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Biology

Methyltransferases और cofactor analogues साथ न्यूक्लिक एसिड और प्रोटीन के अनुक्रम-विशिष्ट लेबलिंग

Published: November 22, 2014 doi: 10.3791/52014
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1
1Institute of Organic Chemistry, Department of Chemistry, RWTH Aachen University
* These authors contributed equally

Summary

डीएनए और प्रोटीन अनुक्रम-विशेष रूप से आकर्षण या डीएनए या प्रोटीन Methyltransferases और सिंथेटिक cofactor के analogues का उपयोग कर फ्लोरोसेंट संवाददाता समूहों के साथ लेबल रहे हैं। एंजाइमों, aziridine या डबल सक्रिय cofactor के analogues के cofactor के विशिष्टता के आधार पर एक या दो कदम लेबलिंग के लिए कार्यरत हैं।

Abstract

एस -Adenosyl एल मेथिओनिन (AdoMet या एसएएम) निर्भर Methyltransferases (MTase) डीएनए, आरएनए, प्रोटीन और छोटे biomolecules में विशिष्ट पदों के लिए AdoMet से सक्रिय मिथाइल समूह के हस्तांतरण को उत्प्रेरित। यह प्राकृतिक मेथिलिकरण प्रतिक्रिया सिंथेटिक cofactor के analogues का उपयोग कर alkylation प्रतिक्रियाओं की एक विस्तृत विविधता का विस्तार किया जा सकता है। एक aziridine की अंगूठी के साथ AdoMet की प्रतिक्रियाशील sulfonium केंद्र की रिप्लेसमेंट विभिन्न डीएनए MTases से डीएनए के साथ मिलकर किया जा सकता है, जो सहकारकों की ओर जाता है। ये aziridine सहकारकों एडिनाइन आधा भाग के विभिन्न पदों पर संवाददाता समूहों के साथ सुसज्जित है और मुझे लगता है कि डीएनए (मुस्कुराते हुए डीएनए) के एल हाबिल आईएनजी nduced ethyltransferase- एस equence-विशिष्ट M के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। एक विशिष्ट उदाहरण के रूप में हम डीएनए MTase M.BseCI और aziridine cofactor के 6BAz में साथ 5'-ATCG ए टी 3 'अनुक्रम में pBR322 प्लास्मिड डीएनए की biotinylation के लिए एक प्रोटोकॉल देएक कदम है। एक ctivated जी roups (mTAG) के एम ethyltransferase निर्देशित टी ransfer के लिए उपयोग किया जाता है जो AdoMet analogues के दूसरे वर्ग में असंतृप्त अल्काइल समूहों परिणामों के साथ सक्रिय मिथाइल समूह का विस्तार। विस्तारित पक्ष श्रृंखला sulfonium केंद्र और असंतृप्त बंधन से सक्रिय रहे हैं, इन सहकारकों डबल सक्रिय AdoMet analogues के कहा जाता है। इन analogues के aziridine सहकारकों तरह डीएनए MTases के लिए सहकारकों, के रूप में कार्य किया है, लेकिन यह भी शाही सेना, प्रोटीन और छोटे अणु MTases के लिए ही नहीं। वे आम तौर पर एक दूसरे रासायनिक चरण में संवाददाता समूहों के साथ चिह्नित कर रहे हैं, जो अद्वितीय कार्य समूहों के साथ MTase substrates के एंजाइमी संशोधन के लिए उपयोग किया जाता है। इस हिस्टोन H3 प्रोटीन की प्रतिदीप्ति लेबलिंग के लिए एक प्रोटोकॉल में उदाहरण है। एक छोटा सा propargyl समूह के लिए क्लिक करें लेबलिंग द्वारा पीछा हिस्टोन H3 लाइसिन 4 (H3K4) MTase Set7 / 9 से प्रोटीन के लिए cofactor के अनुरूप SeAdoYn से स्थानांतरित कर रहा हैTamra azide के साथ alkynylated हिस्टोन H3। Cofactor के analogues के साथ MTase की मध्यस्थता लेबलिंग पहचान और कार्यात्मक अध्ययन MTase substrates के रूप में अच्छी तरह के रूप में डीएनए जीनोटाइपिंग और मेथिलिकरण पता लगाने सहित कई रोमांचक अनुप्रयोगों के लिए एक प्रौद्योगिकी सक्षम है।

Introduction

न्यूक्लिक एसिड 1,2 और प्रोटीन 3,4 के विशिष्ट लेबलिंग कार्यात्मक अभिलक्षण, चिकित्सा निदान और (नैनो) जैव प्रौद्योगिकी के लिए प्रमुख ब्याज की है। यहाँ हम एस -adenosyl एल मेथिओनिन (AdoMet या एसएएम) निर्भर Methyltransferases (MTases) पर आधारित है जो इन बायोपॉलिमरों के लिए एक enzymatic लेबलिंग विधि प्रस्तुत करते हैं। एंजाइमों का यह वर्ग (ईसी 2.1.1।) न्यूक्लिक एसिड और प्रोटीन की विशिष्ट अवशेषों के भीतर व्यक्तिगत न्युक्लेओफ़िलिक पदों (नाइट्रोजन, ऑक्सीजन, सल्फर और कार्बन परमाणुओं) को लक्षित करता है और स्वाभाविक रूप cofactor के AdoMet (चित्रा 1 ए) 5 के सक्रिय मिथाइल समूह स्थानान्तरण। इसके अलावा, MTases आत्मीयता टैग, fluorophores या अन्य लेबल (चित्रा 1 बी) 6 के साथ विशिष्ट लेबलिंग के लिए सिंथेटिक cofactor के अनुरूप उपयोग कर सकते हैं। AdoMet analogues के दो वर्गों विकसित किया गया है: एस equence-विशिष्ट एम ethyltransferase- के लिए मैं Aziridine सहकारकों एल हाबिल आईएनजी (मुस्कुराते हुए) 7 और एक ctivated जी roups के मीटर ethyltransferase निर्देशित टी ransfer के लिए डबल सक्रिय AdoMet analogues (mTAG) 8।

चित्रा 1
चित्रा 1:।। Methyltransferases (MTases) डीएनए, आरएनए, प्रोटीन और छोटे जैवअणुओं सहित विभिन्न substrates के लिए प्राकृतिक cofactor के AdoMet (एसएएम) से ए मिथाइल समूह स्थानांतरण न्यूक्लिक एसिड और प्रोटीन की बी लेबल / functionalization (NNNNN = द्वारा उत्प्रेरित प्रतिक्रियाओं प्रोटीन के लिए शाही सेना और अमीनो एसिड के लिए आधार डीएनए के लिए जोड़े, न्यूक्लियोटाइड, सिंथेटिक cofactor के analogues के साथ हरे रंग में लक्ष्य छाछ) के साथ MTase की XXXXX = मान्यता अनुक्रम। एक पत्रकार समूह युक्त Aziridine सहकारकों (नीले क्षेत्र)विशेष रूप से लक्ष्य छाछ (बाएं) और डबल सक्रिय AdoMet analogues के साथ युग्मित अनुक्रम एडिनाइन अंगूठी करने के लिए कर रहे हैं संलग्न चरण में एक दूसरे bioorthogonal क्लिक प्रतिक्रिया से लेबल किया जा सकता है, जो एक रासायनिक संवाददाता वाई (दाएं) को ले जाने के लिए बढ़ाया अल्काइल श्रृंखला के हस्तांतरण के लिए सीसा। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Aziridine सहकारकों डीएनए MTases के साथ सबसे अच्छा काम करते हैं। वे एक नाइट्रोजन परमाणु 9 (या एक एन 10,11 -mustard) के बजाय sulfonium केंद्र के रूप में प्रतिक्रियाशील समूह के साथ एक तीन अंग का अंगूठी होते हैं। इस नाइट्रोजन परमाणु के Protonation डीएनए के साथ पूरे cofactor के युग्मन सहसंयोजक की ओर जाता है, जो लक्ष्य न्यूक्लियोटाइड द्वारा न्युक्लेओफ़िलिक हमले के लिए aziridine अंगूठी सक्रिय। एडिनाइन अंगूठी के लिए रिपोर्टर समूहों संलग्न द्वारा aziridine सहकारकों (एक कदम में डीएनए लेबल करने के लिए डीएनए MTases साथ संयोजन में उपयोग किया जा सकता है जी> बाएं चित्रा 1 बी), 7,12। , 15 (एडिनाइन अंगूठी के 6 स्थिति से जुड़ी बायोटिन के साथ aziridine cofactor के) और बेसिलस stearothermophilus से एडिनाइन विशिष्ट डीएनए MTase (M.BseCI) 16 (चित्रा 2 - यह 6BAz 13 के साथ डीएनए की biotinylation के लिए विस्तार से प्रदर्शन किया है ) डीएनए से एक कदम लेबलिंग aziridine सहकारकों के माध्यम से: प्रोटोकॉल खंड 2 देखें। हेमोफिलस heamolyticus से M.BseCI (5'-ATCG ए टी 3 'मान्यता अनुक्रम), Thermus aquaticus (M.TaqI, 5'-टीसीजी ए -3 से डीएनए MTases'), के अलावा (M.HhaI, 5 'जी सी जी सी-3') और Spiroplasma (M.SssI से, 5'- सी जी-3 ') सफलतापूर्वक 6BAz 17 के साथ डीएनए biotinylate करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। इसके अलावा, aziridine सहकारकों एक कदम प्रतिदीप्ति डीएनए लेबलिंग 18,19 के लिए नियोजित किया जा सकता है।

ontent "के लिए: रख-together.within पृष्ठ =" हमेशा "> चित्रा 2
चित्रा 2:। M.BseCI और 6BAz साथ डीएनए के अनुक्रम विशिष्ट एक कदम biotinylation डीएनए MTase M.BseCI डबल असहाय डीएनए अनुक्रम 5'-ATCG ए टी 3 'को पहचानता है और स्वाभाविक रूप से दूसरे एडिनाइन के अमीनो समूह methylates छाछ (हरा) AdoMet का उपयोग कर। Aziridine cofactor के 6BAz के साथ प्रतिक्रिया की दिशा बदल दी है और M.BseCI लक्ष्य एडिनाइन साथ बायोटिन (नीला) सहित पूरे cofactor के युग्मन द्वारा विशिष्ट डीएनए biotinylation अनुक्रम की ओर जाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

डबल सक्रिय AdoMet analogues के असंतृप्त पक्ष श्रृंखला के बजाय sulfonium केंद्र में एक मिथाइल समूह (चित्रा 1 बी विस्तारित होते 20। sulfonium केंद्र के लिए β-स्थिति में असंतृप्त डबल या ट्रिपल बंधन को इलेक्ट्रॉनिक conjugative स्थिरीकरण द्वारा संक्रमण राज्य के भीतर प्रतिकूल steric प्रभाव compensates। Sulfonium केंद्र और असंतृप्त बांड दोनों एंजाइमी हस्तांतरण के लिए पक्ष श्रृंखला को सक्रिय करने के बाद, इन सहकारकों डबल सक्रिय AdoMet analogues के नाम थे। आमतौर पर, वे एक दूसरे कदम 8,21 में केमो-चयनात्मक लेबलिंग के लिए, अमीनो, alkyne और azide के समूहों की तरह अद्वितीय रासायनिक समूहों (रासायनिक संवाददाताओं से), के साथ पक्ष श्रृंखला स्थानांतरित करने के लिए उपयोग किया जाता है। आरएनए और प्रोटीन की अतिरिक्त लेबलिंग की अनुमति के 28 - सामान्य में, डबल सक्रिय AdoMet analogues के शाही सेना MTases 22,23 डीएनए MTases 8,20,21 के लिए, लेकिन यह भी के लिए सहकारकों और प्रोटीन MTases 24 के रूप में न केवल कार्य कर सकते हैं। हालांकि, विस्तारित पक्ष श्रृंखला sterically अधिक एक मिथाइल समूह की तुलना में मांग और इंजीनियरिंग बहुधा है प्रोटीन से MTase सक्रिय साइटों विस्तार कर रहे हैंएन कुशल अंतरण दर प्राप्त करने के लिए आवश्यक है। कॉपर द्वारा रासायनिक संशोधनों के बाद के लिए एंजाइमी स्थानांतरण के दौरान संक्रमण राज्य के 1. स्थिरीकरण और 2. प्रतिक्रियाशील हैंडल: इस समस्या के लिए एक और समाधान के लिए एक छोटा सा propargyl टर्मिनल alkyne दो कार्यों में कार्य करता है जहां समूह (तीन कार्बन) के साथ एक AdoMet अनुरूप उपयोग करने के लिए है उत्प्रेरित azide-alkyne cycloaddition (CuAAC) रसायन शास्त्र क्लिक करें। यह जिसके परिणामस्वरूप propargylic AdoMet अनुरूप 29 तटस्थ या थोड़ा बुनियादी शर्तों के अधीन है और केवल सीमित उपयोग की काफी अस्थिर है कि बाहर कर दिया। इस खामी सेलेनियम के साथ सल्फर परमाणु जगह से तय किया जा सकता है। जिसके परिणामस्वरूप cofactor के 5 '- [(एसई) [(3) एस -3 अमीनो-3-carboxypropyl] सहारा-2-ynylselenonio] -5'-deoxyadenosine (SeAdoYn, चित्रा 3) जंगली प्रकार के डीएनए द्वारा स्वीकार किया जाता है, आरएनए और प्रोटीन MTases 30 - कई मामलों में प्रोटीन इंजीनियरिंग के लिए की जरूरत रद्द जो 32। इस प्रतिदीप्ति समर्थक द्वारा उदाहरण है हिस्टोन H3 लाइसिन साथ Tein लेबलिंग 4 (H3K4) MTase Set7 / 9 33 (: डबल सक्रिय सहकारकों के माध्यम से दो कदम प्रोटीन लेबलिंग चित्रा 3, प्रोटोकॉल धारा 3 देखें)।

चित्रा 3
चित्रा 3:। Set7 / 9 के साथ हिस्टोन H3 के अनुक्रम विशिष्ट दो कदम प्रतिदीप्ति लेबलिंग, SeAdoYn और Tamra azide के प्रोटीन MTase Set7 / 9 स्वाभाविक रूप से AdoMet का उपयोग करते हुए हिस्टोन H3 में लाइसिन 4 के अमीनो समूह (H3K4, हरा) methylates। डबल सक्रिय cofactor के साथ SeAdoYn MTase लाइसिन अवशेषों को एक छोटे से propargyl समूह (लाल) स्थानान्तरण। संलग्न टर्मिनल ट्रिपल बंधन तो चुनिंदा azide-derivatized Tamra (tetramethylrhodamine, नीला) फ्लोरोफोरे के साथ एक bioorthogonal क्लिक प्रतिक्रिया (तांबा-उत्प्रेरित azide-alkyne cycloaddition, CuAAC) में संशोधित किया गया है।लोड / 52,014 / 52014fig3highres.jpg "लक्ष्य =" _blank "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Protocol

1. सामान्य निर्देश

  1. स्टोर aziridine cofactor (DMSO में) 6BAz और प्रोटीन MTase -80 डिग्री सेल्सियस पर Set7 / 9 और डबल सक्रिय cofactor के SeAdoYn और डीएनए MTase M.BseCI -20 डिग्री सेल्सियस पर (50% में ग्लिसरॉल) सहित अन्य सभी अभिकर्मकों।
  2. विआयनीकृत पानी में विलुप्त होने के गुणांक ε 269nm (6BAz) = 16,000 सेमी -1 एम -1 और ε 260nm (SeAdoYn) = 15,400 सेमी -1 एम -1 का उपयोग कर यूवी / विज़ स्पेक्ट्रोस्कोपी के माध्यम से 6BAz और SeAdoYn की एकाग्रता का निर्धारण। विलुप्त होने के गुणांक उपलब्ध है अगर 280 एनएम पर प्रत्यक्ष अवशोषण के माध्यम से, ब्रैडफोर्ड परख द्वारा MTases की एकाग्रता का निर्धारण या।
  3. एंजाइम गतिविधि के नुकसान को रोकने के लिए गहन pipetting या vortexing द्वारा बुलबुले बनाने से बचने की कोशिश करें। इसके बजाय, धीरे से ऊपर और नीचे pipetting द्वारा मिश्रण।
  4. DMSO में शेयर समाधान से aziridine सहकारकों जोड़ते समय परख में अंतिम DMSO के एकाग्रता कम है कि यह सुनिश्चित कर लें5% से अधिक है। हमेशा डीएनए के साथ गैर विशिष्ट प्रतिक्रियाओं को रोकने के लिए परख बफर में 10 मिमी मैग्नीशियम आयनों शामिल हैं।
  5. अम्लीय शेयर समाधान से डबल सक्रिय सहकारकों जोड़ते समय पीएच परिवर्तन से बचने और परख समाधान के पीएच काफी बदल नहीं करता है सुनिश्चित करने के लिए छोटे संस्करणों (अत्यधिक ध्यान केंद्रित शेयर समाधान) का उपयोग करें। वे आवश्यक तांबा आयनों की complexation द्वारा क्लिक प्रतिक्रिया के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं, क्योंकि परख बफर में thiols, जैसे, β-mercaptoethanol या dithiothreitol (डीटीटी), से बचें।

Aziridine Cofactors के माध्यम से डीएनए के 2. एक कदम लेबल

  1. अनुक्रम विशिष्ट मिथाइल-प्रेरित लेबल आईएनजी M.BseCI डीएनए MTase और aziridine cofactor के 6BAz साथ प्लास्मिड डीएनए की (मुस्कुराते हुए)।
    1. 20 डिग्री सेल्सियस पर cofactor के समाधान पिघलना और बर्फ पर प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार करते हैं।
    2. परख के अलावा किसी भी गैर विशिष्ट संशोधन, और एक & # कल्पना करने के लिए, एक "cofactor के" नियंत्रण प्रदर्शन8220; एंजाइम "नियंत्रण, MTase तैयारी प्राकृतिक cofactor के AdoMet से मुक्त है कि सुनिश्चित करने के लिए।
    3. 10x संशोधन बफर की परख मिश्रण 2 μl के लिए (100 मिमी Tris-एचसीएल, जिसमें 100 मिमी 2 MgCl, 20 मिमी β-mercaptoethanol, पीएच 7.4), pBR322 (0.5 माइक्रोग्राम प्रति / μl), 10 EQ के 2 μl। डीएनए पर मान्यता अनुक्रम (pBR322 में एक मान्यता अनुक्रम) और 20 μl की कुल मात्रा के भीतर 60 सुक्ष्ममापी के अंतिम एकाग्रता के लिए aziridine cofactor के 6BAz प्रति M.BseCI। Cofactor और डीएनए MTase पिछले जोड़ें।
      नोट: β-mercaptoethanol, विषैले संक्षारक और पर्यावरण की दृष्टि से हानिकारक है।
    4. "Cofactor के" नियंत्रण के लिए बजाय 6BAz की विआयनीकृत पानी जोड़ने के बजाय M.BseCI की और "एंजाइम" नियंत्रण के लिए विआयनीकृत पानी जोड़ें।
    5. धीरे ऊपर और नीचे pipetting द्वारा समाधान मिलाएं।
    6. 1 घंटे के लिए 55 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूबों सेते हैं।
    7. अपकेंद्रित्र संक्षिप्त ट्यूबों के नीचे स्थित सभी तरल एकत्र करने के लिए।
  2. प्रतिबंध संशोधन परख डीएनए संशोधन सत्यापित करने के लिए।
    1. 80 μl विआयनीकृत पानी और 3.3 μl (100 मिमी Tris-एचसीएल, 50 मिमी 2 MgCl, 1 एम NaCl, 1 मिलीग्राम / एमएल गोजातीय सीरम albumin, पीएच 8.0 से युक्त) 10 μl 10x R.TaqI बफर मिश्रण से एक समाधान तैयार प्रतिबंध endonuclease Thermus aquaticus से (REase) (R.TaqI, 10 यू / μl)। अंतिम चरण में REase जोड़ने के लिए सुनिश्चित करें।
    2. 2.1.7 से प्रत्येक ट्यूब आर Taqi बफर 10x के 2 μl और ऊपर (2.2.1) से समाधान के 28 μl जोड़ें।
    3. धीरे ऊपर और नीचे pipetting द्वारा समाधान मिलाएं।
    4. 30 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूबों सेते हैं।
    5. अपकेंद्रित्र संक्षिप्त ट्यूबों के नीचे स्थित सभी तरल एकत्र करने के लिए।
  3. Streptavidin के साथ Electromobility पारी परख (EMSA) कार्यात्मक संशोधन सत्यापित करने के लिए।
    1. प्रत्येक ट्यूब (2.2.5) से 25 μl निकालें और streptavidin मीटर करने के लिए सम्मान के साथ एक streptavidin समाधान (1 मिमी की 2.4 μl जोड़नेonomer 100 मिमी ना 2 HPO 4 युक्त streptavidin के बफर में, 100 मिमी NaCl, पीएच 7.5; कुल बायोटिन की चार समकक्ष)। शेष ट्यूबों के लिए streptavidin के बफर के 2.4 μl जोड़ें।
    2. 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सभी ट्यूबों को सेते हैं।
  4. Agarose जेल वैद्युतकणसंचलन के माध्यम से विश्लेषण।
    1. प्रत्येक ट्यूब 6x लोड हो रहा है बफर (नीला 0.25% bromophenol, 30% ग्लिसरॉल) के 5 μl जोड़ें।
    2. धीरे समाधान मिलाएं।
    3. लोड (एक 10,000x शेयर समाधान से 1x GelRed युक्त 0.5x TBE बफर में 1% agarose) एक agarose जेल के कुओं में प्रत्येक नमूने के 10 μl।
    4. लगभग 80 वी के साथ 0.5x TBE बफर में जेल चला। एक घंटा।
    5. एक फिल्टर (540 ± 50 एनएम) के साथ सुसज्जित एक सीसीडी कैमरा के साथ एक यूवी तालिका (312 एनएम) पर डीएनए बैंड कल्पना।
      नोट: यूवी प्रकाश आंखों और त्वचा के लिए हानिकारक है।

डबल सक्रिय Cofactors के माध्यम से 3. दो कदम प्रोटीन लेबलिंग

  1. Methyltransfहिस्टोन H3 लाइसिन 4 लेबलिंग (संशोधन कदम) के लिए Set7 / 9 और डबल सक्रिय cofactor के SeAdoYn के साथ सक्रिय समूह (mTAG) का स्थानांतरण मिटा निर्देशित।
    1. घटकों पिघलना और बर्फ पर प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार करते हैं। नोट: हमेशा SeAdoYn गिरावट से बचने के लिए ठंडा रखने के लिए।
    2. परख के अलावा किसी भी गैर विशिष्ट संशोधन कल्पना करने के लिए, एक "cofactor के" नियंत्रण करते हैं, और एक "एंजाइम" नियंत्रण, फ्लोरोसेंट जांच की गैर विशिष्ट प्रतिक्रियाओं बाहर करने के लिए।
    3. एक परख समाधान (20 μl) संशोधन बफर (50 मिमी Tris-एचसीएल, 5% ग्लिसरॉल, पीएच 8.5), 10 माइक्रोन हिस्टोन H3, माइक्रोन Set7 / 9 10 और 600 माइक्रोन SeAdoYn (सेलेनियम पर दोनों epimers का मिश्रण) से युक्त तैयार करें। पिछले चरणों में तो cofactor और MTase जोड़ें।
    4. "Cofactor के" नियंत्रण के लिए 3.1.3 के रूप में एक परख समाधान तैयार करने और सिंथेटिक cofactor के साथ प्रतिस्पर्धा करने के लिए 60 मिमी AdoMet जोड़ें। "एंजाइम" नियंत्रण के लिए बजाय SeAdoYn की विआयनीकृत पानी जोड़ें।
    5. धीरे-धीरे ऊपर और नीचे pipetting द्वारा समाधान मिलाएं। एक पीएच पट्टी (- 10 पीएच रेंज 5) के ऊपरी क्षेत्र के लिए प्रत्येक समाधान के 1 μl जोड़कर पीएच की जाँच करें।
    6. 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    7. इस बीच एक 12% एसडीएस polyacrylamide जेल तैयार (चल जेल में: 357 मिमी बीआईएस Tris पीएच 6.5-6.8, 0.1% (/ वी) ए पी डब्ल्यू, 0.04% (वी / वी) TEMED और 12% एक्रिलामाइड / bisacrylamide 37.5: 1 ; लोड हो रहा है जेल: 357 मिमी बीआईएस Tris 6.5-6.8 पीएच, 0.1% ए पी (w / v), 0.04% (वी / वी) TEMED और 5% एक्रिलामाइड / bisacrylamide 37.5: 1)।
      नोट: Acrylamide / bisacrylamide खतरनाक जहरीले और स्वास्थ्य है। इस प्रक्रिया के दौरान दस्ताने पहनें।
  2. तांबे उत्प्रेरित azide-alkyne cycloaddition (CuAAC) (लेबलिंग कदम) के माध्यम से हिस्टोन H3 में alkinylated लाइसिन 4 कैमिकल लेबलिंग।
    1. बस संशोधन प्रतिक्रिया के अंत से पहले 3 मिमी CuSO 4, 3 मिमी Tris (3-Hydroxypropyl-triazolylmethyl) एमाइन (THPTA), 250 मिमी सोडियम एस्कॉर्बेट और एक साथ 6 मिमी Tamra azide युक्त एक 5x क्लिक मिश्रण तैयार20 μl की कुल मात्रा।
    2. CuAAC शुरू करने और संशोधन प्रतिक्रिया बुझाने के लिए प्रत्येक ट्यूब हौसले से तैयार 5x क्लिक मिश्रण के 5 μl जोड़ें।
    3. ऊपर और नीचे pipetting द्वारा धीरे मिलाएं।
    4. फ्लोरोफोरे की तस्वीर विरंजन से बचने के लिए प्रकाश से एल्यूमीनियम पन्नी के साथ सभी ट्यूबों को सुरक्षित रखें।
    5. 1 घंटे के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  3. प्रोटीन तेज़ी मुक्त Tamra फ्लोरोफोरे से अधिक दूर करने के लिए।
    1. 34 - मुक्त Tamra फ्लोरोफोरे की गहन में जेल प्रतिदीप्ति द्वारा फ्लोरोसेंट लेबल किया हिस्टोन H3 की outshining बचने के लिए, प्रोटीन (3.3.4 3.3.2) की तेज़ी से अतिरिक्त फ्लोरोफोरे हटा दें।
    2. 75 μl मेथनॉल, 18.8 μl क्लोरोफॉर्म और संक्षिप्त के बाद इसके अलावा प्रत्येक ट्यूब और भंवर पानी विआयनीकृत 50 μl जोड़ें। 5 मिनट के लिए 16,000 XG पर अपकेंद्रित्र। प्रोटीन होता है जो इंटरफेस परत, परेशान बिना ऊपरी चरण निकालें।
    3. शेष चरण के लिए 56.3 μl मेथनॉल जोड़ें मैं5 मिनट के लिए 16,000 XG पर प्रत्येक ट्यूब, भंवर और अपकेंद्रित्र प्रोटीन गोली। सतह पर तैरनेवाला निकालें। गोली धोने के लिए इस चरण को दोहराएँ।
    4. एक प्रकार का वृक्ष मुक्त ऊतक के साथ खुला ट्यूब कवर और 15 के लिए उन्हें सूखी - 30 मिनट।
  4. एसडीएस पृष्ठ के माध्यम से विश्लेषण।
    1. (20 μl एसडीएस लोड हो रहा है बफर (50 मिमी Tris-एचसीएल, 2.5% (डब्ल्यू / वी) एसडीएस, 10% (वी / वी) ग्लिसरॉल, 320 मिमी β-mercaptoethanol और 0.05% में 3.3.4 से उपजी प्रोटीन भंग w / V) bromophenol नीले, पीएच 6.8)। पूरी तरह से एक विंदुक के साथ नलियों की दीवारों rinsing द्वारा गोली भंग करने के लिए सुनिश्चित करें।
    2. 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर नमूने सेते हैं और उनमें से 20 डिग्री सेल्सियस नीचे शांत करते हैं।
    3. अपकेंद्रित्र संक्षिप्त ट्यूबों के नीचे स्थित सभी तरल एकत्र करने के लिए।
    4. एक एसडीएस polyacrylamide जेल (3.1.7) के कुओं में प्रत्येक नमूने की पूरी राशि लोड करें। 50 मिमी mops, 50 मिमी Tris-एक्स (Tris आधार), 5 मिमी EDTA, 0.1% का उपयोग करें (w / v) वैद्युतकणसंचलन के लिए बफर चलाने के रूप में एसडीएस।
    5. लगभग 120 वी के साथ जेल चलाएँ। 90 मिनट।
    6. एक फिल्टर (50 एनएम ± एनएम 540) के साथ सुसज्जित एक सीसीडी कैमरा के साथ एक यूवी तालिका (312 एनएम) पर में जेल प्रतिदीप्ति कल्पना।
      नोट: यूवी प्रकाश आंखों और त्वचा के लिए हानिकारक है।

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Representative Results

Aziridine Cofactors के माध्यम से डीएनए के एक कदम लेबल

यह उदाहरण प्रतिक्रिया डबल असहाय 5'-ATCG ए टी 3 'अनुक्रम के भीतर दूसरा एडिनाइन अवशेषों को संशोधित और pBR322 प्लाज्मिड (चित्रा -4 ए) पर एक मान्यता साइट है जो डीएनए MTase M.BseCI, के साथ किया जाता है। प्लाज्मिड लेबलिंग का परीक्षण करने के लिए, pBR322 प्रतिबंध endonuclease (REase) R.TaqI (5'-TCGA-3 ') के साथ चुनौती दी है। R.TaqI M.BseCI साइट में शामिल किया गया है, जिनमें से एक pBR322 पर सात साइटों है। लेबलिंग होती है, तो M.BseCI साइट दरार के खिलाफ की रक्षा की जाएगी और दो अन्य टुकड़े (315 और 368 बीपी) गायब हो जाएगा, जबकि 683 आधार जोड़े (बीपी) के साथ एक नया टुकड़ा बनेगी। बेशक, इसी मान्यता दृश्यों के साथ अन्य डीएनए MTases अलग REases के साथ डीएनए लेबलिंग का विश्लेषण करते समय नियोजित किया जाना चाहिए।

4B चित्रा में agarose जेल स्पष्ट रूप से दिखाई देते हैं पता चलता है683 बीपी (3 लेन) के साथ एक नया टुकड़ा की मंजूरी। इस M.BseCI साइट की लेबलिंग हुई यह दर्शाता है कि। केवल परख (3 लेन) इस खंड से पता चलता है। "Cofactor के" नियंत्रण (लेन 5) के रूप में अच्छी तरह से "एंजाइम" नियंत्रण (लेन 7) इस बैंड याद कर रहे हैं। यह प्राकृतिक cofactor के AdoMet एंजाइम तैयारी में मौजूद नहीं है कि यह दर्शाता है क्योंकि विशेष रूप से "एंजाइम" नियंत्रण जरूरी है। लेबलिंग प्रतिक्रिया की विशिष्टता (4C में 4B चित्रा और विस्तार) streptavidin के अलावा पर ​​electromobility पारी परख (EMSA) द्वारा प्रदर्शन किया है। M.BseCI साइट के बिना सभी अन्य टुकड़े की गतिशीलता नियंत्रण (गलियों 6 और 8 के साथ 4 लेन तुलना) को अपरिवर्तित तुलना की जाती है, जबकि 683 बीपी के Electromobility मंद है।

चित्रा 4
चित्रा 4: अनुक्रमM.BseCI और 6BAz साथ pBR322 प्लास्मिड डीएनए के विशिष्ट biotinylation। मान्यता M.BseCI (लाल) और R.TaqI (हरा) के लिए साइटों के साथ ही डीएनए के R.TaqI। बी विश्लेषण के साथ प्रतिबंध के बाद आधार जोड़े (बीपी) में उम्मीद की डीएनए टुकड़े की लंबाई दिखा pBR322 की ए प्लास्मिड नक्शा agarose जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा विखंडन और EMSA। एम = मार्कर, गलियों 1 और 2: प्लास्मिड डीएनए केवल, गलियों 3 और 4: परख, गलियों 5 और 6: 'cofactor के' नियंत्रण, गलियों 7 और 8: 'एंजाइम' नियंत्रण। लेन 2, 4, 6 और 8 अतिरिक्त streptavidin के होते हैं। बी से इनसेट सी प्रॉस्टेट इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

डबल सक्रिय Cofactors के माध्यम से प्रोटीन के दो कदम लेबल

डबल सक्रिय AdoMet analogues के साथ substrates MTase के दो कदम लेबलिंग के लिए एक उदाहरण के रूप में हम हिस्टोन चुनाH3 लाइसिन 4 (H3K4) MTase Set7 / 9 और छोटे SeAdoYn cofactor के। हिस्टोन H3 सब्सट्रेट (प्रथम चरण) के लिए सक्रिय propargyl समूह के enzymatic हस्तांतरण के बाद, टर्मिनल alkyne रासायनिक CuAAC क्लिक रसायन विज्ञान (द्वितीय चरण) द्वारा एक azide के संशोधित Tamra फ्लोरोफोरे के साथ लेबल है (चित्रा 3 तुलना)। लेबलिंग प्रतिक्रिया का विश्लेषण एसडीएस पृष्ठ के द्वारा किया जाता है और में जेल प्रतिदीप्ति का पता लगाने (चित्रा 5A) है। परख (लेन 1) हिस्टोन cofactor के पक्ष श्रृंखला सफलतापूर्वक स्थानांतरित किया गया था यह दर्शाता है कि H3 और Tamra फ्लोरोफोरे के साथ लेबल संशोधित प्रोटीन के लिए इसी एक फ्लोरोसेंट बैंड से पता चलता है। कोई बैंड MTase द्वारा मध्यस्थता है "cofactor के" और हिस्टोन H3 की है कि लेबलिंग का प्रदर्शन "एंजाइम" नियंत्रण (गलियों 2 और 3) में दिखाई दे रहे हैं। इसलिए, गैर विशिष्ट रासायनिक लेबलिंग या तो अकेले cofactor के (प्रथम चरण) द्वारा या CuAAC (द्वितीय चरण) के दौरान की संभावना से इनकार किया जा सकता है। "Cofactor के" नियंत्रण घ किया जाता हैifferently एक कदम डीएनए लेबलिंग के लिए प्रोटोकॉल की तुलना में। हिस्टोन H3 की तेज़ी Set7 / 9 की उपस्थिति और MTase लोडिंग नियंत्रण में हिस्टोन H3 की कम मात्रा में करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं प्रोटीन omitting में अधिक कुशल है क्योंकि यह है। इस प्रकार, हम SeAdoYn के साथ प्रतिस्पर्धा करने के लिए प्राकृतिक cofactor के AdoMet के एक उच्च एकाग्रता गयी। हिस्टोन H3 की लोडिंग आसानी से प्रतिदीप्ति का पता लगाने के बाद Coomassie ब्लू के साथ जेल धुंधला द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है।

MTase substrates के भी दूसरे रासायनिक कदम 30 में azide-derivatized बायोटिन का उपयोग करके बायोटिन की बजाय fluorophores के साथ लेबल किया जा सकता है। प्रोटीन की Biotinylation सुविधाजनक हॉर्सरैडिश peroxidase संयुग्मित avidin के साथ पश्चिमी सोख्ता द्वारा विश्लेषण किया है। इस Set7 / 9, SeAdoYn और azide के संशोधित बायोटिन के साथ हिस्टोन H3 की biotinylation के लिए चित्रा 5 ब में दिखाया गया है। लेन एक में परख में लेबल हिस्टोन H3 के लिए एक स्पष्ट बैंड से पता चलता है। "एंजाइम" में बैंड की अनुपस्थिति (2 लेन)और "cofactor के" नियंत्रण (3 लेन) कि लेबलिंग MTase के लिए विशिष्ट है फिर दर्शाता है। पश्चिमी धब्बा विश्लेषण प्रोटीन तेज़ी से अतिरिक्त बायोटिन को हटाने की आवश्यकता नहीं है क्योंकि "cofactor के" नियंत्रण बस प्रोटीन MTase के अभाव में किया जाता है।

चित्रा 5
चित्रा 5: azide-derivatized लेबल के साथ क्लिक प्रतिक्रियाओं द्वारा पीछा प्रोटीन MTase Set7 / 9 और SeAdoYn साथ हिस्टोन H3 की लेबलिंग। Biotinylated हिस्टोन H3 और avidin-हॉर्सरैडिश peroxidase (एचआरपी) साधना का उपयोग करते हुए नियंत्रण की लोडिंग पर नियंत्रण के लिए Coomassie ब्लू के साथ हिस्टोन H3 और नियंत्रण के रूप में अच्छी तरह से धुंधला Tamra लेबल। बी पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के ए में जेल प्रतिदीप्ति। प्रयोगात्मक शर्तों ए (एंजाइमी संशोधन में प्रतिदीप्ति लेबलिंग के लिए उन लोगों के लिए बहुत समान थे: 6.581, एम हिस्टोन H3, Set7 / 9 10 माइक्रोन, 50 मिमी में 600 माइक्रोन SeAdoYn, Tris-एचसीएल, 5 मिमी 2 MgCl, 5% ग्लिसरॉल, पीएच 9.0, 30 डिग्री सेल्सियस, 3 घंटा; रासायनिक लेबलिंग:। 0.6 मिमी CuSO 4, 0.6 मिमी THPTA, 50 मिमी सोडियम ascorbate, 1.2 मिमी बायोटिन azide, 37 डिग्री सेल्सियस, 1 घंटा) यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

डीएनए MTases और aziridine सहकारकों (मुस्कुराते हुए डीएनए) के साथ डीएनए से एक कदम लेबलिंग एक मजबूत तरीका है, लेकिन प्रयोग की योजना बनाते समय कुछ पहलुओं पर विचार किया जाना चाहिए।

Aziridine cofactor: M.BseCI के साथ डीएनए लेबलिंग के लिए 6BAz एकाग्रता 60 माइक्रोन था। अन्य डीएनए MTases का उपयोग करते समय cofactor के एकाग्रता, के रूप में कम के रूप में 20 माइक्रोन डीएनए MTase M.TaqI 19 के साथ नियोजित किया गया है जैसे सांद्रता अनुकूलित किया जाना चाहिए। कम 6BAz सांद्रता streptavidin (परख में बायोटिन की पूरी राशि के संबंध में बाध्यकारी साइटों) के एक चौगुना अतिरिक्त सीधे EMSA द्वारा विश्लेषण के साथ हस्तक्षेप किए बिना REase साथ ऊष्मायन के बाद जोड़ा जा सकता है कि फायदा है। अन्यथा biotinylated डीएनए अतिरिक्त cofactor को हटाने और agarose जेल वैद्युतकणसंचलन दौरान डीएनए के smearing से बचने के लिए शुद्ध किया जाना चाहिए। DMSO में शेयर समाधान से aziridine सहकारकों जोड़ते समय यह सुनिश्चित कर लें कि वीं में अंतिम DMSO के एकाग्रताई परख 5% से कम है। बहुत ज्यादा DMSO के एंजाइमों को निष्क्रिय कर सकते हैं। हमेशा गिरावट से बचने के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर aziridine सहकारकों की दुकान।

डीएनए MTase: डीएनए के साथ aziridine सहकारकों की एंजाइमी युग्मन मजबूत उत्पाद inhibitors और डीएनए MTases stoichiometric मात्रा में इस्तेमाल किया जा करने के लिए है करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। इसलिए हमेशा डीएनए MTase से अधिक एक बराबर का उपयोग करें। अधिकांश डीएनए MTases व्यापक डायलिसिस या बफर की बड़ी मात्रा के साथ एक स्तंभ पर एंजाइमों धोने से हटा दिया जाना चाहिए जो बाध्य AdoMet साथ copurify। "एंजाइम" नियंत्रण AdoMet अभी भी एंजाइम तैयारी में मौजूद है कि क्या बता देंगे। M.BseCI साथ लेबलिंग भी 37 डिग्री सेल्सियस पर रात में ऊष्मायन के द्वारा किया जा सकता है।

संशोधन बफर: डीएनए के साथ aziridine सहकारकों की गैर विशिष्ट प्रतिक्रियाओं को रोकने के लिए बफर में 10 मिमी मैग्नीशियम आयनों को शामिल करें। मैग्नीशियम आयनों contaminating न्युक्लिअसिज़ के सक्रियण के लिए नेतृत्व करते हैं, बेरियम आयनों के बजाय जोड़ा जा सकता है।

डीएनए के अनुक्रम विशिष्ट लेबलिंग के लिए न केवल डीएनए मुस्कुरा लेकिन यह भी mTAG नियोजित किया जा सकता है। यहाँ डबल सक्रिय सहकारकों डीएनए के लिए अद्वितीय कार्य समूहों के साथ पक्ष श्रृंखला के enzymatic हस्तांतरण के लिए उपयोग किया जाता है। इन कार्य समूहों, जैसे प्राथमिक amines, एक दूसरे कदम 8,35,36 में एनएचएस एस्टर रसायन शास्त्र द्वारा बायोटिन या fluorophores सहित संवाददाता समूहों, की एक विस्तृत विविधता के साथ संशोधित किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से हम पहले से ही रिपोर्टर समूह युक्त बड़े पक्ष श्रृंखला के साथ डबल सक्रिय AdoMet analogues के synthesize करने के लिए शुरू कर दिया और एक कदम में डीएनए लेबलिंग के लिए उन्हें इस्तेमाल किया है।

डबल सक्रिय cofactor के SeAdoYn साथ प्रोटीन के लिए दो कदम mTAG लेबलिंग प्रक्रिया सफलतापूर्वक प्रोटीन MTases 30,31 की संख्या के साथ प्रयोग किया गया है। हालांकि, निम्न टिप्पणी के प्रयोग का प्रदर्शन करने से पहले विचार किया जाना चाहिए।

डबल सक्रिय cofactor: ये सहकारकों, सागर सहितdoYn, अम्लीय परिस्थितियों और देखभाल के अंतर्गत जमा हो जाती संशोधन समाधान के पीएच काफी cofactor के अलावा पर कोई बदलाव नहीं होता है कि लिया जाना चाहिए। हम हमेशा पीएच बहुत कम है, पीएच को समायोजित करने के लिए सोडियम हाइड्रॉक्साइड समाधान (50 मिमी) की छोटी मात्रा में जोड़ने के लिए, एक पीएच पट्टी करने के लिए संशोधन समाधान के 1 μl जोड़कर पीएच की जाँच करें और। इसके अलावा cofactor के analogues के पीएच परिवर्तन से बचने के लिए एक कम मात्रा में जोड़ा जाना चाहिए। इस प्रकार, पूर्ण संशोधन के लिए आवश्यक न्यूनतम cofactor के सांद्रता अन्य MTases के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए और अत्यधिक ध्यान केंद्रित cofactor के शेयर समाधान पसंद कर रहे हैं। Cofactor सांद्रता आम तौर पर 10 माइक्रोन और 600 माइक्रोन के बीच विभिन्न रहे हैं। निष्क्रिय epimer अक्सर प्राप्त करने के लिए कठिन है से, AdoMet के एस -epimer करने के लिए इसी सल्फर या सेलेनियम और जैविक रूप से सक्रिय epimer की जुदाई में epimers का एक मिश्रण: डबल सक्रिय सहकारकों की रासायनिक संश्लेषण आम तौर पर एक लगभग 1 पैदावार। इस प्रकार, cofactor के सांद्रता हैंआम तौर पर isomers के एक मिश्रण के लिए दिया। डबल सक्रिय cofactor के analogues के कमरे के तापमान पर काफी अस्थिर कर रहे हैं और -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जाना चाहिए। इसके अलावा बर्फ पर शेयर समाधान पिघलना और pipetting दौरान ठंड उन्हें रखने के लिए सुनिश्चित करें। वे फिर से जमे हुए किया जा सकता है, लेकिन हम aliquots बनाने के लिए सलाह देते हैं प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य गतिविधि सुनिश्चित करने के लिए।

प्रोटीन MTase: MTases उत्प्रेरक मात्रा में इस्तेमाल किया जा सकता डबल सक्रिय सहकारकों साथ परिवर्तनों के लिए। हालांकि, MTases प्राकृतिक cofactor के AdoMet साथ मिनट -1 रेंज में कारोबार संख्या होने धीमी एंजाइमों अक्सर होते हैं। व्यावहारिक कारणों से हम अक्सर (आमतौर पर 10 मिनट के दो घंटा और 20 डिग्री सेल्सियस से 37 डिग्री सेल्सियस तक) ऊष्मायन समय और तापमान stoichiometric मात्रा में MTases का उपयोग करें और कम से कम। "Cofactor के" नियंत्रण संवाददाता समूह और पता लगाने के प्रकार पर निर्भर करता है। MTase लेबलिंग बायोटिन बस छोड़ा जाता है और विश्लेषण पश्चिमी सोख्ता (चित्रा 5 ब के द्वारा किया जा सकता है (चित्रा 5A) के enzymatic हस्तांतरण को रोकने के लिए जोड़ा जाता है प्राकृतिक cofactor के एक उच्च एकाग्रता में किया जाता है। हिस्टोन H3 की तेज़ी प्रोटीन के नुकसान की ओर जाता है, तो हालांकि, एसडीएस पृष्ठ बढ़ाया जा सकता है और नि: शुल्क Tamra फ्लोरोफोरे से अधिक bromphenol नीले सामने के साथ जेल से बाहर चला जाएगा।

संशोधन बफर: इष्टतम एंजाइम बफर इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन thiols, dithiothreitol (डीटीटी) और β-mercaptoethanol तरह, बचा जाना चाहिए। वे तांबा आयनों और बी के लिए बाध्य निम्नलिखित CuAAC क्लिक प्रतिक्रिया ताला।

CuAAC प्रतिक्रिया क्लिक करें: Tamra azide के अंतिम एकाग्रता alkyne एकाग्रता के रूप में दो बार के रूप में उच्च किया जाना चाहिए। जैविक अर्क का उपयोग करते समय तांबे और ligand एकाग्रता 5 मिमी प्रत्येक अप करने के लिए वृद्धि की जानी चाहिए। Tamra azide के पानी की तुलना में DMSO में बेहतर घुलनशील है। DMSO के अंतिम एकाग्रता 12% से कम है कि सुनिश्चित करें। विस्तारित ऊष्मायन बार एसडीएस polyacrylamide जेल पर प्रोटीन क्षति और smearing के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। इस प्रकार, लेबलिंग प्रतिक्रिया या तो प्रोटीन तेज़ी या thiols के अलावा द्वारा बंद कर दिया जाना चाहिए।

इस दो कदम लेबलिंग प्रक्रिया भी बायोटिन के साथ प्रोटीन MTase substrates के लेबल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है या तो streptavidin लेपित चुंबकीय मोतियों के साथ पश्चिमी धब्बा पता लगाने (चित्रा 5 ब) या अलगाव के लिए। इसके अलावा, डबल सक्रिय AdoMet analogues के इसी MTases के साथ डीएनए, आरएनए और छोटे प्राकृतिक उत्पादों को लेबल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

न्यूक्लिक एसिड और प्रोटीन के लिए सबसे अन्य लेबलिंग तरीकों की तुलना में ve_content ">, MTase की मध्यस्थता लेबलिंग देशी substrates के सीधे इस्तेमाल किया जा सकता है कि लाभ दिया है और आगे कोई संशोधन। बेशक, देखभाल प्राकृतिक substrates के अवरुद्ध नहीं कर रहे हैं कि लिया जाना चाहिए आवश्यक है vivo में एक इसी MTase के माध्यम से मेथिलिकरण द्वारा। इसके अलावा, MTase की मध्यस्थता लेबलिंग MTases के लिए बायोटिन, fluorophores या अन्य आणविक टैग, साथ ही लक्ष्यों में शामिल हैं जो रिपोर्टर समूहों, दोनों के संदर्भ में बहुत लचीला है। रिबेस, प्रतिबंध के लिए एक डेटा बेस endonucleases और डीएनए MTases, दो से आठ बीपी 37 से लेकर विभिन्न मान्यता दृश्यों के सैकड़ों के साथ 700 से अधिक प्रयोगात्मक विशेषता डीएनए MTases सूचीबद्ध करता है और यह सभी प्रकार के 200 से अधिक विभिन्न MTases मानव कोशिका 38 में उत्पादित कर रहे हैं कि उम्मीद है। एक महत्वपूर्ण निर्धारक MTase गतिविधि के लिए AdoMet एनालॉग एंजाइम सक्रिय साइट में फिट बैठता है या नहीं। प्रस्तुत सहकारकों 6 यद्यपिबाज और SeAdoYn कुछ MTases उन्हें आसानी से स्वीकार नहीं कर सकते, छोटे प्रतिक्रियाशील समूहों के लिए डिजाइन किए हैं। Sterically अधिक की मांग की डबल सक्रिय AdoMet analogues के साथ 28 - डीएनए 35, आरएनए 23 और प्रोटीन MTases 25 के लिए प्रदर्शन किया गया है के रूप में इन मामलों में सक्रिय साइटों प्रोटीन इंजीनियरिंग द्वारा विस्तारित किया जा सकता है।

AdoMet analogues के साथ डीएनए और आरएनए के अनुक्रम विशिष्ट लेबलिंग जीनोटाइपिंग (डीएनए मैपिंग) के लिए प्रमुख ब्याज 36 और मेथिलिकरण का पता लगाने के 39 में से एक है, डीएनए / आरएनए और डीएनए / आरएनए को संशोधित करने के एंजाइमों के रूप में 15 अच्छी तरह से (नैनो) जैव प्रौद्योगिकी 13 के लिए के रूप में के कार्यात्मक अध्ययन, 14 और जीन डिलीवरी 19। अनुक्रम विशिष्ट सहसंयोजक डीएनए लेबलिंग के लिए अन्य तरीकों को लक्षित उपकरणों के रूप में या निक अनुवाद लेबलिंग द्वारा पीछा अनुक्रम विशिष्ट Nicking endonucleases (NEases) पर सिंथेटिक ट्रिपल हेलिक्स के गठन oligodeoxynucleotides, पेप्टाइड न्यूक्लिक एसिड या बाल के लिये कांटा polyamides पर भरोसा करते हैं। 37 में सूचीबद्ध हैं) 1,2 डीएनए MTase की मध्यस्थता लेबलिंग अधिक सामान्य बनाता है जो सीमित कर रहे हैं।

डबल सक्रिय AdoMet analogues के साथ प्रोटीन की विशिष्ट लेबलिंग मुख्य रूप से प्रोटिओमिक अनुसंधान, जटिल जैविक मिश्रण 27,28 में प्रोटीन MTases के लिए नए substrates के जैसे पहचान में अनुप्रयोगों की दिशा में निर्देशित किया गया है, लेकिन अन्य अनुप्रयोगों, कार्यात्मक अध्ययन तरह, यह भी संभव होना चाहिए। MTase की मध्यस्थता लेबलिंग मुख्य रूप से इन विट्रो में शुद्ध MTases के साथ प्रदर्शन किया गया है हाल ही में 40 सूचित किया गया है, के रूप में लेबलिंग भी जीवित कोशिकाओं में प्राप्त किया जा सकता है। बेशक, विशिष्ट प्रोटीन लेबलिंग के लिए कई अन्य तरीकों 3,4 उपलब्ध हैं। इंजीनियर कोशिकाओं का उपयोग अप्राकृतिक अमीनो एसिड का समावेश इसके अलावा वे आम तौर पर आत्म-लेबलिंग टैग के साथ ब्याज की प्रोटीन के आनुवंशिक fusions की आवश्यकता होती है / पीआरएंजाइम की मध्यस्थता लेबलिंग के लिए oteins या टैग। इस संबंध में प्रोटीन MTases के लिए substrates के रूप में सेवारत कम पेप्टाइड दृश्यों, जैसे एन टर्मिनल हिस्टोन पूंछ, ब्याज की एक प्रोटीन को इनकार किया जा सकता है और विशेष रूप से AdoMet analogues और इसी प्रोटीन MTases के साथ लेबल।

44 - अंत में, छोटे अणु MTases की biocatalytic प्रदर्शनों की सूची सिंथेटिक AdoMet के साथ 41 analogues का विस्तार किया जा सकता है। इस उपन्यास जैविक गतिविधियों के लिए स्क्रीनिंग में दिलचस्प आवेदनों का पता लगाना चाहिए जो प्राकृतिक उत्पादों, जैसे एंटीबायोटिक दवाओं या polyketides में संरचनात्मक विविधता को पेश करने के लिए एक नया दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
6BAz Synthesized according to Weinhold et al., Patent number US 8,129,106, published March 6, 2012.
β-Mercaptoethanol Serva 28625
Acetic acid Fisher Scientific 10304980
Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1 Serva 10688
UltraPure Agarose Invitrogen 16500100
Ammonium persulfate (APS) Serva 13375
Bis-Tris Gerbu 1304
Boric acid Gerbu 1115
Bromophenol blue Na salt Serva 15375
Copper(II) sulfate Aldrich C1297
Chloroform Fisher Scientific 10020090
Coomassie Brilliant Blue Serva 17525
EDTA disodium salt Gerbu 1034
Ethanol Merck 100983
GelRed (10,000x in water) Biotium 41003
Glycerol (99.5%) Gerbu 2006
FastRuler Low Range DNA Ladder Thermo Scientific SM1103
Histone H3 Expression plasmid obtained from Dr. Philipp Voigt and Prof. Danny Reinberg; expression and isolation according to T. J. Richmond et al., J. Mol. Biol. 1997, 272, 301-311.
M.BseCI Expression plasmid obtained from Dr. Michael Kokkinidis; expression and isolation according to Kapetaniou et al., Acta Cryst. 2006, F63, 12-14.
Methanol Fisher Scientific 10675112
Magnesiumchloride  hexahydrate J.T. Baker 4003
MOPS Gerbu 1081
Sodium chloride Gerbu 1112
pH strip (Neutralit) Merck 1,095,330,001
pBR322 Thermo Scientific SD0041
R.TaqI (10 u/µl) Thermo Scientific ER0671
SeAdoYn Synthesized according to Willnow et al., ChemBioChem 2012, 13, 1167-1173.
Set7/9 Expression plasmid obtained from Prof. Danny Reinberg, expression and isolation according to D. Reinberg et al., Genes Dev.2002, 16, 479-489.
Streptavidin Gerbu 3058
(+)-Sodium L-ascorbate Sigma Life Science A7631
SDS Granular Gerbu 1833
di-Sodium hydrogenphosphate Merck 106,586
TAMRA azide Synthesized according to reference 30: Willnow et al., ChemBioChem 2012, 13, 1167-1173.
TaqI buffer (10x) Thermo Scientific B28
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) Acros Organics 42058
Tris-HCl Gerbu 1028
Tris-X (TRIS-base) Gerbu 1018
Tris(3-hydroxypropyltriazolyl-methyl)amine (THPTA) Sigma-Aldrich 762342

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References

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बायोकैमिस्ट्री अंक 93, AdoMet सैम aziridine cofactor डबल सक्रिय cofactor मिथाइल डीएनए मेथिलिकरण प्रोटीन मेथिलिकरण बायोटिन लेबलिंग प्रतिदीप्ति लेबलिंग mTAG मुस्कुरा
Methyltransferases और cofactor analogues साथ न्यूक्लिक एसिड और प्रोटीन के अनुक्रम-विशिष्ट लेबलिंग
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Hanz, G. M., Jung, B., Giesbertz, A., Juhasz, M., Weinhold, E. Sequence-specific Labeling of Nucleic Acids and Proteins with Methyltransferases and Cofactor Analogues. J. Vis. Exp. (93), e52014, doi:10.3791/52014 (2014).

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