Introduction
Les modèles murins ont été utilisés largement dans la recherche du cerveau 1. Corrélation génotype-phénotype ont été étudiés dans le cerveau de souris et de rats par l'étude de l'expression des gènes à l'ARN et / ou les taux de protéine, d'une part, et les phénotypes morphologiques, fonctionnelles, électrophysiologiques et / ou du comportement de l'autre 6.2. Toutefois, pour bien comprendre les mécanismes liant phénotype génotype, il est impératif d'enquêter sur les événements moléculaires en aval de l'expression des protéines, c'est à dire. le métabolisme des substrats biochimiques des enzymes qui agissent sur 7. Cette exigence a conduit, au cours des 10 à 15 dernières années, à une renaissance de la recherche métabolique dans de nombreuses branches de la biologie 8,9. Alors que les études métaboliques classiques ont souvent été axées sur les détails de voies spécifiques, la nouvelle approche métabolomique est orientée vers une enquête englobe tout du profil métabolique global du tissu à l'étude.Une conséquence de ce concept est une nécessité évidente pour les outils d'analyse qui minimisent biais en faveur des voies et / ou classes de composés métaboliques spécifiques. Cependant, un dosage biochimique classique est basé sur une réaction chimique particulière d'un analyte spécifique qui doit être déterminée avant le dosage est effectué. En revanche, les techniques spectroscopiques telles que la résonance magnétique (RMN) nucléaire et la spectrométrie de masse (MS) (i) sont basés sur certaines moléculaires propriétés (physiques) des composés biochimiques, dont chacune donne lieu à une ou plusieurs signaux distincts dans un spectre détectées au cours d'une expérience; et (ii) détecter un grand nombre de composés différents par expérimentation.
Ainsi, chaque spectre contient les informations combinées de toute une série de métabolites. Pour cette raison, les méthodes spectroscopiques sont des outils appropriés pour la métabolomique, comme aucune sélection préalable doit être faite en ce qui concerne la nature de l'analyte à mesurer huit
Bien que la spectroscopie RMN et MS peuvent être utilisés indifféremment pour l'analyse de nombreux métabolites, chaque méthode présente des avantages et des inconvénients qui ont été récemment examinés 10 spécifiques. En bref, la spectroscopie RMN peut généralement être effectuée à partir des extraits bruts et ne nécessite pas la séparation chromatographique de composés de l'échantillon avant l'analyse. En revanche, MS fonctionne avec du gaz ou la chromatographie liquide (GC ou LC) séparation, sauf pour certains développements récents tels que l'imagerie par spectrométrie de masse. Dans quelques cas particuliers, tels que l'analyse des sucres, la séparation des cristaux liquides peut devenir une nécessité pour la spectroscopie RMN et, car les lignes de résonance des différents sucres se chevauchent de manière significative au proton (1 H) Les spectres de RMN. Néanmoins, 1 H spectroscopie RMN sans chrséparation omatographic reste la méthode la plus populaire métabolomique, presque universellement appliquée RMN. En général, la préparation de l'échantillon est plus longue et complexe pour MS que pour la spectroscopie RMN. Problèmes graves en raison des effets de matrice sont beaucoup moins fréquents en spectroscopie RMN que dans les États membres où elles peuvent conduire à des signaux considérablement atténués. Métabolite quantification peut être réalisée avec les deux méthodes. Cependant, plusieurs types de composés sont nécessaires pour la MS en raison de variations dans les effets de matrice et de l'efficacité d'ionisation entre les métabolites. En revanche, une seule norme par échantillon est nécessaire pour une analyse spectroscopique RMN car dans des conditions de mesure appropriés, la dernière méthode est intrinsèquement grâce quantitatives à la réponse RMN strictement linéaire par les noyaux observés. Un inconvénient majeur de RMN est sa sensibilité relativement faible. MS, en particulier LC-MS, est plus sensible que la RMN de plusieurs ordres de grandeur; pour cette raison, la SEP est préférable à la RMN pourl'analyse des composés d'origine à des concentrations très faibles. D'autre part, la nature non destructive de l'expérience de RMN est un net avantage sur MS; de cette façon, la RMN peut être effectuée plusieurs fois sur le même échantillon, par exemple, pour les différents noyaux de RMN-actifs tels que le 1 H, du phosphore 31 (31 P), le carbone 13 (13 C), du fluor 19 (19 F) etc., étant donné qu'aucun produit est consommé par RMN, par opposition à des mesures de sclérose en plaques.
Les deux RMN et MS peuvent être utilisés dans des modes différents, chacun d'eux étant optimale pour la détection de composés possédant des caractéristiques chimiques. Par exemple, 31 P RMN est souvent mieux que 1 H RMN pour l'analyse de composés phosphorylés modérément concentrée, bien que presque tous les métabolites phosphorylés contiennent également des protons. Cependant, leurs signaux RMN 1 H peuvent être masquées par une signaux H RMN d'autres composés, non phosphorylés, tandis que le secondévidemment pas provoquer un bruit de fond dans 31 spectres RMN P. Dans une situation analogue, 19 F analyse RMN est préférable pour les composés fluorés, par exemple, les médicaments fluorés (pas de signaux de fond de métabolites endogènes), tandis que le cas particulier de RMN 13 C est d'un intérêt presque exclusivement si le sort de 13 C précurseurs métaboliques marqués exogènes doivent être suivis, en raison de la très faible abondance naturelle de l'isotope 13 C (environ 1%). Beaucoup de spectromètres de masse travaille en mode ion négatif ou en mode d'ions positifs. Par conséquent, il est important de savoir à l'avance si l'analyse des ions à observer sont chargés positivement ou négativement. Nous nous concentrons ici sur un protocole pour l'analyse du métabolome de tissu cérébral par 1 H et 31 spectroscopie RMN P parce que cette méthode donne un grand nombre de concentrations de métabolites importants à faible coût en termes de (i) le temps nécessaire pour la préparation des échantillons d'une (ii) l'effort nécessaire pour le métabolite quantification. Toutes les expériences peuvent être effectuées en utilisant l'équipement d'un laboratoire de chimie par voie humide classique et un centre de la spectroscopie RMN à haute résolution. D'autres exigences sont décrites dans la section ci-dessous de protocole.
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Protocol
REMARQUE: l'éthique animale DÉCLARATION
Les études animales sur des rats ont suivi les directives en vigueur en France, et ont été approuvés par le Comité local d'éthique (# 40.04, l'Université de l'École de médecine d'Aix-Marseille, Marseille, France).
1. récolte et de congélation de cerveau de rat
- Préparer les éléments nécessaires: azote liquide (N 2liq.) Dans Dewar qui est suffisamment grande pour maintenir un serrage à la congélation (au moins 2 à 3 L de volume); anesthésie (par exemple, l'isoflurane, ou de kétamine / xylazine); chambre d'anesthésie; outils de dissection stériles: ciseaux chirurgicaux, scalpel, pince; mouchoirs en papier et une bouteille d'alcool de nettoyage (éthanol); aiguilles (25 G); 1 ml et 10 ml de seringues. Feuilles étiquette d'aluminium (environ 10 x 10 cm) avec du ruban adhésif. Utilisez des feuilles pour envelopper cerveaux de rats de gel-serré individuels.
REMARQUE: Toujours porter des gants et des lunettes de protection des yeux ou un masque lors de la manipulation de l'azote liquide! - Remplissez Dewar avec N 2liq. Et placer gratuitementzing pince dans un Dewar. Assurez-vous que la quantité de N dans le 2liq Dewar est suffisante pour les procédures de congélation-clamp répétées (plusieurs litres, la quantité de N 2liq évaporation pendant chaque serrage par congélation dépend de la taille de la pince).
- Anesthésier des animaux (par exemple, par l'isoflurane, ou par injection intra-péritonéale d'un mélange de kétamine / xylazine). Procédez à l'euthanasie par ponction cardiaque pour prévenir les saignements lors du cuir chevelu est retiré et le crâne est ouvert. Étapes 1.4-1.7 ci-dessous décrivent la procédure standard.
REMARQUE: Dans protocoles spéciaux nécessitant une préservation maximale de glucose et de métabolites de haute énergie, par sacrifice rat entonnoir congélation du cerveau de l'animal anesthésié avec de la N 2liq 11 après la rétraction du cuir chevelu. Ensuite, disséquer le cerveau sur le crâne sous intermittent N 2liq pour minimiser le métabolisme post-mortem 12. - Humidifiez la tête de rat d'alcool de nettoyage. Utilisez des ciseaux chirurgicaux à (i) remcuir chevelu ove, et (ii) le crâne ouvert le long de sutures crâniennes.
- Utilisez une pince pour ouvrir le crâne plus loin, et de supprimer tout le cerveau par le dessous du crâne ouvert, le positionnement de la tête à l'envers. Retirer rapidement les traces visibles de sang à l'aide de mouchoirs en papier. Si hémisphères cérébraux et sont métaboliquement morphologiquement symétrique, il est commode d'utiliser l'un des hémisphères d'analyse métabolique après l'avoir séparé de l'autre hémisphère de l'incision avec un scalpel. Si nécessaire, utilisez l'hémisphère restant pour d'autres études sur le cerveau telles que l'histologie.
- Enlever rapidement le gel pince de N 2liq -filled Dewar, placez entier ou demi-cerveau de rat sur une surface intérieure, pince et insérez immédiatement le gel pince en N 2liq -filled Dewar tout en maintenant fermement pince comprimé. Assurez-vous que les étapes 1.3-1.6 pas prendre plus de 60 secondes.
- Après 1-2 min supprimer le gel de la pince Dewar, pince ouverte, desserrer les tissus du cerveau congelé de pince, et une pelliculetissu congelé dans une feuille d'aluminium correctement étiquetés (voir 1.1 ci-dessus). Assurez-vous que l'étiquette est lisible et reste bien en place après que l'échantillon est enveloppé. Placer rapidement échantillon enveloppé dans N 2liq. Effectuez toute la procédure le plus rapidement possible pour éviter la décongélation des tissus du cerveau congelé.
- Rangez échantillon congelé dans N 2liq ou dans un congélateur à -80 ° C jusqu'à l'extraction de métabolites.
REMARQUE: Chaque fois qu'un échantillon biologique doit être stocké pendant plus d'un an, stockage à température N 2liq est préférable à -80 ° C. Cela vaut également pour le reste de ce protocole.
2 Préparation du métabolite méthode d'extraction
- Préparer homogénéiseur de tissus et des tubes à essai correspondants (par exemple, 10 mm de diamètre interne, en fonction du diamètre de l'arbre d'homogénéisation, le plus souvent en matière plastique). Utilisez homogénéisateurs électriques plutôt que homogénéisateurs entraînés manuellement (de broyeurs de tissus). Prépare vortex et balance de laboratoire.
- Préparer un seau rempli de glace pilée. Gardez quantitites suffisamment de méthanol, le chloroforme et de l'eau sur la glace (4 ml chacun par 250-350 mg de tissu cérébral congelé).
- Préparer pipettes de transfert et des flacons.
- Préparer des flacons en verre (≥20 volume ml) avec bouchons à vis et les placer sur la glace (un flacon par extrait de tissu). Vis Fit caps d'un revêtement résistant au chloroforme cloisons en téflon.
- Préparer 5 ml pipettes en plastique pour la distribution de l'eau et du méthanol, et des pipettes en verre ou de seringues Hamilton pour la distribution de chloroforme. Préparer pipettes en plastique supplémentaires (5 ou 10 ml de volume) pour transférer des mélanges de homogénat de tissu et de méthanol.
- Assurez-vous que toute la verrerie est rincée avec de l'eau distillée et sécher soigneusement avant de les utiliser pour éliminer les traces d'impuretés, notamment formate détectable par RMN et l'acétate.
- Remplissez porcelaine mortier avec N 2liq, lieu porcelaine pilon dans le mortier et le remplir avec N 2liq. Azote s'évapore jusqu'à ce que la température de mortier et un pilon est suffisamment faible. Gardez petite quantité de N 2liq dans le mortier.
3 Extraction des métabolites
- Retirer échantillon de tissu du cerveau congelé de stockage (N réservoir de 2liq ou -80 ° C congélateur). Ensuite, transférer immédiatement échantillon de tissu au mortier partiellement rempli de N 2liq.
- Utilisez le N de pilon -cold de briser le tissu cérébral congelé en morceaux plus petits qui s'insèrent facilement dans les tubes à essai utilisés pour l'homogénéisation des tissus. Pour éviter que des morceaux de tissus congelés d'être projetée hors du mortier dans le processus, diviser le tissu, tout en étant enveloppés dans une feuille d'aluminium. Ne pas broyer les tissus congelés en poudre car cela rendrait le transfert de l'éprouvette plus difficile (augmentation des risques de condensation de l'eau). IMPORTANT: Tout au long de la procédure, ajouter N 2liq au mortier comme nécessaire pour maintenir l'échantillon à l'état surgelé.
- Mix spièces de centres commerciaux de tissu cérébral congelé à fond, pèsent sur 250-350 mg et transférer dans un tube à essai rempli de méthanol glacé (4 ml pour les tissus du cerveau 250-350 mg). Chaque fois que les morceaux de tissu congelé sont ajoutés, homogénéiser ces immédiatement à l'homogénéiseur de tissus.
REMARQUE: Terminez toute cette procédure rapidement pour éviter (i) la condensation d'eau importante sur l'échantillon qui conduirait à une surestimation du poids de l'échantillon, et (ii) le chauffage et la décongélation de l'échantillon. Morceaux de tissu individuels doivent être à l'état congelé au début du processus d'homogénéisation. - Après la dernière pièce de l'échantillon de cerveau de rat congelé a été ajouté au tube à essai et on l'homogénéise, transférer le produit d'homogénéisation à une ≥20 ml flacon en verre d'un volume, à proximité bouchon à vis et laisser reposer sur de la glace pendant 15 min. Si le volume de l'éprouvette n'est pas suffisamment grande pour la ≥4 de methanol, en utilisant un petit volume de methanol pour homogénéiser une partie du tissu cérébral congelé, transférer le mélange de l'flacon de verre et continuer à homogénéiser les morceaux de tissu résiduels avec du methanol frais. Assurez-vous que le volume de méthanol totale est de 4 ml par 250-350 mg de tissu cérébral.
- Ajouter le même volume de chloroforme refroidi à la glace (par exemple, 4 250 à 350 ml par mg de tissu cérébral) d'homogénat, vortex et laisser reposer complètement sur de la glace pendant 15 min.
REMARQUE: Toujours utiliser ventilé hotte chimique lors de la manipulation des solvants volatils, notamment le chloroforme! - Ajouter le même volume d'eau (soit 4 ml par 250-350 mg de tissu cérébral) à homogénat, vortex soigneusement et laisser reposer à -20 ° C pendant la nuit.
4 Préparation de la phase de séparation et l'évaporation du solvant
- Préparer centrifugation à froid (4 ° C, 13 000 x g à rayon maximum) et des tubes de centrifugation. Faire en sorte que ceux-ci sont ≥20 ml de volume, résistant au chloroforme, et peut résister à des forces centrifuges de 13 000 x g. Utilisez des tubes à centrifuger en verre dédiés mais rincer (comme toute la vaisselle de verre) avec de l'eau distillée êtreutilisation avant (voir 2.3).
- Préparez soigneusement rincés pipettes Pasteur en verre et un propipettor approprié (ampoule, pompe à pipette manuelle, automatique pipette aide / pipette, etc.).
- Préparer deux tubes supplémentaires soigneusement rincés (≥15 volume ml) par échantillon de cerveau, dont l'un doit être résistant au chloroforme (en verre ou en téflon), l'autre au méthanol (en résistant au méthanol, ou un verre en plastique).
- Préparer solvant appareil d'évaporation (disponible dans le commerce ou de fabrication artisanale). Assurez-vous que ce dispositif fournit un flux finement contrôlée de gaz d'azote sec qui est dirigé sur la surface d'une solution d'extrait contenant des solvants volatils (methanol, chloroforme).
- Préparer deux plateaux ou des seaux remplis de glace supplémentaires: un pour le transport de l'échantillon sur la glace, et un autre pour garder les échantillons froids au cours du processus d'évaporation.
- Préparer lyophilisateur (sèche-gel) et les matériaux nécessaires pour la lyophilisation: (i) un 50ml tube de centrifugeuse ou vide ballon à fond rond par extrait, et (ii) N 2liq de geler la phase aqueuse des échantillons (≤0.3 L par exemple). Si tube de centrifugation est utilisée, préparer aussi à col large bouteille approprié pour lyophilisateur de filtre à vide.
5. séparation de phase et l'évaporation du solvant
- Pour la séparation de phases complète, transférer le broyat de tissu de méthanol / chloroforme / eau / cerveau (voir 3.6) dans un tube de centrifugeuse résistant chloroforme (volume ≥20 ml) et centrifuger à 13 000 x g et 4 ° C pendant 40 min.
REMARQUE: Les deux phases se forment, séparés par une couche de protéine précipitée. La phase (plus lourds) inférieur est constitué de méthanol, le chloroforme et les lipides dissous, tandis que la phase (plus légère) supérieure est constituée d'eau, de methanol et dissous métabolites solubles dans l'eau. - Utiliser une pipette de Pasteur pour transférer la phase supérieure dans un tube approprié de ≥15 ml (résistant à methanol en plastique ou en verre). Gardez sur iCE.
- Utiliser une pipette Pasteur frais de transférer la phase inférieure à un tube ≥15 ml approprié (en verre ou en téflon). Garder sur la glace.
- Stocker la couche de protéine précipitée à -80 ° C si elle doit être utilisée pour la détermination des protéines totales; ou bien le jeter.
- Garder le tube avec la phase eau / méthanol (voir 5.2) sur de la glace et évaporer le méthanol en dirigeant un courant d'azote sec sur la surface de la solution d'extrait. En variante, doucement barboter de l'azote à travers la solution d'extrait. Mettre fin au processus d'évaporation lors de barbotage d'azote ne provoque plus la réduction de volume dans la solution d'extraction. A ce moment, passez à la lyophilisation (voir 5.7), ou le congeler et conserver l'échantillon à -80 ° C avec le tube fermé (bouchon à vis ou parafilm) avant d'être prêt pour la lyophilisation.
- Placer le tube à la phase de méthanol / chloroforme (voir 5.3) sur de la glace et évaporer le méthanol en dirigeant un courant d'azote sec sur le surface de la solution d'extrait. Quand tout le solvant est évaporé, mettre fin au processus et de garder l'échantillon à -80 ° C avec le tube fermé (bouchon à vis ou parafilm) jusqu'au moment de l'analyse par RMN.
- Préparer la phase aqueuse pour lyophilisation
- Après la fin de l'évaporation du méthanol (voir 5.5), transférer l'échantillon dans un tube à centrifuger de 50 ml soigneusement rincés (si l'échantillon est congelé, décongeler avant transfert). Sinon, le transfert à un vide ballon à fond rond.
- Congeler la solution d'extrait en faisant tourner le tube de centrifugeuse (ou ballon à fond rond) partiellement inséré dans 2liq N de telle sorte que la surface intérieure du tube ou flacon est progressivement recouverte par le liquide congelé. Assurez-vous qu'aucun N 2liq. Peuvent entrer dans le réceptacle.
- Lorsque tout le liquide est gelé, couvrir le tube avec un couvercle percé ou bouchon à vis pour permettre à la vapeur de s'échapper, et placer le tube dans un filtre à vide bouteille à large col.
- Lancer lyophilisation après l'attaChing le flacon ou bouteille à lyophilisateur l'.
- Mettre fin au processus de lyophilisation lorsque l'échantillon est entièrement sec. Conserver l'échantillon à -80 ° C dans un tube fermé (avec un capuchon étanche!) Jusqu'à son utilisation pour l'analyse RMN.
REMARQUE: Généralement pas plus de 24 heures sont nécessaires pour la lyophilisation. Plusieurs échantillons peuvent être lyophilisés en même temps, en fonction de la conception du lyophilisateur, et du fait que des tubes de centrifugation dans des bouteilles à col large ou flacons à fond rond sont utilisées.
6 Préparation des échantillons RMN
- Séché magasin et extraits lyophilisés à très basse température (≤ -80 ° C). Re-dissoudre lyophilisats pour la préparation d'échantillons RMN immédiatement avant l'expérience RMN.
REMARQUE: L'enregistrement des échantillons en solution et / ou proche de la température ambiante peut conduire à une dégradation de l'échantillon! - Préparer une solution aqueuse 200 mM de l'agent chélateur, l'acide trans-1,2-cyclohexyldiaminetetraacetic (CDTA), comme suit:
- Ajouter de l'eau pure (par exemple, 20 ml) dans un tube de centrifugeuse de tube ou de test, et ajouter la quantité de poudre nécessaire pour générer CDTA une solution 200 mM.
REMARQUE: Une proportion importante de CDTA ne sera pas soluble, parce que le pH est très faible, car la forme acide du CDTA a été utilisé plutôt qu'un sel CDTA. - Ajouter avec précaution, étape par étape, des quantités croissantes de poudre CsOH à la solution CDTA, et vortex soigneusement après chaque addition.
REMARQUE: La fraction soluble CDTA va augmenter avec l'augmentation de la teneur CsOH dans la solution aqueuse. Éviter "surtitrage", c'est à dire ajouter inférieure à la quantité stoechiométrique de CsOH à la solution CDTA. - Lorsque la quasi-totalité de la poudre CDTA est dissous, commencer à mesurer le pH après chaque addition CsOH et vortex approfondie. Terminate CsOH addition lorsque le pH final est atteinte (tableau 1).
NOTE: A cette époque, tout le CDTA sera dissoute. L'utilisation de Cs + en tant que contre-ion à CDTA est generallié préféré sur Na + ou K +. Cs + est un acide de Lewis doux en raison de son grand rayon ionique, par opposition aux Na + et K + qui ont de plus petits rayons ioniques et sont des acides forts. Par conséquent, Cs + forme des complexes avec les phosphates (bases dures) moins facilement que Na + et K +. Ceci est avantageux pour 31 P spectroscopie RMN des métabolites phosphorylés parce complexation tend à augmenter largeurs de raies de RMN, notamment dans des conditions de faible à échange d'ions intermédiaire.
- Ajouter de l'eau pure (par exemple, 20 ml) dans un tube de centrifugeuse de tube ou de test, et ajouter la quantité de poudre nécessaire pour générer CDTA une solution 200 mM.
- Par analyse RMN du 31 P des phospholipides (PL), dissolvent les lipides séchés (voir 5.6) dans 700 ul d'un mélange de solvants constitué par du chloroforme deutérié (CDCl 3), le méthanol et la solution CDTA préparé comme décrit en 6.2 (5: 4: 1 rapport en volume). Transférer l'échantillon dans un tube à centrifuger. Utilisez directe déplacement (ou volumétrique) micropipette avec du chloroforme-résisterconseils de fourmis dans les deux étapes.
REMARQUE: Gardez à l'esprit que toute modification des paramètres suivants affecte l'aspect (déplacement chimique et des largeurs de ligne) de PL 31 P spectres RMN 13-17:
(I) le rapport de volume CDCl3: solution CDTA: MeOH
(Ii) le volume total de solvant utilisé
(Iii) le pH du composant aqueux du solvant
(Iv) CDTA concentration du composant aqueux du solvant.
REMARQUE: En général, réglage fin de ces paramètres de l'échantillon (tableau 1) n'est pas nécessaire, et doit être effectuée avec un soin extrême, si désiré dans des cas particuliers. Modification du rapport en volume entre les solvants facilement en résulte la formation d'un système constitué de deux phases au lieu d'une phase homogène! Le système à une phase a été jugée plus pratique que le système à deux phases dans la plupart des applications 13,14. - Pour une analyse RMN de métabolites hydrosolubles, dissoudre lyophilisat (voir 5.8) en 700 ul de l'oxyde de deutérium (D 2 O), contenant de 3 (triméthylsilyle) de sel de sodium de l'acide propionique-2,2,3,3-d4 (TSPD 4) dans la plage millimolaire (D 2 O contenant 0,05% TSPD 4 est disponible dans le commerce) . Transférer l'échantillon dans un tube à centrifuger.
- Ajuster le pH de la solution d'extrait aqueux obtenu à 7,3 par addition de petites quantités (environ 2 pi) de chlorure de deuterium (DCL) et des solutions deutéroxyde de sodium (NaOD). Tout d'abord, commencer par 0,02 N solutions DCL ou NaOD. Si 2 ou 3 ajouts ultérieurs ne provoquent pas de changement de pH suffisant, passez à 0,2 N solutions DCL ou NaOD. Veillez à ne pas overtitrate.
NOTE: Le montant global de la solution SLCD ou NaOD nécessaire dépend de la quantité de tissu cérébral extrait; noter cette valeur pour la quantification précise métabolite. Dans la plupart des cas, les volumes combinés des solutions DCL et NaOD ajoutés devraient être pratiquement négligeable (près de 1% du volume de l'échantillon RMN).
- Pour de meilleurs résultats, utilisez un spectromètre de RMN à haute résolution polynucléaires (≥9.4 Tesla champ, correspondant à 162 MHz 31 P, ou 1 400 MHz les fréquences de résonance H). En plus de la bobine 31 P, veiller à ce que le P RMN sonde 31 possède une bobine 1 H pour découplage des protons. Régulation de la température de consigne de la sonde de RMN à une valeur cible désirée (généralement 25 ° C).
REMARQUE: la température de la sonde peut avoir besoin de 10-20 min à stabiliser! - Solution Centrifugeuse PL extrait dans un tube à centrifuger (voir 6.3) à 4 ° C et 11 000 g pendant 30 min à ralentissent résidus solides dans l'échantillon. Transférer 600 pl de surnageant dans un tube de RMN de haute qualité (de diamètre extérieur de 5 mm).
- Préparer la tige d'insert coaxial approprié rempli d'une solution aqueuse à 20 mM méthylènediphosphonate (MDP) à un pH de 7,0 pour le référencement déplacement chimiqueet la quantification. Placer cet insert dans le tube de RMN rempli d'une solution d'extrait de PL.
- Monter le tube RMN avec le spinner approprié et le transfert à l'aimant de RMN. Maintenant tourner l'échantillon à 15-20 Hz et attendre jusqu'à ce que l'échantillon s'est adapté à la température de consigne (environ 10 min).
- Minimiser soigneusement inhomogénéité de champ magnétique dans l'échantillon en ajustant sur l'axe et hors axe courants de bobine de cale 18.
- Réglez RMN paramètres d'acquisition du spectre de valeurs optimales, qui peuvent varier en fonction de l'intensité du champ magnétique (pour un système 9.4 T, voir le tableau 1 pour les valeurs des paramètres recommandés).
- Définir le nombre de transitoires par expérience (= NS).
- Situé à environ 80 NS (durée totale de l'acquisition de données d'environ 20 min), si seulement les MDD plus répandues doivent être quantifiés avec précision (phosphatidylcholine (PtdCho), la phosphatidyléthanolamine (PtdEtn), l'éthanolamine plasmalogène).
- Situé à environ 100-200 NS (durée totale de dacquisition ata 1-2 h) si les MDD sont moins concentrées à être quantifiée (alkyl-acyl-phosphatidylcholine, phosphatidylinositol, la phosphatidylsérine, l'acide phosphatidique).
- Situé à environ NS 1500-2000 (durée totale de l'acquisition de données 7-10 h; expérience la nuit) si PL très faible concentration doivent être quantifiée, par exemple mono phosphatidylinositol et diphosphates (PtdIP et PtdIP 2), la cardiolipine, lyso-PL , alkyl-acyl-phosphatidyléthanolamine, et parfois d'autres.
- Après la fin de l'acquisition du spectre, procédé décroissance d'induction libre (FID) à l'aide des paramètres optimisés. Les valeurs de ces paramètres varient en fonction de la force de champ magnétique, la qualité de la cale, et le signal PL à quantifier.
- Pour obtenir les meilleurs résultats pour l'ensemble de la gamme des MDD, répéter (au moins deux) des procédures de filtrage différentes de traitement utilisant multiple. Utilisez amélioration de la résolution forte pour les signaux fortement se chevauchent, par exemple., Pour PtdCho et PtdEtnrégions.
- Utilisez filtrage puissant (faible ou nulle amélioration de la résolution) pour les signaux faibles.
- Filtre signaux très faibles et larges sans chevauchement significatif par apodisation (par exemple, LB = 3 Hz) afin d'augmenter le rapport signal sur bruit, par exemple PtdIP PtdIP et 2. Voir le tableau 1 pour les paramètres de traitement caractéristiques.
- Quantifier la zone de chaque signal PL par rapport à la surface sous le signal du composé de référence (MDP) dans le même spectre.
- Calibrer le signal du composé de référence (PDM) dans une expérience séparée, au moyen d'un tube RMN de 5 mm rempli avec (i) un composé de concentration connue de phosphore, et (ii) de la même tige d'insert coaxial utilisé dans PL 31 expériences P RMN ( voir 7.3 et 7.9).
- Calculer les concentrations PL individuels en fonction des domaines relatifs des signaux PL d'une part (voir 7.9), et sur la valeur de calibrage obtenue pour MDP deinsert coaxial sur l'autre (voir 7.10). Prendre en compte le fait que le nombre de noyaux de phosphore qui contribuent à un signal particulier de 31 P RMN peut varier en fonction de l'origine moléculaire de ce signal.
REMARQUE: Le signal de phosphonate MDP (généralement référencé à 19.39 ppm) représente deux noyaux de phosphore, de même que le signal de phosphate de cardiolipine. Tous les autres signaux PL 31 P RMN détectés dans des extraits de cerveau représentent un noyau de phosphore chacun. - Utiliser un logiciel de statistiques que nécessaire pour comparer les niveaux PL cerveau entre les groupes d'animaux.
8 Performance de l'Expérience 1 H RMN pour l'analyse de l'eau soluble métabolites du cerveau
- Régulation de la température de consigne de la sonde de RMN 1 H à la valeur cible souhaitée (généralement 25 ° C). Voir aussi les remarques 7.1.
- Centrifuger la solution aqueuse de l'extrait dans le tube à centrifuger (voir 6.5) à 4 ° C et 11 000x g pendant 30 min à tourner vers le bas des résidus solides de l'échantillon. Transférer 600 pl de surnageant dans un tube de RMN de haute qualité (de diamètre extérieur de 5 mm).
- Transfert tube de RMN à l'aimant de RMN, cale et fixés spectre RMN paramètres d'acquisition de valeurs optimales, comme expliqué dans 7,4-7,6. Voir aussi le tableau 1 pour les valeurs des paramètres recommandés.
- Définissez le nombre de transitoires par expérience à environ NS = 32 (durée totale de l'acquisition de données environ 13 min). Pour obtenir de bons rapports signal-bruit pour des signaux très faibles, notamment dans la région aromatique, utiliser NS = 64 (durée totale d'acquisition de données environ 26 min) ou plus.
- Après la fin de l'acquisition du spectre, procédé décroissance d'induction libre (FID) à l'aide des paramètres optimisés. Les valeurs de ces paramètres varient légèrement en fonction de la force de champ magnétique, la qualité de la cale, et le signal de métabolite à quantifier.
REMARQUE: Dans la plupart des cas, il suffit de traiter chaque spectre fois, En utilisant un ensemble de paramètres de traitement qui présentent un bon compromis pour tous les signaux de métabolites. Voir le tableau 1 pour les paramètres de traitement caractéristiques. - Quantification de l'aire de chaque signal de métabolite (souvent un multiplet, qui se chevauchent parfois avec d'autres singulets ou multiplets provenant de différentes molécules) par rapport à la surface sous le signal du composé de référence (TSP-d 4) dans le même spectre.
- Calculer les concentrations de métabolites individuels basés sur TSP-d4 concentration (voir 6.4). Prendre en compte le fait que le nombre de protons qui contribuent à un signal particulier 1 H RMN peut varier en fonction de l'origine moléculaire de ce signal. Le signal TSP-d4 triméthyl (par rapport à 0,0 ppm) représente neuf protons.
- Utiliser un logiciel de statistiques que nécessaire pour comparer les niveaux de métabolites du cerveau entre les groupes d'animaux.
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Representative Results
Pour obtenir une meilleure résolution dans les spectres RMN métabolique de cerveau et d'autres extraits de tissus, il a longtemps été une pratique courante pour enlever ou ions masque de métal (le plus important: les ions paramagnétiques) présents dans des solutions d'extraction. Ceci a été réalisé soit en ajoutant un agent chélateur tel que l'EDTA ou le CDTA à l'extrait 19, ou par passage de l'extrait à travers une résine échangeuse d'ions telle que Chelex-100 20. Les résultats présentés dans la figure 1 montrent que cette étape n'est pas nécessaire pour une analyse par RMN H spectroscopique si des extraits de cerveau sont soigneusement préparés selon le protocole ci-dessus. Ici, raies spectrales très étroites ont été obtenues pour toutes les régions spectrales analysées. Même dans les régions très fréquentés, par exemple, pour la glutamine / glutamate et myo -inositol / glycine, des pics à une distance de <0,01 ppm sont presque entièrement séparable à 400 MHz (Figure 1, en bas). En conséquence, qualitatif,et l'analyse quantitative des nombreux petit, mais actuellement non affectés, les pics sont visibles au centre et en bas des panneaux de la figure 1 peut être envisagée à l'avenir.
Figure 1: Les sous-régions d'une caractéristique du spectre de RMN 1 H (400 MHz) de la phase aqueuse d'un extrait de tissu de cerveau d'un rat Lewis femelle. Ces trois panneaux montrent la très haute résolution pouvant être obtenue en utilisant le protocole présenté dans le présent document. Ni résine agent chélateur ni échange d'ions a été utilisée lors de la préparation de l'échantillon. Centrale et les panneaux du bas montrent l'existence de nombreux pics de faible intensité non affectés qui font allusion à l'immense plage dynamique couverte par haute résolution 1 H RMN spectroscopie d'extraits de tissus si elle est effectuée en utilisant des paramètres expérimentaux optimisés. Ce faible mais biendes signaux détectables peuvent potentiellement être identifiés et quantifiés dans le futur. Plusieurs métabolites détectés sont spécifiques du tissu cérébral, par exemple, le NAA marqueur de neurone ou le neurotransmetteur GABA. Cependant, la plupart des composés sont impliquées dans un large éventail de voies métaboliques qui sont communs à des cellules de mammifères, tels que les acides aminés, l'acide organique à chaîne ramifiée, un polyol, (phospho) lipides et le métabolisme de l'énergie, ainsi que dans la glycolyse et glutaminolysis, et des fonctions telles que la régulation osmotique, la croissance et la prolifération cellulaire. L'astérisque indique que la résonance de méthyle issu d'une impureté de méthanol. Abréviations: ala, alanine; lac, le lactate; thréo, la thréonine; BHB, β-hydroxybutyrate; Val, valine; ile, l'isoleucine; Leu, leucine; AAB, α-aminobutyrique; AHB, α-hydroxybutyrate; -ins de, scyllo -inositol;; tau, de la taurine myo -ins, myo -inositol; GPC, glycérophosphocholine; PC, phosphocholine; cho, choline; CRN, la créatinine; Cr, créatine; GABA,47; -aminobutyrate; asp, aspartate; NAA, N -acetylaspartate; Gin, glutamine; glu, le glutamate; suc, succinate; NANA, N -acetylneuraminate; ac, acétate; gly, de la glycine. Les petits pics à la base de la tige ala doublet du lactate doublet de satellite de 13 C (en haut). Reproduit sous licence Creative Commons Paternité (CCAL) conditions de Lutz NW (2013) les voies biochimiques cérébraux en auto-immune expérimentale encéphalomyélite et arthrite adjuvante et al: une étude comparative métabolomique.. PLoS ONE 8 (2):. E56101 S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Dans 31 spectroscopie RMN P, masquage ou éliminer les cations paramagnétiques (principalement de fer) est incontestablement une nécessité, car les phosphates forment facilement des complexes avec des ions bivalents et trivalents. Ajout de CDTA les extraits affecte à la fois la raie spectrale largeurs unedéplacements chimiques d; comparer la figure 2, en haut et en bas à gauche. rétrécissement de la ligne en choisissant 1000 mM (en bas à gauche) au lieu de 200 mM (en haut à gauche) CDTA a été souhaité, mais a abouti à la superposition de signaux PL qui doivent être quantifiés séparément (en haut à gauche). Par conséquent, 200 mM de CDTA est recommandé pour le composant aqueux du solvant PL, toutes les autres conditions étant égales par ailleurs. En outre, la température de l'échantillon lors de la mesure affecte les largeurs de raies spectrales et des déplacements chimiques; comparer la figure 2, en haut et en bas à droite. rétrécissement de la ligne en choisissant 277 K (en bas à droite) au lieu de 297 K (en haut à droite) a été souhaité, mais a abouti à la superposition de signaux PL qui doivent être quantifiés séparément (en haut à droite). Par conséquent, 297 K est recommandé que la température de mesure, toutes les autres conditions étant égales par ailleurs. La comparaison entre les deux panneaux supérieurs montre qu'une diminution de la concentration CDTA de 200 mM (en haut à gauche) à 50 mM (en haut à droite) n'entraîne deune légère augmentation de la largeur de ligne, et dans presque aucun changement dans les déplacements chimiques. Toutefois, notez que la concentration tissulaire dans l'extrait mM CDTA 50 est deux fois plus faible que dans l'extrait 200 mM CDTA, expliquant les lignes relativement étroites dans le panneau en haut à droite 13.
Figure 2 Phosphatidyléthanolamine (PtdE) régions du spectre des phospholipides RMN 31 P (162 MHz) d'extraits de tissus du cerveau de rats Lewis femelles (panneau en haut à gauche) concentration de tissu cérébral, 236 mg / ml. CDTA concentration et le pH du composant aqueux du solvant, 200 mM et 7,33, respectivement; température de mesure, des signaux de plasm et SM 297 K. PtdE sont bien résolu concentration (en bas à gauche) de tissu cérébral, 236 mg / ml. CDTA concentration et le pH dans le composant aqueux du solvant, 1,000 mM et 7,36, respectivement; Mesure de la température, signaux de plasm et SM 297 K. PtdE se recouvrent entièrement; ils ne peuvent pas être résolus en dépit de la largeur de ligne réduite, par rapport à la gamme haut à gauche (en haut à droite) concentration de tissu cérébral, 118 mg / ml. CDTA concentration et le pH du composant aqueux du solvant, 50 mM et 7,14, respectivement; température de mesure, 297 signaux K. PtdE et SM sont bien résolu concentration (en bas à droite) de tissu cérébral, 118 mg / ml. CDTA concentration et le pH du composant aqueux du solvant, 50 mM et 7,14, respectivement; Mesure de la température, 277 signaux K. PtdE et SM se recouvrent entièrement; ils ne peuvent pas être résolus, malgré une réduction de largeur de ligne par rapport à la gamme en haut à droite. Abréviations: PtdE plasma, plasmalogène éthanolamine; PtdE, la phosphatidyléthanolamine; SM, la sphingomyéline; DAP, phosphatidylserine; PTDC, phosphatidylcholine. Reproduit avec la permission de Lutz NW et al. (2010) l'optimisation multiparamétrique de 31 P analyse spectroscopique RMN de phospholipides dans les extraits de tissus bruts. 1 Déplacement chimique et la séparation du signal. Anal Chem 82 (13): 5433-5440. Copyright 2010 American Chemical Society. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
En utilisant le protocole ci-dessus (système à une phase 14; la figure 3, en haut à gauche), un grand nombre des MDD quantifiables ont été détectés (figure 3, en haut à droite), couvrant une gamme de concentration considérable (note signaux à haute intensité tronquées). Certains de ces signaux sont encore non attribué (U1, U2, U6). Si la préparation de l'échantillon, la mesure RMN et le traitement du spectre sont effectués comme indiqué dans ce protocole, une résolution spectrale est encore suffisante pour D régulièrementetect scission partielle de certains pics (DAP, PtdE, PtdE plasm, AAPtdE; bas à gauche). . En conséquence, qualitative et l'analyse quantitative des autres sous-groupes PL peuvent être envisagées à l'avenir la figure 3, en bas à droite, illustre la puissance de paramètres de traitement judicieusement choisis partiellement signaux séparés de composés à faible concentration (ici: PtdC1u, un PL dérivés de PTDC qui n'est pas entièrement identifié, et PTDC plasma) de résonance proche de signaux très forts (ici: PTDC).
Figure 3 phospholipides spectroscopie 31 P RMN (162 MHz) d'extraits de tissus cérébraux provenant de rats Lewis femelles. (Panneau supérieur gauche) Un système monophasé (à gauche) a été préféré à un système à deux phases (à droite). Le système couramment utilisé deux phases entrave correctePL quantification parce que la plupart de la phase supérieure est située en dehors du volume sensible de la bobine. (Panneau en haut à droite) complète du spectre RMN 31 P PL de cerveau de rat. Pour une meilleure visibilité des signaux faibles (PtdIP, PtdG), exponentielle élargissement de la raie (LB = 3 Hz) a été appliqué. Dans cette représentation, plusieurs signaux PL ne sont pas bien réglés, notamment dans les régions PTDC et PtdE. Pour les PL générant plus d'un signal RMN 31 P, noyaux observés sont soulignés (P TDIP, DJAP P, P TDIP 2, DJAP P 2). Actuellement signaux non affectés sont désignés par "U n" (où n = 1, 2, ...). (Panneau inférieur gauche) régions PtdE et PTDS du même spectre. Pour une meilleure résolution des pics, de Lorentz-Gauss transformation de la forme de la ligne a été appliquée (LB = -1 Hz, GB = 0,3). En raison de ces paramètres de traitement, un grand nombre de très faibles signaux PL sont difficiles à détecter. Cependant, au moins deux pics peutdiscerner pour chaque PtdE, PtdE plasma, AAPtdE, et DAP. (panneau en bas à droite) région PTDC obtenu avec les mêmes paramètres de traitement que la région PtdE. Plusieurs signaux à la base de la résonance PTDC dominante ont été détectés sans ambiguïté, alors qu'ils ne peuvent être distinguées dans le haut du spectre généré avec exponentielle élargissement de la raie (AAPtdC, PTDC plasma, PtdC1u). Outre l'analogique PTDC actuellement sans, PtdC1u, d'autres résonances mineures peut être présent à travers le terrain de PTDC. Abréviations: PtdIP, phosphate de phosphatidylinositol; PtdIP 2, le phosphatidylinositol-diphosphate; Ptda, l'acide phosphatidique; PtdG, le phosphatidylglycérol; CL, la cardiolipine; PtdE .., somme de PtdE, PtdE plasma et AAPtdE; DJAP, phosphatidylinositol. Pour de plus amples abréviations voir légende de la figure 2. Reproduit avec la permission de Lutz NW et al. (2010) l'optimisation multiparamétrique de 31 P analyse spectroscopique RMN de phospholipids dans des extraits bruts de tissus. 1 Déplacement chimique et la séparation du signal. Anal Chem 82 (13): 5433-5440. Copyright 2010 American Chemical Society. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| Récolte et de congélation de cerveau de rat | |||
| Dewar N 2liq.; gel pince (par exemple, pinces Wollenberger maison, refs 1 et 2, en bas du tableau.); chambre d'anesthésie; ciseaux chirurgicaux; scalpel; Flacon de 500 ml avec de l'alcool de nettoyage | 1 de chaque | ||
| Forceps | 2 | ||
| Seringue de 1 ml, 10 ml seringue | 1 de chaque par animal | ||
| 25 G aiguilles | 2 par animal | ||
| Prepar de l'échantillonation | |||
| Typique quantité de tissu cérébral par extraction | 250-350 mg | ||
| Volume de MeOH utilisé en homogénéisant 250 - de tissu cérébral de 350 mg | 4 ml | ||
| 5 ml de pipette en plastique | 3 par extrait | ||
| 10 ml de pipette en plastique | Extrait par une | ||
| Flacon en verre (≥20 ml de volume) | Extrait par une | ||
| Tube de centrifugation chloroforme résistant | Extrait par une | ||
| Période d'attente après homogénéisation des tissus dans du MeOH (mélange à 4 ° C) | 15 min | ||
| L'eau et le volume CHCl3 ajouté à du tissu cérébral homogénéisé dans 4 ml de MeOH | 4 ml chacun | ||
| Période d'attente après le mélange tissu homogénéisé avec de l'eau et CHCl 3 (mélange à -20 ° C) | du jour au lendemain | ||
| Centrifugation pour la séparation of aqueuse de la phase d'extrait organique (tube de centrifugation en verre) | 13 000 x g, pendant 40 min à 4 ° C | ||
| Concentration de la solution CDTA (phase aqueuse de mélange de solvant pour dissoudre les lipides extraits) | 200 mM | ||
| pH de la phase aqueuse du mélange de solvants pour dissoudre les lipides extraits | 7.4 | ||
| rapport du volume de solvant lipidique A utilisé pour l'analyse de PL 31 P (CDCI 3: MeOH: solution CDTA) | 5: 4: 1 | ||
| Quantité de solvant utilisé pour dissoudre Un lipides extraits de 250 - tissu cérébral de 350 mg | 700 ul | ||
| Centrifugation pour filer vers le bas des particules solides dans l'échantillon RMN (microtube) | 11 000 xg pendant 30 min à 4 ° C | ||
| pH de l'échantillon RMN contenant métabolites hydrosolubles | 7.3 | ||
| Le volume d'échantillon transféré au tube RMN, après centrifugation | 600 pl | ||
| Concentration MDP dans la tige d'insertion coaxial pour RMN 31 P | 20 mM | ||
| Les expériences de RMN | |||
| température de l'échantillon pendant expérience de RMN (à régler pour minimiser pic chevauchement) | 25 ° C | ||
| Spinning fréquence pendant expérience de RMN | 15-20 Hz | ||
| 1 Paramètres RMN acquisition | |||
| Solvant fournir 2 signal de verrouillage H | D 2 O | ||
| L'excitation de largeur d'impulsion, P1 | 11 ps | ||
| impulsion d'excitation, amplificateur atténuation, PL1 | 0 dB | ||
| Taille FID, TD | 32 k | ||
| FID acquisition time, AQ | 3.283 sec | ||
| Relaxation retard, D1 | 15 sec | ||
| Retard de suppression de solvant, D4 | 6 s | ||
| Temps de répétition totale, TR | 24.3 sec | ||
| Largeur spectrale en ppm, SWP | 12,47 ppm | ||
| Largeur spectrale en Hz, SW | 4990 Hz | ||
| gain de récepteur, RG | 512 | ||
| Suppression solvant (onde continue) | CW | ||
| Suppression solvant, amplificateur atténuation, PL9 | 50 dB | ||
| Nombre de transitoires, NS | 32 ou 64 | ||
| 31 Paramètres P RMN acquisition | |||
| Solvant fournir 2 signal de verrouillage H | CDCl3 | ||
| Excitation impulsion width, P1 | 9,5 microsecondes | ||
| impulsion d'excitation, amplificateur atténuation, PL1 | 4 dB | ||
| Taille FID, TD | 16 k | ||
| FID temps d'acquisition, AQ | 2.019 sec | ||
| Relaxation retard, D1 | 15 sec | ||
| Temps de répétition totale, TR | 17 sec | ||
| Largeur spectrale en ppm, SWP | 25 ppm | ||
| Largeur spectrale en Hz, SW | 4058 Hz | ||
| gain de récepteur, RG (maximum) | 16384 | ||
| Proton découplage (composite de découplage d'impulsion) | DPC | ||
| Découplage des protons, amplificateur atténuation, PL13 | 19 dB | ||
| Nombre de transitoires, NS | 1500 ou 2000 | ||
| RMN de traitement des données | 1 H amélioration de la résolution, de Gauss-lorentzienne LineShape transformation | ||
| Évaluation globale du spectre (le cas échéant, d'optimiser séparément pour les régions spectrales individuelles, en utilisant 0,1 <F <0,4 et -0,6 <LB <-0,2 Hz) | F = 0,15, LB = -0,2 Hz | ||
| Des signaux très faibles, par exemple, des acides aromatiques (alternativement à APODISATION avec LB ≥ 0,5 Hz) | GB = 0,015, LB = -0,3 Hz | ||
| Domaines relevant de pics: utilisation raie spectrale correspond de chevauchement des résonances | |||
| Amélioration de la résolution 31 P, gaussienne de Lorentz transformation forme de raie | |||
| Évaluation globale du spectre (optimiser séparément pour les régions spectrales individuelles, en utilisant 0,05 <F <0,2, et -3,0 <LB <60; -1,0 Hz) | GB = 0,05, LB = -1.0 Hz | ||
| Des signaux très faibles, par exemple, PtdIP 2, Ptda: apodisation | LB = 3 Hz | ||
| Domaines relevant de pics: utilisation raie spectrale correspond de chevauchement des résonances | |||
| Références | |||
| 1. Palladino GW, bois JJ, Proctor HJ. Modification technique du clamp gel pour le dosage de tissu. Le Journal de la recherche chirurgicale 289, 188-190 (1980). | |||
| 2. Wollenberger A, Ristau O, Schoffa G. [Une simple technique pour la congélation extrêmement rapide de grands morceaux de tissu]. Pflugers Archiv fur die gesamte Physiologie des Menschen und der Tiere 270, 399-412 (1960). | |||
Tableau 1: Les paramètres expérimentaux à haute résolution pour 1 H et 31 P spectroscopie RMN du cerveaudes extraits de tissus. Des valeurs typiques pour les rapports et concentrations de solvants et réactifs utilisés dans l'extraction du tissu cérébral et préparation de l'échantillon RMN de volume sont présentés. D'autres valeurs recommandées concernent pH et de la température de mesure, ainsi que RMN acquisition et de traitement des paramètres de l'échantillon. Des ajustements mineurs peuvent être nécessaires, en particulier si le protocole est appliqué à des tissus autres que le cerveau. Paramètres RMN ont été optimisés pour les mesures à 9,4 T, et devraient être ajustée si nécessaire pour spectromètres fonctionnant à différentes forces de champ magnétique.
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Discussion
La spectroscopie de RMN est une méthode efficace pour mesurer les concentrations des composés chimiques en solution d'une manière très reproductible et précise. Cependant, pour obtenir des données de haute qualité, il est nécessaire de respecter certaines règles concernant la préparation et l'analyse des échantillons. Dans la détermination de concentrations de métabolites par spectroscopie RMN, ni la production ni la réception du signal de RMN domine l'erreur de quantification, à moins que l'intensité d'un signal observé se rapproche du seuil de détection (notamment de signal faible). Dans tous les autres cas de variabilité biologique, la technique de préparation des échantillons (de l'efficacité de l'extraction, la stabilité physique et chimique des composés, pipetage et les erreurs etc pesant), et / ou le choix des paramètres d'acquisition et de traitement de signal détermine la précision et l'exactitude des résultats. De toute évidence, les changements métaboliques qui se produisent lors de la récolte de tissus seront également reflétées dans le métabolite concentrations obteniréd. Par conséquent, il est très important d'effectuer la récolte des tissus aussi vite que possible, et d'appliquer certaines techniques de congélation de tissu, comme un entonnoir de congélation si précis des concentrations in vivo de composés qui métabolisent rapidement sont importantes (notamment le glucose, le lactate, l'ATP et son catabolites, ADP et AMP).
Même à la force de champ magnétique intermédiaire (9,4 T) d'un spectromètre à haute résolution des spectres de RMN excellente routine peut être obtenu. Par exemple, dans une des spectres RMN de la phase aqueuse d'extraits de cerveau de rat, des signaux dont la différence de déplacement chimique, Δδ, s'élève jusqu'à environ 0,005 ppm (correspondant à 2,0 Hz à 400 MHz fréquence de résonance) peut être discerné et quantifiés séparément. Ceci est illustré par la séparation partielle de (i) et la lactate doublets thréonine, et (ii) le doublet alanine à partir des petits pics à la base (13 C lactate de doublet de satellite, la figure 1,haut). Spectromètres fonctionnant à des champs plus élevés (14,1 ou même 18,8 T) augmenteraient résolution et une sensibilité plus loin, bien que ces instruments sont moins fréquentes dans les laboratoires de RMN en raison de leur coût d'achat élevé.
En utilisant une spectroscopie RMN, une large gamme de metabolites peuvent être analysés simultanément, c'est à dire en une seule acquisition. La sensibilité de l'essai peut être améliorée en augmentant le nombre de transitoires accumulés, bien que ce choix augmente le temps de mesure proportionnel. (Le rapport signal-sur-bruit est proportionnel à la racine carrée du nombre de phénomènes transitoires.) Cependant, la durée totale d'acquisition maximale indiquée dans le protocole ci-dessus (20 - 30 min) doit être suffisante pour pratiquement toutes fins, à moins que le montant de tissu disponible pour l'extraction est très limitée. En plus de rendre l'utilisation du noyau le plus sensibles RMN (proton), métabolomique spectroscopie RMN 1 H présente l'avantage complet debases de données étant disponibles pour différentes intensités de champ et les valeurs pH de l'échantillon 10. Par ailleurs, le logiciel d'évaluation automatique ou semi-automatique est devenu disponible spectre 10.
Alors que 1 spectres RMN des extraits de tissus peut être bien résolu sans ajout d'agents chélateurs, ce n'est plus vrai pour les 31 spectres RMN P. En fait, la concentration de l'agent chélateur utilisé (par exemple, l'EDTA ou CDTA) a une influence significative sur les deux largeur de ligne et le déplacement chimique de 31 P RMN des signaux issus de métabolites phosphorylés. Augmentation de la concentration CDTA dans un extrait diminue de 31 largeurs de ligne P RMN, mais cet avantage peut être compensé par les petites différences entre les déplacements chimiques, Δδ, des pics voisins. Par conséquent, la quantité d'agent chélatant utilisée doit être optimisé pour une largeur de ligne à la fois et en même temps déplacement chimique. Dans des extraits lipidiques, ces deux paramètres spectraux sont significantly influencé par la concentration de l'échantillon global, c'est à dire la quantité de tissu extrait, mais aussi par la valeur du pH et la température de l'échantillon au cours de la mesure RMN. En conséquence, toute optimisation des conditions de mesure doit tenir compte des effets combinés de tous les paramètres expérimentaux impliqués, certains d'entre eux n'étant pas additif. La complexité de cette situation est illustrée par le comportement des spectres PL RMN 31 P montre la figure 2. Bien que la concentration tissulaire la plus faible (118 mg / ml), la température la plus basse (277 K) et la concentration la plus élevée CDTA (1,000 mM) testés aboutirait à la plus faible largeur de ligne, le protocole proposé recommande l'utilisation d'une concentration modérée de tissu (236 mg / ml), la concentration CDTA intermédiaire (200 mM) et la température ambiante (297 K) pour éviter les chevauchements de signal.
Bien que les conditions de préparation de l'échantillon et de l'acquisition du spectre sont d'une importance capitale, lerôle des paramètres de traitement du spectre en extraire un maximum d'informations à partir des données brutes acquises ne doit pas être sous-estimée. Un ensemble particulier de paramètres de traitement de mon être idéal pour la détection et la quantification de PL qui se produisent à de faibles concentrations; Toutefois, le même ensemble de paramètres peut masquer des pics individuels dans les régions «surpeuplées» spectrales (figure 3, en haut à droite). En revanche, les paramètres de traitement qui fournissent l'amélioration de la résolution optimale dans les régions de chevauchement des résonances fortement (de la figure 3, en bas) rendraient pics de faible intensité indétectable. Les développements récents, y compris d'une collection complète PL 31 P base de données de RMN 13,14, facilitent grandement l'analyse des spectres RMN 13,14.
En fin de compte, les objectifs de la demande sous-jacente doivent définir les critères pour l'optimisation, à savoir l'équilibre souhaité de la résolution spectrale, la sensibilité, la précision de métabolite QUANTIFication, la vitesse, et d'autres facteurs. Par exemple, le système à une phase recommandé pour l'analyse PL permis de quantification PL plus fiable et plus efficace que les systèmes à deux phases (figure 3, en haut à gauche), et offre une résolution spectrale élevée ainsi que la sensibilité suffisante pour la quantification des MDD moins abondantes . Cependant, dans les cas où plus de séparation de signaux est de plus grande priorité que la quantification précise et efficace, l'utilisation d'un pourcentage élevé de chloroforme-d dans le mélange de solvants peut être tentée, mais cela conduit facilement à une séparation de phases dans l'échantillon. Si tel est le cas, le volume de la phase inférieure doit être déterminée pour obtenir des quantités absolues PL (PL mg, par gramme de tissu ou mg de protéines totales).
Dans des expériences de RMN hétéronucléaire de protons découplés, les intensités de signaux peuvent être modifiées par effet Overhauser nucléaire (NOE), en plus de la saturation en raison de systèmes d'acquisition rapide. Si non corrigé ces effets résultent en métabolite quales erreurs de ntitation. Il existe deux stratégies alternatives pour faire face à ce défi. Dans la première approche, les transitoires individuels d'une acquisition sont séparés par de longs retards. Cette méthode évite toute saturation ou NOE mais résulte relativement longues expériences; il doit être utilisé si les résultats précis et exacts sont nécessaires. Dans certains cas, la priorité peut être donnée à l'acquisition de spectre rapide, en particulier pour les échantillons très dilués qui ne peuvent être mesurés à l'aide d'un grand nombre de transitoires. Dans de tels cas, l'addition d'agents de relaxation paramagnétique de l'échantillon permettra d'acquisition de données rapide et sans saturation ou NOE. Alternativement, l'acquisition rapide de données sans ajout d'agents paramagnétiques peut être utilisé. Cette dernière méthode nécessite une correction des zones où le signal par des facteurs de correction qui doivent être déterminés pour chaque résonance RMN, tandis que la présence d'agents de relaxation provoque un certain élargissement des signaux de RMN qui peut réduire la précision de quantification pour le métaboliterégions spectrales bondés. En général, le choix optimal de conditions expérimentales ne sont pas seulement dictée par le type de l'échantillon, mais également par l'information devant être extraite à partir d'une expérience 13. Si une haute priorité doit être accordée à l'analyse rapide des métabolites plutôt abondantes, sans la nécessité d'une haute précision et d'exactitude, il peut être suffisant pour mesurer des échantillons très concentrés et employer courts temps de répétition, éventuellement avec un agent de relaxation paramagnétique ajouté à l'échantillon. En revanche, si une quantification précise d'un grand nombre de métabolites est plus importante que la vitesse, il est préférable d'utiliser des extraits moins concentrées et accepter de longues périodes d'acquisition RMN, comme en témoigne le protocole présenté ici. En outre, si un projet de recherche met l'accent sur les métabolites spécifiques, les conditions expérimentales peuvent être ajustées pour obtenir une résolution spectrale optimale pour les régions spectrales en question. Le protocole et l'analyse présentée ici peut servir de guide pour l'optimization d'analyse métabolomique des extraits de tissu brut par spectroscopie RMN.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Virbac | Vetflurane | Anesthetic for animals |
| Isoflurane vaporizer | Ohmeda | Isotec 3 | Newer model available: Isotec 4 |
| Scalpel, scissors, forceps, clamps | Harvard Apparatus Fisher Scientific |
various various |
Surgical equipment for animals |
| Freeze-clamp tool | homebuilt | n/a | Tong with aluminium plates, to be inserted in liquid nitrogen for cooling |
| Dewar | Nalgene | 4150-4000 | |
| Liquid nitrogen | Air Liquide | n/a | |
| Nitrogen gas | Air Liquide | n/a | |
| Nitrogen evaporator | Organomation Associates | N-EVAP 111 | Can be replaced by homebuilt device |
| Mortar | Sigma-Aldrich | Z247472 | |
| Pestle | Sigma-Aldrich | Z247510 | |
| Tissue homogenizer | Kinematica | Polytron | With test tubes fitting homogenizer shaft |
| Electronic scale | Sartorius | n/a | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | M3641 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 366910 | |
| Glass centrifuge tubes | Kimble | 45500-15, 45500-30 | Kimax 15 ml, 30 ml tube |
| Microcentrifuge tubes | Kimble | 45150-2 | Kimax 2 ml tube; should replace "Eppendorf" tube if compatible with centrifuge rotor |
| Polystyrene pipettes | Costar Corning | Stripettes | 5 and 10 ml volumes |
| Deuterochloroform | Sigma-Aldrich | 431915 | 99.96% deuterated |
| Deuterium oxide | Sigma-Aldrich | 423459 | 99.96% deuterated |
| Deuterium chloride | Alpha Aesar | 42406 | 20% in deuterium oxide |
| Sodium deuteroxide | Sigma-Aldrich | 164488 | 30% in deuterium oxide |
| Lyophilizer | Christ | Alpha 1-2 | |
| Cold centrifuge | Heraeus | Megafuge 16R | |
| pH meter | Eutech Cybernetics | Cyberscan | |
| CDTA | Sigma-Aldrich | D0922 | |
| Cesium hydroxide | Sigma-Aldrich | 516988 | |
| NMR tubes | Wilmad | 528-PP | |
| NMR stem coaxial insert | Sigma-Aldrich | Z278513 | By Wilmad |
| NMR pipettes | Sigma-Aldrich | Z255688 | |
| Pipettes | Eppendorf | Research | With tips for volumes from 0.5 to 1,000 μl |
| Pipet-Aid | Drummond | XP | |
| NMR spectrometer | Bruker | AVANCE 400 | including probe and other accessories |
| NMR software | Bruker | TopSpin 1.3 | newer version available: Topspin 3.2 |
| Water-soluble standard compounds | Sigma-Aldrich | various | |
| Phospholipid standard compounds | Avanti Polar Lipids Doosan Serdary Sigma-Aldrich |
various various various |
Source for plasmalogens, but may be <70 - 80% purity |
| Methylenediphosphonate | Sigma-Aldrich | M9508 | |
| TSP-d4 | Sigma-Aldrich | 269913 |
References
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