Metabolomic Analyse van de hersenen van de rat door de hoge resolutie nucleaire magnetische resonantie spectroscopie van Tissue Extracten

Introduction

Muismodellen zijn uitgebreid gebruikt in hersenonderzoek ^1. Genotype-fenotype correlaties zijn onderzocht bij muizen en ratten hersenen door het bestuderen van genexpressie op het RNA en / of eiwit niveaus enerzijds en morfologische, functionele, elektrofysiologische en / of gedragsmatige fenotypen anderzijds ^2-6. Echter volledig begrijpen van de mechanismen link fenotype aan genotype, is het noodzakelijk om de moleculaire gebeurtenissen stroomafwaarts van eiwitexpressie ie onderzoeken. het metabolisme van de biochemische substraten waarop enzymen werken ^7. Deze eis heeft geleid, in de afgelopen 10 tot 15 jaar, naar een renaissance van het metabool onderzoek in vele takken van de biologie ^8,9. Terwijl klassieke metabole studies zijn vaak gericht op de details van specifieke studierichtingen, wordt de nieuwe metabolomic aanpak gericht op een allesomvattend onderzoek van de globale metabole profiel van het weefsel in kwestie.Een gevolg van dit concept is een duidelijke behoefte aan analytische tools die voorkeur voor specifieke metabole routes en / of klassen van verbindingen te minimaliseren. Echter een klassieke biochemische assay gebaseerd op een specifieke chemische reactie van een specifiek analyt dat moet worden bepaald voordat de test wordt uitgevoerd. Daarentegen worden spectroscopische technieken zoals nucleaire magnetische resonantie (NMR) spectroscopie en massaspectrometrie (MS) (i) gebaseerd op specifieke moleculaire (fysische) eigenschappen van biochemische stoffen, die elk aanleiding geeft tot een of meer afzonderlijke signalen in een spectrum gedetecteerd in de loop van een experiment; en (ii) detectie een groot aantal verschillende verbindingen per experiment.

Dus elk spectrum bevat de gecombineerde informatie van een hele reeks van metabolieten. Daarom spectroscopische methoden geschikte instrumenten voor metabolomics, als geen voorafgaande selectie moet worden gemaakt over de aard van de analyt te meten ⁸

Hoewel NMR spectroscopie en MS uitwisselbaar worden gebruikt voor de analyse van vele metabolieten, elke methode bezit specifieke voordelen en nadelen die recentelijk hebben beoordeeld ^10. In het kort kan NMR spectroscopie gewoonlijk uitgevoerd uit ruwe extracten en geen chromatografische scheiding van het monster verbindingen voor de analyse vereist. Daarentegen MS werkt met gas of vloeistof chromatografie (GC of LC) scheiding, behalve voor bepaalde recente ontwikkelingen, zoals massaspectrometrie imaging. In enkele speciale gevallen zoals de analyse van suikers, kunnen LC scheiding noodzakelijk voor NMR-spectroscopie en omdat de resonantie lijnen van verschillende suikers aanzienlijk overlappen in proton ^(1H)-NMR spectra. Niettemin, ^1H NMR spectroscopie zonder chromatographic scheiding blijft de meest populaire, bijna universeel toegepaste metabolomic NMR-methode. In het algemeen, monstervoorbereiding is meer tijdrovend en complex voor MS dan voor NMR-spectroscopie. Ernstige problemen door matrixeffecten veel minder vaak in NMR spectroscopie dan in MS wanneer deze kunnen leiden tot aanzienlijk verzwakt signalen. Afbraakproduct kwantificatie kan worden bereikt met deze methoden. Er zijn echter meerdere standaard verbindingen die nodig zijn voor MS te wijten aan variaties in matrix-effecten en de ionisatie-efficiëntie tussen metabolieten. Daarentegen is slechts een standaard per monster nodig voor een NMR spectroscopische analyse omdat onder geschikte meetomstandigheden laatstgenoemde mogelijkheid intrinsiek kwantitatieve dankzij de strikt lineaire NMR reactie van de kernen waargenomen. Een belangrijk nadeel van NMR is de relatief lage gevoeligheid. MS, in het bijzonder LC-MS, is gevoeliger dan NMR door verscheidene orden van grootte; Daarom MS de voorkeur boven NMR voor deanalyse van verbindingen optreden bij zeer lage concentraties. Anderzijds, het destructieve karakter van de NMR experiment is een duidelijk voordeel ten opzichte MS; Zo kan NMR herhaaldelijk worden uitgevoerd op hetzelfde monster, bijvoorbeeld voor verschillende NMR-actieve kernen zoals ^1H, fosfor-31 ^(31P), koolstof-13 ^(13C), fluor-19 ⁽¹⁹ F) etc. als geen materiaal verbruikt door NMR tegenover MS metingen.

Zowel NMR en MS kunnen worden toegepast in verschillende modi, elk optimaal is voor de detectie van verbindingen met bepaalde chemische eigenschappen. Bijvoorbeeld, ^31P NMR vaak beter geschikt dan ^1H NMR voor de analyse van matig geconcentreerd gefosforyleerde verbindingen, hoewel bijna alle gefosforyleerde metabolieten protonen bevatten. Toch kan hun ^1H NMR signalen onzichtbaar door ^1H NMR signalen van andere, niet-gefosforyleerde verbindingen, terwijl de laatsteuiteraard niet leiden achtergrond signalen in ³¹ P-NMR-spectra. In een analoge situatie, ^19F NMR analyse de voorkeur voor fluorverbindingen, bijvoorbeeld gefluoreerde drugs (geen achtergrond signalen van endogene metabolieten), terwijl het bijzondere geval van ¹³ C NMR plaats bijna uitsluitend als het lot van ¹³ C gelabelde exogene metabole precursors moet worden gevolgd door de extreem lage natuurlijke abundantie van de ^13C isotoop (ongeveer 1%). Veel massaspectrometers werken negatief ion mode of positieve ion modus. Daarom is het belangrijk om vóór de analyse of de ionen worden genomen negatief of positief geladen kent. We richten ons hier op een protocol voor de analyse van het hersenweefsel metabolome door ^1H en ^31P NMR spectroscopie omdat deze methode levert een groot aantal van de belangrijkste metaboliet concentraties tegen lage kosten in termen van (i) de tijd die nodig is voor de bereiding van de monsters eennd (ii) inspanning die nodig is voor de metaboliet kwantificatie. Alle experimenten worden uitgevoerd met behulp van de apparatuur van een standaard nat-chemisch laboratorium en een hoge-resolutie NMR spectroscopie faciliteit. Verdere eisen zijn beschreven in het onderstaande protocol.

Protocol

OPMERKING: ANIMAL ETHIEK STATEMENT
Dierstudies met ratten volgden de richtlijnen geldig in Frankrijk, en werden goedgekeurd door de lokale ethische commissie (# 40.04, Universiteit van Aix-Marseille Medical School, Marseille, Frankrijk).

1 Oogst en Bevriezing Rat Brain

1. Bereid werkmateriaal: vloeibare stikstof (N _2liq.) In Dewar dat groot genoeg is om een bevriezing klem (ten minste 2-3 L volume) houden; verdoving (bijvoorbeeld isofluraan of ketamine / xylazine); anesthesie kamer; steriele dissectie-instrumenten: chirurgische schaar, scalpel, tang; weefsel doekjes en de fles met het schoonmaken van alcohol (ethanol); naalden (25 G); 1 ml en 10 ml spuiten. Label aluminium platen (ca. 10 x 10 cm) met plakband. Gebruik vellen individuele freeze-geklemde rat hersenen wikkelen.
   LET OP: Draag altijd beschermende handschoenen en een veiligheidsbril of masker bij het werken met vloeibare stikstof!
2. Vul Dewar met N _2liq. En plaats vrijzing klem in een Dewar. Controleer de hoeveelheid N _2liq in het Dewar is voldoende voor herhaalde vries-clamp procedures (verscheidene liters, de hoeveelheid N _2liq verdampen tijdens elke freeze-klemmen afhankelijk van de grootte van de klem).
3. Verdoven van dieren (bijvoorbeeld door isofluraan of door intraperitoneale injectie van een ketamine / xylazine mengsel). Overgaan tot euthanasie door cardiale punctie bloedingen te voorkomen wanneer de hoofdhuid wordt verwijderd en de schedel wordt geopend. Stappen 1,4-1,7 hieronder beschrijven deze standaard procedure.
   Opmerking In speciale protocollen die maximaal behoud van glucose energy-metabolieten, offer rat door-trechter bevriezen van de hersenen van het verdoofde dier met N _2liq ¹¹ na terugtrekken van de hoofdhuid. Vervolgens ontleden hersenen uit de schedel onder intermitterende N _2liq aan postmortale metabolisme ¹² minimaliseren.
4. Bevochtig het hoofd van de rat met het schoonmaken van alcohol. Gebruik chirurgische schaar om (i) remove hoofdhuid, en (ii) geopend schedel langs schedelnaden.
5. Gebruik een tang om de schedel verder open, en hele brein van onder de open schedel te verwijderen, het positioneren van de kop ondersteboven. Verwijder snel zichtbare sporen van bloed met behulp van weefsel doekjes. Als hersenhelften metabolisch en morfologisch symmetrisch, is het handig om een ​​van de hemisferen voor metaboolanalyse gebruiken na afscheiding uit de andere hemisfeer door incisie met de scalpel. Indien nodig, gebruik maken van de resterende halfrond voor andere hersenen studies zoals histologie.
6. Snel te verwijderen bevriezing klem van N _2liq -gevulde Dewar, plaatst hele of halve hersenen rat op een inwendig oppervlak, klem en steek onmiddellijk invriezen klem in N _2liq -gevulde Dewar terwijl klem stevig samengedrukt. Ervoor te zorgen dat de stappen 1.3-1.6 duren niet langer dan 60 sec.
7. Na 1-2 minuten verwijderen bevriezen klem van de Dewar open klem, los ingevroren hersenweefsel van klem, en wrapingevroren weefsel in het gepaste label aluminium plaat (zie 1.1 hierboven). Zorg ervoor dat het leesbaar is en blijft stevig op zijn plaats nadat het monster is verpakt. Plaats snel verpakte monster in N _2liq. Voer de gehele procedure zo snel mogelijk ontdooien van bevroren hersenweefsel voorkomen.
8. Bewaar bevroren monster in N _2liq of in een vriezer bij -80 ° C tot metaboliet extractie.
   Opmerking: Wanneer een biologisch monster worden opgeslagen meer dan een jaar opslag bij N _2liq temperatuur de voorkeur boven -80 ° C. Dit geldt ook voor de rest van dit protocol.

2 Voorbereiding van Metabolite Extraction Procedure

1. Bereid weefselhomogenisator en bijpassende reageerbuizen (bijvoorbeeld, 10 mm binnendiameter, afhankelijk van de diameter van de schacht homogenisator, meestal van kunststof). Gebruik elektrische homogenisators plaats van handmatig aangedreven homogenisators (weefsel slijpmachines). Prepare vortexer en laboratorium balans.
2. Bereid emmer gevuld met crushed ijs. Houd voldoende hoeveelheden van een methanol, chloroform en water op het ijs (4 ml per stuk per 250-350 mg ingevroren hersenweefsel).
3. Bereid overdracht pipetten en flacons.
   1. Bereid glazen flesjes (≥20 volume ml) met schroefdop en plaats op ijs (een flacon per weefsel extract). Fit schroefdoppen met een Teflon septa bestand tegen chloroform.
   2. Bereid 5 ml plastic pipetten voor het afgeven van methanol en water, en glazen pipetten of Hamilton spuiten voor het afgeven chloroform. Bereid extra plastic pipetten (5 of 10 ml volume) voor het overbrengen mengsels van weefselhomogenaat en methanol.
   3. Controleer het glaswerk wordt grondig gespoeld met gedestilleerd water en zorgvuldig gedroogd voor gebruik om sporen van verontreinigingen, zoals NMR-detecteerbare formiaat en acetaat te verwijderen.
4. Vul porseleinen vijzel met N _2liq, plaats porseleinen stamper in de vijzel en opnieuw vullen met N _2liq. Stikstof zal verdampen totdat de temperatuur van de vijzel en stamper voldoende laag is. Houd kleine hoeveelheid N _2liq in mortel.

3 Extractie van metabolieten

1. Verwijder ingevroren hersenweefsel monster uit de opslag (N _2liq tank of -80 ° C vriezer). Dan meteen weefselmonster overbrengen naar gedeeltelijk gevuld met N _2liq mortel.
2. Gebruik de N _2liq -koude stamper om de bevroren hersenweefsel te breken in kleinere stukken die gemakkelijk passen in de reageerbuizen gebruikt voor weefsel homogenisering. Om stukken bevroren weefsel voorkomen dat geprojecteerd van de mortel in het proces, verdeel het weefsel terwijl nog steeds verpakt in aluminiumfolie. Slijp ingevroren weefsel tot poeder als deze transfer aan de reageerbuis moeilijker (verhoogd risico op condensatie van water) zou maken. Belangrijk: Tijdens de gehele procedure, voeg N _2liq als nodig is om het monster diepgevroren houden mortel.
3. Mix small stukken bevroren hersenweefsel grondig afgewogen 250-350 mg en over te dragen aan een reageerbuis gevuld met ijskoude methanol (4 ml voor 250-350 mg hersenweefsel). Iedere keer dat stukken bevroren weefsel worden toegevoegd, homogeniseren deze onmiddellijk met het weefsel homogenisator.
   LET OP: Vul dit hele procedure snel op het monster, die zou leiden tot een overschatting van het monster gewicht, en (ii) het verwarmen en ontdooien van het monster te voorkomen dat (i) aanzienlijke condensatie van water. Individuele weefselstukken moeten in bevroren toestand aan het begin van het homogenisatieproces.
4. Na het laatste stuk van de bevroren rattenhersenen monster is toegevoegd aan het buisje en gehomogeniseerd, breng het homogenaat een ≥20 ml volume glazen flesje, afsluiten schroefdop en laat op ijs gedurende 15 minuten. Als het volume van de reageerbuis niet groot genoeg voor ≥4 ml methanol, een kleinere volume methanol om een ​​deel van het bevroren hersenweefsel gehomogeniseerd Breng het mengsel aan deglazen flesje en verder homogeniseren van het resterende weefsel stukken met verse methanol. Zorg ervoor dat het totale volume van methanol is 4 ml per 250-350 mg hersenweefsel.
5. Voeg hetzelfde volume ijskoude chloroform (dwz 4 ml per 250-350 mg hersenweefsel) op homogenaat, vortex grondig en laat op ijs gedurende 15 minuten.
   OPMERKING: Gebruik altijd geventileerde chemische kap bij de omgang met vluchtige oplosmiddelen, met name chloroform!
6. Voeg dezelfde hoeveelheid water (dwz 4 ml per 250-350 mg hersenweefsel) op homogenaat, vortex grondig en laat staan ​​bij -20 ° C overnacht.

4 Bereiding van fasescheiding en Oplosmiddel verdamping

1. Bereid koude centrifuge (4 ° C, 13.000 xg bij maximale radius) en centrifugebuizen. Zorg ervoor dat de laatste zijn ≥20 ml volume, bestand tegen chloroform, en kan middelpuntvliedende krachten van 13.000 x g weerstaan. Gebruik speciale glazen centrifugeerbuizen maar spoel (als alle glaswerk) met gedestilleerd watervoorgrond gebruik (zie 2.3).
2. Bereid je grondig gespoeld glas Pasteurpipetten en een geschikte propipettor (lamp, handmatige pipet pomp, automatische pipet hulp / pipet, etc.).
3. Bereid twee extra grondig gespoeld buizen (≥15 volume ml) per hersenmonster, waarvan ook bestand zijn tegen chloroform (glas of Teflon) is, de andere aan methanol (plastiek bestand tegen methanol of glas).
4. Bereid oplosmiddelverdamping apparaat (in de handel verkrijgbaar of zelfbouw). Zorg ervoor dat deze inrichting een fijn gecontroleerde stroom droge stikstof gas dat is gericht op het oppervlak van een extract oplossing die vluchtige oplosmiddelen (methanol, chloroform).
5. Bereid twee extra laden of emmers gevuld met ijs: een voor de steekproef vervoer op het ijs, en een andere voor het opslaan van monsters koud tijdens het verdampingsproces.
6. Bereid vriesdroger (vriesdroger) en materialen die nodig zijn voor vriesdrogen: (i) een 50ml centrifugebuis of vacuum rondbodemkolf per extract en (ii) N _2liq de waterfase monsters (≤0.3 L per monster) bevriezen. Als centrifugebuis wordt gebruikt, ook voorbereiden wijde hals vacuüm filter fles geschikt voor vriesdroger.

5. fasescheiding en Oplosmiddel verdamping

1. Voor volledige fasescheiding, breng de methanol / chloroform / water / hersenweefsel homogenaat (zie 3.6) een chloroform-resistente centrifugebuis (volume ≥20 ml) en gecentrifugeerd bij 13.000 xg en 4 ° C gedurende 40 minuten.
   OPMERKING: Twee fasen zullen vormen, gescheiden door een laag neergeslagen eiwit. De onderste (zwaardere) fase bestaat uit methanol, chloroform en opgeloste lipiden, terwijl de bovenste (lichtere) fase bestaat uit water, methanol en opgelost in water oplosbare metabolieten.
2. Met een Pasteur pipet om de bovenste fase naar een geschikte ≥15 ml buisje (plastic bestand tegen methanol of glas). Keep on ice.
3. Gebruik een nieuw Pasteur pipet om de onderste fase naar een geschikte ≥15 ml buisje (glas of Teflon). Blijf op ijs.
4. Bewaar de laag neergeslagen eiwit bij -80 ° C indien het wordt gebruikt voor de bepaling van totaal eiwit; of anders weggooien.
5. Houd de tube met de water / methanol-fase (zie 5.2) op ijs en methanol verdampt door het richten van een droge stikstofstroom op het oppervlak van het extract oplossing. Als alternatief zachtjes bubble stikstof door het extract oplossing. Beëindig het verdampingsproces bij doorborrelen van stikstof veroorzaakt niet meer volumereductie van het extract oplossing. Op dit moment, verder met vriesdrogen (zie 5.7), of bevriezen en bewaren monster bij -80 ° C met de buis gesloten (schroefdop of Parafilm) tot klaar voor lyofilisatie.
6. Plaats de buis met de methanol / chloroform fase (zie 5.3) op ijs en verdampen van methanol door het richten van een droge stikstofstroom op de suce van het extract oplossing. Wanneer alle oplosmiddel afgedampt, het proces beëindigd en houdt het monster bij -80 ° C met de buis gesloten (schroefdop of Parafilm) tot klaar voor NMR analyse.
7. Bereid waterige fase voor Lyofilisatie
   1. Na het einde van het verdampingsproces methanol (zie 5.5), breng het monster een grondig gespoeld 50 ml centrifugebuis (als het monster bevroren is, ontdooien voor transfer). Alternatief: breng een vacuum rondbodemkolf.
   2. Freeze extractieoplossing door rotatie centrifugebuis (of rondbodemkolf) gedeeltelijk ingevoegd in N _2liq zodat het binnenoppervlak van de buis of kolf geleidelijk onder bevroren vloeistof. Zorg ervoor dat er geen N _2liq. Kan het bakje te openen.
   3. Wanneer alle vloeistof bevroren, bedekken de buis met een doorboord deksel of schroefdop om de verdamping te bevorderen, en plaats de buis in een wijde hals vacuüm filter fles.
   4. Start vriesdrogen na attaching de kolf of fles naar de vriesdroger.
8. Beëindigen het vriesdrogen proces wanneer het monster is helemaal droog. Laat het monster bij -80 ° C in een gesloten buis (met een strakke deksel!) Tot gebruik voor NMR analyse.
   OPMERKING: Meestal maximaal 24 uur nodig voor lyofilisatie. Meerdere monsters kunnen gelijktijdig worden gevriesdroogd, afhankelijk van het ontwerp van de vriesdroger, en of centrifugebuisjes in brede hals flessen of rondbodemkolf worden gebruikt.

6 Bereiding van monsters NMR

1. WINKEL gedroogde en gevriesdroogde extracten bij zeer lage temperatuur (≤ -80 ° C). Re-ontbinden lyofilisaten voor de bereiding van NMR monsters onmiddellijk voor NMR-experiment.
   LET OP: Het opslaan van monsters in oplossing en / of in de buurt van kamertemperatuur kan leiden tot monster degradatie!
2. Bereid een waterige 200 mM oplossing van de chelaatvormer, trans-1,2-cyclohexyldiaminetetraacetic acid (CDTA), als volgt:
   1. Voeg zuiver water (bijvoorbeeld 20 ml) in een reageerbuis of centrifugebuis en voeg de hoeveelheid CDTA poeder moet een 200 mM oplossing te genereren.
      OPMERKING: Een aanzienlijk deel van CDTA niet oplosbaar zijn, omdat de pH laag aangezien de zuurvorm van CDTA eerder werd gebruikt dan CDTA zout.
   2. Voeg voorzichtig, stap voor stap, steeds grotere hoeveelheden CsOH poeder om de CDTA oplossing, en vortex grondig na elke toevoeging.
      OPMERKING: De oplosbare fractie CDTA zal toenemen met toenemende CsOH gehalte in de waterige oplossing. Vermijd "overtitration", dat wil zeggen minder toe dan de stoichiometrische hoeveelheid CsOH aan de CDTA oplossing.
   3. Bij bijna alle CDTA poeder is opgelost, start het meten van de pH na elke CsOH toevoeging en grondig vortexen. Beëindig CsOH Bovendien wanneer de uiteindelijke pH wordt bereikt (tabel 1).
      NB: Op dit moment worden alle CDTA worden opgelost. Het gebruik van Cs ⁺ als tegenion voor CDTA is generbondgenoot voorkeur boven Na ⁺ of K ^+. Cs ⁺ is een zacht Lewiszuur vanwege zijn grote ionenstraal, in tegenstelling tot Na ⁺ en K ⁺ dat de kleinere ionenstralen hebben en sterke zuren. Bijgevolg Cs ⁺ vormen complexen met fosfaten (harde basen) minder gemakkelijk dan doen Na ⁺ en K ^+. Dit is voordelig voor ^31P NMR spectroscopie van gefosforyleerde metabolieten omdat complexering neigt NMR lijnbreedten verhogen, met name onder omstandigheden van langzaam tussenliggende ionenuitwisseling.
3. Voor ^31P NMR analyse van fosfolipiden (PL), opgelost gedroogd lipiden (zie 5.6) in 700 ui van een oplosmiddelmengsel bestaande uit gedeutereerd chloroform _(CDCI3), methanol en CDTA oplossing bereid zoals beschreven in 6.2 (5: 4: 1 volumeverhouding). Breng het monster op een microcentrifugebuis. Gebruik direct-verplaatsing (of positief-verplaatsing) micropipet met chloroform-resistant tips in beide stappen.
   LET OP: Houd er rekening mee dat het veranderen van een van de volgende parameters zal de verschijning (chemische verschuiving en lijndiktes) van PL ³¹ P-NMR-spectra ^13-17 beïnvloeden:
   (I) volumeverhouding _CDCI3: MeOH: CDTA oplossing
   (Ii) het totale volume van het oplosmiddel gebruikt
   (Iii) pH van de waterige component van het oplosmiddel
   (Iv) CDTA concentratie van het waterige bestanddeel van het oplosmiddel.
   OPMERKING: In het algemeen, fine-tuning van deze steekproef parameters (tabel 1) is niet nodig, en dient te worden uitgevoerd met uiterste zorg desgewenst in speciale gevallen. De volumeverhouding oplosmiddel veranderen gemakkelijk resulteert in de vorming van een systeem bestaande uit twee fasen in plaats van een homogene fase! De een-fase systeem bleek praktischer dan de tweefasensysteem meeste toepassingen ^13,14 zijn.
4. Voor ^1H NMR-analyse van in water oplosbare metabolieten, los lyofilisaat (zie 5.8) in 700 gl deuteriumoxide (D ₂ O) bevattende 3 (trimethylsilyl) propionzuur-2,2,3,3-d4 natriumzout (TSPd ₄₎ in het millimolaire bereik _(D2O dat 0,05% TSPd ₄ is commercieel beschikbaar) . Breng het monster op een microcentrifugebuis.
5. Stel de pH van de verkregen waterige extract oplossing 7,3 door toevoeging van kleine hoeveelheden (ca. 2 pl) van deuterium chloride (DCI) en natrium deuteroxide (NaOD) oplossingen. Eerst beginnen met 0,02 N DCl of NaOD oplossingen. Als er 2 of 3 latere toevoegingen niet voldoende pH-verandering veroorzaken, verder met 0,2 N DCl of NaOD oplossingen. Wees voorzichtig niet te overtitrate.
   NB: Het totale bedrag van DCl of NaOD oplossing nodig is afhankelijk van de hoeveelheid hersenweefsel onttrokken; noteer deze waarde voor precieze metaboliet kwantificatie. In de meeste gevallen de gecombineerde hoeveelheden van de toegevoegde DCI en NaOD oplossingen verwaarloosbaar moet zijn (bijna 1% van NMR monstervolume).

itle "> 7. Uitvoering van de ³¹ P-NMR Experiment voor Brain Phospholipid Analyse ^13,14

1. Voor het beste resultaat, gebruik dan een meerkernige hoge-resolutie NMR-spectrometer (≥9.4 Tesla veldsterkte, wat overeenkomt met 162 MHz ³¹ P, of 400 MHz ^1H resonantie frequenties). Naast de ³¹ P spoel, ervoor te zorgen dat de ^31P NMR probe beschikt over een ¹ H spoel voor protonontkoppeling. Set temperatuurregeling van de NMR probe gewenste streefwaarde (meestal 25 ° C).
   OPMERKING: Probe temperatuur kan 10-20 minuten nodig om te stabiliseren!
2. Centrifugeer PL extractieoplossing in microcentrifugebuis (zie 6.3) bij 4 ° C en 11.000 g gedurende 30 min verminderde snelheid vaste residuen in het monster. Breng 600 pi van het supernatant met een hoge kwaliteit NMR buis (5 mm buitendiameter).
3. Bereid geschikte coaxiale insert stengel gevuld met een waterige 20 mM methylenediphosphonate (MDP) oplossing met een pH van 7,0 voor de chemische-shift referencingen kwantificering. Plaats deze insert in de NMR-buis gevuld met PL-extract oplossing.
4. Passen bij de NMR buis met de juiste spinner en transfer naar de NMR-magneet. Nu draaien de monster bij 15-20 Hz en wacht totdat het monster zich heeft aangepast aan de ingestelde temperatuur (ca. 10 min).
5. Minimaliseren zorgvuldig magnetische-veldinhomogeniteit hele monster door het aanpassen van on-axis en off-axis shim spoel stromingen ^18.
6. Stel NMR spectrum opnameparameters optimale waarden, die kunnen variëren als een functie van magneet veldsterkte (voor een 9,4 T systeem, zie Tabel 1 voor de aanbevolen parameterwaarden).
7. Stel het aantal passanten per experiment (= NS).
   1. Stel NS tot ongeveer 80 (totale duur van gegevensverzamelings ca. 20 min) als alleen de meest voorkomende PL worden gekwantificeerd nauwkeurig (fosfatidylcholine (PtdCho), fosfatidylethanolamine (PtdEtn), ethanolamine plasmalogenen).
   2. Stel NS tot ongeveer 100-200 (totale duur van data overname 1-2 uur) of minder geconcentreerd PL's moeten worden gekwantificeerd (alkyl-acyl-fosfatidylcholine, fosfatidylinositol, fosfatidylserine, fosfatidinezuur).
   3. Stel NS ongeveer 1500-2000 (totale duur van gegevensverzamelings 7-10 uur; overnight experiment) indien zeer lage concentraties PL worden gekwantificeerd, zoals fosfatidylinositol mono en difosfaten (PtdIP en PtdIP _2), cardiolipine, lyso-PLs , alkyl-acyl-fosfatidylethanolamine, en soms andere.
8. Na het einde van het spectrum te verwerven, te verwerken vrije inductie verval (FID) met behulp van geoptimaliseerde parameters. De waarden van deze parameters variëren als functie van magnetisch-veldsterkte, shim kwaliteit en de PL signaal te kwantificeren.
   1. Om het beste resultaat te verkrijgen voor het hele scala van PL's, herhaal verwerking met behulp van meerdere (minimaal twee) verschillende filtering procedures. Gebruik sterke verbetering resolutie voor sterk overlappende signalen, bijvoorbeeld., Voor PtdCho en PtdEtngebieden.
   2. Gebruik sterke filtering (zwakke of geen verbetering resolutie) voor zwakke signalen.
   3. Filter zeer zwakke en brede signalen zonder significante overlap van apodisatie (bijvoorbeeld LB = 3 Hz) om signaal-ruisverhouding, zoals PtdIP en PtdIP ₂ verhogen. Zie tabel 1 voor de karakteristieke parameters voor verwerking.
9. Kwantificeer de oppervlakte van elke PL signaal met betrekking tot het gebied onder het signaal van de referentieverbinding (MDP) in hetzelfde spectrum.
10. Kalibreer het signaal van de referentieverbinding (MDP) in een afzonderlijk experiment met een 5 mm NMR buis gevuld met (i) een fosforverbinding bekende concentratie, en (ii) dezelfde coaxiale insert stam gebruikt PL ³¹ P NMR-experimenten ( zie 7.3 en 7.9).
11. Bereken individuele PL concentratie gebaseerd op relatieve oppervlakken van PL signalen enerzijds (zie 7.9) en kalibratiewaarde verkregen uit MDPcoax-insert op de andere (zie 7.10). Er rekening mee dat het aantal fosfor kernen bijdragen aan een specifiek ^31P NMR signaal kan variëren als functie van de moleculaire oorsprong van dat signaal.
    OPMERKING: De MDP fosfonaat signaal (meestal verwezen 19,39 ppm) vertegenwoordigt twee fosfor kernen, evenals de cardiolipine fosfaat signaal. Alle andere PL ^31P NMR signalen waargenomen in hersenen extracten geven een fosfor kern elk.
12. Gebruik statistieken software als nodig is om de hersenen PL niveaus vergelijken tussen groepen dieren.

8 Uitvoering van het ^1H NMR Experiment voor analyse van water-oplosbare hersenmetabolieten

1. Set temperatuurregeling van het ^1H NMR probe gewenste streefwaarde (meestal 25 ° C). Zie ook de opmerkingen in 7.1.
2. Centrifugeer het waterige extract oplossing microcentrifugebuis (zie 6.5) bij 4 ° C en 11.000xg gedurende 30 min verminderde snelheid vaste residuen in het monster. Breng 600 pi van het supernatant met een hoge kwaliteit NMR buis (5 mm buitendiameter).
3. Transfer NMR buis NMR magneet, shim en stel NMR-spectrum acquisitie parameters om optimale waarden zoals uitgelegd in 7,4-7,6. Zie ook Tabel 1 voor de aanbevolen parameterwaarden.
4. Stel het aantal passanten per experiment om over NS = 32 (totale duur van de data-acquisitie ca. 13 min). Om een goede signaal-ruisverhouding te verkrijgen voor zeer zwakke signalen, met name in het aromatische gebied, gebruik NS = 64 (totale duur van gegevensverzamelings ca. 26 min) of meer.
5. Na het einde van het spectrum te verwerven, te verwerken vrije inductie verval (FID) met behulp van geoptimaliseerde parameters. De waarden van deze parameters enigszins variëren als functie van de magnetische veldsterkte, shim kwaliteit en de metaboliet signaal te kwantificeren.
   Opmerking: In de meeste gevallen is het voldoende om elk spectrum keer verwerken, Waarbij een set van procesparameters die een goed compromis voor metaboliet signalen. Zie tabel 1 voor de karakteristieke parameters voor verwerking.
6. Kwantificeer de oppervlakte van elk metaboliet signaal (vaak multiplet, soms overlappen met andere singlets of multiplets gevolg van verschillende moleculen) ten opzichte van de oppervlakte onder het signaal van de referentieverbinding _(TSP-d4) in hetzelfde spectrum.
7. Bereken afzonderlijk metabolietconcentraties basis van _TSP-d4 concentratie (zie 6.4). Er rekening mee dat het aantal protonen bijdragen aan een specifiek ^1H NMR signaal kan variëren als functie van de moleculaire oorsprong van dat signaal. De TSP-d ₄ trimethyl- signaal (referentie: 0.0 ppm) vertegenwoordigt negen protonen.
8. Gebruik statistieken software als nodig is om de hersenen metaboliet niveaus vergelijken tussen groepen dieren.

Representative Results

De beste resolutie te verkrijgen in de metabole NMR-spectra van de hersenen en ander weefsel extracten, is het al lang gebruikelijk om masker metaalionen (belangrijker nog: paramagnetische ionen) te verwijderen of aanwezig in het extract oplossingen. Dit wordt bereikt hetzij door toevoeging van een chelerend middel zoals EDTA of CDTA het extract ¹⁹ of door het passeren van het extract door een ionenuitwisselingshars zoals Chelex-100 ^20. De in figuur 1 resultaten tonen aan dat deze stap niet noodzakelijk ^1H NMR spectroscopische analyse als hersenextracten zorgvuldig bereid volgens de bovenstaande protocol. Hier, zeer smalle spectrale lijnen werden verkregen voor alle spectrale gebieden geanalyseerd. Zelfs in zeer drukke gebieden, bijvoorbeeld voor glutamine / glutamaat en myo-inositol / glycine, pieken bij een afstand van <0,01 ppm bijna volledig gescheiden bij 400 MHz (Figuur 1 bodem). Bijgevolg kwalitatieveen kwantitatieve analyse van de talrijke kleine, maar nog niet toegewezen pieken zichtbaar in het midden en onderste panelen van figuur 1 kan in de toekomst worden overwogen.

Figuur 1 subgebieden van een typisch ^1H-NMR spectrum (400 MHz) van de waterige fase van een hersenweefsel extract van een vrouwelijke Lewis rat. Drie panelen tonen de zeer hoge resolutie verkregen via het protocol in dit document. Noch chelaatvormer of ionenuitwisselingshars is gebruikt tijdens de voorbehandeling. En het onderste panelen tonen het bestaan ​​van vele niet-toegewezen lage intensiteit pieken die wijzen op het enorme dynamische bereik gedekt door een hoge resolutie ^1H NMR spectroscopie van weefselextracten indien uitgevoerd met behulp van geoptimaliseerde experimentele parameters. Deze zwak, maar goeddetecteerbare signalen kan mogelijk worden geïdentificeerd en gekwantificeerd in de toekomst. Verschillende gedetecteerd metabolieten zijn specifiek van hersenweefsel, bijvoorbeeld, het neuron marker NAA of de neurotransmitter GABA.; echter, de meeste verbindingen betrokken bij een breed spectrum van metabole routes die gemeenschappelijk zijn voor zoogdiercellen, zoals aminozuren, vertakte organisch zuur, polyol, (fosfo) lipide en energiemetabolisme en in glycolyse en glutaminolysis en in functies zoals osmoregulatie, celgroei en proliferatie. Het sterretje geeft de methyl resonantie als gevolg van een methanol onzuiverheid. Afkortingen: ala, alanine; lac, lactaat; threo, threonine; BHB, β-hydroxyboterzuur; val, valine; ile, isoleucine; leu, leucine; AAB, α-aminobutyraat; AHB, α-hydroxyboterzuur; tau, taurine; scy -Ins, scyllo inositolgehalte; myo -Ins, myo; GPC, glycerophosphocholine; PC, fosfocholine; cho, choline; CRN, creatinine; Cr creatine; GABA,47; -aminobutyrate; asp, aspartaat; NAA, N -acetylaspartate; Gin, glutamine; glu, glutamaat; suc, succinaat; NANA, N -acetylneuraminate; ac, acetaat; gly, glycine. De kleine pieken bij de basis van de ala doublet voort uit het lactaat ¹³ C satelliet doublet (bovenste paneel). Herdrukt onder de Creative Commons Attribution License (ccal) termen uit Lutz NW et al (2013) Cerebrale biochemische pathways in experimentele auto-immune encefalomyelitis en adjuvant artritis:. Een vergelijkende metabolomic studie. PLoS ONE 8 (2):. E56101 Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

In ³¹ P-NMR-spectroscopie, maskeren of verwijderen van paramagnetische kationen (vooral ijzer) is zonder twijfel een noodzaak omdat fosfaten gemakkelijk complexen met tweewaardige en driewaardige ionen te vormen. Toevoeging van CDTA om extracten van invloed op zowel spectrale lijnbreedten eend chemische verschuivingen; vergelijk figuur 2, boven en onder links. Lijnbenaderingsmechanisme kies 1,000 mM (links) in plaats van 200 mM (linksboven) CDTA gewenst was, maar leidde tot superpositie van PL signalen (linksboven) afzonderlijk worden gekwantificeerd. Daarom wordt 200 mM CDTA aanbevolen voor waterige bestanddeel van de PL oplosmiddel alle andere omstandigheden gelijk. De steekproef temperatuur tijdens een meting spectrale lijndiktes en chemische verschuivingen; vergelijk figuur 2, boven-en onderkant rechts. Lijn vernauwing door te kiezen voor 277 K (rechtsonder) in plaats van 297 K (rechtsboven) gewenst was, maar resulteerde in superpositie van PL signalen die afzonderlijk moeten worden gekwantificeerd (rechts boven). Daarom wordt 297 K aanbevolen als temperatuurmeting, alle andere omstandigheden gelijk. Vergelijking tussen de twee bovenste panelen blijkt dat een afname van CDTA concentratie van 200 mM (linksboven) tot 50 mM (rechtsboven) alleen leidt toteen bescheiden toename van lijnbreedte, en bijna geen verandering in chemische verschuivingen. Merk echter op dat het weefsel-concentratie in de 50 mM CDTA extract is half zo hoog als in de 200 mM CDTA extract, het uitleggen van de relatief smalle lijnen in de bovenste rechter paneel ^13.

Figuur 2 Fosfatidylethanolamine (PtdE) gebieden fosfolipide ^31P NMR spectra (162 MHz) van hersenweefsel extracten van vrouwelijke Lewis-ratten (linker paneel) Hersenweefsel concentratie 236 mg / ml.; CDTA concentratie en pH in het waterige bestanddeel van het oplosmiddel, 200 mM en 7,33, respectievelijk; temperatuurmeting, zijn 297 K. PtdE _plasma en SM-signalen goed opgelost (linksonder) Hersenweefsel concentratie 236 mg / ml.; CDTA concentration en pH in het waterige bestanddeel van het oplosmiddel, 1000 mM en 7,36, respectievelijk; temperatuurmeting, 297 K. PtdE _plasma en SM signalen overlappen geheel; ze kunnen niet worden opgelost, ondanks verminderde lijndikte, in vergelijking met de linker bovenste spectrum (boven rechts) Hersenweefsel concentratie 118 mg / ml.; CDTA concentratie en pH in het waterige bestanddeel van het oplosmiddel, 50 mM en 7,14, respectievelijk; temperatuurmeting, 297 K. PtdE en SM signalen zijn goed opgelost (rechtsonder) Hersenweefsel concentratie 118 mg / ml.; CDTA concentratie en pH in het waterige bestanddeel van het oplosmiddel, 50 mM en 7,14, respectievelijk; temperatuurmeting, 277 K. PtdE en SM signalen overlappen geheel; ze kunnen niet worden opgelost, ondanks verminderde lijnbreedte opzichte rechtsboven spectrum. Afkortingen: PtdE _plasma, ethanolamine plasmalogenen; PtdE, fosfatidylethanolamine; SM, sphingomyeline; PtdS, phosphatidylserine; PTDC, fosfatidylcholine. Overgenomen met toestemming van Lutz NW ea. (2010) Multiparametrische optimalisatie van ^31P NMR spectroscopische analyse van fosfolipiden in ruwe weefsel extracten. 1 Chemische shift en signaal scheiding. Anal Chem 82 (13): 5433-5440. Copyright 2010 American Chemical Society. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Met de bovengenoemde protocol (een-fase systeem ¹⁴ Figuur 3 linksboven), een groot aantal meetbare PL's werden gedetecteerd (Figuur 3, rechtsboven), die een aanzienlijke concentratiebereik (noot afgeknotte hoge intensiteit signalen). Sommige van deze signalen nog toegewezen (U1, U2, U6). Als monstervoorbereiding, NMR-metingen en spectrum verwerking worden uitgevoerd zoals aangegeven in dit protocol, spectrale resolutie is zelfs voldoende om routinematig detect partiële splitsing van bepaalde pieken (PtdS, PtdE, PtdE _plasma, AAPtdE; linksonder). . Bijgevolg kwalitatieve en kwantitatieve analyse van andere PL subgroepen in de toekomst worden overwogen figuur 3, rechtsonder illustreert de kracht van oordeelkundig gekozen procesparameters gedeeltelijk afzonderlijke signalen van lage concentratie verbindingen (hier: PtdC1u een PL afgeleide van PTDC die niet volledig wordt geïdentificeerd, en PTDC _plasma) resoneert dicht bij zeer sterke signalen (hier: PTDC).

Figuur 3 fosfolipide ^31P NMR spectroscopie (162 MHz) van hersenweefsel extracten van vrouwelijke Lewis ratten. (Linker paneel) Een een-fase systeem (links) de voorkeur boven een tweefasensysteem (rechts). De gebruikte tweefasensysteem correct belemmertPL kwantificering omdat de meeste van de bovenste fase zich buiten de gevoelige volume van de spoel. (Top rechterpaneel) Complete ^31P NMR PL spectrum van rattenhersenen. Voor een betere zichtbaarheid van de zwakke signalen (PtdIP, PtdG), exponentiële lijnverbreding (LB = 3 Hz) werd toegepast. In deze voorstelling, meerdere PL-signalen zijn niet goed opgelost, met name in de PTDC en PtdE regio. Voor PL's het genereren van meer dan een ³¹ P-NMR-signaal worden waargenomen kernen onderstreept (P Tijdelijke, PtdI P, P Tijdelijke _2, PtdI P _2). Momenteel toegewezen signalen worden aangeduid met "U n" (waarin n = 1, 2, ...). (Onder linkerpaneel) PtdE en PtdS gebieden van hetzelfde spectrum. Voor een betere piek resolutie, werd Lorentz-Gauss lijn vorm transformatie toegepast (LB = -1 Hz, GB = 0,3). Vanwege deze procesparameters, vele zeer zwakke PL signalen zijn moeilijk te detecteren. Echter, ten minste twee piekenonderscheiden worden voor elke PtdE, PtdE _plasma, AAPtdE en PtdS. (Rechtsonder paneel) PTDC gebied verkregen met dezelfde bewerking parameters als de regio PtdE. Verschillende signalen aan de voet van de opvallende resonantie PTDC werden ondubbelzinnig waargenomen, terwijl zij niet kunnen worden onderscheiden in het bovenste spectrum gemaakt met exponentiële lijnverbreding (AAPtdC, PTDC _plasma, PtdC1u). Naast de momenteel toegewezen PTDC analoge, PtdC1u, verder kleine resonanties aanwezig upfield vanaf PTDC. Afkortingen: PtdIP, phosphatidylinositol fosfaat; PtdIP _2, phosphatidylinositol difosfaat; Ptda, fosfatidezuur; PtdG, fosfatidylglycerol; CL, cardiolipine; PtdE .., som van PtdE, PtdE _plasma en AAPtdE; PtdI, phosphatidylinositol. Voor verdere afkortingen zie legenda figuur 2. Overgenomen met toestemming van Lutz NW ea. (2010) Multiparametrische optimalisatie van ^31P NMR spectroscopische analyse van phospholipids in ruwe weefsel extracten. 1 Chemische shift en signaal scheiding. Anal Chem 82 (13): 5433-5440. Copyright 2010 American Chemical Society. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Oogsten en invriezen Rat Brain
Dewar voor N 2liq.; bevriezing clamp (bijvoorbeeld zelfgemaakte Wollenberger tang, refs 1 en 2 onderaan tabel.); anesthesie kamer; chirurgische schaar; scalpel; 500 ml fles met schoonmaak alcohol	1 van elke
Tang	2
1 ml spuit, 10 ml spuit	1 van elk per dier
25 G naalden	2 per dier
Voorbeeld Preparatie
Typische hoeveelheid hersenweefsel per extractie	250-350 mg
MeOH volume gebruikt in homogeniserende 250-350 mg hersenweefsel	4 ml
5 ml plastic pipet	3 per extract
10 ml plastic pipet	1 per extract
Glazen flacon (≥20 volume ml)	1 per extract
Chloroform-resistente centrifugebuis	1 per extract
Wachttijd na weefsel homogenisatie in MeOH (mengsel bij 4 ° C)	15 min
Water en CHCl3 volume hersenweefsel gehomogeniseerd in 4 ml MeOH toegevoegd	Elk 4 ml
Wachttijd na mengen gehomogeniseerd weefsel met water en CHCI3 (mengsel bij -20 ° C)	's nachts
Centrifugeren voor scheiding of waterig uit organische extract fase (glazen centrifugebuis)	13,000 xg, 40 minuten bij 4 ° C
Concentratie van CDTA oplossing (waterige fase oplosmiddelmengsel voor het oplossen geëxtraheerde lipiden)	200 mM
pH van de waterige fase van oplosmiddelmengsel voor het oplossen geëxtraheerde lipiden	7.4
Volume verhouding lipide oplosmiddel A gebruikt 31 P PL analyse (CDCI3: MeOH: CDTA oplossing)	5: 4: 1
Hoeveelheid oplosmiddel A gebruikt om lipiden geëxtraheerd uit 250 los - 350 mg hersenweefsel	700 ul
Centrifugeren te stoppen met draaien vaste deeltjes in de NMR-monster (microcentrifugebuisje)	11.000 xg gedurende 30 min bij 4 ° C
pH van NMR monster dat in water oplosbare metabolieten	7.3
Monstervolume overgedragen aan NMR-buis, na CENTRIFugation	600 ul
MDP-concentratie in coaxiale insert stam voor 31 P-NMR	20 mM
NMR experimenten
Sample temperatuur tijdens NMR experiment (ingesteld voor het minimaliseren peak overlap)	25 ° C
Spinning frequentie tijdens NMR experiment	15-20 Hz
1H NMR Acquisition Parameters
Oplosmiddel verstrekken 2 H signaal van het slot	D2O
Excitatie puls breedte, P1	11 msec
Excitatie puls, versterker demping, PL1	0 dB
FID grootte, TD	32 k
FID overname time, AQ	3.283 sec
Ontspanning vertraging D1	15 sec
Oplosmiddelonderdrukking vertraging D4	6 sec
Totale herhalingstijd, TR	24.3 sec
Spectrale breedte in ppm, SWP	12.47 ppm
Spectrale breedte in Hz, SW	4.990 Hz
Ontvangerversterking, RG	512
Oplosmiddel onderdrukking (continuous wave)	CW
Oplosmiddel onderdrukking, versterker demping, PL9	50 dB
Aantal transiënten, NS	32 of 64
31P NMR Acquisitie Parameters
Oplosmiddel verstrekken 2 H signaal van het slot	CDCl3
Excitatiepulsgetal width, P1	9,5 msec
Excitatie puls, versterker demping, PL1	4 dB
FID grootte, TD	16 k
FID acquisitietijd, AQ	2.019 sec
Ontspanning vertraging D1	15 sec
Totale herhalingstijd, TR	17 sec
Spectrale breedte in ppm, SWP	25 ppm
Spectrale breedte in Hz, SW	4.058 Hz
Ontvangerversterking, RG (maximaal)	16.384
Protonontkoppeling (samengestelde puls ontkoppeling)	CPD
Protonontkoppeling, versterker demping, PL13	19 dB
Aantal transiënten, NS	1.500 of 2.000
NMR Data Processing		1H Resolution Enhancement, Gauss-Lorentz Lineshape Transformatie
Algemene evaluatie van het spectrum (indien nodig, te optimaliseren afzonderlijk voor individuele spectrale gebieden, met behulp van 0,1 <GB <0,4, en -0.6 <LB <-0,2 Hz)	GB = 0,15, LB = -0.2 Hz
Zeer zwakke signalen, bijvoorbeeld, aromatische zuren (als alternatief voor apodisatie met LB ≥ 0,5 Hz)	GB = 0.015, LB = -0.3 Hz
Gebieden onder pieken: gebruik lineshape past voor overlappende resonanties
31 P resolutie enhancement, Gauss-Lorentz lineshape transformatie
Algemene evaluatie van het spectrum (apart te optimaliseren voor individuele spectrale gebieden, met behulp van 0,05 <GB <0,2, en -3.0 <LB <60; -1.0 Hz)	GB = 0,05, LB = -1.0 Hz
Zeer zwakke signalen, bijvoorbeeld, PtdIP 2, Ptda: apodisatie	LB = 3 Hz
Gebieden onder pieken: gebruik lineshape past voor overlappende resonanties
Referenties
1 Palladino GW, Wood JJ, Proctor HJ. Bewerkt freeze clamp techniek om weefsel assay. De Journal of chirurgische onderzoek 289, 188-190 (1980).
2 Wollenberger A, Ristau O, Schoffa G. [Een eenvoudige techniek voor zeer snel invriezen van grote stukken weefsel]. Pflugers Archiv für die gesamte Physiologie des Menschen und der Tiere 270, 399-412 (1960).

Tabel 1 Experimentele parameters voor hoge resolutie ^1H en ^31P NMR spectroscopie van hersenenweefselextracten. Typische waarden voor volume verhoudingen en concentraties van oplosmiddelen en reagentia in hersenweefsel extractie en NMR monsterbereiding gepresenteerd. Verdere richtwaarden betrekking tot pH en meettemperatuur, alsmede NMR en verwerken parameters monster. Kleine aanpassingen nodig zijn, met name indien protocol wordt toegepast op andere dan hersenweefsel. NMR parameters zijn geoptimaliseerd voor metingen op 9.4 T, en moet worden aangepast zoals nodig voor spectrometers die op verschillende magnetische veldsterktes.

Discussion

NMR spectroscopie is een efficiënte methode voor het meten van concentraties van chemische verbindingen in oplossing in een zeer reproduceerbare en accurate wijze. Echter, om kwalitatief hoogwaardige gegevens te verkrijgen is het nodig om zich te houden aan bepaalde voorschriften betreffende het monster voorbereiding en analyse. Bij het bepalen van metabolietconcentraties door NMR spectroscopie, noch de vorming of de ontvangst van het NMR signaal domineert de kwantificering fout, tenzij de intensiteit van een waargenomen signaal zal de detectiegrens (bijzonder zwak signaal). In alle andere gevallen biologische variabiliteit, de monsterbereidingstechniek (extractie-efficiëntie, fysische en chemische stabiliteit van verbindingen pipetteren en weegfouten etc.) en / of de keuze van het signaal en verwerken parameters precisie en nauwkeurigheid van de resultaten te bepalen. Uiteraard worden alle metabole veranderingen in weefsel oogst ook weerspiegeld in de metaboliet concentraties verkrijgened. Daarom is het zeer belangrijk om weefsel oogsten voltooien zo snel mogelijk, en bepaald weefsel bevriezing technieken zoals trechter bevriezen of juist in vivo concentraties snel metaboliserende verbindingen belangrijk (met name glucose, lactaat, ATP en katabolieten, ADP en AMP).

Zelfs bij de tussenliggende magnetische veldsterkte (9,4 T) van een routine hoge-resolutie NMR spectrometer uitstekende spectra worden verkregen. Bijvoorbeeld, in ^1H NMR-spectra van de waterige fase van rattenhersenen extracten signalen waarvan het verschil in chemische verschuiving, Δδ bedraagt ​​0.005 dpm (overeenkomend met 2,0 Hz 400 MHz resonantiefrequentie) ca. kunnen worden onderscheiden en afzonderlijk gekwantificeerd. Dit wordt geïllustreerd door de gedeeltelijke scheiding van (i) het lactaat en threonine wambuizen, en (ii) de alanine doublet van de kleine pieken bij zijn basis (lactaat ¹³ C satelliet doublet Figuur 1,boven). Spectrometers werken bij hogere velden (14,1 of zelfs 18,8 T) zouden resolutie en gevoeligheid verder te vergroten, hoewel deze instrumenten minder vaak in NMR laboratoria vanwege hun hoge aanschafkosten.

Met ^1H NMR spectroscopie, kan een groot aantal metabolieten gelijktijdig worden geanalyseerd, dat wil zeggen in een enkele acquisitie. De gevoeligheid van het experiment kan worden verbeterd door het aantal geaccumuleerde transiënten Hoewel hierdoor toeneemt meettijd proportioneel. (De signaal-ruisverhouding is evenredig met de vierkantswortel van het aantal overgangen.) De maximale totale opnametijd van bovenstaande protocol (20 - 30 min) voldoende voor vrijwel alle doeleinden dienen, behoudens het bedrag weefsel voor extractie is zeer beperkt. Naast het maken van de NMR-gevoelige kern (proton), metabolomic ^1H NMR spectroscopie heeft het voordeel van gerealiseerdedatabanken beschikbaar zijn voor verschillende veldsterktes en monster pH-waarde ^10. Voorts heeft de software voor automatische of semi-automatische evaluatie spectrum beschikbaar ¹⁰ zijn.

Terwijl ^1H NMR spectra van weefselextracten goed kan worden opgelost zonder toevoeging van chelerende middelen, is dit niet meer het geval voor ^31P NMR spectra. In feite, de concentratie van de chelaatvormer gebruikt (bijvoorbeeld EDTA of CDTA) heeft een belangrijke invloed op zowel lijnbreedte chemische verschuiving van ^31P NMR signalen afkomstig van gefosforyleerde metabolieten. Toenemende CDTA concentratie in een extract vermindert ^31P NMR lijndiktes, maar dit voordeel kan worden gecompenseerd door kleinere verschillen tussen de chemische verschuivingen, Δδ, van aangrenzende pieken. Daarom is de hoeveelheid chelerend middel gebruikt moet worden geoptimaliseerd voor zowel lijnbreedte chemische verschuiving samen. In lipide extracten, deze twee spectrale parameters significantly beïnvloed door de algemene monsterconcentratie, dwz de hoeveelheid weefsel geëxtraheerd, maar ook van de pH-waarde en de temperatuur van het monster tijdens de NMR meting. Bijgevolg moet elke optimalisering van meetcondities de gecombineerde effecten van alle experimentele parameters voor sommige van deze produkten niet additief verhelpen. De complexiteit van deze situatie wordt geïllustreerd door het gedrag van PL ^31P NMR spectra getoond in figuur 2. Alhoewel de laagste weefsel concentratie (118 mg / ml), de laagste temperatuur (277 K) en de hoogste CDTA concentratie (1,000 mM) getest zou resulteren in de laagste lijndikte, de voorgestelde protocol beveelt het gebruik van matige weefsel concentratie (236 mg / ml), tussentijdse CDTA concentratie (200 mm) en de kamertemperatuur (297 K) om het signaal overlappingen te voorkomen.

Hoewel de voorwaarden van monstervoorbereiding en spectrum overname van het grootste belang, derol van het spectrum verwerking parameters in het extraheren van een maximum aan informatie uit de verkregen ruwe gegevens moeten niet worden onderschat. Een bepaalde set verwerkingsparameters mijn ideaal voor het detecteren en kwantificeren van PL die bij lage concentraties; evenwel dezelfde set parameters individuele pieken in 'overvol' spectrale gebieden (figuur 3, rechtsboven) verhullen. Omgekeerd zou de verwerking parameters die een optimale resolutie verbetering in gebieden van sterk overlappende resonanties (Figuur 3, onder) een lage intensiteit pieken niet op te sporen maken. Recente ontwikkelingen, waaronder ook een uitgebreide PL ^31P NMR-database ^13,14, de analyse van de NMR-spectra ^13,14 aanzienlijk vergemakkelijken.

Uiteindelijk moet de doelstellingen van de onderliggende applicatie de criteria voor optimalisatie, dwz het gewenste evenwicht van spectrale resolutie, gevoeligheid, nauwkeurigheid van metaboliet quantificatie, snelheid, en andere factoren. Bijvoorbeeld, de aanbevolen fase voor PL analyse mogelijk betrouwbaarder en efficiënter PL kwantificatie dan tweefasensystemen (figuur 3, linksboven), en biedt een hoge spectrale resolutie alsmede voldoende gevoeligheid voor de kwantificering van minder overvloedig PL . In gevallen waarin de signaalverwerking scheiding veel hogere prioriteit dan efficiënte en nauwkeurige kwantificering, het gebruik van een hoger percentage van chloroform-d in het oplosmiddelmengsel kan worden geprobeerd, alhoewel dit gemakkelijk tot scheiding in de steekproef fase. In dat geval moet het volume van de onderste fase worden bepaald absolute PL bedragen die (PL mg, per gram weefsel of mg totaal eiwit).

In proton-ontkoppelde heteronucleaire NMR experimenten kunnen signaalintensiteiten worden veranderd door nucleair Overhauser effect (NOE), naast verzadiging door snelle acquisitie systemen. Als ongecorrigeerd deze effecten resulteren in metaboliet quantitation fouten. Er zijn twee alternatieve strategieën om te gaan met deze uitdaging. In de eerste benadering worden individuele transiënten van een overname van elkaar gescheiden door langdurige vertragingen. Deze methode vermijdt verzadiging of NOE maar leidt tot relatief lange experimenten; het moet worden gebruikt als er een nauwkeurige en betrouwbare resultaten nodig. In sommige gevallen kan prioriteit worden gegeven aan een snelle acquisitie spectrum, met name voor zeer verdunde monsters die alleen kan worden gemeten met een groot aantal passanten. In dergelijke gevallen zou de toevoeging van paramagnetische relaxatie middelen om het monster snelle data acquisitie zonder verzadiging of NOE toestaan. Als alternatief kan een snelle data-acquisitie, zonder toevoeging van paramagnetische stoffen worden gebruikt. Deze laatste methode vereist correctie van signaal gebieden door middel van correctiefactoren die moeten worden bepaald voor elke NMR resonantie, terwijl de aanwezigheid van ontspanning agenten veroorzaakt sommige verbreding van NMR signalen die de precisie van metaboliet kwantificatie kan verminderen voor hebbendruk spectrale gebieden. In het algemeen is de optimale keuze van experimentele omstandigheden niet alleen bepaald door het type monster, maar ook door de informatie van een experiment worden ¹³ geëxtraheerd. Indien hoge prioriteit worden gegeven aan een snelle analyse nogal overvloedig metabolieten, zonder de noodzaak voor hoge precisie en nauwkeurigheid, kan het voldoende om zeer geconcentreerde monsters te meten en te gebruiken korte herhalingstijden, eventueel met paramagnetische relaxatie middel toegevoegd aan het monster. Indien daarentegen accurate kwantificering van een groot aantal metabolieten belangrijker dan snelheid, het de voorkeur om minder geconcentreerde extracten gebruikt en geaccepteerd lange NMR opnametijden, zoals blijkt uit de hier gepresenteerde protocol. Bovendien, als een specifiek onderzoek benadrukt specifieke metabolieten, experimentele omstandigheden worden aangepast om optimale spectrale resolutie voor de spectrale gebieden te verwezenlijken. Het protocol en de discussie hier gepresenteerd kan als leidraad voor de o dienenptimization van metabolomic analyse van ruwe weefsel extracten met behulp van NMR spectroscopie.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane	Virbac	Vetflurane	Anesthetic for animals
Isoflurane vaporizer	Ohmeda	Isotec 3	Newer model available: Isotec 4
Scalpel, scissors, forceps, clamps	Harvard Apparatus Fisher Scientific	various various	Surgical equipment for animals
Freeze-clamp tool	homebuilt	n/a	Tong with aluminium plates, to be inserted in liquid nitrogen for cooling
Dewar	Nalgene	4150-4000
Liquid nitrogen	Air Liquide	n/a
Nitrogen gas	Air Liquide	n/a
Nitrogen evaporator	Organomation Associates	N-EVAP 111	Can be replaced by homebuilt device
Mortar	Sigma-Aldrich	Z247472
Pestle	Sigma-Aldrich	Z247510
Tissue homogenizer	Kinematica	Polytron	With test tubes fitting homogenizer shaft
Electronic scale	Sartorius	n/a
Methanol	Sigma-Aldrich	M3641
Chloroform	Sigma-Aldrich	366910
Glass centrifuge tubes	Kimble	45500-15, 45500-30	Kimax 15 ml, 30 ml tube
Microcentrifuge tubes	Kimble	45150-2	Kimax 2 ml tube; should replace "Eppendorf" tube if compatible with centrifuge rotor
Polystyrene pipettes	Costar Corning	Stripettes	5 and 10 ml volumes
Deuterochloroform	Sigma-Aldrich	431915	99.96% deuterated
Deuterium oxide	Sigma-Aldrich	423459	99.96% deuterated
Deuterium chloride	Alpha Aesar	42406	20% in deuterium oxide
Sodium deuteroxide	Sigma-Aldrich	164488	30% in deuterium oxide
Lyophilizer	Christ	Alpha 1-2
Cold centrifuge	Heraeus	Megafuge 16R
pH meter	Eutech Cybernetics	Cyberscan
CDTA	Sigma-Aldrich	D0922
Cesium hydroxide	Sigma-Aldrich	516988
NMR tubes	Wilmad	528-PP
NMR stem coaxial insert	Sigma-Aldrich	Z278513	By Wilmad
NMR pipettes	Sigma-Aldrich	Z255688
Pipettes	Eppendorf	Research	With tips for volumes from 0.5 to 1,000 μl
Pipet-Aid	Drummond	XP
NMR spectrometer	Bruker	AVANCE 400	including probe and other accessories
NMR software	Bruker	TopSpin 1.3	newer version available: Topspin 3.2
Water-soluble standard compounds	Sigma-Aldrich	various
Phospholipid standard compounds	Avanti Polar Lipids Doosan Serdary Sigma-Aldrich	various various various	Source for plasmalogens, but may be <70 - 80% purity
Methylenediphosphonate	Sigma-Aldrich	M9508
TSP-d4	Sigma-Aldrich	269913