Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Sekvens-spesifikk merking av nukleinsyrer og proteiner med metyltransferaser og kofaktor analoger

Published: November 22, 2014 doi: 10.3791/52014
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1
1Institute of Organic Chemistry, Department of Chemistry, RWTH Aachen University
* These authors contributed equally

Summary

DNA og proteiner er sekvens-spesifikt merket med affinitet eller fluorescerende reporter grupper som bruker DNA eller protein metyltransferaser og syntetiske kofaktor analoger. Avhengig av kofaktor spesifisiteten av enzymer, aziridin eller dobbelt aktiverte kofaktor-analoger anvendes for en- eller to-trinns merking.

Abstract

S -Adenosyl-L-methionin (AdoMet) -avhengige eller SAM metyltransferaser (MTAse) katalyserer overføringen av den aktiverte metylgruppen fra AdoMet til bestemte stillinger i DNA, RNA, proteiner og små biomolekyler. Denne naturlige metyleringen kan utvides til et bredt utvalg av alkyleringsreaksjoner ved bruk av syntetiske analoger kofaktor. Utskifting av den reaktive sulfonium sentrum av AdoMet med et aziridin ringen fører til kofaktorer som kan kobles sammen med DNA ved hjelp av forskjellige DNA MTases. Disse azidirin kofaktorer kan utstyres med reporter grupper på forskjellige posisjoner på adeninenheten og brukes for S equence spesifikke M ethyltransferase- jeg nduced L abel ing av DNA (smilende DNA). Som et typisk eksempel gir vi en protokoll for biotinylering av pBR322 plasmid DNA i 5'-ATCG A-T-3 'sekvensen med DNA MTAse M.BseCI og aziridinet kofaktor i 6BAzett trinn. Forlengelse av den aktiverte metylgruppe med umettede alkylgrupper resulterer i en annen klasse av AdoMet-analoger som brukes for m ethyltransferase rettet T ransfer av A ctivated G roups (mTAG). Siden de utvidede sidekjeder blir aktivert av sulfonium sentrum og umettet binding, er disse kofaktorer kalles dobbelt-aktiverte AdoMet-analoger. Disse analoger ikke bare fungere som kofaktorer for DNA MTases, som aziridinet kofaktorer, men også for RNA, protein og små molekyl MTases. De blir vanligvis anvendt for enzymatisk modifisering av MTAse-substrater med unike funksjonelle grupper som er markert med rapportørgrupper i en andre kjemisk trinn. Dette er eksemplifisert i en protokoll for fluorescens-merking av histon H3-protein. En liten propargylgruppe overføres fra kofaktor analog SeAdoYn til proteinet av histon H3-lysin 4 (H3K4) MTAse Set7 / 9 etterfulgt av klikk-merking avalkynylated histon H3 med TAMRA azide. MTAse-mediert merking med kofaktor analoger er en slik teknologi for mange spennende bruksområder, inkludert identifisering og funksjonell studie av MTAse underlag samt DNA genotyping og metylering deteksjon.

Introduction

Særlig merking av nukleinsyrer 1,2 og proteiner 3,4 er av stor interesse for funksjonelle karakteristikker, medisinsk diagnose og (nano) bioteknologi. Her presenterer vi en enzymatisk merking metode for disse biopolymerer som er basert på S -adenosyl-l-metionin (AdoMet eller SAM) -avhengige metyltransferaser (MTases). Denne klassen av enzymer (EC 2.1.1.) Er rettet mot individuelle nukleofile posisjoner (nitrogen, oksygen, svovel og karbonatomer) innenfor bestemte rester av nukleinsyrer og proteiner og naturlig overfører den aktiverte metylgruppe av kofaktor AdoMet (figur 1A) 5. I tillegg kan MTases utnytte syntetiske kofaktor analoger til spesifikk merking med affinitet koder, fluoroforene eller andre etiketter (Figur 1b) 6. To klasser av AdoMet analoger har blitt utviklet: Aziridine kofaktorer for S equence spesifikke M ethyltransferase- jeg L abel ing (smilende) 7 og doble aktivert AdoMet analoger til m ethyltransferase styrt T ransfer av A ctivated G roups (mTAG) 8.

Figur 1
Figur 1: reaksjoner katalysert av metyltransferaser (MTases) A. Metyl-gruppen overføring fra den naturlige kofaktor AdoMet (SAM) til forskjellige substrater, inkludert DNA, RNA, proteiner og små biomolekyler B. Merking / funksjonalisering av nukleinsyrer og proteiner (NNNNN =.. basepar av DNA-nukleotider, for RNA- og aminosyrer til proteiner; XXXXX = gjenkjennelsessekvensen av MTAse med target rest i grønt) med syntetiske analoger kofaktor. Azidirin kofaktorer som inneholder en reporter gruppe (blå sfære)festet til adenin-ringen er sekvensen spesielt kombinert med målet residuet (til venstre) og dobbelt-aktivert AdoMet analoger fører til overføring av lengre alkylkjeder som bærer en kjemisk reporter Y (til høyre), som kan merkes ved å bioorthogonal klikk reaksjon i et annet trinn. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Azidirin kofaktorer fungerer best med DNA MTases. De inneholder en tre-leddet ring med et nitrogenatom 9 (eller et N -mustard 10,11) i stedet for sulfonium senter som reaktiv gruppe. Protonering av dette nitrogenatom aktiverer Åziridinringen for nukleofilt angrep av target-nukleotid som fører til kovalent kobling av hele kofaktor med DNA. Ved å feste rapportørgrupper til adenin ringen aziridinet kofaktorer kan brukes i kombinasjon med DNA-MTases å merke DNA i ett trinn ( g> Figur 1B, venstre) 7,12. Dette er vist i detalj for biotinylering av DNA med 6BAz 13-15 (aziridin kofaktor med biotin festet til 6 stillingen av adenin-ring) og adenin-spesifikk DNA MTAse fra Bacillus stearothermophilus (M.BseCI) 16 (figur 2, se protokoll seksjon 2: Ett-trinns merking av DNA via azidirin kofaktorer). I tillegg til M.BseCI (5'-ATCG A-T-3 'gjenkjenningssekvens), DNA MTases fra Thermus aquaticus (M.TaqI, 5'-TCG A -3'), fra Haemophilus heamolyticus (M.HhaI, 5 '-G C GC-3') og fra Spiroplasma (M.SssI, 5'-G C-3 ") har blitt brukt til å biotinylere DNA med 6BAz 17. Videre kan azidirin kofaktorer være ansatt for ett-trinns fluorescens DNA merking 18,19.

ontent "fo: keep-together.within-side =" always "> Figur 2
Fig. 2: Sekvens spesifikk ett-trinns biotinylering av DNA med M.BseCI og 6BAz DNA MTAse M.BseCI gjenkjenner dobbeltkjedet DNA-sekvens 5'-ATCG A-T-3 'og naturligvis methylates aminogruppen av den andre adenin Residuet (grønn) ved hjelp av AdoMet. Med aziridinet kofaktor 6BAz løpet av reaksjonen endres og M.BseCI fører til sekvensere spesifikk DNA biotinylering ved å koble hele kofaktor inkludert biotin (blå) med målet adenin. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Doble aktivert AdoMet analoger inneholder utvidet umettede sidekjeder i stedet for en metylgruppe på sulfonium sentrum (Figur 1B 20. Den umettede dobbelt- eller trippelbinding i β-stilling til sulfonium midt elektronisk kompenserer ugunstige steriske effekter i overgangstilstanden ved konjugativt stabilisering. Siden både sulfonium sentrum og umettet binding aktivere sidekjeden for enzymatisk overføring, ble disse kofaktorer heter dobbel-aktiverte AdoMet analoger. Vanligvis blir de brukt til å overføre sidekjeder med unike kjemiske grupper (kjemiske journalister), som amino, alkyn og azid grupper, for chemo-selektiv merking i et andre trinn 8,21. Generelt, dobbel-aktivert AdoMet analoger kan ikke bare fungere som kofaktorer for DNA MTases 8,20,21 men også for RNA MTases 22,23 og protein MTases 24-28 tillater ytterligere merking av RNA og proteiner. Men de utvidede sidekjedene er sterisk mer krevende enn en metylgruppe og utvide den MTAse aktive områder ved protein engineering er oftno nødvendig for å oppnå effektiv overføringshastigheter. En annen løsning på dette problemet er å bruke en AdoMet analog med en liten propargylgruppe (tre karboner), hvor terminalen alkyn tjener to funksjoner: 1. Stabilisering av overgangstilstanden ved enzymatisk overføring og 2. reaktiv håndtak for følgende kjemiske modifiseringer av kobber katalysert azid-alkyn cykloaddisjon (CuAAC) klikk kjemi. Det viste seg at den resulterende propargylalkoholer AdoMet analog 29 er ganske ustabil under nøytrale eller svakt basiske betingelser, og kun av begrenset nytte. Denne ulempen kan bli løst ved å erstatte svovelatomet med selen. Den resulterende kofaktor 5 '- [(Se) [(3 S) -3-amino-3-karboksypropyl] prop-2-ynylselenonio] -5'-deoksyadenosin (SeAdoYn, figur 3) er akseptert av villtype DNA, RNA og protein MTases 30-32 som opphever behovet for protein engineering i mange tilfeller. Dette eksemplifiseres ved fluorescens pro tein merking med histon H3 lysin 4 (H3K4) MTAse Set7 / 9 33 (figur 3, se protokoll seksjon 3: To-trinns protein merking via doble aktiverte kofaktorer).

Figur 3
Fig. 3: Sekvens-spesifikke to-trinns fluorescens-merking av histon H3 med Set7 / 9, SeAdoYn og TAMRA azid Proteinet MTAse Set7 / 9 naturlig methylates aminogruppen av lysin 4 i histon H3 (H3K4, grønn) ved hjelp av AdoMet. Med den dobbeltaktiverte kofaktor SeAdoYn den MTAse overfører en liten propargylgruppe (rød) til lysinresten. Vedlagte terminal trippelbinding er så selektivt modifiseres i en bioorthogonal klikk reaksjon (kobber-katalysert azid-alkyn cykloaddisjon, CuAAC) med azid-avledede TAMRA (tetramethylrhodamine, blå) fluorophore.belastning / 52014 / 52014fig3highres.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Generelle instruksjoner

  1. Butikk aziridin kofaktor 6BAz (i DMSO) og protein MTAse Set7 / 9 ved -80 ° C og alle andre reagenser inklusive dobbeltaktiverte kofaktor SeAdoYn og DNA MTAse M.BseCI (i 50% glycerol) ved -20 ° C.
  2. Bestemme konsentrasjonen av 6BAz og SeAdoYn via UV / Vis-spektroskopi ved bruk av ekstinksjonskoeffisientene ε 269nm (6BAz) = 16,000 cm -1 -1 M og ε 260nm (SeAdoYn) = 15,400 cm -1 -1 M i avionisert vann. Bestemme konsentrasjonen av MTases ved Bradford-assay eller, hvis ekstinksjonskoeffisienten er tilgjengelig, via direkte absorpsjon ved 280 nm.
  3. Prøv å unngå å skape bobler ved intensiv pipettering eller virvling å hindre tap av enzymaktivitet. Isteden blandes ved forsiktig pipettering opp og ned.
  4. Når du legger azidirin kofaktorer fra lager løsninger i DMSO sørge for at endelig DMSO konsentrasjonen i analysen er mindreenn 5%. Alltid inneholde 10 mM magnesium-ioner i analysebufferen til å hindre at ikke-spesifikke reaksjoner med DNA.
  5. Ved tilsetning av dobbelt aktiverte kofaktorer fra sure stamløsninger bruker små volumer (sterkt konsentrerte stamløsninger) for å unngå pH-endringer og sørge for at pH-verdien i analyseoppløsning ikke endrer seg vesentlig. Unngå tioler, for eksempel β-mercaptoethanol eller dithiothreitol (DTT), i analysebuffer fordi de kan forstyrre med å klikke reaksjon ved kompleks av de nødvendige kobberioner.

2. Ett-trinns Merking av DNA via Aziridine kofaktorer

  1. Sekvens-spesifikk metyltransferase-Induced Etikett ing (smilende) av plasmid DNA med M.BseCI DNA MTAse og aziridin kofaktor 6BAz.
    1. Tine kofaktor-løsning ved 20 ° C og klar reaksjonsblandingene på is.
    2. I tillegg til å utføre en assay "kofaktor" kontroll, for å visualisere noen ikke-spesifikke modifikasjoner, og en & #8220; enzymet "kontroll, for å være sikker på at den MTAse forberedelse er fri for den naturlige kofaktor AdoMet.
    3. For analyseblandingen 2 ul av 10 x modifikasjon buffer (inneholdende 100 mM Tris-HCl, 100 mM MgCl2, 20 mM β-merkaptoetanol, pH 7,4), 2 pl av pBR322 (0,5 pg / pl), 10 ekv. M.BseCI per gjenkjenningssekvensen i DNA (en gjenkjennelsessekvens i pBR322) og aziridinet kofaktor 6BAz til en sluttkonsentrasjon på 60 uM i et totalvolum på 20 ul. Legg kofaktor og DNA MTAse sist.
      MERK: β-Mercaptoethanol er giftig, etsende og miljøskadelig.
    4. For "kofaktor" kontroll legge avionisert vann i stedet for M.BseCI og for "enzym" kontroll legge avionisert vann i stedet for 6BAz.
    5. Bland løsninger ved forsiktig pipettering opp og ned.
    6. Inkuber rørene ved 55 ° C i 1 time.
    7. Sentrifuger lett for å samle all væske ved bunnen av rørene.
  2. Restriction-modifikasjon analyse for å bekrefte DNA modifisering.
    1. Fremstille en oppløsning ved å blande 10 pl 10x R.TaqI buffer (inneholdende 100 mM Tris-HCl, 50 mM MgCl2, 1 M NaCl, 1 mg / ml bovint serumalbumin, pH 8,0), 80 ul avionisert vann og 3,3 pl av restriksjonsendonuklease (REase) fra Thermus aquaticus (R.TaqI, 10 U / mikroliter). Sørg for å legge til REase i det siste trinnet.
    2. Til hvert rør fra 2.1.7 tilsett 2 mL av 10x R. Taql buffer og 28 mL av løsningen fra ovenfor (2.2.1).
    3. Bland løsninger ved forsiktig pipettering opp og ned.
    4. Inkuber rørene ved 65 ° C i 30 min.
    5. Sentrifuger lett for å samle all væske ved bunnen av rørene.
  3. Electro shift-analysen (EMSA) med streptavidin å verifisere funksjonelle endringer.
    1. Fjern 25 ul fra hvert rør (2.2.5) og tilsett 2,4 mL av en streptavidin-oppløsning (1 mM med hensyn til streptavidin monomer i streptavidin-buffer inneholdende 100 mM Na HPO 2 4, 100 mM NaCl, pH 7,5; 4 ekvivalenter av samlet biotin). Legg 2,4 ul streptavidin-buffer til de gjenværende rør.
    2. Inkuber alle rør ved 37 ° C i 1 time.
  4. Analyse via agarosegel-elektroforese.
    1. Tilsett 5 ul av 6x ladningsbuffer (0,25% bromfenol blå, 30% glyserol) til hvert rør.
    2. Bland løsningene forsiktig.
    3. Lasten 10 ul av hver prøve til brønnene av en agarosegel (1% agarose i 0,5x TBE-buffer inneholdende 1 x GelRed fra en 10,000x stamløsning).
    4. Kjør gel i 0,5x TBE buffer med 80 V for ca. 1 time.
    5. Visualisere DNA-bånd på en UV-tabell (312 nm) med et CCD-kamera utstyrt med et filter (540 ± 50 nm).
      MERK: UV-lys er skadelig for øynene og huden.

3. To-trinns Protein Merking via Double Aktivert kofaktorer

  1. Methyltransfviske-Regissert Overføring av Aktivert grupper (mTAG) med Set7 / 9 og dobbelt aktivert kofaktor SeAdoYn for histon H3 lysin fire merking (modifikasjon trinn).
    1. Tine komponentene og forberede reaksjonsblandingene på is. MERK: Ha alltid SeAdoYn avkjølt for å unngå degradering.
    2. I tillegg til å utføre en assay "kofaktor" kontroll, for å visualisere noen ikke-spesifikke modifikasjoner, og en "enzym" kontroll, for å utelukke uspesifikke reaksjoner av den fluorescerende probe.
    3. Tilbered en analyseløsning (20 ul) inneholdende modifikasjon buffer (50 mM Tris-HCl, 5% glycerol, pH 8,5), 10 uM histon H3, 10 pM Set7 / 9 og 600 uM SeAdoYn (blanding av begge epimerer ved selen). I de siste trinnene legge kofaktor og deretter MTAse.
    4. For "kofaktor" kontroll fremstille en analyseoppløsning som i 3.1.3 og tilsett 60 mM AdoMet til å konkurrere med den syntetiske kofaktor. For "enzym" kontroll legge avionisert vann i stedet for SeAdoYn.
    5. Bland løsninger ved langsomt å pipettere opp og ned. Kontroller pH-verdien ved tilsetning av 1 pl av hver oppløsning til den øvre felt av en pH-strimmel (pH-område 5-10).
    6. Inkuber ved 37 ° C i 2 timer.
    7. I mellomtiden fremstille en 12% SDS-polyakrylamidgel (rennende gel: 357 mM Bis-Tris, pH 6,5 til 6,8, 0,1% (w / v) APS, 0,04% (v / v) TEMED og 12% akrylamid / bisakrylamid 37.5: 1 ; lasting gel: 357 mM Bis-Tris, pH 6,5 til 6,8, 0,1% (w / v) APS, 0,04% (v / v) TEMED og 5% akrylamid / bisakrylamid 37,5: 1).
      MERK: Akrylamid / akrylamid er giftig og helsefarlig. Bruk hansker under denne prosedyren.
  2. Kjemisk merking av alkinylated lysin 4 i histon H3 via kobber-katalysert azid-alkyn cykloaddisjon (CuAAC) (merking trinn).
    1. Like før slutten av modifikasjonsreaksjon fremstille en 5x klikk blanding inneholdende 3 mM CuSO4, 3 mM tris (3-hydroksypropyl-triazolylmetyl) amin (THPTA), 250 mM natriumaskorbat og 6 mM TAMRA azid med entotalvolum på 20 ul.
    2. Tilsett 5 mL av nylaget 5x klikk mix til hvert rør for å starte CuAAC og slukke modifikasjon reaksjon.
    3. Bland forsiktig ved å pipettere opp og ned.
    4. Beskytt alle rør med aluminiumsfolie mot lys for å unngå foto bleking av fluorophore.
    5. Inkuber ved 20 ° C i 1 time.
  3. Proteinutfelling å fjerne overskudd av gratis TAMRA fluorophore.
    1. For å unngå outshining av fluorescerende merket histon H3 ved intensiv i-gel fluorescens av gratis TAMRA fluorophore, fjerne overflødig fluorophore ved utfelling av proteiner (3.3.2 - 3.3.4) 34.
    2. Legg 75 mL metanol, 18,8 mL kloroform og 50 mL deionisert vann til hvert rør og vortex kort etter hver tilsetning. Sentrifuger ved 16000 x g i 5 min. Fjern det øvre fase uten å forstyrre grensesnittlaget, som inneholder protein.
    3. Legg 56.3 mL metanol til den gjenværende fase jegn hvert rør, vortex og sentrifuger ved 16 000 xg i 5 minutter for å pelletere protein. Fjern supernatanten. Gjenta dette trinnet for å vaske pelleten.
    4. Dekke de åpne rør med en lofri vev og la dem tørke i 15-30 min.
  4. Analyse via SDS PAGE.
    1. Oppløse de utfelte proteiner fra 3.3.4 i 20 ul SDS applikasjonsbuffer (50 mM Tris-HCl, 2,5% (w / v) SDS, 10% (v / v) glycerol, 320 mM β-merkaptoetanol og 0,05% (w / v) bromfenolblått, pH 6,8). Sørg for å løse opp pellet ved å skylle veggene i rørene med en pipette.
    2. Inkuber prøvene ved 95 ° C i 10 minutter, og la dem avkjøles til 20 ° C.
    3. Sentrifuger lett for å samle all væske ved bunnen av rørene.
    4. Laste hele mengden av hver prøve i brønner på en SDS-polyakrylamid gel (3.1.7). Bruke 50 mM MOPS, 50 mM Tris-X (Tris-base), 5 mM EDTA, 0,1% (w / v) SDS som buffer for elektroforese.
    5. Kjør gel med 120 V for ca. 90 min.
    6. Visualisere in-gel fluorescens på en UV-tabell (312 nm) med et CCD-kamera utstyrt med et filter (540 nm ± 50 nm).
      MERK: UV-lys er skadelig for øynene og huden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ett-trinns Merking av DNA via Aziridine kofaktorer

Dette eksempel reaksjonen utføres med DNA MTAse M.BseCI, som modifiserer den andre adeninrest i dobbeltkjedet 5'-ATCG A-T-3 'sekvensen og har en gjenkjenningssete på pBR322-plasmid (figur 4A). For å teste plasmid merking, er pBR322 utfordret med restriksjonsendonuklease (REase) R.TaqI (5'-TCGA-3 '). R.TaqI har sju steder på pBR322, hvorav den ene er inkludert i M.BseCI nettstedet. Hvis merkingen skjer, vil M.BseCI området beskyttes mot spaltning og et nytt fragment med 683 basepar (bp) vil danne mens to andre fragmenter vil forsvinne (315 og 368 bp). Selvfølgelig, når analysere DNA merking med andre DNA MTases forskjellige REases med tilsvarende anerkjennelse sekvenser bør benyttes.

Den agarosegel i Figur 4B viser tydelig visesgen av et nytt fragment med 683 bp (felt 3). Dette viser at merkingen av den M.BseCI området inntraff. Bare analysen (kolonne 3) viser dette fragment. Den "kofaktor" kontroll (felt 5), så vel som "enzym" kontroll (felt 7) mangler dette båndet. Spesielt "enzym" kontroll er viktig fordi det viser at den naturlige kofaktor AdoMet er ikke tilstede i enzympreparatet. Spesifisitet av merkingsreaksjonen er demonstrert av electro skift analyse (EMSA) ved tilsetning av streptavidin (figur 4B og 4C i detalj). Electro av 683 bp er tilbakestående, mens mobiliteten til alle andre fragmenter uten M.BseCI nettstedet er uendret sammenlignet med kontroller (sammenligne kjørefelt 4 med baner 6 og 8).

Figur 4
Figur 4: Sekvensspesifikk biotinylering av pBR322 plasmid DNA med M.BseCI og 6BAz. A. Plasmid kart over pBR322 viser anerkjennelse nettsteder for M.BseCI (rød) og R.TaqI (grønn) samt lengden av forventede DNA-fragmenter i basepar (bp) etter begrensning med R.TaqI. B. Analyse av DNA fragmentering og EMSA ved agarosegel-elektroforese. M = Marker, baner 1 og 2: plasmid DNA bare, felt 3 og 4: assay, baner 5 og 6: 'kofaktor' kontroll, kolonnene 7 og 8: "enzym 'kontroll. Lanes 2, 4, 6 og 8 inneholder i tillegg streptavidin. C. Forstørret innfelt fra B. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

To-trinns Merking av proteiner via Double Aktivert kofaktorer

Som et eksempel for to-trinns merking av MTAse substrater med dobbeltaktiverte AdoMet analoger valgte vi histonH3 lysin 4 (H3K4) MTAse Set7 / 9 og den lille SeAdoYn kofaktor. Etter enzymatisk overføring av den aktiverte propargylgruppe til histon H3 substrat (første trinn), blir terminalen alkyn kjemisk merket med et azid-modifisert TAMRA fluoroforen av CuAAC klikk kjemi (andre trinn) (sammenlign figur 3). Analyse av merkingsreaksjonen utføres ved hjelp av SDS-PAGE og i-gel fluorescens deteksjon (figur 5A). Analysen (kolonne 1) viser et fluorescerende bånd tilsvarende histon H3 angir at sidekjeden av kofaktor ble overført, og det modifiserte protein merket med fluorofor TAMRA. Ingen band er synlig i "kofaktor" og "enzym" kontroller (sporene 2 og 3) viser at merking av histon H3 er mediert av MTAse. Derfor, ikke-spesifikk kjemisk merking enten av kofaktor alene (første trinn) eller i løpet av CuAAC (andre trinn) kan utelukkes. Den "kofaktor" kontroll utføres differently enn i protokollen for ett-trinns DNA-merking. Dette er fordi utfelling av histon H3 er mer effektive i nærvær av Set7 / 9 og utelatelse av protein MTAse kan føre til reduserte mengder av histon H3 i lastekontroll. Således, tilsatte vi en høy konsentrasjon av den naturlige kofaktor AdoMet til å konkurrere med SeAdoYn. Lasting av histon H3 kan enkelt kontrolleres ved farging gelen med Coomassie Blå etter fluorescensdeteksjon.

MTAse-substrater kan også bli merket med biotin i stedet for ved hjelp av fluoroforer azid-derivatisert biotin i andre kjemiske trinn 30. Biotinylering av proteiner er beleilig analysert ved Western blotting med pepperrot-peroksidase-konjugert avidin. Dette er vist i figur 5B for biotinylering av histon H3 med Set7 / 9, SeAdoYn og azid-modifisert biotin. Analysen i kjørefelt 1 viser en klar band for den merkede histon H3. Fraværet av båndene i "enzym" (kolonne 2)og "kofaktor" kontroll (spor 3) demonstrerer igjen at merking er spesifikk for MTAse. Den "kofaktor" kontrollen blir ganske enkelt utføres i fravær av protein MTAse fordi Western blot-analyse krever ikke fjerning av overskudd av biotin med proteinutfelling.

Figur 5
Figur 5: Merking av histon H3 med protein MTAse Set7 / 9 og SeAdoYn fulgt av klikk reaksjoner med azid-derivatiseres etiketter. A. I-gel fluorescens av TAMRA-merket histon H3 og kontroller, samt farging med Coomassie blå for lasting kontroll. B. Western blot analyse av biotinylert histon H3 og kontroller ved hjelp av avidin-pepperrot (HRP) konjugat. Eksperimentelle forholdene var svært like de for fluorescens merking i A (enzymatisk modifikasjon: 6.581; M histon H3, 10 pM Set7 / 9, 600 pM SeAdoYn, i 50 mM Tris-HCl, 5 mM MgCl2, 5% glycerol, pH 9,0, 30 ° C, 3 timer; kjemisk merking.: 0,6 mM CuSO4, 0,6 mM THPTA, 50 mM natrium askorbat, 1,2 mM biotin-azidet, 37 ° C, 1 time) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ett-trinns merking av DNA med DNA MTases og azidirin kofaktorer (smilende DNA) er en robust metode, men noen aspekter bør vurderes når du planlegger forsøket.

Aziridine kofaktor: The 6BAz konsentrasjon for DNA merking med M.BseCI var 60 mikrometer. Ved bruk av andre DNA MTases kofaktor konsentrasjonen skal være optimalisert, f.eks konsentrasjoner så lavt som 20 mikrometer har vært ansatt med DNA MTAse M.TaqI 19. Lave konsentrasjoner 6BAz har den fordel at en fire overskudd av streptavidin (bindingssteder med hensyn til hele mengden av biotin i analysen) kan tilsettes direkte etter inkubasjon med REase uten å forstyrre analysen av EMSA. Hvis ikke det biotinylerte DNA blir renset for å fjerne overskudd av kofaktor og unngå smearing av DNA under agarosegel-elektroforese. Når du legger azidirin kofaktorer fra lager løsninger i DMSO være sikker på at den endelige DMSO konsentrasjon i the analysen er mindre enn 5%. For mye DMSO kan inaktivere enzymer. Oppbevar alltid azidirin kofaktorer ved -80 ° C for å unngå degradering.

DNA MTAse: Enzymatisk kobling av aziridin kofaktorer med DNA kan føre til sterke produkt inhibitorer og DNA MTases må benyttes i støkiometriske mengder. Derfor alltid bruke mer enn en tilsvarende DNA MTAse. De fleste DNA MTases copurify med bundet AdoMet som trenger å bli fjernet ved omfattende dialyse eller vasking av enzymer på en kolonne med store volumer av buffer. Den "enzym" kontroll vil si hvorvidt AdoMet fremdeles er til stede i enzympreparatet. Merking med M.BseCI kan også gjøres ved inkubering over natten ved 37 ° C.

Modifikasjon buffer: Ta 10 mM magnesium-ioner i bufferen for å hindre at ikke-spesifikke reaksjoner av aziridin kofaktorer med DNA. Hvis magnesiumioner fører til aktivering av forurensende nukleaser, kan bariumioner tilsettes i stedet.

For sekvensen spesifikk merking av DNA ikke bare smilende DNA, men også mTAG kan benyttes. Her dobbelt aktiverte kofaktorer anvendes for enzymatisk overføring av sidekjeder med unike funksjonelle grupper i DNA. Disse funksjonelle grupper, for eksempel primære aminer, kan endres med en rekke forskjellige reportergrupper, inkludert biotin eller fluoroforer, av NHS-ester kjemi i et andre trinn 8,35,36. Alternativt vi har begynt å syntetisere doble aktivert AdoMet analoger med store sidekjeder som allerede inneholder reporteren gruppen og brukte dem for DNA-merking i ett trinn.

Den to-trinns mTAG merkningsmetode for proteiner med dobbelt aktivert kofaktor SeAdoYn har blitt brukt med en rekke protein MTases 30,31. Imidlertid bør følgende kommentarer bli vurdert før du utfører forsøket.

Dobbel aktivert kofaktor: Disse kofaktorer, inkludert havetdoYn, lagres under sure betingelser, og man må være omhyggelig med at pH-verdien for modifisering løsning ikke i vesentlig grad endrer ved tilsetning kofaktor. Vi kontrollerer alltid pH ved å tilsette en ul av modifikasjonsløsning til en pH-strimmel, og hvis pH er for lav, tilsette små mengder av natrium-hydroksyd-oppløsning (50 mM) for å justere pH. I tillegg kofaktor analoger bør tilsettes i et lite volum for å unngå pH-endringer. Således bør minimale konsentrasjoner kofaktor som er nødvendig for fullstendig modifikasjon bestemmes for andre MTases og høykonsentrerte kofaktor stamløsninger er foretrukket. Kofaktor konsentrasjoner er vanligvis variert mellom 10 mikrometer og 600 mikrometer. Den kjemiske syntese av dobbeltaktiverte kofaktorer typisk gir en tilnærmet 1: 1 blanding av epimerer ved svovel eller selen, og separering av det biologisk aktive epimer, svarende til S -epimer av AdoMet, fra inaktiv epimer er ofte vanskelig å oppnå. Dermed kofaktor konsentrasjonervanligvis gitt for en blanding av isomerer. Doble aktiverte kofaktor analoger er ganske ustabil ved romtemperatur og bør lagres ved -20 ° C. Pass også på å tine lagerløsninger på is og holde dem kalde under pipettering. De kan fryses igjen, men for å sikre reproduserbar aktivitet vi anbefaler å gjøre tilsetningene.

Protein MTAse: For transformasjoner med doble aktivert kofaktorer de MTases kan brukes i katalytiske mengder. Men MTases er ofte trege enzymer med omsetningstall i min -1-serie med naturlig kofaktor AdoMet. Av praktiske grunner vi bruker ofte MTases i støkiometriske mengder og minimere inkubasjonstid og temperatur (vanligvis 10 minutter til 2 timer og 20 ° C til 37 ° C). Den "kofaktor" kontroll varierer, avhengig av hvilken type rapportørgruppe og deteksjon. For biotin merking av MTAse er rett og slett utelates og analyse kan utføres ved hjelp av Western blotting (figur 5B (figur 5A). Men hvis utfelling av histon H3 fører til tap av protein, SDS-PAGE kan utvides og overskudd av gratis TAMRA fluorophore vil kjøre ut av gelen med bromfenolblått foran.

Modifikasjon buffer: Den optimale enzymbuffer kan anvendes, men tioler, for eksempel ditiotreitol (DTT) og β-merkaptoetanol, bør unngås. De binder seg til kobberioner og b låse følgende CuAAC klikk reaksjon.

CuAAC klikk reaksjon: Den endelige konsentrasjon av TAMRA azid bør være to ganger så høy som den alkyn konsentrasjon. Ved bruk av biologiske ekstrakter konsentrasjonen av kobber og ligand bør økes opp til 5 mm hver. TAMRA azid er bedre løselig i DMSO enn i vann. Pass på at den endelige konsentrasjonen av DMSO er mindre enn 12%. Utvidet inkuberingstider kan føre til skader protein og utglidning på SDS polyakrylamid gel. Således bør merkingsreaksjonen være enten stoppet ved proteinutfelling eller tilsetning av tioler.

Denne to-trinns merking fremgangsmåten kan også brukes til å merke proteiner MTAse substrater med biotin enten for Western blot-påvisning (figur 5B) eller isolering med streptavidin-belagte magnetiske kuler. I tillegg kan doble aktiverte AdoMet analoger brukes til å merke DNA, RNA og små naturlige produkter med tilsvarende MTases.

ve_content "> Sammenlignet med de fleste andre metoder for merking av nukleinsyrer og proteiner, har MTAse-mediert merking den fordel at det opprinnelige substrater kan brukes direkte og uten ytterligere modifikasjon er nødvendig. Selvfølgelig må man passe på at de naturlige substrater ikke er blokkert ved metylering gjennom en tilsvarende MTAse in vivo. I tillegg er MTAse-mediert merking meget fleksibel både i form av rapportørgrupper, som inkluderer biotin, fluoroforer eller andre molekylære tagger, samt mål for MTases. REBASE, en data base for begrensning endonucleases og DNA MTases, viser mer enn 700 eksperimentelt karakteriserte DNA MTases med hundrevis av forskjellige gjenkjenningssekvenser som spenner fra to til åtte bp 37, og det er forventet at mer enn 200 forskjellige MTases av alle typer er produsert i menneskecellen 38. En viktig determinant for MTAse-aktivitet er om AdoMet analog passer inn enzymet aktivt sete. Selv om de present kofaktorer 6Baz og SeAdoYn er designet for å ha små reaktive grupper, noen MTases kanskje ikke lett aksepterer dem. I disse tilfellene de aktive setene kan bli utvidet med protein engineering som er vist for DNA 35, RNA 23 og protein MTases 25-28 med sterisk mer krevende doble aktivert AdoMet analoger.

Sekvens spesifikk merking av DNA og RNA med AdoMet analoger er av stor interesse for genotyping (DNA kartlegging) 36 og metylering deteksjon 39, funksjonelle studier av DNA / RNA og DNA / RNA-modifiserende enzymer 15 så vel som for (nano) bioteknologi 13, 14 og genavlevering 19. Andre metoder for sekvens spesifikk kovalente DNA merking stole på syntetiske triple helix dannende oligodeoksynukleotider, peptid nukleinsyrer eller hårnål polyamider som målgruppe heter eller på sekvensspesifikke nicking endonucleases (NEases) etterfulgt av nick oversettelse merking. 37) er begrenset, noe som gjør at DNA MTAse-mediert merking mer generelt.

Spesifikk merking av proteiner med dobbelt aktiverte AdoMet-analoger er hovedsakelig rettet mot anvendelser i proteomikk forskning, f.eks identifisering av nye substrater for protein MTases i komplekse biologiske blandinger 27,28, men andre anvendelser, slik som funksjonelle studier, bør også være mulig. Selv MTAse-mediert merking har hovedsakelig blitt utført med rensede MTases in vitro, kan merking også oppnås i levende celler som er nylig 40 blitt rapportert. Selvfølgelig er mange andre metoder for spesifikk proteinmerking er tilgjengelig 3,4. I tillegg til innlemmelse av unaturlige aminosyrer ved å bruke modifiserte cellene de vanligvis krever genetiske fusjoner av proteinet av interesse med selv merking koder / proteins eller koder for enzymet-mediert merking. I dette henseende korte peptidsekvenser som tjener som substrater for protein MTases, f.eks N-terminale histon haler, kan være kondensert til et protein av interesse og er merket med AdoMet-analoger og tilsvarende protein MTases.

Endelig kan biokatalytisk repertoar av lavmolekylære MTases utvides med syntetisk AdoMet analoger 41-44. Dette representerer en ny tilnærming for å innføre strukturelle mangfoldet i naturlige produkter, som for eksempel antibiotika eller polyketider, som skal finne interessante programmer i screening for nye biologiske aktiviteter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6BAz Synthesized according to Weinhold et al., Patent number US 8,129,106, published March 6, 2012.
β-Mercaptoethanol Serva 28625
Acetic acid Fisher Scientific 10304980
Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1 Serva 10688
UltraPure Agarose Invitrogen 16500100
Ammonium persulfate (APS) Serva 13375
Bis-Tris Gerbu 1304
Boric acid Gerbu 1115
Bromophenol blue Na salt Serva 15375
Copper(II) sulfate Aldrich C1297
Chloroform Fisher Scientific 10020090
Coomassie Brilliant Blue Serva 17525
EDTA disodium salt Gerbu 1034
Ethanol Merck 100983
GelRed (10,000x in water) Biotium 41003
Glycerol (99.5%) Gerbu 2006
FastRuler Low Range DNA Ladder Thermo Scientific SM1103
Histone H3 Expression plasmid obtained from Dr. Philipp Voigt and Prof. Danny Reinberg; expression and isolation according to T. J. Richmond et al., J. Mol. Biol. 1997, 272, 301-311.
M.BseCI Expression plasmid obtained from Dr. Michael Kokkinidis; expression and isolation according to Kapetaniou et al., Acta Cryst. 2006, F63, 12-14.
Methanol Fisher Scientific 10675112
Magnesiumchloride  hexahydrate J.T. Baker 4003
MOPS Gerbu 1081
Sodium chloride Gerbu 1112
pH strip (Neutralit) Merck 1,095,330,001
pBR322 Thermo Scientific SD0041
R.TaqI (10 u/µl) Thermo Scientific ER0671
SeAdoYn Synthesized according to Willnow et al., ChemBioChem 2012, 13, 1167-1173.
Set7/9 Expression plasmid obtained from Prof. Danny Reinberg, expression and isolation according to D. Reinberg et al., Genes Dev.2002, 16, 479-489.
Streptavidin Gerbu 3058
(+)-Sodium L-ascorbate Sigma Life Science A7631
SDS Granular Gerbu 1833
di-Sodium hydrogenphosphate Merck 106,586
TAMRA azide Synthesized according to reference 30: Willnow et al., ChemBioChem 2012, 13, 1167-1173.
TaqI buffer (10x) Thermo Scientific B28
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) Acros Organics 42058
Tris-HCl Gerbu 1028
Tris-X (TRIS-base) Gerbu 1018
Tris(3-hydroxypropyltriazolyl-methyl)amine (THPTA) Sigma-Aldrich 762342

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gottfried, A., Weinhold, E. Sequence-specific covalent labelling of DNA. Biochem. Soc. Trans. 39, 623-628 (2011).
  2. Zohar, H., Muller, S. J. Labeling DNA for single-molecule experiments: methods of labeling internal specific sequences on double-stranded DNA. Nanoscale. 3, 3027-3039 (2011).
  3. Hinner, M. J., Johnsson, K. How to obtain labeled proteins and what to do with them. Curr. Opin. Biotechnol. 21, 766-776 (2010).
  4. Wua, Y. -W., Goody, R. S. Probing protein function by chemical modification. J. Pept. Sci. 16, 514-523 (2010).
  5. Struck, A. -W., Thompson, M. L., Wong, L. S., Micklefield, J. S-Adenosyl-methionine-dependent methyltransferases: Highly versatile enzymes in biocatalysis, biosynthesis and other biotechnological applications. ChemBioChem. 13, 2642-2655 (2012).
  6. Klimasauskas, S., Weinhold, E. A new tool for biotechnology: AdoMet-dependent methyltransferases. Trends Biotechnol. 25, 99-104 (2007).
  7. Pljevaljcic, G., Schmidt, F., Weinhold, E. Sequence-specific Methyltransferase-Induced Labeling of DNA (SMILing DNA). ChemBioChem. 5, 265-269 (2004).
  8. Lukinavicius, G., Lapiene, V., Stasevskij, Z., Dalhoff, C., Weinhold, E., Klimasauskas, S. Targeted labeling of DNA by methyltransferase-directed Transfer of Activated Groups (mTAG). J. Am. Chem. Soc. 129, 2758-2759 (1021).
  9. Pignot, M., Siethoff, C., Linscheid, M., Weinhold, E. Coupling of a nucleoside with DNA by a methyltransferase. Angew. Chem. Int. Ed. 37, 2888-2891 (1998).
  10. Weller, R. L., Rajski, S. R. Design, synthesis, and preliminary biological evaluation of a DNA methyltransferase-directed alkylating agent. ChemBioChem. 7, 243-245 (2006).
  11. Du, Y., Hendrick, C. E., Frye, K. S., Comstock, L. R. Fluorescent DNA Labeling by N-Mustard Analogues of S-adenosyl-l-methionine. ChemBioChem. 13, 2225-2233 (2012).
  12. Pljevaljcic, G., Schmidt, F., Scheidig, A. J., Lurz, R., Weinhold, E. Quantitative labeling of long plasmid DNA with nanometer precision. ChemBioChem. 8, 1516-1519 (1002).
  13. Wilkinson, S., et al. Molecular scale architecture: engineered three- and four-way junctions. Bioconjugate Chem. 19, 470-475 (2008).
  14. Braun, G., et al. Enzyme-directed positioning of nanoparticles on large DNA templates. Bioconjugate Chem. 19, 476-479 (2008).
  15. Kim, S., et al. Enzymatically incorporated genomic tags for optical mapping of DNA binding proteins. Chem. Int. Ed. 51, 3578-3581 (2012).
  16. Rina, M., Bouriotis, V. Cloning purification and characterization of the BseCI DNA methyltransferase from Bacillus stearothermophilus. Gene. 133, 91-94 (1993).
  17. Sequence-specific detection of methylation in biomolecules. US Patent. Weinhold, E., Meier, T., Düfel, H., Markert-Hahn, C., Schmuck, R. , 8,129,106 (2012).
  18. Pljevaljcic, G., Pignot, M., Weinhold, E. Design of a new fluorescent cofactor for DNA methyltransferases and sequence-specific labeling of DNA. J. Am. Chem. Soc. 125, 3492-3410 (2003).
  19. Schmidt, F. H. -G., Hüben, M., Gider, B., Renault, F., Teulade-Fichou, M. -P., Weinhold, E. Sequence-specific Methyltransferase-Induced Labelling (SMILing) of plasmid DNA for studying cell transfection. Bioorg. Med. Chem. 16, 40-48 (2008).
  20. Dalhoff, C., Lukinavicius, G., Klimasauskas, S., Weinhold, E. Direct transfer of extended groups from synthetic cofactors by DNA methyltransferases. Nat. Chem. Biol. 2, 31-32 (2006).
  21. Lukinavicius, G., Tomkuviene, M., Masevicius, V., Klimasauskas, S. Enhanced chemical stability of AdoMet analogues for improved methyltransferase-directed labeling of DNA. ACS Chem. Biol. 8, 1134-1139 (2013).
  22. Motorin, Y., et al. Expanding the chemical scope of RNA:methyltransferases to site-specific alkynylation of RNA for click labeling. Nucleic Acids Res. 39, 1943-1952 (1943).
  23. Schulz, D., Holstein, J. M., Rentmeister, A. A chemo-enzymatic approach for site-specific modification of the RNA cap. Angew. Chem. Int. Ed. 52, 7874-7878 (2013).
  24. Peters, W., et al. Enzymatic site-specific functionalization of protein methyltransferase substrates with alkynes for click labeling. Angew. Chem. Int. Ed. 49, 5170-5173 (2010).
  25. Islam, K., Zheng, W., Yu, H., Deng, H., Luo, M. Expanding cofactor repertoire of protein lysine methyltransferase for substrate labeling. ACS Chem. Biol. 6, 679-684 (2011).
  26. Wang, R., Zheng, W., Yu, H., Deng, H., Luo, M. Labeling substrates of protein arginine methyltransferase with engineered enzymes and matched S-adenosyl-l-methionine analogues. J. Am. Chem. Soc. 133, 7648-7651 (2011).
  27. Islam, K., et al. Bioorthogonal profiling of protein methylation using azido derivative of S-adenosyl-l-methionine. J. Am. Chem. Soc. 134, 5909-5915 (2012).
  28. Islam, K., et al. Defining efficient enzyme-cofactor pairs for bioorthogonal profiling of protein methylation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 16778-16783 (2013).
  29. Binda, O., Boyce, M., Rush, J. S., Palaniappan, K. K., Bertozzi, C. R., Gozani, O. A chemical method for labeling lysine methyltransferase substrates. ChemBioChem. 12, 330-334 (2011).
  30. Willnow, S., Martin, M., Lüscher, B., Weinhold, E. A selenium-based click AdoMet analogue for versatile substrate labeling with wild-type protein methyltransferases. ChemBioChem. 13, 1167-1173 (2012).
  31. Bothwell, I. R., et al. Se-Adenosyl-l-selenomethionine cofactor analogue as a reporter of protein methylation. J. Am. Chem. Soc. 134, 14905-14912 (2012).
  32. Tomkuviene, M., Clouet-d’Orval, B., Cerniauskas, I., Weinhold, E., Klimasauskas, S. Programmable sequence-specific click-labeling of RNA using archaeal box C/D RNP methyltransferases. Nucleic Acids Res. 40, 6765-6773 (2012).
  33. Nishioka, K., et al. Set9, a novel histone H3 methyltransferase that facilitates transcription by precluding histone tail modifications required for heterochromatin formation. Genes Dev. 16, 479-489 (2002).
  34. Clark, P. M., et al. Direct in-gel fluorescence detection and cellular imaging of O-GlcNAc-modified proteins. J. Am. Chem. Soc. 130, (2008).
  35. Lukinavicius, G., Lapinaite, A., Urbanaviciute, G., Gerasimaite, R., Klimasauskas, S. Engineering the DNA cytosine-5 methyltransferase reaction for sequence-specific labeling of DNA. Nucleic Acids Res. 40, 11594-11602 (2012).
  36. Neely, R. K., Dedecker, P., Hotta, J., Urbanaviciute, G., Klimasauskas, S., Hofkens, J. DNA fluorocode: A single molecule, optical map of DNA with nanometre resolution. Chem. Sci. 1, 453-460 (2010).
  37. Roberts, R. J., Vincze, T., Posfai, J., Macelis, D. REBASE-a database for DNA restriction and modification: enzymes, genes and genomes. Nucleic Acids Res. 38, 234-236 (2010).
  38. Petrossian, T. C., Clarke, S. G. Uncovering the human methyltransferasome. Mol. Cell. Proteomics. 10, 1-12 (2011).
  39. Kriukiene, E., et al. DNA unmethylome profiling by covalent capture of CpG sites. Nat. Commun. 4, 2190 (2013).
  40. Wang, R., et al. Profiling genome-wide chromatin methylation with engineered posttranslation apparatus within living cells. J. Am. Chem. Soc. 135, 1048-1056 (2013).
  41. Zhang, C., Weller, R. L., Thorson, J. S., Rajski, S. R. Natural product diversification using a non-natural cofactor analogue of S-adenosyl-l-methionine. J. Am. Chem. Soc. 128, 2760-2761 (2006).
  42. Stecher, H., et al. Biocatalytic Fiedel-Crafts alkylation using non-natural cofactors. Angew. Chem. Int. Ed. 48, 9546-9548 (2009).
  43. Lee, B. W. K., Sun, H. G., Zang, T., Kim, B. J., Alfaro, J. F., Zhou, Z. S. Enzyme-catalyzed transfer of a ketone group from an S-adenosylmethionine analogue: A tool for the functional analysis of methyltransferases. J. Am. Chem. Soc. 132, 3642-3643 (2010).
  44. Winter, J. M., et al. Expanding the structural diversity of polyketides by exploring the cofactor tolerance of an inline methyltransferase domain. Org. Lett. 15, 3774-3777 (2013).

Tags

Biokjemi , AdoMet SAM aziridin kofaktor dobbel aktivert kofaktor metyltransferase DNA metylering protein metylering biotinmerking fluorescens merking smilende mTAG
Sekvens-spesifikk merking av nukleinsyrer og proteiner med metyltransferaser og kofaktor analoger
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hanz, G. M., Jung, B., Giesbertz,… More

Hanz, G. M., Jung, B., Giesbertz, A., Juhasz, M., Weinhold, E. Sequence-specific Labeling of Nucleic Acids and Proteins with Methyltransferases and Cofactor Analogues. J. Vis. Exp. (93), e52014, doi:10.3791/52014 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter