Summary
DNA und Proteine sequenzspezifisch mit Affinität oder fluoreszierenden Reportergruppen mit DNA- oder Protein-Methyltransferasen und synthetischen Cofaktor-Analoga bezeichnet. Abhängig von der Cofaktor-Spezifität der Enzyme, Aziridin- oder doppelt aktivierte Cofaktor-Analoga werden für ein- oder zweistufige Kennzeichnung verwendet.
Abstract
S -Adenosyl-L-Methionin (AdoMet oder SAM) -abhängige Methyltransferasen (MTase) katalysieren den Transfer des aktivierten Methylgruppe von AdoMet auf bestimmte Positionen in der DNA, RNA, Proteinen und kleinen Biomolekülen. Diese natürliche Methylierungsreaktion kann auf eine Vielzahl von Alkylierungsreaktionen unter Verwendung von synthetischen Cofaktor-Analoga ausgedehnt werden. Ersatz des reaktiven Sulfonium- Mitte AdoMet mit einem Aziridin-Ring führt zu Cofaktoren, die mit DNA von verschiedenen DNA MTasen koppelbar ist. Diese Aziridin Cofaktoren können mit Reportergruppen an verschiedenen Positionen des Adeninrestes ausgestattet und für S equence spezifischen M ethyltransferase- I L Abel ing der DNA (Smiling DNA) nduced verwendet werden. Als typisches Beispiel geben wir ein Protokoll für die Biotinylierung von pBR322 Plasmid-DNA an der 5'-ATCG A T-3'-Sequenz mit der DNA MTase M.BseCI und Aziridin Cofaktor 6BAz ineinem Schritt. Verlängerung der aktivierten Methylgruppe mit ungesättigten Alkylgruppen Ergebnisse in einer anderen Klasse von AdoMet-Analoga, die für m ethyltransferase gerichtete Nous Transfer von A ctivated G ruppen (MTAG) verwendet werden. Da die verlängerten Seitenketten durch Sulfonium Zentrum und der ungesättigten Bindung aktiviert werden diese Cofaktoren doppel aktiviert AdoMet Analoga genannt. Diese Analoga nicht nur als Cofaktoren für DNA MTasen wie Aziridin Cofaktoren, sondern auch für RNA, Proteinen und kleinen Molekülen MTasen. Sie werden typischerweise zur enzymatischen Modifizierung MTase Substrate einzigartige funktionelle Gruppen, die mit Reportergruppen in einem zweiten Syntheseschritt markiert verwendet. Dies wird in einem Protokoll für die Fluoreszenzmarkierung der Histon H3-Protein veranschaulicht. Eine kleine Propargylgruppe ist aus der Cofaktor analogen SeAdoYn an das Protein durch die Histon H3 Lysin 4 (H3K4) MTase Set7 / 9 gefolgt von Klick Kennzeichnung der übertragenealkinylierten Histon H3 mit TAMRA Azid. MTase vermittelte Markierung mit Cofaktor-Analoga ist eine Schlüsseltechnologie für viele spannende Anwendungen, einschließlich Identifizierung und funktionelle Untersuchung der MTase Substrate sowie DNA-Genotypisierung und Methylierungsnachweis.
Introduction
Spezifische Markierung von Nukleinsäuren und Proteinen 1,2 3,4 ist von großem Interesse für die funktionelle Charakterisierung, der medizinischen Diagnostik und (Nano-) Biotechnologie. Hier stellen wir eine enzymatische Markierungsverfahren für diese Biopolymere, die auf S -adenosyl-L-Methionin (AdoMet oder SAM) -abhängige Methyltransferasen (MTasen) basiert. Diese Enzymklasse (EC 2.1.1.) Zielt einzelnen nucleophilen Stellen (Stickstoff, Sauerstoff, Schwefel und Kohlenstoffatomen) innerhalb spezifischer Reste von Nukleinsäuren und Proteinen, und überträgt die aktivierte Methylgruppe des Cofaktors AdoMet (1A) 5 natürlich. Darüber hinaus können MTasen synthetischen Cofaktor-Analoga zur spezifischen Markierung mit Affinitätsmarkern, Fluorophore oder andere Etiketten (Abbildung 1B) 6 zu nutzen. Zwei Klassen von AdoMet-Analoga entwickelt: Aziridin Cofaktoren für S equence spezifischen M ethyltransferase- I L abel ing (lächelnd) 7 und Doppel aktiviert AdoMet-Analoga für m ethyltransferase gerichteter Nous Transfer von A ctivated G ruppen (MTAG) 8.
Figur 1: Die Reaktionen von Methyltransferasen (MTasen) A. Methyl Gruppe von der natürlichen Cofaktor AdoMet (SAM) auf verschiedenen Substraten, einschließlich DNA, RNA, Proteinen und kleinen Biomolekülen B. Labeling / Funktionalisierung von Nukleinsäuren und Proteinen (NNNNN = katalysiert.. Basenpaare der DNA, Nukleotiden von RNA und Aminosäuren für Proteine; XXXXX = Erkennungssequenz der MTase mit Ziel Rückstand in grün) mit synthetischen Cofaktor-Analoga. Aziridin Cofaktoren, die eine Reportergruppe (blaue Kugel)an den Adenin gebunden sind sequenzspezifisch mit der Zielrest (links), und doppelklicken aktiviert AdoMet-Analoga gekoppelt führen zu erweiterter Alkylketten, der eine chemische Reporter Y (rechts), die von bioorthogonale Klick-Reaktion in einem zweiten Schritt bezeichnet werden kann übertragen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Aziridin Cofaktoren funktionieren am besten mit DNA MTasen. Sie enthalten einen dreigliedrigen Ring mit einem Stickstoffatom, 9 (oder ein N -mustard 10,11) anstelle der Sulfonium- Zentrum als reaktive Gruppe. Protonierung des Stickstoffatoms aktiviert den Aziridinring für den nucleophilen Angriff durch die Zielnukleotidsequenz, die Kopplung des ganzen Cofaktor mit DNA kovalent führt. Durch das Anbringen Reportergruppen an den Adeninring die Aziridin Kofaktoren kann in Kombination mit DNA MTasen verwendet, um DNA in einem Schritt zu kennzeichnen (werden
Fig. 2: Sequenzspezifische einstufigen Biotinylierung von DNA mit M.BseCI und 6BAz Die DNA MTase M.BseCI erkennt die doppelsträngige DNA-Sequenz 5'-ATCG A T-3 'und natürlich methyliert die Aminogruppe des zweiten Adenin Rückstand (grün) mit AdoMet. Mit dem Aziridin Cofaktor 6BAz der Verlauf der Reaktion verändert wird und M.BseCI führt zu spezifischen DNA-Biotinylierung durch Kopplung des gesamten Cofaktor einschließlich Biotin (blau) mit der Ziel Adenin zu sequenzieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Doppel aktiviert AdoMet-Analoga enthalten verlängert ungesättigte Seitenketten statt einer Methylgruppe an der Sulfonium- Zentrum (1B 20. Die ungesättigte Doppel- oder Dreifachbindung in β-Stellung zu dem Sulfoniumsalz Zentrum elektronisch kompensiert ungünstige sterische Effekte im Übergangszustand durch Konjugation Stabilisierung. Da sowohl die Sulfonium-Center und die ungesättigte Bindung aktivieren Sie die Seitenkette für die enzymatische Übertragung wurden diese Cofaktoren doppelt aktivierte AdoMet-Analoga genannt. Typischerweise werden sie verwendet, um Seitenketten mit einzigartigen chemischen Gruppen (chemischer Reporter), wie Amino, Alkin- und Azidgruppen in einem zweiten Schritt 8,21 zu übertragen, für die chemoselektive Etikettierung. In der Regel können mit einem Doppelklick aktiviert AdoMet-Analoga nicht nur als Co-Faktoren für die DNA-MTasen 8,20,21 sondern auch für RNA MTasen 22,23 und Protein MTasen 24-28 ermöglicht zusätzliche Kennzeichnung von RNA und Proteinen. Allerdings sind die verlängerten Seitenketten sterisch anspruchsvoller als eine Methylgruppe und eine Vergrößerung der MTase aktiven Zentren durch Protein-Engineering ist often erforderlich, um eine effiziente Übertragungsraten zu erzielen. Eine andere Lösung für dieses Problem ist es, eine AdoMet-Analogon mit einem kleinen Propargylgruppe (drei Kohlenstoffatome), wobei das terminale Alkin hat zwei Funktionen: 1. Stabilisierung des Übergangszustands bei der enzymatischen Übertragung und 2. Reaktivgriff für folgende chemische Modifikationen von Kupfer- katalysierte Azid-Alkin-Cycloaddition (CuAAC) Klickchemie. Es stellte sich heraus, dass die resultierende propargylische AdoMet analogen 29 ist unter neutralen oder leicht basischen Bedingungen und nur bedingt recht instabil. Dieser Nachteil kann durch den Ersatz des Schwefelatoms mit Selen fixiert werden. Der resultierende Cofaktor 5 '- [(Se) [(3S) -3-Amino-3-carboxypropyl] prop-2-ynylselenonio] -5'-Desoxyadenosin (SeAdoYn, Bild 3) durch Wildtyp-DNA erlaubt, RNA und Protein MTasen 30-32, die die Notwendigkeit für das Protein-Engineering in vielen Fällen aufheben. Dies wird durch Fluoreszenz pro exemplifiziert Protein Markierung mit dem Histon H3 Lysin 4 (H3K4) MTase Set7 / 9 33 (Abbildung 3, siehe Protokoll Abschnitt 3: Zweistufige Proteinmarkierung durch Doppelklick aktiviert Kofaktoren).
Fig. 3: Sequenzspezifische zweistufige Fluoreszenzmarkierung von Histon H3 mit Set7 / 9, SeAdoYn und TAMRA Azid Das Protein MTase Set7 / 9 natürlich methyliert die Aminogruppe des Lysins 4 in Histon H3 (H3K4, grün) mit AdoMet. Mit dem Doppel aktiviert Cofaktor SeAdoYn die MTase trägt eine kleine Propargylgruppe (rot) an den Lysinrest. Das angeschlossene Klemme Dreifachbindung wird dann selektiv in einer bioorthogonale Klick-Reaktion (Kupfer-katalysierte Azid-Alkin-Cycloaddition, CuAAC) mit Azid-derivatisierten TAMRA (Tetramethylrhodamin, blau) Fluorophor modifiziert.Last / 52.014 / 52014fig3highres.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
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Protocol
1. Allgemeine Hinweise
- Speicher Aziridin Cofaktor 6BAz (in DMSO) und Protein MTase Set7 / 9 bei -80 ° C und alle anderen Reagenzien, wie doppel aktiviert Cofaktor SeAdoYn und DNA MTase M.BseCI (in 50% Glycerin) bei -20 ° C.
- Bestimmen Sie die Konzentration von 6BAz und SeAdoYn durch UV / Vis-Spektroskopie unter Verwendung des Extinktionskoeffizienten ε 269nm (6BAz) = 16.000 cm -1 M -1 und 260 nm ε (SeAdoYn) = 15.400 cm -1 M -1 in VE-Wasser. Man bestimmt die Konzentration der MTasen nach dem Bradford-Assay oder bei der Extinktionskoeffizient ist, durch direkte Absorption bei 280 nm.
- Versuchen Sie, um zu vermeiden, Blasen, die durch intensive Pipettieren oder Vortexen, um Verlust der Enzymaktivität zu verhindern. Stattdessen mischen durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren.
- Beim Hinzufügen Aziridin Cofaktoren aus Stammlösungen in DMSO sicherstellen, dass DMSO-Endkonzentration in dem Test wenigerals 5%. Immer auch 10 mM Magnesiumionen in dem Assay-Puffer, um nicht-spezifische Reaktionen mit DNA zu verhindern.
- Beim Hinzufügen Doppel aktiviert Cofaktoren aus sauren Stammlösungen verwenden kleine Mengen (hochkonzentrierten Stammlösungen) auf pH-Änderungen zu vermeiden und sicherzustellen, dass der pH-Wert der Testlösung nicht wesentlich ändert. Vermeiden Thiole, beispielsweise β-Mercaptoethanol oder Dithiothreitol (DTT), in dem Assaypuffer, da sie mit dem Klick-Reaktion durch Komplexbildung der benötigten Kupferionen stören können.
2. Ein-Schritt-Markierung von DNA durch Aziridin Cofaktoren
- Sequenzspezifischen Methyltransferase-induzierte Etiketten ing (lächelnd) von Plasmid-DNA mit DNA M.BseCI MTase und Aziridin Cofaktor 6BAz.
- Auftauen Cofaktor Lösung bei 20 ° C und bereiten die Reaktionsgemische auf Eis.
- Zusätzlich zur Durchführung des Assays eine "Cofaktor" -Steuerung, um alle nicht-spezifischen Modifikationen und eine & # visualisieren8220; Enzym "Kontrolle, um sicherzustellen, dass die MTase Zubereitung frei von natürlichen Cofaktor AdoMet.
- Für den Assay Mix 2 ul 10x Modifikation Puffer (enthaltend 100 mM Tris-HCl, 100 mM MgCl 2, 20 mM β-Mercaptoethanol, pH 7,4), 2 ul von pBR322 (0,5 ug / ul), 10 eq. M.BseCI pro Erkennungssequenz auf der DNA (1 Erkennungssequenz in pBR322) und dem Aziridin Cofaktor 6BAz bis zu einer Endkonzentration von 60 & mgr; M in einem Gesamtvolumen von 20 ul. Fügen Cofaktor und DNA MTase letzten.
HINWEIS: β-Mercaptoethanol ist giftig, ätzend und umweltschädliche. - Für die "Cofaktor" Kontrolle hinzufügen entsalztem Wasser anstelle von M.BseCI und für die "Enzym" Kontrolle hinzufügen entsalztem Wasser anstelle von 6BAz.
- Mischen Sie die Lösungen durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren.
- Die Röhrchen bei 55 ° C inkubieren 1 Std.
- Kurz zentrifugieren, um alle Flüssigkeit an dem Boden der Röhrchen zu sammeln.
- Restriktions-Modifikations-Assay zur DNA-Modifikation zu prüfen.
- Es wird eine Lösung durch Mischen von 10 ul 10x R.TaqI Puffer (enthaltend 100 mM Tris-HCl, 50 mM MgCl 2, 1 M NaCl, 1 mg / ml Rinderserumalbumin, pH 8,0), 80 & mgr; l deionisiertes Wasser und 3,3 ul der Restriktionsendonuklease (Rease) aus Thermus aquaticus (R.TaqI, 10 U / ul). Achten Sie auf die Rease im letzten Schritt hinzuzufügen.
- Zu jedem Röhrchen aus 2.1.7 hinzuzufügen 2 ul 10x R. TaqI-Puffer und 28 ul der Lösung von oben (2.2.1).
- Mischen Sie die Lösungen durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren.
- Die Röhrchen bei 65 ° C Inkubation 30 min.
- Kurz zentrifugieren, um alle Flüssigkeit an dem Boden der Röhrchen zu sammeln.
- Elektro Shift Assay (EMSA) mit Streptavidin funktionelle Änderung zu überprüfen.
- Entfernen von 25 ul aus jedem Röhrchen (2.2.5) und füge 2,4 ul einer Streptavidin-Lösung (1 mM in Bezug auf Streptavidin monomer in Streptavidin-Puffer, enthaltend 100 mM Na 2 HPO 4, 100 mM NaCl, pH 7,5; 4 Äquivalente Gesamt Biotin). Hinzufügen 2,4 ul Streptavidin-Puffer zu den verbleibenden Rohren.
- Alle Röhrchen bei 37 ° C inkubieren 1 Std.
- Analyse mittels Agarose-Gelelektrophorese.
- Mit 5 ul 6x Ladepuffer (0,25% Bromphenolblau, 30% Glycerin) in jedes Röhrchen.
- Mischen Sie die Lösungen vorsichtig.
- Last 10 ul jeder Probe in die Vertiefungen von einem Agarosegel (1% Agarose in 0,5x TBE-Puffer, enthaltend 1x GelRed von einem 10.000-Stammlösung).
- Führen Sie das Gel in 0,5 x TBE-Puffer mit 80 V für ca. 1 Std.
- Visualisieren DNA-Banden auf einem UV-Tisch (312 nm) mit einer CCD-Kamera mit einem Filter (540 ± 50 nm) ausgestattet ist.
HINWEIS: UV-Licht die Augen und die Haut zu beschädigen.
3. Zwei-Schritt-Protein Labeling über Doppel aktivierte Cofaktoren
- MethyltransfLöschen-Regie Übertragung von Aktivgruppen (MTAG) mit Set7 / 9 und doppelklicken aktiviert Cofaktor SeAdoYn für Histon H3 Lysin 4 Kennzeichnung (Modifikationsschritt).
- Tauen Sie die Komponenten und bereiten die Reaktionsgemische auf Eis. HINWEIS: Halten Sie immer SeAdoYn gekühlt, um den Abbau zu vermeiden.
- Zusätzlich zur Durchführung des Assays eine "Cofaktor" -Steuerung, um alle nicht-spezifischen Modifikationen zu visualisieren, und ein "Enzym" Kontrolle, um nicht-spezifische Reaktionen der fluoreszierenden Sonde auszuschließen.
- Vorbereiten einer Testlösung (20 ul), die Modifikationspuffer (50 mM Tris-HCl, 5% Glycerin, pH 8,5), 10 & mgr; M Histon H3, 10 uM Set7 / 9 und 600 & mgr; M SeAdoYn (Gemisch der beiden Epimeren in Selen). In den letzten Schritten hinzufügen Cofaktor und dann MTase.
- Für die "Cofaktor" Steuer bereiten eine Testlösung wie in 3.1.3 und fügen 60 mM AdoMet um mit dem synthetischen Cofaktor konkurrieren. Für die "Enzym" Kontrolle hinzufügen entsalztem Wasser anstelle von SeAdoYn.
- Mischen Sie die Lösungen durch langsames Auf- und Abpipettieren. Der pH-Wert durch Zugabe von 1 & mgr; l jeder Lösung in dem oberen Bereich eines pH-Streifen (pH 5 - 10).
- Bei 37 ° C für 2 Std.
- In der Zwischenzeit bereiten ein 12% SDS Polyacrylamidgel (Laufgel: 357 mM Bis-Tris, pH 6,5-6,8, 0,1% (w / v) APS, 0,04% (v / v) TEMED und 12% Acrylamid / Bisacrylamid 37,5: 1 ; Lade Gels: 357 mM Bis-Tris, pH 6,5-6,8, 0,1% (w / v) APS, 0,04% (v / v) TEMED und 5% Acrylamid / Bisacrylamid 37,5: 1).
HINWEIS: Acrylamid / Bisacrylamid ist giftig und gesundheitsgefährdenden. Während dieses Vorgangs Handschuhe tragen.
- Chemische Kennzeichnung alkinylated Lysin 4 in Histon H3 durch Kupfer-katalysierte Azid-Alkin-Cycloaddition (CuAAC) (Markierungsschritt).
- Kurz vor dem Ende der Modifizierungsreaktion bereiten 5x Klick Mischung, enthaltend 3 mM CuSO 4, 3 mM Tris (3-hydroxypropyl-triazolylmethyl) amin (THPTA), 250 mM Natriumascorbat und 6 mM TAMRA Azids mit einemGesamtvolumen von 20 ul.
- Mit 5 ul des frisch hergestellten 5x Klick Mischung zu jedem Röhrchen, um die CuAAC beginnen und löschen den Modifikationsreaktion.
- Vorsichtig mischen nach oben und unten.
- Schützen Sie alle Rohre mit Aluminiumfolie vor Licht auf Photobleaching des Fluorophors zu vermeiden.
- Inkubiere bei 20 ° C für 1 Stunde.
- Proteinfällung, um überschüssige freie TAMRA Fluorophor zu entfernen.
- Um Überstrahlen des fluoreszierend markierten Histon H3 durch intensive in-Gel-Fluoreszenz der freien TAMRA Fluorophor zu vermeiden, entfernen Sie überschüssige Fluorophor durch Fällung von Proteinen (3.3.2 - 3.3.4) 34.
- In 75 ul Methanol, 18,8 ul Chloroform und 50 ul entionisiertem Wasser zu jedem Röhrchen und vortexen kurz nach jeder Zugabe. Zentrifugieren bei 16.000 × g für 5 min. Die obere Phase ohne Störung der Grenzschicht, die das Protein enthält.
- In 56,3 ul Methanol zu der verbleibenden Phase in jedes Rohr, Wirbel und Zentrifuge bei 16.000 × g für 5 min, um das Protein zu pelletieren. Entfernen Sie den Überstand. Wiederholen Sie diesen Schritt, um das Pellet zu waschen.
- Decken Sie die offene Rohre mit einem fusselfreien Tuch und lassen Sie sie für 15 trocken - 30 min.
- Analyse über SDS-PAGE.
- Man löst die ausgefällten Proteine aus 3.3.4 in 20 ul SDS-Ladepuffer (50 mM Tris-HCl, 2,5% (w / v) SDS, 10% (v / v) Glycerin, 320 mM β-Mercaptoethanol und 0,05% (w / v) Bromphenolblau, pH 6,8). Achten Sie darauf, um das Pellet vollständig auflösen durch Spülen der Wände der Rohre mit einer Pipette.
- Inkubieren der Proben bei 95 ° C für 10 min und ließ sie abkühlen auf 20 ° C.
- Kurz zentrifugieren, um alle Flüssigkeit an dem Boden der Röhrchen zu sammeln.
- Legen der gesamten Menge von jeder Probe in die Vertiefungen eines SDS-Polyacrylamidgels (3.1.7). Benutzen 50 mM MOPS, 50 mM Tris-X (Tris-Base), 5 mM EDTA, 0,1% (w / v) SDS als Laufpuffer für die Elektrophorese.
- Führen Sie das Gel mit 120 V für ca. 90 min.
- Visualisierung der im Gel auf eine Fluoreszenz-UV-Tabelle (312 nm) mit einer CCD-Kamera mit einem Filter (540 nm ± 50 nm) ausgestattet ist.
HINWEIS: UV-Licht die Augen und die Haut zu beschädigen.
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Representative Results
Ein-Schritt-Markierung von DNA durch Aziridin Cofaktoren
Dieses Beispiel Reaktion mit der DNA MTase M.BseCI, die den zweiten Adenin innerhalb des doppelsträngigen 5'-ATCG A-T-3'-Sequenz modifiziert ist und eine Erkennungsstelle auf dem Plasmid pBR322 (4A) durchgeführt. Um das Plasmid Kennzeichnung zu testen, wird pBR322 mit der Restriktionsendonuklease (ReaSE) R.TaqI (5'-TCGA-3 '), herausgefordert. R.TaqI sieben Stellen am pBR322 umfasst, von denen eine in der M.BseCI Website enthalten. Wenn die Kennzeichnung auf, wird die M.BseCI Website gegen Spaltung geschützt werden und eine neue Fragment mit 683 Basenpaaren (bp) wird zu bilden, während zwei weitere Fragmente verschwinden (315 und 368 bp). Natürlich, wenn die Analyse DNA-Markierung mit anderen DNA MTasen verschiedenen REases mit entsprechenden Erkennungssequenzen verwendet werden sollte.
Das Agarosegel in 4B zeigt deutlich die erscheintrung eines neuen Fragments mit 683 bp (Bahn 3). Dies zeigt, dass die Kennzeichnung der M.BseCI Website aufgetreten. Nur der Assay (Spur 3) zeigt dieses Fragment. Die "Cofaktor" Kontrolle (Spur 5) sowie die "Enzym" Kontrolle (Spur 7) diese Band fehlt. Vor allem die "Enzym" Steuerung ist wichtig, da es zeigt, daß die natürliche Cofaktor AdoMet nicht in der Enzymzubereitung vorhanden ist. Spezifität der Markierungsreaktion wird durch Elektro Shift Assay (EMSA) nach Zugabe von Streptavidin (4B und Detail in 4C) demonstriert. Elektromobilität des 683 bp verzögert wird, während die Mobilität aller anderen Fragmenten ohne M.BseCI Seite ist unverändert im Vergleich zu den Kontrollen (vergleiche Spur 4 mit Spuren 6 und 8).
Abbildung 4: Ablaufspezifische Biotinylierung von pBR322 Plasmid-DNA mit M.BseCI und 6BAz. A. Plasmidkarte von pBR322, die Erkennungsstellen für M.BseCI (rot) und R.TaqI (grün) sowie die Länge der erwarteten DNA-Fragmente in Basenpaaren (bp) nach Restriktion mit R.TaqI. B. Analyse von DNA- Fragmentierung und EMSA durch Agarosegelelektrophorese. M = Marker, Spuren 1 und 2: Plasmid-DNA nur, Bahnen 3 und 4: Assay, Bahnen 5 und 6: "Cofaktor" Kontrolle, Bahnen 7 und 8: "Enzym" Kontrolle. Die Spuren 2, 4, 6 und 8 enthalten zusätzlich Streptavidin. C Vergrößerte Einsatz von B. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Zwei-Stufen-Markierung von Proteinen durch Doppelklicken aktiviert Cofaktoren
Als ein Beispiel für die zweistufige Kennzeichnung MTase Substrate mit Doppel-aktivierte AdoMet-Analoga haben wir uns für die Histon-H3 Lysin 4 (H3K4) MTase Set7 / 9 und die kleine SeAdoYn Cofaktor. Nach der enzymatischen Transfer der aktivierten Propargylgruppe zu der Histon H3-Substrat (erste Stufe) wird das terminale Alkin chemisch mit einem Azid-modifizierten TAMRA Fluorophor CuAAC Click-Chemie (zweiter Schritt) bezeichnet (vergleiche Figur 3). Analyse der Markierungsreaktion wird durch SDS-PAGE durchgeführt und in-Gel-Fluoreszenzdetektion (5A). Der Assay (Spur 1) zeigt eine fluoreszierende Bande entsprechend Histon H3 anzeigt, dass die Seitenkette des Cofaktors erfolgreich übertragen wurde und das modifizierte Protein mit dem TAMRA Fluorophor markiert. Keine Bands sind in der "Co-Faktor" und "Enzym" Kontrollen (Spuren 2 und 3) zeigen, dass die Kennzeichnung von Histon H3 sichtbar wird durch den MTase vermittelt. Daher unspezifische chemische Markierung entweder durch den Cofaktor allein (erste Stufe) oder während CuAAC (zweiter Schritt) ausgeschlossen werden kann. Die "Cofaktor" Steuerung d durchgeführtifferently als in dem Protokoll für die einstufige DNA-Markierung. Dies liegt daran, Ausfällung von Histon H3 ist effizienter in Gegenwart Set7 / 9 und dem Auslassen der Protein MTase können reduzierte Mengen von Histon H3 in der Ladekontrolle führen. Daher haben wir eine hohe Konzentration des natürlichen Cofaktors AdoMet mit SeAdoYn konkurrieren. Laden von Histon H3 können durch Färbung des Gels mit Coomassie-Blau nach Fluoreszenzdetektion gesteuert werden.
MTase Substrate können auch mit Biotin statt Fluorophore mit Hilfe Azid-derivatisierten Biotin in der zweiten chemischen Schritt 30 zu kennzeichnen. Biotinylierung von Proteinen wird bequem durch Western-Blot mit Meerrettichperoxidase-konjugiertem Avidin analysiert. Dies ist in Figur 5B für die Biotinylierung des Histons H3 mit Set7 / 9, SeAdoYn und Azid-modifiziertes Biotin dargestellt. Der Test in Spur 1 zeigt eine klare Band für den markierten Histon H3. Das Fehlen von Bands der "Enzym" (Bahn 2)und "Cofaktor" Kontrolle (Bahn 3) zeigt erneut, dass die Kennzeichnung ist spezifisch für die MTase. Die "Cofaktor" Steuer wird einfach in der Abwesenheit von Protein MTase geführt, weil die Western Blot-Analyse keine Entfernung überschüssiger Biotin durch Proteinfällung erforderlich.
Abbildung 5: Kennzeichnung von Histon H3 mit dem Protein MTase Set7 / 9 und SeAdoYn gefolgt von Klick-Reaktionen mit Azid-derivatisierten Etiketten. A. In-Gel-Fluoreszenz zur Ladesteuerung TAMRA-markierter Histon H3 und Kontrollen sowie der Färbung mit Coomassie-Blau. B. Western-Blot-Analyse von biotinylierten Histone H3 und Kontrollen unter Verwendung von Avidin-Meerrettich-Peroxidase (HRP) -Konjugat. Versuchsbedingungen waren ähnlich den für die Fluoreszenzmarkierung in A (enzymatische Modifizierung: 6,581; M Histon H3, 10 uM Set7 / 9, 600 uM SeAdoYn, in 50 mM Tris-HCl, 5 mM MgCl 2, 5% Glycerol, pH 9,0, 30 ° C, 3 h; chemische Markierung:. 0,6 mM CuSO 4, 0,6 mM THPTA, 50 mM Natriumascorbat, 1,2 mM Biotin-Azid, 37 ° C, 1 h) Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
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Discussion
Ein-Schritt-Markierung von DNA mit DNA MTasen und Aziridin Cofaktoren (lächelnd DNA) ist eine robuste Methode, aber einige Aspekte sollten bei der Planung des Experiments werden.
Aziridin Cofaktor: Der 6BAz Konzentration zur DNA-Markierung mit M.BseCI betrug 60 uM. Bei Verwendung anderer DNA MTasen sollte die Cofaktor-Konzentration optimiert werden, zum Beispiel so niedrigen Konzentrationen wie 20 & mgr; M wurden mit der DNA MTase M.TaqI 19 eingesetzt. Low 6BAz Konzentrationen haben den Vorteil, dass ein vierfachen Überschuß von Streptavidin (Bindungsstellen in Bezug auf die gesamte Menge an Biotin im Assay) können direkt nach der Inkubation mit ReaSE hinzugefügt werden, ohne sich mit Analyse durch EMSA. Ansonsten sollte die biotinylierte DNA gereinigt werden, um überschüssige Cofaktor entfernen und Verschmieren der DNA zu vermeiden während Agarose-Gelelektrophorese. Beim Hinzufügen Aziridin Cofaktoren aus Stammlösungen in DMSO stellen Sie sicher, dass die endgültige DMSO-Konzentration in the Test beträgt unter 5%. Zu viel DMSO können Enzyme zu inaktivieren. Aziridin Cofaktoren immer bei -80 ° C lagern, um den Abbau zu vermeiden.
DNA MTase: Enzymatische Kopplung Aziridin Cofaktoren mit DNA zu starken Produkt-Inhibitoren und DNA MTasen müssen in stöchiometrischen Mengen verwendet werden, führen. Verwenden Sie deshalb immer mehr als 1 Äquivalent DNA MTase. Die meisten DNA MTasen copurify mit gebundenen AdoMet die durch extensive Dialyse oder Waschen die Enzymen auf eine Säule mit großen Volumina Puffer entfernt werden muss. Die "Enzym" Steuer wird zeigen, ob AdoMet ist noch in der Enzymzubereitung vorhanden. Markierung mit M.BseCI kann auch durch Inkubation über Nacht bei 37 ° C durchgeführt werden.
Modifikation Puffer: Füge 10 mM Magnesiumionen in dem Puffer, um unspezifische Reaktionen Aziridin Cofaktoren mit DNA zu verhindern. Wenn Magnesiumionen führen zur Aktivierung der Verunreinigung Nukleasen kann Barium-Ionen statt hinzugefügt werden.
Für die Sequenz-spezifische Markierung von DNA nicht nur lächelnd DNA, sondern auch MTAG eingesetzt werden. Hier Doppel aktiviert Cofaktoren für die enzymatische Übertragung von Seitenketten mit einzigartigen funktionellen Gruppen der DNA verwendet. Diese funktionellen Gruppen, beispielsweise primäre Amine, können mit einer Vielzahl von Reportergruppen, wie Biotin oder Fluorophoren von NHS-Ester-Chemie in einem zweiten Schritt 8,35,36 modifiziert werden. Alternativ haben wir begonnen, Doppel aktiviert AdoMet-Analoga mit großen Seitenketten die Reportergruppe bereits enthalten, synthetisieren und verwendet sie für die DNA-Markierung in einem Schritt.
Das zweistufige Mtag Markierungsverfahren für Proteine mit der Doppel aktivierte Cofaktor SeAdoYn wurde erfolgreich mit einer Reihe von Protein MTasen 30,31 verwendet. Allerdings sollten die folgenden Anmerkungen vor der Durchführung des Experiments zu betrachten.
Doppel aktiviert Cofaktor: Diese Co-Faktoren, einschließlich MeeresDoyn, unter sauren Bedingungen und Pflege gespeichert zu achten, daß der pH der Modifikationslösung nicht signifikant auf Kofaktor zusätzlich verändern. Wir den pH immer überprüfen, indem 1 ul der Modifikationslösung auf einen pH-Streifen und, falls der pH zu niedrig ist, kleine Mengen von Natriumhydroxid-Lösung (50 mM), um den pH einzustellen. Darüber hinaus sollte Cofaktor-Analoga in geringer Lautstärke hinzugefügt werden, um den pH-Wert zu vermeiden. Somit sollte minimal Cofaktor Konzentrationen für volle benötigte Änderung für andere MTasen bestimmt und hochkonzentriert Cofaktor Stammlösungen bevorzugt. Cofaktor-Konzentrationen liegen typischerweise zwischen 10 und 600 um variiert. Die chemische Synthese von doppelt aktivierten Cofaktoren ergibt typischerweise eine etwa 1: 1 Epimere Schwefel oder Selen und Abtrennung des biologisch aktiven Epimer, entsprechend dem S -Epimer von AdoMet, vom inaktiven Epimers ist oft schwierig zu erreichen. Somit sind Cofaktor-Konzentrationentypischerweise eine Isomerenmischung gegeben. Doppel aktivierte Cofaktor-Analoga sind ziemlich unstabil bei Raumtemperatur und bei -20 ° C gelagert werden. Stellen Sie außerdem sicher, dass die Stammlösungen auf Eis auftauen und kalten halten sie beim Pipettieren. Sie können wieder eingefroren werden, sondern um reproduzierbare Aktivität, die wir empfehlen, Aliquots machen zu gewährleisten.
Protein MTase: Für Transformationen mit Doppel aktivierten Kofaktoren die MTasen kann in katalytischen Mengen verwendet werden. Allerdings sind MTasen oft langsam Enzyme mit Umsatzzahlen im Bereich min -1 mit dem natürlichen Cofaktor AdoMet. Aus praktischen Gründen verwendet man häufig die MTasen in stöchiometrischen Mengen und Minimierung Inkubationszeit und Temperatur (typischerweise 10 min bis 2 h und 20 ° C bis 37 ° C). Die "Cofaktor" Steuer variiert je nach der Art der Reportergruppe und Detektion. Für die Beschriftung der Biotin MTase wird einfach weggelassen und Analyse kann durch Western-Blot (5B durchgeführt werden (5A) durchgeführt wird. Wenn jedoch Ausfällung von Histon H3 führt zu einem Verlust an Protein, kann SDS-PAGE verlängert und Schuß freier TAMRA Fluorophor wird aus dem Gel mit dem Bromphenolblau vorne laufen.
Modifikationspuffer: Die optimale Enzympuffer können verwendet werden, aber Thiole, wie Dithiothreitol (DTT) und β-Mercaptoethanol, vermieden werden sollte. Sie binden an Kupferionen und b sperren Sie die folgenden CuAAC Klick-Reaktion.
CuAAC klicken Reaktion: Die Endkonzentration des TAMRA Azid sollte doppelt so hoch wie der Alkin-Konzentration ist. Bei der Verwendung von biologischen Extrakten Kupfer und Liganden-Konzentration sollte je bis zu 5 mM erhöht werden. TAMRA Azid in DMSO besser löslich ist als in Wasser. Sicherstellen, dass die Endkonzentration an DMSO weniger als 12% ist. Erweiterte Inkubationszeiten können zu Proteinschädigung und Verschmieren auf der SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese führen. Somit sollte die Markierungsreaktion entweder durch Proteinfällung oder Addition von Thiolen gestoppt werden.
Dieses zweistufige Markierungsverfahren können ebenfalls verwendet werden, um Protein MTase Substraten mit Biotin markieren entweder für Western-Blot-Detektion (Figur 5B) oder Trennung mit Streptavidin-beschichteten magnetischen Kügelchen. Zusätzlich können aktivierte Doppel AdoMet-Analoga verwendet werden, um DNA, RNA und kleine natürliche Produkte mit entsprechenden MTasen markieren.
ve_content "> Vergleich zu den meisten anderen Markierungsverfahren für Nukleinsäuren und Proteine, hat MTase-vermittelte Etikettierung den Vorteil, dass natives Substrate können direkt verwendet werden, und keine weitere Modifikation erforderlich ist. Selbstverständlich muß darauf geachtet werden, daß die natürlichen Substrate nicht gesperrt werden durch Methylierung durch eine entsprechende MTase in vivo. Zusätzlich ist MTase-vermittelte Kennzeichnung sehr flexibel sowohl hinsichtlich der Reportergruppen, die Biotin, Fluorophore oder andere molekulare Markierungen sowie Ziele für MTasen umfassen. Unterfütterung, eine Datenbasis für die Beschränkung Endonukleasen und DNA MTasen listet mehr als 700 experimentell charakterisierten DNA MTasen mit Hunderten von verschiedenen Erkennungssequenzen zwischen zwei und acht bp 37 und es wird erwartet, dass mehr als 200 verschiedene MTasen aller Art sind in der humanen Zelle 38 erzeugt wird. Eine wichtige Determinante für MTase-Aktivität, ob die AdoMet Analog passt in das aktive Zentrum des Enzyms. Obwohl die dargestellten Cofaktoren 6Baz und SeAdoYn sind so konzipiert, kleine reaktive Gruppen haben, einige MTasen nicht ohne weiteres akzeptieren. In diesen Fällen könnten die aktiven Zentren durch Protein-Engineering erweitert werden, wie es für die DNA 35, 23 RNA und Protein MTasen 25 gezeigt - 28 mit sterisch anspruchsvoller Doppel aktiviert AdoMet-Analoga. Sequenz spezifische Markierung von DNA und RNA mit AdoMet Analoga von großem Interesse für die Genotypisierung (DNA Mapping) 36 und Methylierungsnachweis 39, Funktionsstudien von DNA / RNA und DNA / RNA-modifizierende Enzyme, 15 sowie für (nano) Biotechnologie 13, 14 und Gentransfer 19. Andere Verfahren zur Sequenz-spezifischen kovalenten DNA-Markierung beruhen auf synthetischen Tripelhelix-bildende-Oligodesoxynukleotide, Peptid-Nukleinsäuren oder Hairpin Polyamiden als Zielgeräte oder auf sequenzspezifische Nicking-Endonuklease (NEases), gefolgt von Nick-Translationsmarkierung.
Spezifische Markierung von Proteinen mit Doppel aktiviert AdoMet-Analoga wurde vor allem auf Anwendungen in der Proteinforschung, zB Identifizierung neuer Substrate für Protein MTasen in komplexen biologischen Mischungen 27,28 gerichtet, aber auch andere Anwendungen, wie funktionelle Studien, sollte auch möglich sein. Obwohl MTase vermittelte Kennzeichnung wurde hauptsächlich mit gereinigtem MTasen in vitro durchgeführt, kann die Kennzeichnung auch in lebenden Zellen erzielt wie kürzlich 40 gemeldet werden. Natürlich sind viele andere Verfahren zur spezifischen Markierung von Proteinen verfügbar sind 3,4. Neben Einbau von nichtnatürlichen Aminosäuren mit veränderten Zellen sie benötigen in der Regel genetische Fusionen des Proteins von Interesse mit Selbstkennzeichnung Tags / proteins oder Tags für enzymvermittelten Kennzeichnung. In dieser Hinsicht kurzen Peptidsequenzen als Substrate für Protein MTasen dienen, beispielsweise N-terminale Histon-Enden, um ein Protein von Interesse fusioniert werden und spezifisch mit AdoMet-Analoga und entsprechender Protein MTasen markiert.
44 - Schließlich kann die biokatalytische Repertoire kleines Molekül MTasen mit synthetischen AdoMet 41 erweitert werden Analoga. Dies stellt einen neuen Ansatz für die strukturelle Vielfalt in natürlichen Produkten, wie zB Antibiotika oder Polyketide, die interessante Anwendungen im Screening nach neuen biologischen Aktivitäten finden sollte einzuführen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6BAz | Synthesized according to Weinhold et al., Patent number US 8,129,106, published March 6, 2012. | ||
| β-Mercaptoethanol | Serva | 28625 | |
| Acetic acid | Fisher Scientific | 10304980 | |
| Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1 | Serva | 10688 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500100 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Serva | 13375 | |
| Bis-Tris | Gerbu | 1304 | |
| Boric acid | Gerbu | 1115 | |
| Bromophenol blue Na salt | Serva | 15375 | |
| Copper(II) sulfate | Aldrich | C1297 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | 10020090 | |
| Coomassie Brilliant Blue | Serva | 17525 | |
| EDTA disodium salt | Gerbu | 1034 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| GelRed (10,000x in water) | Biotium | 41003 | |
| Glycerol (99.5%) | Gerbu | 2006 | |
| FastRuler Low Range DNA Ladder | Thermo Scientific | SM1103 | |
| Histone H3 | Expression plasmid obtained from Dr. Philipp Voigt and Prof. Danny Reinberg; expression and isolation according to T. J. Richmond et al., J. Mol. Biol. 1997, 272, 301-311. | ||
| M.BseCI | Expression plasmid obtained from Dr. Michael Kokkinidis; expression and isolation according to Kapetaniou et al., Acta Cryst. 2006, F63, 12-14. | ||
| Methanol | Fisher Scientific | 10675112 | |
| Magnesiumchloride hexahydrate | J.T. Baker | 4003 | |
| MOPS | Gerbu | 1081 | |
| Sodium chloride | Gerbu | 1112 | |
| pH strip (Neutralit) | Merck | 1,095,330,001 | |
| pBR322 | Thermo Scientific | SD0041 | |
| R.TaqI (10 u/µl) | Thermo Scientific | ER0671 | |
| SeAdoYn | Synthesized according to Willnow et al., ChemBioChem 2012, 13, 1167-1173. | ||
| Set7/9 | Expression plasmid obtained from Prof. Danny Reinberg, expression and isolation according to D. Reinberg et al., Genes Dev.2002, 16, 479-489. | ||
| Streptavidin | Gerbu | 3058 | |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Sigma Life Science | A7631 | |
| SDS Granular | Gerbu | 1833 | |
| di-Sodium hydrogenphosphate | Merck | 106,586 | |
| TAMRA azide | Synthesized according to reference 30: Willnow et al., ChemBioChem 2012, 13, 1167-1173. | ||
| TaqI buffer (10x) | Thermo Scientific | B28 | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Acros Organics | 42058 | |
| Tris-HCl | Gerbu | 1028 | |
| Tris-X (TRIS-base) | Gerbu | 1018 | |
| Tris(3-hydroxypropyltriazolyl-methyl)amine (THPTA) | Sigma-Aldrich | 762342 |
References
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