Introduction
Murine मॉडल मस्तिष्क अनुसंधान 1 में बड़े पैमाने पर उपयोग किया गया है. जीनोटाइप-phenotype सहसंबंध अन्य 2-6 पर एक हाथ पर शाही सेना और / या प्रोटीन के स्तर पर जीन अभिव्यक्ति का अध्ययन करके माउस और चूहे के दिमाग में जांच की, और, रूपात्मक कार्यात्मक, electrophysiological और / या व्यवहार phenotypes किया गया है. हालांकि, पूरी तरह से जीनोटाइप के लिए फेनोटाइप जोड़ने तंत्र को समझने के लिए, यह नीचे की ओर प्रोटीन अभिव्यक्ति, यानी की आणविक घटनाओं की जांच के लिए जरूरी है. एंजाइमों 7 कार्य जिस पर जैव रासायनिक substrates के चयापचय. इस आवश्यकता को जीव विज्ञान 8,9 की कई शाखाओं में चयापचय अनुसंधान के पुनर्जागरण के लिए, पिछले 10 से 15 वर्षों में, का नेतृत्व किया. शास्त्रीय चयापचय अध्ययन अक्सर विशिष्ट रास्ते में से विवरण पर ध्यान केंद्रित किया गया है, वहीं नए metabolomic दृष्टिकोण विचाराधीन ऊतक के वैश्विक चयापचय प्रोफाइल के एक सब को शामिल जांच की दिशा में सक्षम है.इस अवधारणा का एक परिणाम यह विशिष्ट चयापचय मार्ग और / या यौगिकों की कक्षाओं के प्रति पूर्वाग्रह कम से कम कि विश्लेषणात्मक उपकरणों के लिए एक स्पष्ट की जरूरत है. हालांकि, एक शास्त्रीय जैव रासायनिक परख परख प्रदर्शन किया है से पहले निर्दिष्ट करने की आवश्यकता है कि एक विशिष्ट analyte की एक विशेष रासायनिक प्रतिक्रिया पर आधारित है. इसके विपरीत, इस तरह के परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) स्पेक्ट्रोस्कोपी और मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) (क) के रूप में स्पेक्ट्रोस्कोपी तकनीक जैव रासायनिक यौगिकों, का विशेष आणविक (शारीरिक) गुणों के आधार पर कर रहे हैं, जिनमें से प्रत्येक एक स्पेक्ट्रम में एक या कई अलग संकेतों को जन्म देता है एक प्रयोग के पाठ्यक्रम में पाया; और (ii) प्रयोग प्रति अलग यौगिकों की एक बड़ी संख्या का पता लगा.
इस प्रकार, प्रत्येक स्पेक्ट्रम मेटाबोलाइट्स की एक पूरी रेंज के संयुक्त जानकारी है. कोई पूर्व चयन विश्लेष्य की प्रकृति के बारे में 8 मापा जा करने के लिए किए जाने की आवश्यकता के रूप में इस कारण से, स्पेक्ट्रोस्कोपी तरीकों metabolomics के लिए पर्याप्त उपकरण हैं,
एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी और एमएस कई मेटाबोलाइट्स के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, प्रत्येक विधि विशिष्ट फायदे और हाल ही में 10 की समीक्षा की गई है कि नुकसान के पास. संक्षेप में, एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी आमतौर पर कच्चे तेल के अर्क से किया जा सकता है और विश्लेषण से पहले नमूना यौगिकों की chromatographic जुदाई की आवश्यकता नहीं है. इसके विपरीत, एमएस ऐसे मास स्पेक्ट्रोमेट्री इमेजिंग के रूप में विशेष रूप से हाल के घटनाक्रम के अलावा, गैस या तरल क्रोमैटोग्राफी (जीसी या नियंत्रण रेखा) जुदाई के साथ काम करता है. विभिन्न शर्करा की गूंज लाइनों (1 एच) एनएमआर स्पेक्ट्रा प्रोटॉन में काफी ओवरलैप क्योंकि ऐसे शर्करा के विश्लेषण के रूप में कुछ विशेष मामलों में, नियंत्रण रेखा जुदाई, साथ ही एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी के लिए एक आवश्यकता बन सकता है. CHR बिना फिर भी, 1 एच एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपीomatographic जुदाई सबसे लोकप्रिय, लगभग सार्वभौमिक एप्लाइड metabolomic एनएमआर विधि बनी हुई है. आम तौर पर, नमूना तैयार यह एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी के लिए है की तुलना में एमएस के लिए और अधिक समय लेने वाली और जटिल है. मैट्रिक्स प्रभाव के कारण गंभीर समस्या ज्यादा वे काफी तनु संकेतों को जन्म दे सकती है, जहां एमएस में से एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी में कम आम हैं. Metabolite quantitation या तो विधि के साथ प्राप्त किया जा सकता है. हालांकि, कई मानक यौगिकों के कारण मेटाबोलाइट्स के बीच मैट्रिक्स प्रभाव और आयनीकरण क्षमता में बदलाव करने के लिए एमएस के लिए आवश्यक हैं. इसके विपरीत, नमूना प्रति केवल एक मानक क्योंकि उपयुक्त मापने परिस्थितियों में एक एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी विश्लेषण के लिए आवश्यक है, बाद विधि आंतरिक रूप से मनाया नाभिक से सख्ती से रेखीय एनएमआर प्रतिक्रिया के लिए मात्रात्मक धन्यवाद है. एनएमआर की एक बड़ी खामी इसकी अपेक्षाकृत कम संवेदनशीलता है. एमएस, विशेष रूप से नियंत्रण रेखा एमएस में, परिमाण के कई आदेशों द्वारा एनएमआर तुलना में अधिक संवेदनशील है; इस कारण से, एमएस के लिए एनएमआर अधिक पसंद किया जा रहा हैबहुत कम मात्रा में होने वाली यौगिकों का विश्लेषण. दूसरी ओर, एनएमआर प्रयोग के nondestructive प्रकृति एमएस पर एक स्पष्ट लाभ है; इस तरह, एनएमआर ऐसे 1 एच, फास्फोरस-31 (31 पी), कार्बन -13 (13 सी) के रूप में विभिन्न एनएमआर सक्रिय नाभिक के लिए, जैसे ही नमूना, पर बार बार प्रदर्शन किया जा सकता फ्लोरीन -19 (19 एफ) आदि., एमएस माप के लिए विरोध के रूप में कोई सामग्री एनएमआर द्वारा सेवन किया जाता है के रूप में.
एनएमआर और एमएस दोनों अलग मोड में नियोजित किया जा सकता है, हर एक विशेष रासायनिक गुणों के साथ यौगिकों का पता लगाने के लिए इष्टतम किया जा रहा है. लगभग सभी phosphorylated मेटाबोलाइट्स भी प्रोटॉन होते हैं, हालांकि उदाहरण के लिए, 31 पी एनएमआर, अक्सर मामूली केंद्रित phosphorylated यौगिकों के विश्लेषण के लिए 1 एच एनएमआर से बेहतर अनुकूल है. हालांकि, उनके 1 एच एनएमआर संकेतों जबकि बाद, अन्य, गैर phosphorylated यौगिकों से 1 एच एनएमआर संकेतों से छिप जा सकता हैजाहिर है 31 पी एनएमआर स्पेक्ट्रा में पृष्ठभूमि संकेतों का कारण नहीं है. 13 सी एनएमआर का विशेष मामला लगभग विशेष रूप से ब्याज की है, जबकि एक अनुरूप स्थिति में, 19 एफ एनएमआर विश्लेषण, fluorinated यौगिकों, जैसे, fluorinated दवाओं (अंतर्जात मेटाबोलाइट्स से कोई पृष्ठभूमि संकेत) के लिए पसंद किया जा रहा है तो 13 सी के भाग्य लेबल बहिर्जात चयापचय व्यापारियों कारण 13 सी आइसोटोप (सीए 1%) के बहुत कम प्राकृतिक बहुतायत के लिए, का पालन किया जाना चाहिए. कई मास स्पेक्ट्रोमीटर नकारात्मक आयन मोड या सकारात्मक आयन मोड या तो में काम करते हैं. इसलिए, यह आगे आयनों नकारात्मक या सकारात्मक चार्ज कर रहे हैं मनाया जा चाहे विश्लेषण के बारे में पता करने के लिए महत्वपूर्ण है. इस विधि नमूना तैयार करने के लिए एक के लिए आवश्यक (मैं) समय के संदर्भ में कम लागत में महत्वपूर्ण metabolite सांद्रता की एक बड़ी संख्या पैदावार क्योंकि हम 1 एच और 31 पी एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा मस्तिष्क के ऊतकों metabolome के विश्लेषण के लिए एक प्रोटोकॉल पर यहाँ ध्यान केंद्रितएन डी (द्वितीय) प्रयास metabolite quantitation के लिए जरूरी है. सभी प्रयोगों एक मानक गीला रसायन विज्ञान प्रयोगशाला के उपकरण और एक उच्च संकल्प एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी सुविधा का उपयोग किया जा सकता है. आगे की आवश्यकताओं नीचे प्रोटोकॉल खंड में वर्णित हैं.
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Protocol
नोट: पशु आचार वक्तव्य
चूहों पर जानवरों के अध्ययन फ्रांस में मान्य दिशा निर्देशों का पालन किया, और स्थानीय आचार समिति (# 40.04, ऐक्स मार्सिले मेडिकल स्कूल विश्वविद्यालय, मार्सिले, फ्रांस) द्वारा अनुमोदित किया गया.
1 कटाई और चूहे के मस्तिष्क बर्फ़ीली
- आवश्यक वस्तुओं की तैयारी: तरल नाइट्रोजन (एन 2liq.) देवर में एक ठंड दबाना (कम से कम 2-3 एल मात्रा) रखने के लिए पर्याप्त रूप से बड़ा है; संवेदनाहारी (जैसे, isoflurane, या ketamine / xylazine); संज्ञाहरण चैम्बर; बाँझ विच्छेदन उपकरण: शल्य कैंची, छुरी, संदंश; ऊतक पोंछे और शराब (इथेनॉल) की सफाई के साथ बोतल; सुई (25 जी); 1 मिलीग्राम और 10 मिलीग्राम सीरिंज. चिपचिपा टेप के साथ लेबल एल्यूमीनियम शीट (सीए 10 x 10 सेमी). व्यक्तिगत फ्रीज clamped चूहे के दिमाग को लपेटने के लिए शीट का उपयोग करें.
नोट: तरल नाइट्रोजन से निपटने जब हमेशा सुरक्षात्मक दस्ताने और नेत्र सुरक्षा चश्मे या नकाब पहनने! - एन 2liq साथ देवर भरें. और मुफ्त जगहएक देवर में zing दबाना. देवर में एन 2liq की राशि दोहराया फ्रीज दबाना प्रक्रियाओं के लिए पर्याप्त है सुनिश्चित करें (कई लीटर, प्रत्येक फ्रीज clamping के दौरान वाष्पन एन 2liq की राशि क्लैंप के आकार पर निर्भर करता है).
- (Isoflurane से, उदाहरण के लिए, या एक ketamine / xylazine मिश्रण की intraperitoneal इंजेक्शन द्वारा) पशु anesthetize. खोपड़ी निकाल दिया जाता है और खोपड़ी खोला है जब खून बह रहा रोकने के लिए हृदय पंचर द्वारा इच्छामृत्यु के लिए आगे बढ़ें. कदम 1.4-1.7 नीचे इस मानक प्रक्रिया का वर्णन.
नोट: कीप ठंड एन के साथ anesthetized जानवर के मस्तिष्क से ग्लूकोज और उच्च ऊर्जा मेटाबोलाइट्स, बलिदान चूहे का अधिकतम संरक्षण की आवश्यकता होती है विशेष प्रोटोकॉल में खोपड़ी के त्याग के बाद 11 2liq. फिर, पोस्टमार्टम चयापचय 12 कम करने के लिए आंतरायिक एन 2liq तहत खोपड़ी से बाहर मस्तिष्क काटना. - शराब की सफाई के साथ चूहे का सिर गीला. (मैं) रेम को शल्य कैंची का प्रयोग करेंove खोपड़ी, और कपाल टांके साथ (द्वितीय) खुला खोपड़ी.
- आगे खोपड़ी को खोलने के लिए संदंश का प्रयोग करें, और उल्टा सिर स्थिति, खुले खोपड़ी के नीचे से पूरे मस्तिष्क को दूर करने के लिए. जल्दी से ऊतक पोंछे का उपयोग रक्त के किसी भी दृश्य निशान हटाने. मस्तिष्क गोलार्द्धों पाचन और आकृति विज्ञान सममित हैं, तो यह स्केलपेल के साथ चीरा द्वारा अन्य गोलार्द्ध से अलग होने के बाद चयापचय विश्लेषण के लिए गोलार्द्धों में से एक का उपयोग करने के लिए सुविधाजनक है. यदि आवश्यक हो, ऐसे ऊतक विज्ञान के रूप में अन्य मस्तिष्क के अध्ययन के लिए शेष गोलार्द्ध का उपयोग करें.
- जल्दी निकालने के देवर एन 2liq से दबाना -filled ठंड, एक भीतरी सतह, दबाना पर पूरे या आधे चूहे के मस्तिष्क जगह है और तुरंत एन 2liq में दबाना ठंड डालने मजबूती से संकुचित दबाना पकड़े जबकि देवर -filled. कि 1.3-1.6 60 सेकंड से अधिक नहीं रह गया कदम उठाने सुनिश्चित करें.
- देवर, खुला दबाना से 1-2 मिनट हटाने ठंड दबाना बाद, स्थिर मस्तिष्क दबाना से ऊतक, और चादर ढीलाउचित लेबल एल्यूमीनियम शीट में जमे हुए ऊतक (ऊपर 1.1 देखें). लेबल पढ़ने योग्य है और नमूना लिपटे होने के बाद जगह में मजबूती से रहता है कि सुनिश्चित करें. जल्दी एन 2liq में लिपटे नमूना जगह है. जमे हुए मस्तिष्क के ऊतकों का विगलन से बचने के लिए जितनी जल्दी संभव हो पूरी प्रक्रिया को पूरा करें.
- एन 2liq में या metabolite निष्कर्षण तक -80 डिग्री सेल्सियस पर एक फ्रीजर में जमी नमूना स्टोर.
नोट: एक जैविक नमूने एक से अधिक वर्ष के लिए भंडारित किया जा रहा है जब भी, एन 2liq तापमान पर भंडारण -80 डिग्री सेल्सियस से अधिक पसंद किया जा रहा है. यह भी इस प्रोटोकॉल के शेष के लिए लागू होता है.
Metabolite निष्कर्षण प्रक्रिया के 2. तैयारी
- ऊतक homogenizer और मिलान टेस्ट ट्यूब (; आमतौर पर प्लास्टिक से बने homogenizer शाफ्ट का व्यास के आधार पर जैसे, 10 मिमी भीतरी व्यास,) तैयार करें. बिजली homogenizers बजाय मैन्युअल संचालित homogenizers (ऊतक grinders) का प्रयोग करें. पूर्वvortexer और प्रयोगशाला संतुलन छाँटना.
- कुचल बर्फ से भरा बाल्टी तैयार करें. बर्फ (4 मिलीलीटर 250-350 मिलीग्राम जमे हुए मस्तिष्क के ऊतकों के अनुसार प्रत्येक) पर मेथनॉल, क्लोरोफॉर्म और पानी की पर्याप्त quantitites रखें.
- स्थानांतरण pipettes और शीशियों तैयार करें.
- ग्लास बर्फ पर पेंच टोपियां और जगह के साथ शीशियों (≥20 मिलीलीटर मात्रा) (ऊतक निकालने के प्रति एक शीशी) तैयार करें. फ़िट पेंच क्लोरोफॉर्म के लिए प्रतिरोधी एक Teflon सेप्टा के साथ टोपियां.
- क्लोरोफॉर्म के वितरण के लिए मेथनॉल और पानी, और कांच pipettes या हैमिल्टन सीरिंज के वितरण के लिए 5 मिलीलीटर प्लास्टिक pipettes तैयार करें. ऊतक homogenate और मेथनॉल के मिश्रण में परिवर्तित करने के लिए अतिरिक्त प्लास्टिक pipettes (5 या 10 मिलीलीटर मात्रा) तैयार करें.
- सुनिश्चित करें कि सभी के बने पदार्थ अच्छी तरह से आसुत जल के साथ rinsed और ध्यान से अशुद्धियों के निशान, विशेषकर एनएमआर-detectable वह स्वरूप और एसीटेट दूर करने के लिए उपयोग करने से पहले सूख जाता है बनाओ.
- मोर्टार में एन 2liq, जगह बरतन मूसल के साथ चीनी मिट्टी के बरतन मोर्टार भरें और एन 2L के साथ फिर से भरनाबुद्धि. मोर्टार और मूसल का तापमान पर्याप्त रूप से कम है जब तक नाइट्रोजन लुप्त हो जाएगा. मोर्टार में एन 2liq की छोटी राशि रखें.
चयापचयों का 3 निकालना
- भंडारण (एन 2liq टैंक या -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर) से जमे हुए मस्तिष्क ऊतक के नमूने निकालें. तो, तुरंत एन 2liq के साथ आंशिक रूप से भर मोर्टार के ऊतक नमूना हस्तांतरण.
- आसानी से ऊतक homogenization के लिए इस्तेमाल टेस्ट ट्यूब में फिट कि छोटे टुकड़ों में जमे हुए मस्तिष्क के ऊतकों को तोड़ने के लिए एन 2liq -cold मूसल का प्रयोग करें. इस प्रक्रिया में मोर्टार के बाहर पेश किया जा रहा से जमे हुए ऊतक के टुकड़े को रोकने अभी भी एल्यूमीनियम शीट में लपेटा जा रहा है, जबकि ऊतक को तोड़ने के लिए. इस टेस्ट ट्यूब अधिक मुश्किल (पानी संक्षेपण का खतरा बढ़) करने के लिए स्थानांतरण होगा के रूप में पाउडर के लिए जमे हुए ऊतक पीस न करें. महत्वपूर्ण: इस पूरी प्रक्रिया के दौरान, के रूप में जमे हुए गहरी नमूना रखने के लिए आवश्यक मोर्टार के एन 2liq जोड़ें.
- मिक्स हैअच्छी तरह से जमे हुए मस्तिष्क के ऊतकों के मॉल टुकड़े, 250-350 मिलीग्राम वज़न और ठंडा मेथनॉल (250-350 मिलीग्राम मस्तिष्क के ऊतकों के लिए 4 मिलीग्राम) से भरा एक टेस्ट ट्यूब को हस्तांतरण. जमे हुए ऊतक का हर समय टुकड़े ऊतक homogenizer साथ तुरंत इन homogenize, जोड़ रहे हैं.
नोट: नमूना वजन का एक overestimation के लिए नेतृत्व, और नमूना (ii) हीटिंग और विगलन होगा जो नमूना पर पानी की महत्वपूर्ण संक्षेपण (मैं) से बचने के लिए जल्दी से इस पूरी प्रक्रिया को पूरा करें. व्यक्तिगत ऊतक टुकड़े homogenization प्रक्रिया की शुरुआत में एक जमे हुए राज्य में होना चाहिए. - जमे हुए चूहे के मस्तिष्क नमूना के अंतिम टुकड़ा टेस्ट ट्यूब और homogenized में जोड़ा गया है के बाद, एक ≥20 मिलीलीटर मात्रा कांच की शीशी, करीब पेंच टोपी के लिए homogenate स्थानांतरण और 15 मिनट के लिए बर्फ पर खड़े हो जाओ. टेस्ट ट्यूब की मात्रा ≥4 मिलीलीटर मेथनॉल के लिए पर्याप्त बड़ी नहीं है, तो स्थानांतरण के मिश्रण, स्थिर मस्तिष्क के ऊतकों का एक हिस्सा homogenize करने के लिए एक छोटे मेथनॉल मात्रा का उपयोगकांच की शीशी और ताजा मेथनॉल के साथ अवशिष्ट ऊतक टुकड़े homogenizing जारी है. कुल मेथनॉल मात्रा 250-350 मिलीग्राम मस्तिष्क ऊतक के अनुसार 4 मिलीग्राम है सुनिश्चित करें.
- अच्छी तरह से homogenate, भंवर को ठंडा क्लोरोफॉर्म (यानी, 250-350 मिलीग्राम मस्तिष्क ऊतक के अनुसार 4 मिलीलीटर) की उसी मात्रा जोड़ें और 15 मिनट के लिए बर्फ पर खड़े हो जाओ.
नोट: विशेष रूप से क्लोरोफॉर्म, अस्थिर सॉल्वैंट्स निपटने जब हमेशा हवादार रासायनिक हुड का उपयोग करें! - पानी की एक ही मात्रा में जोड़ें (यानी, 250-350 मिलीग्राम मस्तिष्क के ऊतकों प्रति 4 मिलीलीटर) homogenate, भंवर को अच्छी तरह से और -20 डिग्री सेल्सियस रातोंरात पर खड़े हो जाओ.
चरण जुदाई और वाष्पीकरण विलायक का 4 तैयारी
- ठंड अपकेंद्रित्र (4 डिग्री सेल्सियस, अधिकतम त्रिज्या में 13,000 XG) और अपकेंद्रित्र ट्यूबों तैयार. उत्तरार्द्ध क्लोरोफॉर्म के लिए प्रतिरोधी ≥20 मिलीलीटर मात्रा में हैं, और 13,000 एक्स जी के केंद्रत्यागी बलों का सामना कर सकते हैं सुनिश्चित करें. हो आसुत जल के साथ समर्पित ग्लास ट्यूब का उपयोग करें, लेकिन (सभी कांच के बर्तन के रूप में) कुल्लासामने उपयोग (2.3 देखें).
- अच्छी तरह से rinsed गिलास पाश्चर pipettes और एक उपयुक्त propipettor तैयार (बल्ब, पुस्तिका पिपेट पंप, स्वत: पिपेट सहायता / pipettor, आदि.).
- (कांच या Teflon से बना) क्लोरोफॉर्म के लिए प्रतिरोधी होने की जरूरत है, जिनमें से एक मस्तिष्क नमूना प्रति दो अतिरिक्त अच्छी तरह से rinsed ट्यूब (≥15 मिलीलीटर मात्रा), (मेथनॉल, या कांच के लिए प्रतिरोधी प्लास्टिक से बने) मेथनॉल के लिए एक दूसरे को तैयार करें.
- (व्यावसायिक रूप से उपलब्ध या homebuilt) विलायक वाष्पीकरण तंत्र तैयार करें. इस डिवाइस अस्थिर सॉल्वैंट्स (मेथनॉल, क्लोरोफॉर्म) युक्त एक उद्धरण समाधान की सतह पर निर्देश दिया है कि सूखी नाइट्रोजन गैस का एक पतले नियंत्रित प्रवाह प्रदान करता है कि सुनिश्चित करें.
- बर्फ से भरा दो अतिरिक्त ट्रे या बाल्टी तैयार: एक नमूना बर्फ पर परिवहन, और वाष्पीकरण की प्रक्रिया के दौरान ठंड के नमूने रखने के लिए एक दूसरे के लिए.
- Lyophilization के लिए आवश्यक lyophilizer (फ्रीज ड्रायर) और सामग्री तैयार: (मैं) एक 50एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब या वैक्यूम दौर नीचे निकालने प्रति फ्लास्क, और (ii) एन 2liq नमूनों की जलीय चरण (नमूना प्रति ≤0.3 एल) फ्रीज करने के लिए. अपकेंद्रित्र ट्यूब प्रयोग किया जाता है, तो भी lyophilizer के लिए उपयुक्त विस्तृत गर्दन वैक्यूम फिल्टर बोतल तैयार करते हैं.
5 चरण जुदाई और वाष्पीकरण विलायक
- पूर्ण चरण जुदाई के लिए, 13,000 XG पर एक क्लोरोफॉर्म प्रतिरोधी अपकेंद्रित्र ट्यूब (≥20 मिलीलीटर मात्रा) और अपकेंद्रित्र (3.6 देखें) मेथनॉल / क्लोरोफॉर्म / पानी / मस्तिष्क ऊतक homogenate हस्तांतरण और 40 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस.
नोट: दो चरणों उपजी प्रोटीन की एक परत से अलग, बनेगी. ऊपरी (हल्का) चरण पानी, मेथनॉल और भंग पानी में घुलनशील मेटाबोलाइट्स के होते हैं, जबकि कम (भारी) चरण, मेथनॉल, क्लोरोफॉर्म और भंग लिपिड के होते हैं. - एक उपयुक्त ≥15 मिलीलीटर ट्यूब (मेथनॉल के लिए प्रतिरोधी प्लास्टिक, या ग्लास) ऊपरी चरण स्थानांतरित करने के लिए एक पाश्चर पिपेट का उपयोग करें. मैं पर रखेंCE.
- एक उपयुक्त ≥15 मिलीलीटर ट्यूब (ग्लास या Teflon) को कम चरण स्थानांतरित करने के लिए एक ताजा पाश्चर पिपेट का उपयोग करें. बर्फ पर रखें.
- यह कुल प्रोटीन के निर्धारण के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है अगर -80 डिग्री सेल्सियस पर उपजी प्रोटीन की परत स्टोर; वरना त्यागें.
- बर्फ पर पानी / मेथनॉल चरण (5.2 देखें) के साथ ट्यूब रखें और निकालने समाधान की सतह पर एक सूखी नाइट्रोजन धारा निर्देशन द्वारा मेथनॉल लुप्त हो जाना. वैकल्पिक रूप से, निकालने समाधान के माध्यम से धीरे बुलबुला नाइट्रोजन. नाइट्रोजन बुदबुदाती नहीं रह निकालने समाधान में मात्रा में कमी का कारण बनता है जब वाष्पीकरण की प्रक्रिया को समाप्त. इस समय, lyophilization के साथ जारी (5.7 देखें), या फ्रीज और ट्यूब बंद के साथ lyophilization के लिए जब तक (पेंच टोपी या Parafilm) -80 डिग्री सेल्सियस पर तैयार नमूना रखना.
- बर्फ पर मेथनॉल / क्लोरोफॉर्म चरण (5.3 देखें) के साथ ट्यूब प्लेस और सु पर एक सूखी नाइट्रोजन धारा निर्देशन द्वारा मेथनॉल लुप्त हो जानानिकालने समाधान की rface. सभी विलायक सुखाया जाता है, इस प्रक्रिया को समाप्त कर और ट्यूब बंद के साथ एनएमआर विश्लेषण के लिए तैयार है जब तक (पेंच टोपी या Parafilm) -80 डिग्री सेल्सियस पर नमूना रखना.
- Lyophilization के लिए जलीय चरण की तैयारी
- मेथनॉल वाष्पीकरण की प्रक्रिया के अंत (5.5 देखें) के बाद, एक अच्छी तरह से rinsed 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब नमूना स्थानांतरण (नमूना जमे हुए है, तो पिघलना हस्तांतरण से पहले). वैकल्पिक रूप से, नीचे कुप्पी दौर एक निर्वात को हस्तांतरण.
- आंशिक रूप से ट्यूब या कुप्पी की भीतरी सतह उत्तरोत्तर जमे हुए तरल द्वारा कवर किया जाता है कि इस तरह के एन 2liq में डाला अपकेंद्रित्र ट्यूब (या दौर नीचे कुप्पी) घूर्णन से निकालने समाधान रुक. सुनिश्चित करें कि कोई एन 2liq बनाओ. गोदाम में प्रवेश कर सकते हैं.
- सभी तरल जमे हुए है, भाप से बचने के लिए अनुमति देने के लिए एक पंचर ढक्कन या पेंच टोपी के साथ ट्यूब को कवर, और एक विस्तृत गर्दन वैक्यूम फिल्टर बोतल में ट्यूब जगह.
- आटा के बाद lyophilization प्रारंभचिंग फ्रीज ड्रायर को कुप्पी या बोतल.
- नमूना पूरी तरह से सूखा है जब lyophilization प्रक्रिया को समाप्त. एक बंद ट्यूब में -80 डिग्री सेल्सियस पर नमूना रखें (एक तंग टोपी के साथ!) एनएमआर विश्लेषण के लिए प्रयोग किया जाता है जब तक.
नोट: आमतौर पर कोई अधिक से अधिक 24 घंटा lyophilization के लिए आवश्यक हैं. कई नमूने lyophilizer के डिजाइन पर निर्भर करता है, एक साथ lyophilized, और व्यापक गर्दन की बोतलें या दौर नीचे बोतल में अपकेंद्रित्र ट्यूबों इस्तेमाल कर रहे हैं कि क्या किया जा सकता है.
एनएमआर नमूने के 6 तैयारी
- स्टोर सूखे और बहुत कम तापमान पर lyophilized अर्क (≤ -80 डिग्री सेल्सियस). तुरंत एनएमआर प्रयोग से पहले एनएमआर नमूने की तैयारी के लिए lyophilizates पुनः भंग.
नोट: समाधान और / या निकट कमरे के तापमान में नमूने संग्रहीत नमूना गिरावट में परिणाम हो सकता है! - निम्नानुसार, chelating एजेंट, पार 1,2-cyclohexyldiaminetetraacetic एसिड (CDTA) की एक जलीय 200 मिमी समाधान तैयार:
- एक टेस्ट ट्यूब या अपकेंद्रित्र ट्यूब शुद्ध पानी (जैसे, 20 मिलीग्राम) जोड़ें, और एक 200 मिमी समाधान उत्पन्न करने के लिए आवश्यक CDTA पाउडर की राशि जोड़ें.
नोट: CDTA की एसिड फार्म एक CDTA नमक के बजाय इस्तेमाल किया गया था के बाद से पीएच बहुत कम है क्योंकि CDTA का एक बड़ा अनुपात, घुलनशील नहीं होगा. - ध्यान से, जोड़ CDTA समाधान करने CsOH पाउडर की मात्रा बढ़ रही है, कदम से कदम, और भंवर अच्छी तरह से इसके अतिरिक्त प्रत्येक के बाद.
नोट: घुलनशील CDTA अंश जलीय घोल में CsOH सामग्री में वृद्धि के साथ बढ़ जाएगा. यानी CDTA समाधान करने CsOH की stoichiometric राशि से कम जोड़ने, "overtitration" से बचें. - लगभग सभी CDTA पाउडर भंग कर रहा है, जब प्रत्येक CsOH अलावा और पूरी तरह से vortexing के बाद पीएच मापने शुरू करते हैं. अंतिम पीएच (1 टेबल) तक पहुँच जाता है जब CsOH अलावा बर्खास्त.
नोट: इस समय, सभी CDTA भंग कर दिया जाएगा. CDTA को एक counterion के रूप में सीएस + का उपयोग gener हैसहयोगी ना + या + K अधिक पसंद. छोटे आयनिक त्रिज्या है और कठिन एसिड हैं कि ना + और + K के लिए विरोध के रूप में सीएस +, अपने बड़े आयनिक त्रिज्या के कारण एक नरम लुईस एसिड है. नतीजतन, सी + रूपों फॉस्फेट (हार्ड अड्डों) के साथ परिसरों कम आसानी से ना + और + K करते हैं. Complexation विशेष रूप से मध्यवर्ती आयन एक्सचेंज के लिए धीमी गति की शर्तों के तहत, एनएमआर linewidths बढ़ जाता है क्योंकि यह phosphorylated मेटाबोलाइट्स के 31 पी एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी के लिए फायदेमंद है.
- एक टेस्ट ट्यूब या अपकेंद्रित्र ट्यूब शुद्ध पानी (जैसे, 20 मिलीग्राम) जोड़ें, और एक 200 मिमी समाधान उत्पन्न करने के लिए आवश्यक CDTA पाउडर की राशि जोड़ें.
- 31 पी एनएमआर फॉस्फोलिपिड का विश्लेषण (पीएल) के लिए, सूखे लिपिड (CDCl 3) deuterated क्लोरोफॉर्म से मिलकर एक विलायक मिश्रण के 700 μl में (5.6 देखें) भंग, मेथनॉल और में वर्णित के रूप में तैयार CDTA समाधान 6.2 (5: 4: 1 मात्रा अनुपात). एक microcentrifuge ट्यूब नमूना स्थानांतरण. प्रत्यक्ष विस्थापन (या सकारात्मक विस्थापन) के साथ micropipette का प्रयोग क्लोरोफॉर्म का विरोधदोनों चरणों में चींटी टिप्स.
नोट: निम्नलिखित मानकों के किसी भी बदलते पी एल 31 पी एनएमआर स्पेक्ट्रा 13-17 की उपस्थिति (रासायनिक पारी और लाइन चौड़ाई) को प्रभावित करेगा कि मन में रखें:
(मैं) मात्रा अनुपात CDCl 3: MeOH: CDTA समाधान
(Ii) कुल विलायक मात्रा का इस्तेमाल किया
विलायक के जलीय घटक (iii) पीएच
विलायक के जलीय घटक (iv) CDTA एकाग्रता.
नोट: ये नमूने मानकों के सामान्य, ठीक ट्यूनिंग (1 टेबल) आवश्यक नहीं है, और विशेष मामलों में वांछित अगर चरम देखभाल के साथ किया जाना चाहिए. विलायकों के बीच मात्रा अनुपात बदलने आसानी से दो चरणों के बजाय एक समरूप चरण से मिलकर एक प्रणाली के गठन में परिणाम! एक चरण प्रणाली सबसे अनुप्रयोगों 13,14 में दो चरण प्रणाली की तुलना में अधिक व्यावहारिक हो पाया था. - पानी में घुलनशील मेटाबोलाइट्स के 1 एच एनएमआर विश्लेषण के लिए, में lyophilizate (5.8 देखें) भंग 700 μl ड्यूटेरियम ऑक्साइड 3 (trimethylsilyl) युक्त (डी ओ 2) propionic-2,2,3,3-D4 एसिड सोडियम नमक millimolar रेंज में (TSPd 4) (डी 2 0.05% TSPd 4 युक्त हे व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है) . एक microcentrifuge ट्यूब नमूना स्थानांतरण.
- ड्यूटेरियम क्लोराइड (डीसीएल) और सोडियम deuteroxide (NaOD) समाधान की थोड़ी मात्रा (सीए 2 μl) जोड़कर 7.3 के परिणामस्वरूप जलीय निकालने समाधान के पीएच को समायोजित करें. सबसे पहले, 0.02 एन डीसीएल या NaOD समाधान के साथ शुरू करते हैं. 2 या 3 बाद परिवर्धन पर्याप्त पीएच परिवर्तन का कारण नहीं है, तो 0.2 एन डीसीएल या NaOD समाधान के साथ जारी है. Overtitrate नहीं सावधान रहो.
नोट: जरूरत डीसीएल या NaOD समाधान की समग्र राशि निकाली मस्तिष्क के ऊतकों की मात्रा पर निर्भर करता है; सटीक metabolite quantitation के लिए यह मान ध्यान दें. ज्यादातर मामलों में गयी डीसीएल और NaOD समाधान के संयुक्त संस्करणों (एनएमआर नमूना मात्रा के करीब 1%) लगभग नगण्य होना चाहिए.
- सर्वोत्तम परिणामों के लिए, (162 मेगाहर्ट्ज 31 पी, या 400 मेगाहर्ट्ज 1 एच गूंज आवृत्तियों के लिए इसी ≥9.4 टेस्ला क्षेत्र शक्ति) एक multinuclear उच्च संकल्प एनएमआर स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग करें. 31 पी कुंडल के अलावा, 31 पी एनएमआर जांच प्रोटॉन decoupling के लिए एक 1 एच कुंडली के पास यह सुनिश्चित करें कि. वांछित लक्ष्य मूल्य (आमतौर पर 25 डिग्री सेल्सियस) के लिए एनएमआर जांच के सेट तापमान विनियमन.
ध्यान दें: जांच के तापमान को स्थिर करने के लिए 10-20 मिनट आवश्यकता हो सकती है! - अपकेंद्रित्र पी एल निकालने 4 डिग्री सेल्सियस पर microcentrifuge ट्यूब में समाधान (6.3 देखें) और 30 मिनट के लिए 11,000 XG नमूने में ठोस अवशेष नीचे स्पिन करने के लिए. एक उच्च गुणवत्ता एनएमआर ट्यूब (5 मिमी बाहरी व्यास) के लिए सतह पर तैरनेवाला के 600 μl स्थानांतरण.
- (एमडी) समाधान रासायनिक पारी संदर्भित के लिए 7.0 पीएच पर एक जलीय 20 मिमी methylenediphosphonate से भर उपयुक्त समाक्षीय डालने स्टेम तैयारऔर quantitation. पी एल निकालने समाधान के साथ भरा एनएमआर ट्यूब में इस डालने रखें.
- एनएमआर चुंबक को उचित स्पिनर और हस्तांतरण के साथ एनएमआर ट्यूब फ़िट. अब 15-20 हर्ट्ज पर नमूना स्पिन और नमूना सेट तापमान (सीए 10 मिनट) को समायोजित किया गया है जब तक प्रतीक्षा करें.
- ध्यान शिम का तार धाराओं 18 धुरी पर और बंद अक्ष समायोजन करके नमूना भर में चुंबकीय क्षेत्र inhomogeneity कम से कम.
- चुंबक क्षेत्र ताकत (एक 9.4 टी प्रणाली के लिए सिफारिश करते पैरामीटर मान के लिए 1 टेबल देखें) के एक समारोह के रूप में भिन्न हो सकते हैं जो इष्टतम मूल्यों को एनएमआर स्पेक्ट्रम अधिग्रहण मापदंडों सेट.
- प्रयोग (= एन एस) के अनुसार यात्रियों की निर्धारित संख्या.
- केवल सबसे अधिक प्रचलित PLs परिशुद्धता के साथ quantitated किया जा रहे हैं के बारे में यदि 80 (डाटा अधिग्रहण सीए 20 मिनट की कुल अवधि) के लिए एन एस सेट (phosphatidylcholine (PtdCho), phosphatidylethanolamine (PtdEtn), ethanolamine plasmalogen).
- डी के बारे में 100-200 (कुल अवधि के लिए एन एस सेटअता अधिग्रहण 1-2 घंटा) (alkyl-एसाइल-phosphatidylcholine, phosphatidylinositol, phosphatidylserine, phosphatidic एसिड) quantitated होने के लिए कम केंद्रित है pls है.
- के बारे में 1,500-2,000 के लिए एन एस सेट (डाटा अधिग्रहण 7-10 घंटे की कुल अवधि, रातोंरात प्रयोग) बहुत कम एकाग्रता PLs quantitated हो रहे हैं, जैसे phosphatidylinositol मोनो और diphosphates (PtdIP और PtdIP 2), cardiolipin, lyso-PLs , alkyl-एसाइल-phosphatidylethanolamine, और कभी कभी दूसरों.
- स्पेक्ट्रम अधिग्रहण, अनुकूलित मापदंडों का उपयोग प्रक्रिया मुक्त प्रेरण क्षय (खूंटी) के अंत के बाद. चुंबकीय क्षेत्र ताकत, शिम गुणवत्ता, और पी एल संकेत के एक समारोह मात्रा निर्धारित किया जा करने के रूप में इन मानकों के मूल्यों में भिन्नता है.
- प्रसंस्करण एकाधिक का उपयोग (कम से कम दो) अलग फ़िल्टरिंग प्रक्रियाओं को दोहराने, pls की पूरी श्रृंखला के लिए सबसे अच्छा परिणाम प्राप्त करने के लिए. जोरदार अतिव्यापी संकेतों के लिए मजबूत संकल्प को बढ़ाने का प्रयोग करें जैसे., PtdCho और PtdEtn के लिएक्षेत्रों के.
- कमजोर संकेतों के लिए मजबूत फ़िल्टरिंग (कमजोर या कोई संकल्प वृद्धि) का प्रयोग करें.
- संकेत करने वाली शोर अनुपात, जैसे PtdIP और PtdIP 2 बढ़ाने के लिए apodization द्वारा महत्वपूर्ण ओवरलैप (जैसे, लेग = 3 हर्ट्ज) के बिना बहुत कमजोर और व्यापक संकेत फ़िल्टर. विशेषता प्रसंस्करण मापदंडों के लिए 1 टेबल देखें.
- एक ही स्पेक्ट्रम में संदर्भ यौगिक (एमडी) के संकेत के तहत क्षेत्र के संबंध में प्रत्येक पी एल संकेत के क्षेत्र यों.
- ((मैं) में जाना एकाग्रता के फास्फोरस यौगिक, और पीएल 31 पी एनएमआर प्रयोगों में इस्तेमाल किया (द्वितीय) एक ही समाक्षीय डालने स्टेम से भरा एक 5 मिमी एनएमआर ट्यूब का उपयोग कर, एक अलग प्रयोग में संदर्भ यौगिक (एमडी) का संकेत जांचना देखने 7.3 और 7.9).
- एक हाथ (7.9 देखें) पर पी एल संकेतों के सापेक्ष क्षेत्रों के आधार पर व्यक्तिगत पी एल सांद्रता की गणना, और से एमडी के लिए प्राप्त अंशांकन मूल्य परअन्य पर समाक्षीय डालने (7.10 देखें). एक विशेष 31 पी एनएमआर संकेत के लिए योगदान दे फास्फोरस नाभिक की संख्या कि संकेत के आणविक मूल के एक समारोह के रूप में भिन्न हो सकते हैं कि खाते में ले लो.
नोट: cardiolipin फॉस्फेट संकेत के रूप में करता MDP phosphonate संकेत (आमतौर पर 19.39 पीपीएम को संदर्भित), दो फास्फोरस नाभिक का प्रतिनिधित्व करता है. मस्तिष्क निष्कर्षों में पाया अन्य सभी पी एल 31 पी एनएमआर संकेतों एक फास्फोरस नाभिक प्रत्येक का प्रतिनिधित्व करते हैं. - जानवरों के समूहों के बीच मस्तिष्क पी एल के स्तर की तुलना करने की जरूरत के रूप में आँकड़े सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें.
ब्रेन चयापचयों पानी में घुलनशील के विश्लेषण के लिए 1 एच एनएमआर प्रयोग के 8 प्रदर्शन
- वांछित लक्ष्य मूल्य (आमतौर पर 25 डिग्री सेल्सियस) के लिए 1 एच एनएमआर जांच के सेट तापमान विनियमन. यह भी देखें 7.1 में टिप्पणी.
- 4 डिग्री सेल्सियस और 11,000 पर microcentrifuge ट्यूब (6.5 देखें) में जलीय निकालने समाधान अपकेंद्रित्र30 मिनट के लिए XG नमूने में ठोस अवशेष नीचे स्पिन करने के लिए. एक उच्च गुणवत्ता एनएमआर ट्यूब (5 मिमी बाहरी व्यास) के लिए सतह पर तैरनेवाला के 600 μl स्थानांतरण.
- एनएमआर चुंबक, शिम और 7.4-7.6 में समझाया इष्टतम मूल्यों के लिए सेट एनएमआर स्पेक्ट्रम अधिग्रहण मापदंडों पर स्थानांतरण एनएमआर ट्यूब. सिफारिश पैरामीटर मान के लिए भी 1 टेबल देखें.
- एन एस 32 (डाटा अधिग्रहण सीए 13 मिनट की कुल अवधि) = के बारे में करने के लिए प्रयोग प्रति यात्रियों की संख्या निर्धारित करें. विशेष रूप से सुरभित क्षेत्र में, बहुत कमजोर संकेतों के लिए अच्छा संकेत करने वाली शोर अनुपात प्राप्त करने के लिए, एन एस या अधिक 64 (डाटा अधिग्रहण सीए 26 मिनट की कुल अवधि) = का प्रयोग करें.
- स्पेक्ट्रम अधिग्रहण, अनुकूलित मापदंडों का उपयोग प्रक्रिया मुक्त प्रेरण क्षय (खूंटी) के अंत के बाद. चुंबकीय क्षेत्र ताकत, शिम गुणवत्ता, और metabolite संकेत के एक समारोह मात्रा निर्धारित किया जा करने के रूप में इन मानकों के मूल्यों को थोड़ा भिन्न हो.
नोट: ज्यादातर मामलों में, यह एक बार प्रत्येक स्पेक्ट्रम पर कार्रवाई करने के लिए पर्याप्त है, सभी metabolite संकेतों के लिए एक अच्छा समझौता पेश प्रसंस्करण मानकों का एक सेट को रोजगार. विशेषता प्रसंस्करण मापदंडों के लिए 1 टेबल देखें. - एक ही स्पेक्ट्रम में संदर्भ यौगिक (टीएसपी डी 4) के संकेत के तहत क्षेत्र के संबंध में (कभी कभी अलग अणुओं से stemming अन्य singlets या multiplets साथ अतिव्यापी, अक्सर एक multiplet) प्रत्येक metabolite संकेत के क्षेत्र यों.
- टीएसपी डी 4 एकाग्रता के आधार पर व्यक्तिगत metabolite सांद्रता (6.4 देखें) की गणना. एक विशेष 1 एच एनएमआर संकेत के लिए योगदान दे प्रोटॉनों की संख्या है कि संकेत के आणविक मूल के एक समारोह के रूप में भिन्न हो सकते हैं कि खाते में ले लो. (0.0 पीपीएम को संदर्भित) टीएसपी डी 4 trimethyl संकेत नौ प्रोटॉन का प्रतिनिधित्व करता है.
- जानवरों के समूहों के बीच मस्तिष्क metabolite स्तर की तुलना करने के लिए जरूरत के रूप में आँकड़े सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें.
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Representative Results
निकालने के समाधान में मौजूद: मस्तिष्क और अन्य ऊतकों के अर्क के चयापचय एनएमआर स्पेक्ट्रा में सबसे अच्छा समाधान प्राप्त करने के लिए, यह लंबे समय से हटाने या (अणुचुंबकीय आयनों सबसे महत्वपूर्ण) मुखौटा धातु आयनों के लिए आम बात हो गया है. यह, या ऐसे Chelex-100 के रूप में 20 एक आयन एक्सचेंज राल के माध्यम से निकालने से गुजर रहा निकालने 19 तक EDTA या CDTA के रूप में इस तरह के एक chelating एजेंट जोड़कर या तो हासिल किया गया है. चित्रा 1 में प्रस्तुत परिणामों मस्तिष्क अर्क ध्यान से ऊपर प्रोटोकॉल के अनुसार तैयार कर रहे हैं तो इस चरण 1 एच एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी विश्लेषण के लिए आवश्यक नहीं है कि प्रदर्शित करता है. इधर, अत्यंत संकीर्ण वर्णक्रमीय लाइनों का विश्लेषण किया सभी वर्णक्रमीय क्षेत्रों के लिए प्राप्त किया गया. यहां तक कि glutamine / ग्लूटामेट और myo -inositol / ग्लाइसिन के लिए बहुत भीड़ क्षेत्रों, जैसे, में, <0.01 पीपीएम की दूरी पर चोटियों लगभग 400 मेगाहर्ट्ज (चित्रा 1, नीचे) पर पूरी तरह से पृथक कर रहे हैं. एक परिणाम के रूप में, गुणात्मक,और चित्रा 1 के केंद्र और नीचे पैनल में दिखाई, कई छोटे, लेकिन वर्तमान में असाइन नहीं की गई चोटियों के मात्रात्मक विश्लेषण भविष्य में परिकल्पित किया जा सकता है.
चित्रा एक महिला लुईस चूहे से एक मस्तिष्क ऊतक निकालने की जलीय चरण का एक विशिष्ट 1 एच एनएमआर स्पेक्ट्रम (400 मेगाहर्ट्ज) की 1 उपक्षेत्र. तीनों पैनलों अत्यंत उच्च संकल्प प्राप्य इस अखबार में प्रस्तुत प्रोटोकॉल का उपयोग प्रदर्शित करता है. न तो chelating एजेंट और न ही आयन एक्सचेंज राल नमूना तैयार करने के दौरान इस्तेमाल किया गया है. केंद्र और नीचे पैनल अनुकूलित प्रयोगात्मक मापदंडों का उपयोग किया अगर ऊतक अर्क के उच्च संकल्प 1 एच एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा कवर विशाल गतिशील रेंज में संकेत है कि कई असाइन नहीं की गई कम तीव्रता चोटियों के अस्तित्व को दिखाते हैं. इन कमजोर लेकिन अच्छी तरह सेdetectable संकेत संभावित पहचान और भविष्य में मात्रा निर्धारित किया जा सकता है. कई का पता चला मेटाबोलाइट्स, मस्तिष्क के ऊतकों की विशिष्ट हैं जैसे, न्यूरॉन मार्कर NAA या न्यूरोट्रांसमीटर गाबा.; हालांकि, ज्यादातर यौगिकों ऐसे एमिनो एसिड, branched श्रृंखला कार्बनिक अम्ल, polyol, (phospho) लिपिड और ऊर्जा चयापचय के साथ ही ग्लाइकोलाइसिस और glutaminolysis में, और के रूप में स्तनधारी कोशिकाओं के लिए आम हैं कि चयापचय मार्ग, का एक व्यापक स्पेक्ट्रम में शामिल कर रहे हैं ऐसे osmoregulation, सेल के विकास और प्रसार के रूप में कार्य करता है. तारांकन एक मेथनॉल अशुद्धता से stemming मिथाइल गूंज अर्थ. लघुरूप: आला, alanine; लाख, लैक्टेट; threo, Threonine; BHB, β-हाइड्रोक्सिब्यूटाइरेट; वैल, valine; इले, isoleucine; लियू, leucine; AAB, α-aminobutyrate; AHB, α-हाइड्रोक्सिब्यूटाइरेट; ताऊ, बैल की तरह, SCY -Ins, scyllo -inositol; myo -Ins, myo -inositol; जीपीसी, glycerophosphocholine; पीसी, phosphocholine; चो, choline; CRN, क्रिएटिनिन; , Creatine करोड़; गाबा,47; -aminobutyrate; एएसपी, एस्पार्टेट; NAA, एन -acetylaspartate; GLN, glutamine; ग्लू, ग्लूटामेट; सफलता, succinate; नाना, एन -acetylneuraminate; एसी, एसीटेट; Gly, ग्लाइसिन. लैक्टेट 13 सी उपग्रह नक़ल (शीर्ष पैनल) से आला नक़ल स्तंभ के आधार पर छोटे चोटियों. क्रिएटिव कॉमन्स रोपण लाइसेंस के तहत पुनर्प्रकाशित (CCAL) लुट्ज़ एनडब्ल्यू एट अल प्रयोगात्मक autoimmune इंसेफैलोमाईलिटिस और सहायक गठिया में (2013) सेरेब्रल जैव रासायनिक रास्ते से शर्तें:. एक तुलनात्मक metabolomic अध्ययन. एक PLoS 8 (2):. E56101 इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
31 पी एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी, अणुचुंबकीय फैटायनों (ज्यादातर लौह) मास्किंग या हटाने फॉस्फेट आसानी द्विसंयोजक और त्रिसंयोजक आयनों के साथ परिसरों फार्म क्योंकि एक जरूरत निश्चित रूप से है. अर्क को CDTA के अलावा दोनों वर्णक्रमीय रेखा एक चौड़ाई को प्रभावित करता हैडी रासायनिक बदलाव; चित्रा 2, ऊपर और नीचे बाईं तुलना करें. मिमी (बाएं नीचे) 1000 मिमी चुनने के बजाय 200 से लाइन संकुचन (ऊपर बाएं) CDTA वांछित है, लेकिन (ऊपर बाएं) अलग मात्रा निर्धारित किया जाना चाहिए कि पी एल संकेतों के superposition के परिणामस्वरूप किया गया था. इसलिए, 200 मिमी CDTA पीएल विलायक के जलीय घटक के लिए सिफारिश की है, अन्य सभी शर्तों बराबर किया जा रहा है. इसके अलावा, माप दौरान नमूना तापमान वर्णक्रमीय रेखा चौड़ाई और रासायनिक बदलाव को प्रभावित करता है; चित्रा 2, ऊपर और नीचे सही तुलना करें. बजाय 297 कश्मीर (ऊपर दाएं) के (ठीक नीचे) 277 कश्मीर चुनकर रेखा संकुचन वांछित है, लेकिन (ऊपर दाएं) अलग मात्रा निर्धारित किया जाना चाहिए कि पी एल संकेतों के superposition के परिणामस्वरूप किया गया था. इसलिए, 297 कश्मीर माप तापमान के रूप में सिफारिश की है, अन्य सभी शर्तों बराबर किया जा रहा है. दो शीर्ष पैनल के बीच तुलना से पता चलता है कि 50 मिमी (ऊपर दाएं) ही में परिणाम के लिए 200 मिमी (ऊपर बाएं) से CDTA एकाग्रता में कमीलाइन में एक मामूली वृद्धि चौड़ाई, और रासायनिक पाली में लगभग कोई परिवर्तन नहीं है. हालांकि, यह सही शीर्ष पैनल 13 में अपेक्षाकृत संकीर्ण लाइनों समझा, 200 मिमी CDTA निकालने में है के रूप में 50 मिमी CDTA निकालने में ऊतक एकाग्रता आधे के रूप में उच्च है कि ध्यान दें.
चित्रा 2 Phosphatidylethanolamine (PtdE) महिला लुईस चूहों से मस्तिष्क के ऊतकों के अर्क के फॉस्फोलिपिड 31 पी एनएमआर स्पेक्ट्रा (162 मेगाहर्ट्ज) (ऊपर बाएं पैनल) मस्तिष्क के ऊतकों एकाग्रता के क्षेत्रों, 236 मिलीग्राम / एमएल. CDTA एकाग्रता और विलायक के जलीय घटक में पीएच, 200 मिमी और क्रमशः 7.33,; माप तापमान, 297 लालकृष्ण PtdE प्लाज्म और एस.एम. संकेतों अच्छी तरह से हल कर रहे हैं (नीचे बाएं) मस्तिष्क के ऊतकों एकाग्रता, 236 मिलीग्राम / एमएल. CDTA concentration और विलायक के जलीय घटक में पीएच, 1000 मिमी और क्रमशः 7.36,; माप तापमान, 297 लालकृष्ण PtdE प्लाज्म और एस.एम. संकेत पूरी तरह से ओवरलैप; वे ऊपर छोड़ दिया स्पेक्ट्रम के साथ तुलना में, कम पंक्ति चौड़ाई के बावजूद हल नहीं किया जा सकता है (ऊपर दाएं) मस्तिष्क के ऊतकों एकाग्रता, 118 मिलीग्राम / एमएल. CDTA एकाग्रता और विलायक के जलीय घटक में पीएच, 50 मिमी और क्रमशः 7.14,; माप तापमान, 297 लालकृष्ण PtdE और एस.एम. संकेतों को अच्छी तरह से हल कर रहे हैं (नीचे सही) मस्तिष्क के ऊतकों एकाग्रता, 118 मिलीग्राम / एमएल. CDTA एकाग्रता और विलायक के जलीय घटक में पीएच, 50 मिमी और क्रमशः 7.14,; माप तापमान, 277 लालकृष्ण PtdE और एस.एम. संकेत पूरी तरह से ओवरलैप; वे शीर्ष सही स्पेक्ट्रम के साथ तुलना में कम पंक्ति चौड़ाई के बावजूद हल नहीं किया जा सकता है. लघुरूप: PtdE प्लाज्म, ethanolamine plasmalogen; PtdE, phosphatidylethanolamine; एसएम, sphingomyelin; PtdS, phosphatidylserine; PtdC, phosphatidylcholine. Lutz एनडब्ल्यू एट अल. (2010) कच्चे ऊतक अर्क में फॉस्फोलिपिड के 31 पी एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी विश्लेषण के Multiparametric अनुकूलन से अनुमति के साथ पुनर्प्रकाशित. 1 रासायनिक पारी और संकेत जुदाई. गुदा केम 82 (13): 5433-5440. कॉपीराइट 2010 अमेरिकन केमिकल सोसायटी. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
ऊपर प्रोटोकॉल (एक चरण प्रणाली 14, चित्रा 3, शीर्ष बाएं) का उपयोग करते हुए एक काफी एकाग्रता रेंज को कवर, quantifiable pls के बड़ी संख्या में पाया गया (चित्रा 3, शीर्ष सही) (छोटा उच्च तीव्रता संकेतों पर ध्यान दें). इन संकेतों से कुछ (U1, U2, U6) के रूप में अभी तक असाइन नहीं की गई हैं. इस प्रोटोकॉल में संकेत के रूप में नमूना तैयार करने, एनएमआर माप और स्पेक्ट्रम प्रसंस्करण प्रदर्शन कर रहे हैं, वर्णक्रमीय संकल्प नियमित विकास के लिए भी पर्याप्त हैकुछ चोटियों के आंशिक बंटवारे etect (PtdS, PtdE, PtdE प्लाज्म, AAPtdE; नीचे बाएं). . PtdC1u, एक पी एल व्युत्पन्न: एक परिणाम, गुणात्मक और भविष्य में परिकल्पित किया जा सकता है आगे पीएल उपसमूहों की मात्रात्मक विश्लेषण के रूप में 3, नीचे सही चित्रा, आंशिक रूप से यहां कम एकाग्रता यौगिकों (के अलग संकेतों को विवेकपूर्ण तरीके से चुना प्रसंस्करण मानकों की शक्ति दिखाता है गूंज पूरी तरह से पहचान नहीं है कि PtdC, और PtdC प्लाज्म) से यहाँ बहुत मजबूत संकेतों (के करीब: PtdC).
महिला लुईस चूहों से मस्तिष्क के ऊतकों के अर्क के चित्रा 3 फॉस्फोलिपिड 31 पी एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी (162 मेगाहर्ट्ज). (ऊपर बाएं पैनल) एक एक चरण प्रणाली (बाएं) एक दो चरण प्रणाली (दाएं) से अधिक पसंद किया गया था. आमतौर पर इस्तेमाल दो चरण प्रणाली सही बाधितऊपरी चरण की सबसे कुंडली के संवेदनशील मात्रा के बाहर स्थित है क्योंकि पी एल quantitation. (शीर्ष सही पैनल) चूहे के मस्तिष्क की पूरी 31 पी एनएमआर पी एल स्पेक्ट्रम. कमजोर संकेतों (PtdIP, PtdG), घातीय लाइन विस्तार (पौंड = 3 हर्ट्ज) के बेहतर दृश्यता के लिए आवेदन किया था. इस प्रतिनिधित्व में, कई पी एल संकेत विशेषकर PtdC और PtdE क्षेत्रों में, अच्छी तरह से हल नहीं कर रहे हैं. एक से अधिक 31 पी एनएमआर संकेत पैदा करने के लिए pls, मनाया नाभिक (पी tdIP, PtdI पी, पी tdIP 2, PtdI पी 2) रेखांकित कर रहे हैं. वर्तमान में असाइन नहीं की गई संकेतों 'यू एन "(जहाँ n = 1, 2, ...). एक ही स्पेक्ट्रम की (नीचे बाएं पैनल) PtdE और PtdS क्षेत्रों से चिह्नित हैं. बेहतर शिखर संकल्प के लिए, Lorentzian गाऊसी लाइन आकार परिवर्तन लागू किया गया था (पौंड = -1 हर्ट्ज, जीबी = 0.3). क्योंकि इन प्रसंस्करण मानकों की, कई बहुत कमजोर पीएल संकेतों का पता लगाने के लिए मुश्किल हैं. हालांकि, कम से कम दो चोटियों कर सकते हैंPtdE क्षेत्र के रूप में ही प्रसंस्करण मानकों के साथ प्राप्त प्रत्येक PtdE, PtdE प्लाज्म, AAPtdE, और PtdS. (नीचे सही पैनल) PtdC क्षेत्र के लिए discerned किया. वे घातीय लाइन विस्तार (AAPtdC, PtdC प्लाज्म, PtdC1u) के साथ उत्पन्न ऊपरी स्पेक्ट्रम में discerned नहीं किया जा सकता है, जबकि हावी PtdC गूंज के आधार पर कई संकेत स्पष्ट रूप से पता चला रहे थे. वर्तमान में असाइन नहीं की गई PtdC अनुरूप इसके अलावा, PtdC1u, आगे नाबालिग अनुनादों PtdC से upfield मौजूद हो सकता है. लघुरूप: PtdIP, phosphatidylinositol फॉस्फेट; PtdIP 2, phosphatidylinositol diphosphate; PtdA, phosphatidic एसिड; PtdG, phosphatidylglycerol; सीएल, cardiolipin; PtdE .., PtdE, PtdE प्लाज्म और AAPtdE की राशि; PtdI, phosphatidylinositol. आगे संक्षिप्ताक्षर कथा को देखने के लिए 2 चित्र. लुट्ज़ एनडब्ल्यू एट अल से अनुमति के साथ पुनर्प्रकाशित. (2010) phospholipi के 31 पी एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी विश्लेषण के Multiparametric अनुकूलनकच्चे ऊतक अर्क में डी एस. 1 रासायनिक पारी और संकेत जुदाई. गुदा केम 82 (13): 5433-5440. कॉपीराइट 2010 अमेरिकन केमिकल सोसायटी. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
| फसल काटने वाले और चूहे के मस्तिष्क बर्फ़ीली | |||
| एन 2liq के लिए देवर.; दबाना ठंड (जैसे, घर का बना Wollenberger चिमटे, refs 1 और 2, मेज के नीचे.); संज्ञाहरण चैम्बर; शल्य कैंची; स्केलपेल; सफाई शराब के साथ 500 मिलीलीटर की बोतल | प्रत्येक की 1 | ||
| संदंश | 2 | ||
| 1 मिलीलीटर सिरिंज, 10 मिलीलीटर सिरिंज | पशु प्रति प्रत्येक की 1 | ||
| 25 जी सुइयों | पशु प्रति 2 | ||
| उदाहरणार्थ preparसमझना | |||
| निकासी के अनुसार मस्तिष्क के ऊतकों की विशिष्ट राशि | 250-350 मिलीग्राम | ||
| 350 मिलीग्राम मस्तिष्क ऊतक - MeOH मात्रा homogenizing 250 में इस्तेमाल किया | 4 मिलीलीटर | ||
| 5 मिलीलीटर प्लास्टिक पिपेट | निकालने प्रति 3 | ||
| 10 मिलीलीटर की प्लास्टिक पिपेट | निकालने प्रति 1 | ||
| ग्लास शीशी (≥20 मिलीलीटर मात्रा) | निकालने प्रति 1 | ||
| क्लोरोफॉर्म प्रतिरोधी अपकेंद्रित्र ट्यूब | निकालने प्रति 1 | ||
| MeOH में ऊतक homogenization के बाद प्रतीक्षा अवधि (4 डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण) | 15 मिनट | ||
| जल और CHCl 3 मात्रा 4 मिलीग्राम MeOH में homogenized मस्तिष्क के ऊतकों में जोड़ा | 4 मिलीलीटर प्रत्येक | ||
| पानी और CHCl 3 के साथ homogenized ऊतक मिश्रण के बाद प्रतीक्षा अवधि (मिश्रण -20 डिग्री सेल्सियस पर) | रातोंरात | ||
| जुदाई ओ के लिए केन्द्रापसारणजैविक निकालने चरण (गिलास अपकेंद्रित्र ट्यूब) से च जलीय | 4 डिग्री सेल्सियस पर 40 मिनट के लिए 13,000 × छ, | ||
| (निकाले लिपिड भंग के लिए विलायक मिश्रण का जलीय चरण) CDTA समाधान की एकाग्रता | 200 मिमी | ||
| निकाले लिपिड भंग के लिए विलायक मिश्रण का जलीय चरण के पीएच | 7.4 | ||
| लिपिड में मात्रा अनुपात एक 31 पी पी एल विश्लेषण के लिए इस्तेमाल विलायक (CDCl 3: MeOH: CDTA समाधान) | 5: 4: 1 | ||
| 350 मिलीग्राम मस्तिष्क ऊतक - विलायक एक की राशि 250 से निकाले लिपिड भंग करने के लिए इस्तेमाल किया | 700 μl | ||
| एनएमआर नमूने में ठोस कणों नीचे कताई के लिए केन्द्रापसारण (microcentrifuge ट्यूब) | 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 11,000 XG, | ||
| पानी में घुलनशील मेटाबोलाइट्स युक्त एनएमआर नमूना के पीएच | 7.3 | ||
| नमूना मात्रा centrif के बाद, एनएमआर ट्यूब को हस्तांतरितugation | 600 μl | ||
| 31 पी एनएमआर के लिए समाक्षीय डालने स्टेम में MDP एकाग्रता | 20 मिमी | ||
| एनएमआर प्रयोगों | |||
| एनएमआर प्रयोग के दौरान तापमान का नमूना (शिखर ओवरलैप को कम करने के लिए समायोजित किया जा सकता है) | 25 डिग्री सेल्सियस | ||
| एनएमआर प्रयोग के दौरान आवृत्ति स्पिनिंग | 15-20 हर्ट्ज | ||
| 1 एच एनएमआर अधिग्रहण मापदंडों | |||
| 2 एच ताला संकेत उपलब्ध कराने सॉल्वेंट | डी ओ 2 | ||
| उत्तेजना पल्स चौड़ाई, P1 | 11 μsec | ||
| उत्तेजना नाड़ी, एम्पलीफायर क्षीणन, PL1 | 0 DB | ||
| खूंटी आकार, टीडी | 32 K | ||
| खूंटी अधिग्रहण टिमई, वायु | 3.283 सेकंड | ||
| विश्राम देरी, डी 1 | 15 सेकंड | ||
| सॉल्वेंट दमन देरी, D4 | 6 सेकंड | ||
| कुल पुनरावृत्ति समय, टी.आर. | 24.3 सेकंड | ||
| पीपीएम, एसडब्ल्यूपी में वर्णक्रमीय चौड़ाई | 12.47 पीपीएम | ||
| हर्ट्ज, दप में वर्णक्रमीय चौड़ाई | 4990 हर्ट्ज | ||
| रिसीवर लाभ, आरजी | 512 | ||
| सॉल्वेंट दमन (निरंतर तरंग) | स.ग. | ||
| सॉल्वेंट दमन, एम्पलीफायर क्षीणन, PL9 | 50 डीबी | ||
| यात्रियों की संख्या, एन एस | 32 या 64 | ||
| 31 पी एनएमआर अधिग्रहण मापदंडों | |||
| 2 एच ताला संकेत उपलब्ध कराने सॉल्वेंट | CDCl 3 | ||
| उत्तेजना नाड़ी वाईडीटीएच, P1 | 9.5 μsec | ||
| उत्तेजना नाड़ी, एम्पलीफायर क्षीणन, PL1 | 4 डीबी | ||
| खूंटी आकार, टीडी | 16 K | ||
| खूंटी अधिग्रहण के समय, वायु | 2.019 सेकंड | ||
| विश्राम देरी, डी 1 | 15 सेकंड | ||
| कुल पुनरावृत्ति समय, टी.आर. | 17 सेकंड | ||
| पीपीएम, एसडब्ल्यूपी में वर्णक्रमीय चौड़ाई | 25 पीपीएम | ||
| हर्ट्ज, दप में वर्णक्रमीय चौड़ाई | 4058 हर्ट्ज | ||
| रिसीवर लाभ, आरजी (अधिकतम) | 16,384 | ||
| प्रोटॉन decoupling (समग्र नाड़ी decoupling) | सीपीडी | ||
| प्रोटॉन decoupling, एम्पलीफायर क्षीणन, PL13 | 19 डीबी | ||
| यात्रियों की संख्या, एन एस | 1,500 या 2,000 | ||
| एनएमआर डाटा प्रोसेसिंग | 1 एच रिज़ोल्यूशनएनहैंसमेंट, गाऊसी-Lorentzian Lineshape परिवर्तन | ||
| स्पेक्ट्रम की समग्र मूल्यांकन (यदि आवश्यक हो, 0.1 <जीबी <0.4, और -0.6 का उपयोग, व्यक्तिगत वर्णक्रमीय क्षेत्रों के लिए अलग से अनुकूलन <लेग <-0.2 हर्ट्ज) | जीबी = 0.15, लेग = -0.2 हर्ट्ज | ||
| बहुत कमजोर संकेतों, जैसे, खुशबूदार एसिड (वैकल्पिक रूप से लेग ≥ 0.5 हर्ट्ज के साथ apodization के लिए) | जीबी = 0.015, लेग = -0.3 हर्ट्ज | ||
| चोटियों के तहत क्षेत्रों उपयोग lineshape अनुनादों ओवरलैपिंग के लिए फिट बैठता है | |||
| 31 पी संकल्प वृद्धि, गाऊसी-Lorentzian lineshape परिवर्तन | |||
| स्पेक्ट्रम की समग्र मूल्यांकन (0.05 <जीबी <0.2, और -3.0 <लेग <उपयोग कर, व्यक्तिगत वर्णक्रमीय क्षेत्रों के लिए अलग से अनुकूलन60; -1.0 हर्ट्ज) | जीबी = 0.05, लेग = -1.0 हर्ट्ज | ||
| बहुत कमजोर संकेतों, जैसे, PtdIP 2, PtdA: apodization | लेग = 3 हर्ट्ज | ||
| चोटियों के तहत क्षेत्रों उपयोग lineshape अनुनादों ओवरलैपिंग के लिए फिट बैठता है | |||
| सन्दर्भ | |||
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तालिका 1 प्रायोगिक उच्च संकल्प के लिए मानकों 1 एच और मस्तिष्क के 31 पी एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपीमात्रा अनुपात और मस्तिष्क के ऊतकों निष्कर्षण और एनएमआर नमूना तैयार करने में इस्तेमाल किया विलायकों और अभिकर्मकों की सांद्रता के लिए ऊतक अर्क. विशिष्ट मूल्यों प्रस्तुत कर रहे हैं. आगे की सिफारिश मूल्यों पीएच और माप तापमान, साथ ही एनएमआर अधिग्रहण और प्रसंस्करण मानकों का नमूना से संबंधित हैं. प्रोटोकॉल मस्तिष्क के अलावा अन्य ऊतकों को लागू किया जाता है तो मामूली समायोजन विशेष रूप से, आवश्यक हो सकता है. एनएमआर मापदंडों 9.4 टी पर माप के लिए अनुकूलित किया गया है, और विभिन्न चुंबकीय क्षेत्र की ताकत पर काम स्पेक्ट्रोमीटर के लिए जरूरत के रूप में समायोजित किया जाना चाहिए.
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Discussion
एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी एक बहुत प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है और सही ढंग से समाधान में रासायनिक यौगिकों की सांद्रता को मापने के लिए एक कारगर तरीका है. हालांकि, उच्च गुणवत्ता वाले डेटा प्राप्त करने के लिए यह नमूना तैयार करने और विश्लेषण के विषय में कुछ नियमों का पालन करना आवश्यक है. एक मनाया संकेत की तीव्रता का पता लगाने सीमा (विशेष रूप से कमजोर संकेत) दृष्टिकोण जब तक एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा metabolite सांद्रता के निर्धारण में, पीढ़ी और न ही एनएमआर संकेत का स्वागत न तो quantitation त्रुटि हावी है. अन्य सभी मामलों जैविक परिवर्तनशीलता, नमूना तैयार करने की तकनीक (निष्कर्षण दक्षता, यौगिकों की भौतिक और रासायनिक स्थिरता, pipetting और त्रुटियों आदि वजन), और / या सटीक और परिणामों की सटीकता का निर्धारण करेगा संकेत अधिग्रहण और प्रसंस्करण मापदंडों के चुनाव में. जाहिर है, ऊतक फसल के दौरान होने वाली किसी भी चयापचय परिवर्तनों भी सांद्रता प्राप्त metabolite में परिलक्षित होगाएड. इसलिए, यह जितनी जल्दी हो सके ऊतक फसल को पूरा करने के लिए, और इस तरह कीप तेजी metabolizing यौगिकों की विवो सांद्रता में सही अगर ठंड के रूप में विशेष ऊतक ठंड तकनीकों को लागू करने के लिए (महत्वपूर्ण हैं बहुत महत्वपूर्ण है विशेष रूप से ग्लूकोज, लैक्टेट, एटीपी और उसके catabolites, ADP और एएमपी).
यहां तक कि एक नियमित उच्च संकल्प एनएमआर स्पेक्ट्रोमीटर उत्कृष्ट स्पेक्ट्रा के मध्यवर्ती चुंबकीय क्षेत्र ताकत (9.4 टी) पर प्राप्त किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, चूहे के मस्तिष्क के अर्क के जलीय चरण के 1 एच एनएमआर स्पेक्ट्रा में, जिसका अंतर रासायनिक पारी में संकेत, Δδ, (400 मेगाहर्ट्ज अनुनाद आवृत्ति पर 2.0 हर्ट्ज के लिए इसी) 0.005 पीपीएम सीए करने के लिए अलग से discerned और quantitated किया जा सकता है बराबर है. , चित्रा 1, यह उसके आधार (लैक्टेट 13 सी उपग्रह नक़ल पर छोटे चोटियों से (i) लैक्टेट और Threonine दोहरी, और (ii) alanine नक़ल का आंशिक जुदाई से यह साफ है) शीर्ष. इन उपकरणों के कारण उनके उच्च खरीद लागत को एनएमआर प्रयोगशालाओं में कम आम हैं, हालांकि उच्च क्षेत्रों (14.1 या यहां तक 18.8 टी) पर काम स्पेक्ट्रोमीटर, आगे संकल्प और संवेदनशीलता में वृद्धि होगी.
1 एच एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग, मेटाबोलाइट्स के एक विस्तृत रेंज एक ही अधिग्रहण में यानी, एक साथ विश्लेषण किया जा सकता है. इस चुनाव आनुपातिक माप समय बढ़ जाती है, हालांकि प्रयोग की संवेदनशीलता, संचित यात्रियों की संख्या में वृद्धि से सुधार किया जा सकता है. (संकेत करने वाली शोर अनुपात यात्रियों की संख्या का वर्गमूल के लिए आनुपातिक है.) बहरहाल, ऊपर प्रोटोकॉल में दी गई अधिकतम कुल अधिग्रहण समय - राशि जब तक, लगभग सभी प्रयोजनों के लिए पर्याप्त होना चाहिए (20 से 30 मिनट) निकासी के लिए उपलब्ध ऊतक के बहुत सीमित है. सबसे एनएमआर के प्रति संवेदनशील नाभिक (प्रोटॉन) का इस्तेमाल कर रही है इसके अलावा, metabolomic 1 एच एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी व्यापक का लाभ दियाडेटाबेस विभिन्न क्षेत्र की ताकत के लिए उपलब्ध किया जा रहा है और नमूना पीएच 10 मान. इसके अलावा, स्वचालित या अर्द्ध स्वचालित स्पेक्ट्रम मूल्यांकन के लिए सॉफ्टवेयर 10 उपलब्ध हो गया है.
ऊतक के अर्क के 1 एच एनएमआर स्पेक्ट्रा अच्छी तरह chelating एजेंट के अलावा बिना हल किया जा सकता है, यह अब 31 पी एनएमआर स्पेक्ट्रा के लिए सच है. वास्तव में, chelating एजेंट की एकाग्रता (जैसे, EDTA या CDTA) पंक्ति चौड़ाई और phosphorylated मेटाबोलाइट्स से stemming 31 पी एनएमआर संकेतों के रासायनिक बदलाव दोनों पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव है इस्तेमाल किया. एक उद्धरण में बढ़ाने CDTA एकाग्रता 31 पी एनएमआर लाइन की चौड़ाई कम हो जाती है, लेकिन यह लाभ पड़ोसी चोटियों का रासायनिक परिवर्तन, Δδ के बीच छोटे मतभेदों से outweighed किया जा सकता है. इसलिए, chelating एजेंट की राशि एक साथ लाइन चौड़ाई और रासायनिक बदलाव दोनों के लिए अनुकूलित किया जाना है इस्तेमाल किया. लिपिड अर्क में, इन दो वर्णक्रमीय मापदंडों significa हैंntly, लेकिन यह भी पीएच मूल्य और एनएमआर माप के दौरान नमूने के तापमान से निकाले ऊतक की राशि यानी, समग्र नमूना एकाग्रता से प्रभावित. नतीजतन, माप शर्तों के किसी भी अनुकूलन शामिल सभी प्रयोगात्मक मापदंडों, ये जा रहा है नहीं additive के कुछ के संयुक्त प्रभाव पर विचार करना चाहिए. इस स्थिति की जटिलता चित्रा 2 में दिखाया पी एल 31 पी एनएमआर स्पेक्ट्रा के व्यवहार से यह साफ है. सबसे कम ऊतक एकाग्रता (118 मिलीग्राम / एमएल), सबसे कम तापमान (277 कश्मीर) और उच्चतम CDTA एकाग्रता (1000 मिमी) का परीक्षण किया है सबसे कम लाइन चौड़ाई में नतीजा होगा, सुझाव दिया प्रोटोकॉल संकेत ओवरलैप से बचने के लिए उदार ऊतक एकाग्रता (236 मिलीग्राम / एमएल), मध्यवर्ती CDTA एकाग्रता (200 मिमी) और कमरे के तापमान (297 कश्मीर) के उपयोग की सिफारिश की.
नमूना तैयार करने और स्पेक्ट्रम अधिग्रहण की शर्तों हालांकि, अत्यंत महत्व के हैंअधिग्रहीत कच्चे डेटा से जानकारी की एक अधिकतम निकालने में स्पेक्ट्रम प्रसंस्करण मानकों की भूमिका को कम करके आंका नहीं होना चाहिए. प्रसंस्करण मापदंडों के एक विशेष सेट का पता लगाने और कम मात्रा में पाए जाते हैं कि PLs quantitating के लिए आदर्श हो मेरी; हालांकि, मापदंडों के एक ही सेट 'भीड़' वर्णक्रमीय क्षेत्रों (चित्रा 3, शीर्ष सही) में व्यक्तिगत चोटियों अस्पष्ट हो सकता है. इसके विपरीत, दृढ़ता ओवरलैपिंग अनुनादों (चित्रा 3, नीचे) के क्षेत्रों में इष्टतम संकल्प वृद्धि प्रदान प्रसंस्करण मापदंडों कम तीव्रता चोटियों undetectable प्रस्तुत करना होगा. एक व्यापक पी एल 31 पी एनएमआर डेटाबेस 13,14 भी शामिल हाल के घटनाक्रम,, बहुत एनएमआर स्पेक्ट्रा 13,14 के विश्लेषण की सुविधा.
अंत में, अंतर्निहित आवेदन के उद्देश्यों वर्णक्रमीय संकल्प, संवेदनशीलता, metabolite quantif की परिशुद्धता के वांछित संतुलन यानी, अनुकूलन के लिए मापदंड को परिभाषित करना होगाication, गति, और अन्य कारकों. उदाहरण के लिए, की सिफारिश की एक चरण दो चरण प्रणाली (चित्रा 3, ऊपर छोड़ दिया) की तुलना में अधिक विश्वसनीय और कुशल पी एल मात्रा का ठहराव पीएल विश्लेषण परमिट के लिए प्रणाली, और कम से प्रचुर मात्रा में pls के quantitation के लिए उच्च वर्णक्रमीय संकल्प के साथ ही पर्याप्त संवेदनशीलता प्रदान करता है . यह आसानी से नमूने में जुदाई चरण के लिए जाता है लेकिन, हालांकि सबसे अच्छा संकेत जुदाई कुशल और सटीक quantitation के मुकाबले कहीं ज्यादा प्राथमिकता के मामलों में जहां, विलायक मिश्रण में क्लोरोफॉर्म डी के एक उच्च प्रतिशत का उपयोग करते हैं, का प्रयास किया जा सकता है. यदि यह मामला है, कम चरण की मात्रा निरपेक्ष पी एल मात्रा में प्राप्त करने के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए (एमजी पी एल, जी ऊतक या मिलीग्राम कुल प्रोटीन प्रति).
प्रोटॉन decoupled heteronuclear एनएमआर प्रयोगों में, संकेत तीव्रता तेजी से अधिग्रहण योजनाओं के कारण संतृप्ति के अलावा, परमाणु Overhauser प्रभाव (NOE) द्वारा बदला जा सकता है. Uncorrected अगर इन प्रभावों metabolite योग्यता में परिणामntitation त्रुटियों. इस चुनौती से निपटने के लिए दो वैकल्पिक रणनीतियों रहे हैं. पहले दृष्टिकोण में, एक अधिग्रहण की व्यक्तिगत यात्रियों लंबी देरी से अलग होती है. इस विधि में किसी भी संतृप्ति से बचा जाता है या NOE लेकिन अपेक्षाकृत लंबे प्रयोगों में यह परिणाम है; सटीक और सही परिणाम की जरूरत है अगर यह प्रयोग किया जाना चाहिए. कुछ मामलों में, प्राथमिकता केवल यात्रियों की एक उच्च संख्या का उपयोग करके मापा जा सकता है कि बहुत पतला नमूने के लिए विशेष रूप से, तेजी से स्पेक्ट्रम अधिग्रहण के लिए दिया जाना पड़ सकता है. ऐसे मामलों में, नमूने के अणुचुंबकीय छूट एजेंटों के अलावा संतृप्ति या NOE बिना तेजी से डाटा अधिग्रहण की अनुमति होगी. वैकल्पिक रूप से, अणुचुंबकीय एजेंटों के अलावा बिना तेजी से डाटा अधिग्रहण नियोजित किया जा सकता. बाद विधि छूट एजेंटों की उपस्थिति के लिए metabolite quantitation की शुद्धता को कम कर सकते हैं कि एनएमआर संकेतों के कुछ विस्तार का कारण बनता है, जबकि प्रत्येक एनएमआर गूंज के लिए निर्धारित किया है कि सुधार कारकों के माध्यम से संकेत क्षेत्रों में सुधार की आवश्यकता हैभीड़ वर्णक्रमीय क्षेत्रों. आम तौर पर, प्रयोगात्मक शर्तों के इष्टतम पसंद ही नमूना प्रकार से तय नहीं है, लेकिन यह भी जानकारी से एक प्रयोग में 13 से निकाला जाता था. उच्च प्राथमिकता उच्च परिशुद्धता और सटीकता की आवश्यकता के बिना, बल्कि प्रचुर मेटाबोलाइट्स के तेजी से विश्लेषण करने के लिए दिया जाता है, तो यह अत्यधिक ध्यान केंद्रित नमूनों को मापने और अणुचुंबकीय छूट एजेंट नमूना में जोड़ा संभवतः के साथ, कम पुनरावृत्ति बार काम करने के लिए पर्याप्त हो सकता है. मेटाबोलाइट्स की एक बड़ी संख्या का सटीक quantitation गति से ज्यादा महत्वपूर्ण है, अगर यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल के द्वारा प्रदर्शन के रूप में इसके विपरीत, यह कम केंद्रित अर्क का प्रयोग और लंबी एनएमआर अधिग्रहण बार स्वीकार करने के लिए बेहतर है. एक विशेष अनुसंधान परियोजना विशिष्ट मेटाबोलाइट्स पर जोर देती है इसके अलावा, अगर, प्रयोगात्मक शर्तों के प्रश्न में वर्णक्रमीय क्षेत्रों के लिए इष्टतम वर्णक्रमीय संकल्प को प्राप्त करने के लिए समायोजित किया जा सकता है. यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल और चर्चा ओ के लिए एक गाइड के रूप में सेवा कर सकता हैएनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा कच्चे ऊतक अर्क के metabolomic विश्लेषण के ptimization.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Virbac | Vetflurane | Anesthetic for animals |
| Isoflurane vaporizer | Ohmeda | Isotec 3 | Newer model available: Isotec 4 |
| Scalpel, scissors, forceps, clamps | Harvard Apparatus Fisher Scientific |
various various |
Surgical equipment for animals |
| Freeze-clamp tool | homebuilt | n/a | Tong with aluminium plates, to be inserted in liquid nitrogen for cooling |
| Dewar | Nalgene | 4150-4000 | |
| Liquid nitrogen | Air Liquide | n/a | |
| Nitrogen gas | Air Liquide | n/a | |
| Nitrogen evaporator | Organomation Associates | N-EVAP 111 | Can be replaced by homebuilt device |
| Mortar | Sigma-Aldrich | Z247472 | |
| Pestle | Sigma-Aldrich | Z247510 | |
| Tissue homogenizer | Kinematica | Polytron | With test tubes fitting homogenizer shaft |
| Electronic scale | Sartorius | n/a | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | M3641 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 366910 | |
| Glass centrifuge tubes | Kimble | 45500-15, 45500-30 | Kimax 15 ml, 30 ml tube |
| Microcentrifuge tubes | Kimble | 45150-2 | Kimax 2 ml tube; should replace "Eppendorf" tube if compatible with centrifuge rotor |
| Polystyrene pipettes | Costar Corning | Stripettes | 5 and 10 ml volumes |
| Deuterochloroform | Sigma-Aldrich | 431915 | 99.96% deuterated |
| Deuterium oxide | Sigma-Aldrich | 423459 | 99.96% deuterated |
| Deuterium chloride | Alpha Aesar | 42406 | 20% in deuterium oxide |
| Sodium deuteroxide | Sigma-Aldrich | 164488 | 30% in deuterium oxide |
| Lyophilizer | Christ | Alpha 1-2 | |
| Cold centrifuge | Heraeus | Megafuge 16R | |
| pH meter | Eutech Cybernetics | Cyberscan | |
| CDTA | Sigma-Aldrich | D0922 | |
| Cesium hydroxide | Sigma-Aldrich | 516988 | |
| NMR tubes | Wilmad | 528-PP | |
| NMR stem coaxial insert | Sigma-Aldrich | Z278513 | By Wilmad |
| NMR pipettes | Sigma-Aldrich | Z255688 | |
| Pipettes | Eppendorf | Research | With tips for volumes from 0.5 to 1,000 μl |
| Pipet-Aid | Drummond | XP | |
| NMR spectrometer | Bruker | AVANCE 400 | including probe and other accessories |
| NMR software | Bruker | TopSpin 1.3 | newer version available: Topspin 3.2 |
| Water-soluble standard compounds | Sigma-Aldrich | various | |
| Phospholipid standard compounds | Avanti Polar Lipids Doosan Serdary Sigma-Aldrich |
various various various |
Source for plasmalogens, but may be <70 - 80% purity |
| Methylenediphosphonate | Sigma-Aldrich | M9508 | |
| TSP-d4 | Sigma-Aldrich | 269913 |
References
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