合体を形成する。複合体形成は、特に中間イオン交換に遅い条件下で、NMR線幅を増加させる傾向があるので、これはリン酸化された代謝物の31 P NMR分光法のために有利で ある。
- 試験管や遠心管に純水（ 例えば 、20 ml）を追加し、200 mM溶液を生成するのに必要なCDTA粉末の量を追加する。
- 4：1、リン脂質（PL）の31 P NMR分析のために、5（乾燥重クロロホルム（CDCl 3中）からなる溶媒混合物の700μlの脂質（5.6を参照） を 、メタノールおよび6.2に記載のように調製CDTA液を溶解する体積比）。マイクロチューブにサンプルを移す。レジストクロロホルムで直接変位（または容積）マイクロピペットを使用してください両工程におけるアリヒント。
メモ：以下のパラメータのいずれかを変更すると、PL 31 P NMRスペクトル13-17の外観（化学シフトや線幅）に影響することに注意してください：
（ⅰ）体積比を CDCl 3：メタノール：CDTAソリューション
（ⅱ）全溶媒量使用
（iii）は、溶媒の水性成分のpH
溶剤の水性成分の（ⅳ）CDTA濃度。
注：これらのサンプルパラメータの一般的な微調整（ 表1）は不要であり、特別な場合には、所望であれば、細心の注意を払って行われるべきでは。溶媒の体積比を変更すると、簡単に1つではなく均一相の二相からなる系の形成をもたらす。一相系は、ほとんどのアプリケーション13,14の二相系よりも実用的であることが見出された。 - 水溶性代謝物の1 H NMR分析のために、（5.8を参照）で凍結乾燥物を溶解ミリモルの範囲で3-（トリメチルシリル）プロピオン-2,2,3,3-d4の酸ナトリウム塩（TSPD 4）を含有する700μlの重水（D 2 O）（TSPD 4 0.05％Tween20を含むD 2 Oは市販されている） 。マイクロチューブにサンプルを移す。
- 重水素ライド（DCL）とナトリウム重水素（NaOD中）ソリューション、少量（ 約 2μl）を加えることによって7.3に得られた水性抽出液のpHを調整する。まず、0.02 NのDClまたはNaOD中のソリューションで始まります。 2または3に続く追加が十分なpH変化を起こさない場合は、0.2 NのDClまたはNaOD中のソリューションを続行します。 overtitrateないように注意してください。
注：必要なのDClまたはNaOD中の溶液の全体量は、抽出された脳組織の量に依存する。正確な代謝物の定量のために、この値を確認します。ほとんどの場合、追加のDClとNaOD中のソリューションを組み合わせたボリュームは（NMR試料量の1％に近い）事実上無視できるはずです。
- 最良の結果を得るために、（162メガヘルツ31 P、または400MHzの1 H共鳴周波数に対応する、≥9.4テスラの磁場強度）多核高分解能NMR分光計を使用する。 31 Pコイルのほかに、31 P NMRプローブは、プロトンデカップリングのための1 Hコイルを有していることを確認してください。所望の目標値へのNMRプローブのセット温度調節（通常25°C）。
注：プローブの温度が安定化するために10〜20分を必要とするかもしれない！ - 遠心分離機PLエキス、4℃でマイクロ遠心チューブ内の溶液（6.3を参照）、30分間11000×gで、試料中の固体残留物をスピンダウンします。高品質のNMR管（5ミリメートル、外径）に上清の600μlのを転送します。
- 化学シフト参照のためのpH 7.0の水性20mMのメチレンジ（MDP）溶液で満たし、適切な同軸挿入ステムを準備および定量。 PL抽出液で満たされたNMR管中でこの挿入を置きます。
- NMR磁石に適切なスピナーと転送したNMRチューブを取り付けます。今15〜20 Hzでサンプルを回転し、サンプルが設定温度（ 約 10分）に調整されるまで待ちます。
- 注意深くシムコイル電流18軸上および軸外調整することにより、サンプルを横切る磁場不均一性を最小限に抑える。
- 磁場強度の関数として変化し得る最適値、（9.4 Tシステムのために、推奨パラメータ値については表1を参照）NMRスペクトル取得パラメータを設定する。
- 実験ごとのトランジェントのセット数（= NS）。
- 唯一の最も普及しているのPLは、高精度で定量される場合、約80（データ収集、約 20分の合計時間）にNSを設定します（ホスファチジルコリン（PtdCho）、ホスファチジルエタノールアミン（PtdEtn）、エタノールアミンプラスマローゲン）。
- dは約100〜200（合計期間にNSを設定してくださいATA取得1〜2時間）低濃度のPLは、（アルキル - アシル - ホスファチジルコリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジル酸）定量することになる場合。
- （データ収集7-10時間の合計時間、一晩実験）約1,500〜2,000にNSを設定し、非常に低濃度のPLを定量しようとする場合、 例えば、ホスファチジルイノシトールモノと二リン酸（PtdIPとPtdIP 2）、カルジオリピン、リゾ-PLS 、アルキル - アシル - ホスファチジルエタノールアミン、時には他。
- スペクトル取得、最適化されたパラメータを使用して、プロセス自由誘導減衰（FID）の終了後。これらのパラメータの値は、磁界強度、シムの品質、及び定量化するためにPL信号の関数として変化する。
- plsは複数の（少なくとも2）異なるフィルタリング手順を使用して繰り返し処理の全範囲のための最良の結果を得るためには。 たとえば 、強く重なった信号のための強力な分解能向上を使用します。、PtdChoとPtdEtnのために地域。
- 弱い信号のための強力なフィルタリング（弱いか無い解像度向上）を使用します。
- アポダイゼーションによってかなりの重複がなく、非常に弱く、ブロードなシグナルをフィルタリングし、信号対雑音比、 たとえば PtdIPとPtdIP 2を増加させる（ 例えば 、LB = 3ヘルツ）。特徴的な処理パラメータについては、表1を参照してください。
- 同じスペクトルにおける参照化合物（MDP）の信号の下の面積に対する各PL信号の面積を定量化する。
- （（i）の既知濃度のリン化合物、およびPL 31 P NMR実験で用い（ii）は、同一の同軸インサートのステムを充填した5mmのNMR管を使用して、別の実験における対照化合物（MDP）の信号を較正7.3および7.9）を参照してください。
- 一方PL信号の相対領域に基づいて個別のPL濃度を計算する（7.9を参照）、および較正値に基づいからMDPについて得られた他方では、同軸のインサート（7.10を参照）。特に31 P NMR信号に寄与リン核の数は、その信号の分子起源の関数として変化し得ることを考慮している。
注：カルジオリピンリン酸シグナルがそうであるように、MDPホスホ信号（通常は19.39 ppmの参照先）は、2つのリン核を表します。脳抽出物中に検出されたすべての他のPL 31 P NMRシグナルは、一つのリン核をそれぞれ表す。 - 動物の群間で脳のPLレベルを比較するために、必要に応じて統計ソフトウェアを使用してください。
水溶性脳代謝物の分析のための1 H NMR実験の8パフォーマンス
- 所望の目標値（通常25℃）1 H NMRプローブの設定温度調整。も参照してください。7.1で発言。
- 4℃、11000で遠心マイクロチューブ内の水抽出液（6.5参照 ）30分間の遠心は、試料中の固体残留物をスピンダウンします。高品質のNMR管（5ミリメートル、外径）に上清の600μlのを転送します。
- NMRマグネット、シム及び7.4〜7.6で説明したように、最適な値に設定さNMRスペクトル取得パラメータへの転送のNMRチューブ。推奨されるパラメータ値にも表1を参照してください。
- NSが32（データ取得約 13分の合計時間）を=程度に実験あたりのトランジェント数を設定します。特に芳香族領域において、非常に弱い信号のために良好な信号対雑音比を得るためには、NSは以上の64（データ収集、約 26分の合計時間）を=を使用します。
- スペクトル取得、最適化されたパラメータを使用して、プロセス自由誘導減衰（FID）の終了後。これらのパラメータの値は、磁場強度、シムの品質、及び定量化する代謝産物信号の関数として若干変化する。
注：ほとんどの場合、一度各スペクトルを処理するのに十分である、すべての代謝産物信号の適切な妥協点を提示する処理パラメータのセットを使用する。特徴的な処理パラメータについては、表1を参照してください。 - 同じスペクトルにおける参照化合物（TSP-dの4）の信号の下の面積に対する（多くの場合、多重線、時には異なる分子に由来する他のシングレットまたは多重線とオーバーラップ）各代謝シグナルの面積を定量化する。
- TSP-d 4は濃度に基づいて個別の代謝物濃度（6.4参照 ）を計算します。特定の1 H NMRシグナルに寄与するプロトンの数は、その信号の分子起源の関数として変化し得ることを考慮する。 （0.0 ppmの基準）TSP-d 4はトリメチル信号が9プロトンを表しています。
- 動物の群間の脳の代謝産物レベルを比較するために、必要に応じて統計ソフトウェアを使用してください。
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Representative Results
抽出溶液中に存在する：脳および他の組織抽出物の代謝NMRスペクトルにおける最高の解像度を得るためには、長い金属イオン（常磁性イオン、最も重要なこと）を削除するか、マスクするのが一般的となっている。これは、またはそのようなキレックス-100 20としてイオン交換樹脂を通過エキスを通過させることによって抽出物19へEDTAまたはCDTAなどのキレート剤を添加することのいずれかによって達成されている。 図1に示す結果は、脳抽出物を慎重に上記のプロトコールに従って調製する場合は、このステップは、1 H NMR分光分析に必要でないことを実証する。ここで、非常に狭いスペクトル線は、分析した全てのスペクトル領域について得られた。でも、非常に混雑した地域では、 たとえば 、グルタミン/グルタミン酸とミオ -イノシトールの /グリシン、<0.01 ppmでの距離でのピークは400 MHzの（ 図1、下）でほぼ完全に分離可能である。その結果、定性、図1の中央と下部のパネルに表示され、小さな多数のが、現在割り当てられていないピークの定量分析は、将来的に想定することができる。
図メスのルイスラットの脳組織抽出物の水相の代表的な1 H NMRスペクトル（400 MHz）での1サブ領域はすべての3つのパネルは、非常に高い解像度が得られるこの論文で提示プロトコルを使用して実証する。キレート剤やイオン交換樹脂のいずれも、試料調製中に使用されている。中央及び下部のパネルは最適化された実験パラメータを用いて行った場合に組織抽出物の高分解能1 H NMR分光法によってカバー巨大なダイナミックレンジをほのめかす多くの割り当てられていない低強度のピークの存在を示している。これらの弱いが、よく検出可能なシグナルは、潜在的に、将来的に同定し、定量することができる。いくつかの検出された代謝物は、脳組織に特異的であり、例えば 、ニューロンマーカーNAAまたは神経伝達物質GABA;しかしながら、ほとんどの化合物は、アミノ酸、分枝鎖有機酸、ポリオール、（リン）脂質及びエネルギー代謝ならびに解糖およびglutaminolysisであり、同様に、哺乳動物の細胞に共通している代謝経路の広範囲に関与しているそのような浸透圧調節、細胞成長および増殖として機能する。アスタリスクは、メタノール不純物から生じるメチル共鳴を示している。略語：ALA、アラニン; LAC、乳酸塩;トレオ、スレオニン; BHB、β-ヒドロキシ酪酸;ヴァル、バリン;イル、イソロイシン;レイ、ロイシン; AAB、α-アミノ酪酸; AHB、α-ヒドロキシ酪酸;タウ、タウリン; SCY -INS、 シロ -イノシトール; ミオ -INS、 ミオ -イノシトールの ; GPC、グリセロホスホコリン; PC、ホスホコリン;町、コリン; CRN、クレアチニン;クロム、クレアチン; GABA、47; - アミノブチ; ASP、アスパラギン酸; NAA、N -acetylaspartate; GLN、グルタミン; Gluの酸、グルタミン酸; SUC、コハク酸塩; NANA、N -acetylneuraminate;交流、アセテート; Glyを、グリシン。乳酸13 C衛星ダブレット（上のパネル）から翼ダブレット幹の基部に小さなピーク。ルッツNW らからクリエイティブコモンズライセンス（CCAL）条件の下で再版実験的自己免疫性脳脊髄炎およびアジュバント関節炎（2013）脳の生化学的経路：比較メタボローム研究。 PLOS ONE 8（2）：e56101 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
リン酸塩は簡単に二価及び3価のイオンと錯体を形成するので、31 P NMR分光法では、常磁性カチオン（主に鉄）をマスキングまたは除去することは間違いなく必需品です。抽出物をCDTAの添加は、両方のスペクトル線幅は影響を与えD化学シフト; 図2、上部と下部、左と比較します。代わりに200 mMの（左上）1,000 mMの（左下）を選択して、線狭CDTAを所望するが、（左上）を個別に定量化されるべきであるPL信号の重ね合わせをもたらしました。したがって、200 mMのCDTAは、PL溶剤の水性成分に推奨され、他のすべての条件が等しい。また、測定時の試料温度は、スペクトル線幅及び化学シフトに影響を与える; 図2、上部と下部の右側を比較します。 （右上）の代わりに297 Kで277 K（右下）を選択して、ライン狭窄を所望するが、個別に定量化されるべきで、PL信号（右上）の重ね合わせをもたらしました。したがって、297 Kは測定温度として推奨され、他のすべての条件が等しい。 2トップパネルの間の比較は、50 mMの（右上）に200 mMの（左上）からCDTA濃度の低下のみになることを示しています線幅、化学シフトはほとんど変化がない中で適度な増加。しかし、それは右上のパネル13における比較的狭いラインを説明する、200 mMのCDTA抽出物中にあるように50 mMのCDTA抽出物中の組織濃度の半分の高さであることに注意してください。
図2ホスファチジルエタノールアミン（PtdE）メスのルイスラットから脳組織抽出物のリン脂質31 P NMRスペクトル（162 MHz）で（上左パネル）脳組織濃度領域 、236 mg / mlの。; CDTA濃度及び溶剤の水性成分のpH、200 mMのそれぞれ7.33;測定温度は、297 K. PtdE 細胞質とSMの信号が十分に解決されます（左下）の脳組織濃度、236 mg / mlの。; CDTAのconcentrationと溶媒の水性成分のpH、千mMのそれぞれ7.36;測定温度は、297 K. PtdE 細胞質とSMの信号が完全に重複する。それらは、左上のスペクトルと比較して、減少した線幅にもかかわらず、解決できない（上右）の脳組織濃度、118 mg / mlの。; CDTA濃度及び溶剤の水性成分のpH、50 mMのそれぞれ7.14;測定温度は、297 K. PtdE及びSM信号が十分に分解される（下右）の脳組織濃度は、118 mg / mlの; CDTA濃度及び溶剤の水性成分のpH、50 mMのそれぞれ7.14;測定温度は、277 K. PtdEとSMの信号が完全に重複する。彼らは右上のスペクトルと比較して低減線幅にもかかわらず、解決できません。略語：PtdE 細胞質 、エタノールアミンプラスマローゲン; PtdE、ホスファチジルエタノールアミン; SM、スフィンゴミエリン; PTDは、phosphatidylserine; PTDC、ホスファチジルコリン。ルッツNW ら （2010）の粗組織抽出物中のリン脂質の31 P NMRスペクトル解析のマルチパラメトリック最適化の許可を得て転載。 1化学シフトと信号分離。アナルCHEM 82（13）：5433から5440。著作権2010米国化学会。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
上記のプロトコル（一相系14、 図3、左上）を使用して、かなりの濃度範囲をカバーする、定量化のPLが多数検出された（ 図3、右上）を（切断型高強度信号に注意）。これらの信号のいくつかは（U1、U2、U6）まだ割り当てられていない。このプロトコルに示されるように、試料調製、NMR測定スペクトル処理が実行される場合、スペクトル分解能は、日常dまでさえ十分である特定のピークの部分的な分裂etect（PTDは、PtdE、PtdE 細胞質 、AAPtdEを、左下）。 。PtdC1uは、PLが由来：その結果、定性的および将来的に想定され得るさらなるPLサブグループの定量分析として3、右下の図 、部分的にここで低濃度の化合物（別個の信号がために慎重に選択された処理パラメータのパワーを示している共振完全に識別されないPTDC、およびPTDC 細胞質 ）から、ここで非常に強い信号（に近い：PTDC）。
雌のLewisラットからの脳組織抽出物の図3リン31 P NMRスペクトル（162 MHz）の（上部左パネル）一相系（左）二相系（右）よりも好まれた。一般的に使用される二相系は、正しい妨げ上相の大部分は、コイルの感応容積の外側に位置するので、PL定量。（右上のパネル）は 、ラットの脳の完全な31 P NMR PLスペクトルを示す。微弱な信号（PtdIP、PtdG）、指数関数的線幅拡大（LB = 3 Hz）での視認性のために適用した。この表現では、いくつかのPL信号は、特にPTDCとPtdE地域で、十分に解決されません。二つ以上の31 P NMR信号を生成するのPLのために、観察核（P tdIP、PTDI P、P tdIP 2、PTDI P2）下線を引いた。現在割り当てられていない信号は、「U n」は （ここで、n = 1,2、...）が付されている。同じスペクトルの（左下パネル）PtdEとのPTD領域。優れたピーク分離については、ローレンツ·ガウス線形状変換が適用された（LB = -1 Hzで、GB = 0.3）。なぜならこれらの処理パラメータのために、多くの非常に弱いPL信号は検出が難しい。しかし、少なくとも2つのピークができPtdE領域と同じ処理パラメータを用いて得られた各PtdE、PtdE 細胞質 、AAPtdEとのPTD。（下右パネル）PTDC領域について識別すること。それらは指数関数的な線の広がり（AAPtdC、PTDC 細胞質 、PtdC1u）で生成された上側のスペクトルで識別することはできないが支配PTDC共鳴の基部にあるいくつかの信号は、明確に検出された。現在割り当てられていないPTDCアナログ、PtdC1uのほかに、さらにマイナーな共振が高磁場PTDCから存在していてもよい。略語：PtdIP、ホスファチジルイノシトールリン酸; PtdIP 2、ホスファチジルイノシトール二リン酸; PTDA、ホスファチジン酸; PtdG、ホスファチジル; CL、カルジオリピン; PtdE .. PtdE、PtdE 細胞質とAAPtdEの和; PTDI、ホスファチジルイノシトール。さらに略語については図2を参照して 、凡例を参照してください。ルッツNW らから許可を得て転載。phospholipiの31 P NMRスペクトル解析の（2010）マルチパラメトリック最適化粗組織抽出物中のds。 1化学シフトと信号分離。アナルCHEM 82（13）：5433から5440。著作権2010米国化学会。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| ラットの脳を収穫し、凍結 | |||
| N個の2liq用デュワー。クランプを凍結する（ 例えば 、自家製Wollenbergerトング、参考文献1および2、表の一番下）;麻酔チャンバー;外科はさみ;外科用メス;クリーニングアルコールで500ミリリットルボトル | それぞれの1 | ||
| 鉗子 | 2 | ||
| 1mlシリンジ10 mlシリンジ | 動物あたり各1 | ||
| 25 G針 | 動物あたり2 | ||
| サンプルPreparation | |||
| 抽出当たりの脳組織の典型的な量 | 250-350ミリグラム | ||
| 350 mgの脳組織 - 250を均質に使用されるメタノール量 | 4ミリリットル | ||
| 5ミリリットルのプラスチックピペット | 抽出液あたり3 | ||
| 10ミリリットルのプラスチックピペット | 抽出液あたり1 | ||
| ガラスバイアル（≥201ml容量） | 抽出液あたり1 | ||
| クロロホルム耐性遠心管 | 抽出液あたり1 | ||
| MeOH中で、組織の均質化した後の待機期間（4℃で混合物） | 15分 | ||
| 水とクロロホルムの体積は4ミリリットルメタノールでホモジナイズ脳組織に追加 | 各4ml | ||
| 水とCHCl 3でホモジナイズした組織を混合した後の待機期間（混合物を-20℃で） | 一晩 | ||
| 分離O用遠心分離有機抽出相（ガラス遠心管）からの水性fは | 4℃で40分間13000×gで、 | ||
| CDTA溶液の濃度（抽出された脂質を溶解する溶媒混合物の水性相） | 200 mMの | ||
| 抽出した脂質を溶解する溶媒混合物の水性相のpH | 7.4 | ||
| 脂質中の体積比は31 PのPL分析に使用溶媒（CDCl 3中：メタノール：CDTA溶液） | 1：5：4 | ||
| 350mgの脳組織 - 溶媒Aの量は、250から抽出された脂質を溶解するために使用 | 700μlの | ||
| NMR試料に固体粒子をスピンダウンするための遠心分離（マイクロチューブ） | 4°Cで30分間11000×gで、 | ||
| 水溶性代謝産物を含むNMR試料のpH | 7.3 | ||
| centrif後、NMRチューブに移し、サンプル容量ugation | 600μlの | ||
| 31 P NMR用の同軸挿入ステムにおけるMDP濃度 | 20 mMの | ||
| NMR実験 | |||
| NMR実験における試料温度（ピークの重なりを最小化するために調整される） | 25°C | ||
| NMR実験中に周波数をスピニング | 15-20ヘルツ | ||
| 1 H NMR取得パラメータ | |||
| 2 Hロック信号を提供する溶剤 | D 2 O | ||
| 励起パルス幅P1 | 11秒 | ||
| 励起パルスは、増幅器の減衰、PL1 | 0デシベル | ||
| FIDサイズ、TD | 32 K | ||
| FID買収ティム電子メール、AQ | 3.283秒 | ||
| 緩和遅延、D1 | 15秒 | ||
| 溶剤抑制遅延、D4 | 6秒 | ||
| 総繰り返し時間、TR | 24.3秒 | ||
| ppmでスペクトル幅、SWP | 12.47 ppmの | ||
| ヘルツ、SWでのスペクトル幅 | 4,990 Hzの | ||
| レシーバゲイン、RG | 512 | ||
| 溶媒サプレッション（連続波） | CW | ||
| 溶媒抑制、増幅器、減衰、PL9 | 50デシベル | ||
| トランジェントの数、NS | 32または64 | ||
| 31 P NMR取得パラメータ | |||
| 2 Hロック信号を提供する溶剤 | CDCl 3中 | ||
| 励起パルスWIDTH、P1 | 9.5秒 | ||
| 励起パルスは、増幅器の減衰、PL1 | 4デシベル | ||
| FIDサイズ、TD | 16 K | ||
| FID取得時間、AQ | 2.019秒 | ||
| 緩和遅延、D1 | 15秒 | ||
| 総繰り返し時間、TR | 17秒 | ||
| ppmでスペクトル幅、SWP | 25 ppmの | ||
| ヘルツ、SWでのスペクトル幅 | 4058ヘルツ | ||
| レシーバゲイン、RG（最大） | 16,384 | ||
| プロトンデカップリング（複合パルスデカップリング） | CPD | ||
| プロトンデカップリング、アンプの減衰、PL13 | 19デシベル | ||
| トランジェントの数、NS | 1500または2000 | ||
| NMRデータ処理 | 1 H高解像度化、ガウスローレンツ線形変換 | ||
| スペクトルの全体的な評価は、（必要であれば、0.1 <GB <0.4、-0.6を使用して、個別のスペクトル領域ごとに個別に最適化する<LB <-0.2ヘルツ） | GB = 0.15、LB = -0.2 Hzの | ||
| 非常に弱い信号、 例えば 、芳香族酸（あるいはLB≥0.5ヘルツでアポダイゼーションするため） | GB = 0.015、LB = -0.3 Hzの | ||
| ピーク下の面積：ユース線形は、共振をオーバーラップのために適合 | |||
| 31 Pの解像度向上、ガウスローレンツ線形変換 | |||
| スペクトルの全体的な評価（0.05 <GB <0.2、および-3.0 <LBを<使用して、個別のスペクトル領域ごとに個別に最適化する60; -1.0ヘルツ） | GB = 0.05、LB = -1.0ヘルツ | ||
| 非常に弱い信号、 例えば 、PtdIP 2、PTDA：アポダイゼーション | LB = 3 Hzの | ||
| ピーク下の面積：ユース線形は、共振をオーバーラップのために適合 | |||
| 参考文献 | |||
| 1パラディーノ、GW、ウッドJJ、プロクターHJ。組織分析のために修正されたフリーズクランプ法。外科研究289誌、188〜190（1980）。 | |||
| 2 Wollenberger A、Ristau O、Schoffa Gの組織の大規模な作品の非常に急速凍結するための簡単なテクニック]。 Pflugersに保管毛皮死ぬgesamte PhysiologieデMenschenウント·デア·Tiere 270、399から412（1960）。 | |||
表1の実験高解像度のパラメータ1 H及び脳の31 P NMR分光法体積比および脳組織抽出およびNMR試料調製において使用される溶媒および試薬の濃度についての組織抽出物。典型的な値は、提示されている。さらに推奨値は、pH測定温度、ならびにNMR取得と処理パラメータをサンプリングすることに関する。プロトコルは脳以外の組織に適用した場合の微調整は、特に、必要であり得る。 NMRパラメータは9.4 Tでの測定のために最適化されており、異なる磁場強度で作動する分光計のために必要に応じて調整されるべきである。
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Discussion
NMR分光法は、非常に再現性および正確な方法で、溶液中の化学物質の濃度を測定するための効率的な方法である。しかし、高品質のデータを得るために、サンプル調製および分析に関する特定の規則を遵守する必要がある。観察されたシグナルの強度が検出閾値（特に弱い信号）に近づくない限り、NMR分光法による代謝産物濃度の測定では、生成もNMR信号の受信のいずれも、定量誤差を支配する。他のすべての場合生物学的変動、（ 等抽出効率、化合物の物理的および化学的安定性、ピペッティングエラー計量）試料調製技術において、および/ または信号取得および処理パラメータの選択は、結果の精度と正確さを決定する。明らかに、組織の収穫の間に生じる任意の代謝の変化はまた、代謝物濃度に反映され得るエド。したがって、できるだけ速く組織の収穫を完了するために非常に重要であり、正確な場合に急速に代謝化合物の生体内濃度の凍結など漏斗のような特定の組織の凍結技法を適用することが重要である（特にグルコース、乳酸、ATPおよびその異化代謝産物、ADPおよびAMP）。
偶数ルーチン高分解能NMR分光計優れたスペクトルの中間の磁界強度（9.4 T）で得ることができる。例えば、ラット脳抽出物の水相の1 H NMRスペクトルにおいて、その差は化学シフトの信号は、Δδは、（400 MHzの共振周波数で2.0 Hzに対応する）、0.005 ppmのを約別個に識別および定量することができる量。これは、（i）乳酸塩およびスレオニンダブレット、そのベース（乳酸13 Cサテライトダブレットの小さなピークから（ii）のアラニンダブレットの部分的な分離により例示され、 図1上）。これらの機器は、それらの高い購買コストのNMR研究室であまり一般的であるが、より高いフィールド（14.1あるいは18.8 T）で動作分光計は、さらに分解能と感度を増加させるであろう。
1 H NMR分光法を用いて、代謝産物の広範囲の単一の取得に、即ち 、同時に分析することができる。この選択は比例的に測定時間を増加するが、実験の感度は、蓄積されたトランジェントの数を増やすことによって改善することができる。 （信号対雑音比は、過渡現象の数の平方根に比例する。）しかし、上記のプロトコルに与えられた最大総取得時間 - 量がない限り、事実上全ての目的のために十分であるべきである（20〜30分）抽出のために利用可能な組織の非常に限られている。最もNMR敏感な原子核（陽子）を利用することのほかに、代謝学的1 H NMR分光法は、総合的な利点を有するデータベースの異なる磁場強度と試料のpH値10のために利用可能である。さらに、自動または半自動のスペクトル評価用ソフトウェアは、10利用可能になった。
組織抽出物の1 H NMRスペクトルは、十分にキレート剤を添加せずに解決することができるが、これはもはや31 P NMRスペクトルについて真ではない。実際には、キレート剤の濃度（ 例えば 、EDTAまたはCDTA）を用いた線幅およびリン酸化代謝物に由来する31 P NMRシグナルの化学シフトの両方に大きな影響を与える。抽出物中の増加CDTA濃度は、31 P NMR線幅を減少させるが、この利点は、隣接するピークの化学シフトを、Δδとの間の小さな相違を上回ることができる。したがって、使用されるキレート剤の量は、線幅と一緒に、化学シフトの両方のために最適化されなければならない。脂質抽出物では、これらの2つのスペクトルパラメータがsignificaあるntlyだけでなく、pH値及びNMR測定中の試料の温度によって抽出された組織の量、すなわち 、全体的なサンプル濃度によって影響を受ける。その結果、測定条件のいずれかの最適化は、これらのうちのいくつかは、添加されていない、関連するすべての実験パラメータの複合効果を考慮する必要があります。この状況の複雑さは、31 P NMRスペクトルを図2に示すPLの挙動によって示されている。最低の組織濃度（118 mg / ml）で、最も低い温度（277 K）と最高CDTA濃度（千mM）を試験したが最低の線幅をもたらすであろう、提案されたプロトコルは、信号の重複を避けるために、中程度の組織濃度（236 mg / ml）で、中間CDTA濃度（200 mM）を、室温（297 K）での使用を推奨しています。
試料調製及びスペクトル取得条件が最も重要であるが、取得した生データから最大限の情報を抽出するスペクトラム処理パラメータの役割は過小評価すべきではない。処理パラメータの特定のセットは、低濃度で起こるのPLを検出し、定量するために理想的でMY;しかし、同じパラメータのセットは、「混雑した」スペクトル領域（ 図3、右上）内の個別のピークを不明瞭にすることができる。逆に、強く重なり合う共鳴（ 図3、下）の領域において最適な高解像度化を提供する処理パラメータは、低強度のピークが検出不可能にするであろう。また、総合的なPL 31 P NMRデータベース13,14を含む最近の開発は、大幅NMRスペクトル13,14の分析を容易。
最終的には、基礎となるアプリケーションの目的は、スペクトル分解能、感度、代謝物quantifの精度の所望のバランス、 すなわち最適化のための基準を定義する必要がありますication、速度、およびその他の要因。たとえば、PL分析許すための、推奨される1相系二相系よりも信頼性の高い効率的なPLの定量化（ 図3、左上）、高スペクトル分解能だけでなく、あまり豊富でのPLの定量のための十分な感度を提供します。これは容易に、試料中の相分離をもたらすものの、最高の信号分離を効率的かつ正確な定量よりもはるかに高い優先順位のものである場合には、溶媒混合物中のクロロホルム-dをより高い割合の使用が試みられ得る。この場合、下相の体積は絶対PL量（PLミリグラム、グラムあたりの組織またはmg総タンパク質）を得るために決定されなければならない。
プロトンデカップリング異核NMR実験では、信号強度が急激取得スキームに飽和に加えて、核オーバーハウザー効果（NOE）によって変更することができる。修正されないと、これらの効果は、代謝物の資格でになるntitationエラー。この課題に対処するための二つの代替方法があります。最初のアプローチでは、買収の個別の過渡現象は、長い遅延によって分離されている。このメソッドは、彩度やNOEが、比較的長い実験での結果を回避すること;精密かつ正確な結果が必要な場合には使用すべきである。いくつかの場合において、優先度は、トランジェントの高い数を用いて測定することができる非常に希薄な試料について、特に、高速スペクトル取得に与えなければならないことがある。このような場合には、試料に常磁性緩和剤の添加は、飽和またはNOEことなく迅速なデータ取得を可能にするであろう。代替的に、常磁性剤を添加せずに、高速データ取得を使用することができる。緩和剤の存在のためには、代謝産物の定量の精度を減少させることができるNMR信号の一部拡大を引き起こし、一方、後者の方法は、それぞれのNMR共鳴のために決定されなければならない補正係数を介して信号領域の補正を必要とする混雑したスペクトル領域。一般に、実験条件の最適な選択は、試料の種類によって決定されるだけでなく、情報実験13から抽出する。高い優先度が高い精度と正確さを必要とせず、むしろ豊富な代謝産物の迅速な分析に与えられる必要がある場合には、高濃度のサンプルを測定し、常磁性緩和剤を試料に添加し、おそらく、短い繰り返し回数を用いることが適切であり得る。代謝産物の多数の正確な定量が速度よりも重要である場合に対照的に、ここで提示されたプロトコルによって実証されるように、低濃度の抽出物を使用し、長いNMR取得時間を受け入れることが好ましい。特定の研究プロジェクトは、特定の代謝産物を強調する場合さらに、実験条件は、問題のスペクトル領域のための最適なスペクトル分解能を達成するように調整することができる。ここで紹介するプロトコルとの議論は、Oのためのガイドとして機能することができるNMR分光法による粗組織抽出物のメタボローム解析のptimization。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Virbac | Vetflurane | Anesthetic for animals |
| Isoflurane vaporizer | Ohmeda | Isotec 3 | Newer model available: Isotec 4 |
| Scalpel, scissors, forceps, clamps | Harvard Apparatus Fisher Scientific |
various various |
Surgical equipment for animals |
| Freeze-clamp tool | homebuilt | n/a | Tong with aluminium plates, to be inserted in liquid nitrogen for cooling |
| Dewar | Nalgene | 4150-4000 | |
| Liquid nitrogen | Air Liquide | n/a | |
| Nitrogen gas | Air Liquide | n/a | |
| Nitrogen evaporator | Organomation Associates | N-EVAP 111 | Can be replaced by homebuilt device |
| Mortar | Sigma-Aldrich | Z247472 | |
| Pestle | Sigma-Aldrich | Z247510 | |
| Tissue homogenizer | Kinematica | Polytron | With test tubes fitting homogenizer shaft |
| Electronic scale | Sartorius | n/a | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | M3641 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 366910 | |
| Glass centrifuge tubes | Kimble | 45500-15, 45500-30 | Kimax 15 ml, 30 ml tube |
| Microcentrifuge tubes | Kimble | 45150-2 | Kimax 2 ml tube; should replace "Eppendorf" tube if compatible with centrifuge rotor |
| Polystyrene pipettes | Costar Corning | Stripettes | 5 and 10 ml volumes |
| Deuterochloroform | Sigma-Aldrich | 431915 | 99.96% deuterated |
| Deuterium oxide | Sigma-Aldrich | 423459 | 99.96% deuterated |
| Deuterium chloride | Alpha Aesar | 42406 | 20% in deuterium oxide |
| Sodium deuteroxide | Sigma-Aldrich | 164488 | 30% in deuterium oxide |
| Lyophilizer | Christ | Alpha 1-2 | |
| Cold centrifuge | Heraeus | Megafuge 16R | |
| pH meter | Eutech Cybernetics | Cyberscan | |
| CDTA | Sigma-Aldrich | D0922 | |
| Cesium hydroxide | Sigma-Aldrich | 516988 | |
| NMR tubes | Wilmad | 528-PP | |
| NMR stem coaxial insert | Sigma-Aldrich | Z278513 | By Wilmad |
| NMR pipettes | Sigma-Aldrich | Z255688 | |
| Pipettes | Eppendorf | Research | With tips for volumes from 0.5 to 1,000 μl |
| Pipet-Aid | Drummond | XP | |
| NMR spectrometer | Bruker | AVANCE 400 | including probe and other accessories |
| NMR software | Bruker | TopSpin 1.3 | newer version available: Topspin 3.2 |
| Water-soluble standard compounds | Sigma-Aldrich | various | |
| Phospholipid standard compounds | Avanti Polar Lipids Doosan Serdary Sigma-Aldrich |
various various various |
Source for plasmalogens, but may be <70 - 80% purity |
| Methylenediphosphonate | Sigma-Aldrich | M9508 | |
| TSP-d4 | Sigma-Aldrich | 269913 |
References
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