Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

תיוג רצף ספציפי של חומצות גרעין וחלבונים עם Methyltransferases ואנלוגים כקו-פקטורים

Published: November 22, 2014 doi: 10.3791/52014
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1
1Institute of Organic Chemistry, Department of Chemistry, RWTH Aachen University
* These authors contributed equally

Summary

DNA וחלבונים-במיוחד רצף שכותרתו עם זיקה או קבוצות כתב ניאון באמצעות methyltransferases DNA או חלבון ואנלוגים cofactor סינטטיים. בהתאם לסגולי כקו-הפקטורים של האנזימים, aziridine או אנלוגים cofactor מופעלים כפולים מועסקים תיוג אחת או שני שלבים.

Abstract

S -Adenosyl-l-מתיונין (AdoMet או SAM) methyltransferases + התלוי (MTase) לזרז את העברת הקבוצה מתיל מופעלת מAdoMet לתפקידים מסוימים בדנ"א, רנ"א, חלבונים ומולקולות ביולוגיים קטנות. תגובת מתילציה טבעית זה יכול להיות מורחב למגוון רחב של תגובות אלקילציה באמצעות אנלוגים cofactor סינטטיים. החלפה של מרכז sulfonium תגובה של AdoMet עם טבעת aziridine מובילה לקו-פקטורים שיכולים להיות בשילוב עם ה- DNA על ידי MTases DNA השונים. יכול להיות מצויד קו-פקטורי aziridine אלה עם קבוצות כתב בעמדות שונות של מחצית אדנין ומשמשים לM equence הספציפי S ethyltransferase- אני nduced ing הבל L של DNA (DNA מחייך). כדוגמא טיפוסית שאנו נותנים לפרוטוקול biotinylation של פלסמיד דנ"א pBR322 ברצף 5'-ATCG 'T-3 עם DNA MTase M.BseCI והקו-פקטורי aziridine 6BAz בצעד אחד. סיומת של קבוצה מתיל מופעלת עם תוצאות קבוצות אלקיל בלתי רוויות בסוג אחר של אנלוגים AdoMet המשמשים לransfer T מ 'מכוון ethyltransferase של roups ctivated G (mTAG). הואיל וצד הרשתות המורחבות מופעלות על ידי מרכז sulfonium וקשר בלתי רווי, קו-פקטורים אלה נקראים אנלוגים AdoMet כפולים הופעלו. אנלוגים אלה לא רק פונקציה כקו-פקטורים לMTases DNA, כמו הקו-פקטורי aziridine, אלא גם לRNA, חלבונים וMTases מולקולה קטנה. הם משמשים בדרך כלל לשינוי האנזימטית של מצעי MTase עם קבוצות פונקציונליות ייחודיות אשר כותרתו עם קבוצות כתב בצעד כימי שני. זה בא לידי ביטוי בפרוטוקול לתיוג הקרינה חלבון היסטון H3 של. קבוצת propargyl קטנה מועברת מSeAdoYn האנלוגי cofactor לחלבון על ידי ליזין H3 היסטון 4 (H3K4) MTase Set7 / 9 ואחריו תיוג לחיצהH3 היסטון alkynylated עם אזיד טמרה. תיוג בתיווך MTase עם אנלוגים cofactor הוא טכנולוגיה המאפשרת ליישומים מרגשים רבים כוללים זיהוי ומחקר פונקציונלי של מצעי MTase כמו גם genotyping DNA וגילוי מתילציה.

Introduction

תיוג ספציפי של חומצות גרעין וחלבוני 1,2 3,4 הוא עניין גדול לאפיונים פונקציונליים, אבחון רפואי וביוטכנולוגיה (ננו). כאן אנו מציגים שיטת תיוג האנזימטית לbiopolymers אלה המבוסס על -adenosyl-l-מתיונין S (AdoMet או SAM) methyltransferases + התלוי (MTases). המעמד הזה של אנזימים (EC 2.1.1.) מיועד לעמדות פרט nucleophilic (חנקן, חמצן, גופרית ואטומה פחמן) בתוך שאריות ספציפיות של חומצות גרעין וחלבונים ובאופן טבעי מעביר את הקבוצה מתיל מופעלת של AdoMet cofactor (איור 1 א) 5. בנוסף, MTases יכול לנצל אנלוגים cofactor סינטטיים לתיוג ספציפי עם תגי זיקה, fluorophores או תוויות אחרות (איור 1) 6. שתי כיתות של אנלוגים AdoMet פותחו: קו-פקטורי Aziridine לי ethyltransferase- M S equence ספציפי L ing (מחייך) 7 ואנלוגים כפולים מופעלים AdoMet לransfer T מ 'מכוון ethyltransferase של roups G ctivated (mTAG) 8.

איור 1
איור 1: תגובות זרזו ידי methyltransferases (MTases) העברת א תיל קבוצה מהקו-הפקטורים הטבעיים AdoMet (SAM) למצעים שונים, כולל DNA, RNA, חלבונים ומולקולות ביולוגיים קטנות B. התיוג / functionalization של חומצות גרעין וחלבונים (לעדכונו =.. זוגות בסיסים לDNA, נוקלאוטידים לחומצות אמינו RNA וחלבונים; XXXXX = רצף הכרה בMTase עם שאריות יעד בירוק) עם אנלוגים cofactor סינטטיים. קו-פקטורי Aziridine המכילים קבוצת כתב (כדור הכחול)מצורף לטבעת אדנין הם הרצף במיוחד בשילוב עם שאריות היעד (משמאל) ואנלוגים מופעלים כפולים AdoMet להוביל להעברת חלק מרשתות אלקיל הוארכו ביצוע Y כתב כימי (מימין) שיכול להיות מתויג בתגובה לחץ bioorthogonal בשלב שני. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

קו-פקטורי Aziridine יעבדו הכי טוב עם MTases DNA. הם מכילים טבעת membered שלוש עם אטום חנקן 9 (או N -mustard 10,11) במקום מרכז sulfonium קבוצה תגובתי כ. Protonation של אטום חנקן זה מפעיל את טבעת aziridine להתקפת nucleophilic ידי נוקלאוטיד היעד שמוביל לקוולנטיים צימוד של כל הקו-הפקטור עם DNA. על ידי הצמדת קבוצות כתב לטבעת אדנין הקו-פקטורי aziridine ניתן להשתמש בשילוב עם MTases DNA לתייג DNA בשלב אחד ( g> איור 1, משמאל) 7,12. זו באה לידי הביטוי בפירוט לbiotinylation של DNA עם 13 6BAz - 15 (קו-פקטור aziridine עם ביוטין מצורף לעמדת 6 של טבעת אדנין) ואדנין הספציפי DNA MTase מstearothermophilus Bacillus (M.BseCI) 16 (איור 2, ראה פרוטוקול סעיף 2: תיוג צעד אחד של DNA באמצעות aziridine קו-פקטורים). בנוסף לM.BseCI ("רצף ההכרה, MTases DNA מThermus aquaticus (M.TaqI, 5'-TCG -3 5'-ATCG T-3)"), מheamolyticus Haemophilus (M.HhaI, 5 "-G C GC-3 ') ומספירופלסמה (M.SssI, 5'- C G-3") שימשו בהצלחה לbiotinylate DNA עם 6BAz 17. יתר על כן, יכול להיות מועסק קו-פקטורי aziridine לתיוג DNA הקרינה צעד אחד 18,19.

ontent "fo: לשמור-together.within-page =" תמיד "> איור 2
איור 2:. Biotinylation צעד אחד ספציפי רצף של DNA עם M.BseCI ו6BAz DNA MTase M.BseCI מכיר את רצף פעמיים תקועים DNA 5'-ATCG T-3 "ובאופן טבעי methylates קבוצת אמינו של אדנין השני שאריות (ירוק) באמצעות AdoMet. עם הקו-פקטור aziridine 6BAz במהלך התגובה משתנה וM.BseCI מוביל לרצף biotinylation DNA הספציפי על ידי צימוד כל cofactor כולל ביוטין (כחול) עם אדנין היעד. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

אנלוגים AdoMet מופעלים זוגי מכילים הוארכו שרשרות צד בלתי רוויות במקום קבוצה מתיל במרכז sulfonium (איור 1 20. הקשר כפול או משולש בלתי רווי בβ-עמדה למרכז sulfonium אלקטרוני מפצה אפקטים סטרית שליליים בתוך מדינת המעבר על ידי ייצוב conjugative. מאחר ששני מרכז sulfonium והקשר בלתי רווי להפעיל את שרשרת הצד להעברה האנזימטית, הקו-הפקטורים הללו בשם אנלוגים AdoMet כפול הופעלו. בדרך כלל, הם משמשים להעברת רשתות בצד עם קבוצות ייחודיות כימיות (כתבים כימיים), כמו קבוצות אמינו, alkyne ויזיד, לתיוג הכימותרפיה סלקטיבי בשלב שני 8,21. באופן כללי, אנלוגים מופעלים כפולים AdoMet לא יכולים לתפקד רק כקו-פקטורים לDNA MTases 8,20,21 אלא גם לRNA MTases 22,23 וMTases חלבון 24-28 המאפשרים תיוג נוסף של RNA וחלבונים. עם זאת, בצד הרשתות המורחבות הן sterically תובעניים יותר מקבוצה מתיל והרחבת האתרים הפעילים MTase על ידי חלבון הנדסה היא לעתים קרובותen נדרש כדי להשיג קצבי העברה יעילה. פתרון נוסף לבעיה זו הוא להשתמש אנלוגי AdoMet עם קבוצה קטנה propargyl (שלושה פחמנים) שבו alkyne המסוף משרת שתי פונקציות: 1. ייצוב של מצב המעבר בעת ההעברה האנזימטית ו2. ידית תגובה לשינויים כימיים הבאים על ידי נחושת cycloaddition אזיד-alkyne זרז (CuAAC) לחץ כימיה. התברר כי propargylic כתוצאה האנלוגית AdoMet 29 הוא די יציב בתנאים ניטראליים או מעט בסיסיים ושימוש מוגבל בלבד. חסרון זה יכול להיות קבוע על ידי החלפת אטום הגופרית עם סלניום. הקו-פקטור תוצאת 5 '- [(Se) [(3 S) -3-אמינו-3-carboxypropyl] אבזר-2-ynylselenonio] -5'-deoxyadenosine (SeAdoYn, איור 3) מתקבל על ידי DNA wild-type, RNA וMTases חלבון 30-32 שיבטלו את הצורך בהנדסת חלבונים במקרים רבים. זה בא לידי ביטוי על ידי הקרינה פרו תיוג חלבון עם ליזין H3 היסטון 4 (H3K4) MTase Set7 / 9 33 (איור 3, ראה סעיף פרוטוקול 3: תיוג חלבון שני שלבים באמצעות קו-פקטורים כפולים מופעלים).

איור 3
איור 3:. תיוג הקרינה שני שלבי רצף ספציפי של היסטון H3 עם Set7 / 9, אזיד SeAdoYn וטמרה החלבון MTase Set7 / 9 באופן טבעי methylates קבוצת אמינו של ליזין 4 בH3 היסטון (H3K4, הירוקה) באמצעות AdoMet. עם הקו-הפקטור מופעל הכפול SeAdoYn MTase מעביר קבוצה קטנה propargyl (אדום) לשאריות ליזין. הקשר משולש, המסוף המצורף מכן שונו באופן סלקטיבי בתגובת לחץ bioorthogonal (cycloaddition אזיד-alkyne-זרז נחושת, CuAAC) עם (tetramethylrhodamine, כחול) fluorophore-derivatized אזיד טמרה.עומס / 52,014 52014fig3highres.jpg "target =" / _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הוראות כלליות

  1. הקו-פקטור aziridine חנות 6BAz (בDMSO) וחלבון MTase Set7 / 9 ב -80 ° C וכל חומרים כימיים האחרים, כולל קו-פקטור מופעל כפול SeAdoYn וDNA MTase M.BseCI (ב- 50% גליצרול) ב -20 ° C.
  2. קבע את הריכוז של 6BAz וSeAdoYn באמצעות / Vis ספקטרוסקופיה באמצעות UV 269nm מקדמי ε ההכחדה (6BAz) = 16,000 -1 סנטימטר M -1 וε 260nm (SeAdoYn) = 15,400 -1 סנטימטר M -1 במים ללא יונים. קבע את הריכוז של MTases ידי assay ברדפורד או, אם מקדם ההכחדה נגיש, באמצעות קליטה ישירה ב 280 ננומטר.
  3. נסה להימנע מיצירת בועות על ידי pipetting או vortexing האינטנסיביים על מנת למנוע אובדן של פעילות אנזים. במקום זאת, לערבב בעדינות על ידי pipetting מעלה ומטה.
  4. בעת הוספת קו-פקטורי aziridine מפתרונות מניות בDMSO לוודא שריכוז DMSO הסופי בassay הוא פחותמ -5%. תמיד כולל 10 מ"מ יוני מגנזיום במאגר assay כדי למנוע תגובות שאינן ספציפיות עם DNA.
  5. בעת הוספת קו-פקטורים כפולים מופעלים מפתרונות מניות חומצי להשתמש בנפחים קטנים (פתרונות מניות מרוכזים מאוד), כדי למנוע שינויי pH ולוודא כי pH של תמיסת assay אינו משתנה באופן משמעותי. הימנע thiols, למשל, β-mercaptoethanol או dithiothreitol (DTT), במאגר assay כי הם יכולים להפריע לתגובה לחץ על ידי complexation של יוני הנחושת הנדרש.

2. תיוג צעד אחד של DNA באמצעות קו-פקטורי Aziridine

  1. ing Label-מושרה Methyltransferase רצף ספציפי (מחייך) של ה- DNA פלסמיד עם M.BseCI DNA MTase והקו-פקטורי aziridine 6BAz.
    1. להפשיר את פתרון הקו-הפקטור של 20 מעלות צלזיוס ולהכין את תערובות תגובה על קרח.
    2. בנוסף לassay לבצע שליטה "קו-פקטור", כדי לחזות כל שינוי שאינו ספציפי, ו& #8220; אנזים "שליטה, לוודא כי הכנת MTase היא ללא AdoMet cofactor הטבעית.
    3. לתערובת 2 μl assay של חיץ שינוי 10x (המכיל 100 מ"מ טריס-HCl, 100 מ"מ MgCl 2, 20 מ"מ β-mercaptoethanol, pH 7.4), 2 μl של pBR322 (0.5 מיקרוגרם / μl), 10 EQ. M.BseCI לרצף הכרה בDNA (רצף הכרה 1 בpBR322) והקו-פקטורי aziridine 6BAz לריכוז סופי של 60 מיקרומטר בתוך נפח כולל של 20 μl. הוספת קו-פקטור וDNA MTase אחרון.
      הערה: β-mercaptoethanol הוא רעיל ומאכל ומזיק לסביבה.
    4. לשליטה "קו-הפקטור" להוסיף מים ללא יונים במקום M.BseCI ולשליטה "אנזים" להוסיף מים ללא יונים במקום 6BAz.
    5. מערבבים את הפתרונות על ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה.
    6. דגירה הצינורות על 55 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
    7. בקצרה צנטריפוגות כדי לאסוף את כל הנוזל בתחתית הצינורות.
  2. assay Restriction-השינוי כדי לוודא שינוי DNA.
    1. הכן פתרון על ידי ערבוב 10 μl 10x חיץ R.TaqI (המכיל 100 מ"מ טריס-HCl, 50 מ"מ MgCl 2, 1 M NaCl, 1 מ"ג / מיליליטר אלבומין בסרום שור, pH 8.0), מים ללא יוני 80 μl 3.3 μl של endonuclease הגבלה (REase) מThermus aquaticus (R.TaqI, 10 U / μl). הקפד להוסיף REase בשלב האחרון.
    2. על צינור אחד מ2.1.7 להוסיף 2 μl של 10x ר 'תקי חיץ ו -28 μl של הפתרון מלמעלה (2.2.1).
    3. מערבבים את הפתרונות על ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה.
    4. דגירה הצינורות על 65 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
    5. בקצרה צנטריפוגות כדי לאסוף את כל הנוזל בתחתית הצינורות.
  3. assay משמרת electromobility (Emsa) עם streptavidin לאמת שינוי פונקציונלי.
    1. הסר 25 μl מצינור אחד (2.2.5) ולהוסיף 2.4 μl של פתרון streptavidin (1 מ"מ ביחס למ 'streptavidinonomer במאגר streptavidin מכיל 100 מ"מ Na 2 4 HPO, 100 מ"מ NaCl, pH 7.5; 4 שווה של ביוטין בסך הכל). להוסיף 2.4 μl של חיץ streptavidin לצינורות הנותרים.
    2. דגירה כל הצינורות על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
  4. ניתוח באמצעות ג'ל אלקטרופורזה agarose.
    1. הוסף 5 μl של חיץ טעינת 6x (bromophenol 0.25% הכחולים, גליצרול 30%) על צינור אחד.
    2. מערבבים בעדינות את הפתרונות.
    3. טען 10 μl של כל דגימה לתוך הבארות של ג'ל agarose (agarose 1% במאגר TBE 0.5x מכיל 1x GelRed מפתרון 10,000x מלאי).
    4. הפעל את הג'ל במאגר TBE 0.5x עם 80 V לכ. שעה 1.
    5. דמיינו להקות DNA על שולחן UV (312 ננומטר) עם מצלמת CCD מצויד במסנן (540 ± 50 ננומטר).
      הערה: אור UV מזיק לעיניים ועור.

3. תיוג חלבון שני שלבים באמצעות קו-פקטורים הופעל זוגי

  1. Methyltransfלמחוק-בימוי העברת קבוצות הופעל (mTAG) עם Set7 / 9 וקו-פקטורים מופעלים כפולים SeAdoYn לתיוג ליזין 4 H3 היסטון (שלב שינוי).
    1. להפשיר את הרכיבים ולהכין את תערובות תגובה על קרח. הערה: שמור תמיד SeAdoYn מקורר כדי למנוע השפלה.
    2. בנוסף לassay לבצע שליטה "קו-פקטור", כדי לחזות כל שינוי ספציפי שאינו, ושליטה "אנזים", שלא לכלול את תגובות הלא ספציפיות של הבדיקה הניאון.
    3. הכן פתרון assay (20 μl) המכיל מאגר שינוי (50 מ"מ טריס-HCl, גליצרול 5%, pH 8.5), 10 מיקרומטר H3 היסטון, 10 מיקרומטר Set7 / 9 ו -600 מיקרומטר SeAdoYn (תערובת של שניהם epimers בסלניום). בשלבים האחרונים להוסיף קו-פקטור ולאחר מכן MTase.
    4. לשליטה "קו-הפקטור" להכין פתרון assay כמו ב3.1.3 ולהוסיף 60 מ"מ AdoMet להתחרות בקו-פקטור הסינתטי. לשליטה "האנזים" להוסיף מים ללא יונים במקום SeAdoYn.
    5. מערבבים את הפתרונות על ידי pipetting לאט למעלה ולמטה. בדוק את ה- pH על ידי הוספת 1 μl של כל פתרון לשדה העליון של רצועת pH (טווח pH 5 - 10).
    6. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 2.
    7. בג'ל בינתיים להכין 12% ג'ל polyacrylamide SDS (ריצה: 357 Bis-טריס pH 6.5-6.8 מ"מ, 0.1% (w APS / v), 0.04% (V / V) TEMED ו -12% acrylamide / bisacrylamide 37.5: 1 ; ג'ל טעינה: 357 מ"מ Bis-טריס pH 6.5-6.8, 0.1% (w / v) APS, 0.04% (V / V) acrylamide TEMED ו 5% / bisacrylamide 37.5: 1).
      הערה: Acrylamide / bisacrylamide הוא רעיל ומסוכן לבריאות. ללבוש כפפות במהלך הליך זה.
  2. תיוג כימי של ליזין alkinylated 4 בהיסטון H3 באמצעות cycloaddition אזיד-alkyne (שלב תיוג)-זרז נחושת (CuAAC).
    1. רגע לפני סוף תגובת השינוי להכין תערובת 5x לחץ מכילה 3 מ"מ 4 CuSO, 3 טריס מ"מ (3-hydroxypropyl-triazolylmethyl) האמין (THPTA), ascorbate נתרן 250 מ"מ ו 6 מ"מ אזיד טמרה עםנפח כולל של 20 μl.
    2. הוסף 5 μl של תמהיל לחץ 5x מוכן הטרי על צינור אחד להתחיל CuAAC ולהרוות את תגובת השינוי.
    3. מערבבים בעדינות על ידי pipetting מעלה ומטה.
    4. הגן על כל הצינורות בנייר אלומיניום מהאור, כדי למנוע צילום הלבנה של fluorophore.
    5. לדגור על 20 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
  3. ממטרים חלבון כדי להסיר את העודפים של fluorophore טמרה החופשי.
    1. כדי להימנע מoutshining של היסטון H3 הניאון שכותרתו על ידי אינטנסיבי הקרינה בג'ל של fluorophore טמרה החופשי, להסיר fluorophore העודף על ידי משקעים של חלבונים (3.3.2 - 3.3.4) 34.
    2. הוסף 75 מתנול μl, כלורופורם 18.8 μl ו -50 μl deionized מים על צינור אחד ובקצרה מערבולת לאחר כל ההוספה. צנטריפוגה XG ב 16,000 במשך 5 דקות. הסר את השלב העליון מבלי להפריע את שכבת הממשק, המכילה את החלבון.
    3. להוסיף 56.3 מתנול μl לשלב שנותר in צינור אחד, מערבולת ו צנטריפוגות ב16,000 XG במשך 5 דקות עד גלולה החלבון. הסר את supernatant. חזור על שלב זה לשטוף את גלולה.
    4. לכסות את הצינורות הפתוחים עם רקמה נטולה מוך ולתת להם להתייבש במשך 15 - 30 דקות.
  4. ניתוח באמצעות עמוד SDS.
    1. ממיסים את החלבונים זירז מ3.3.4 ב -20 חיץ μl SDS טעינה (50 מ"מ טריס-HCl, 2.5% (w / v) SDS, 10% (V / V) גליצרול, 320 מ"מ β-mercaptoethanol ו 0.05% (w / v) bromophenol כחול, pH 6.8). הקפד לפזר את גלולה לחלוטין על ידי שטיפת הקירות של הצינורות עם טפטפת.
    2. דגירה הדגימות ב 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ולתת להם להתקרר לטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס.
    3. בקצרה צנטריפוגות כדי לאסוף את כל הנוזל בתחתית הצינורות.
    4. טען את כל הסכום של כל דגימה לתוך הבארות של ג'ל SDS polyacrylamide (3.1.7). השתמש 50 מגבי מ"מ, 50 מ"מ טריס-X (טריס-בסיס), 5 מ"מ EDTA, 0.1% (w / v) SDS כחיץ פועל אלקטרופורזה.
    5. הפעל את הג'ל עם 120 V לכ. 90 דקות.
    6. דמיין את הקרינה על שולחן UV (ננומטר 312) בג'ל עם מצלמת CCD מצויד במסנן (540 ננומטר ± 50 ננומטר).
      הערה: אור UV מזיק לעיניים ועור.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

תיוג צעד אחד של DNA באמצעות קו-פקטורי Aziridine

תגובת דוגמא זו מתבצעת עם DNA MTase M.BseCI, אשר משנה את שאריות אדנין השניה בתוך רצף פעמיים תקועים 5'-ATCG T-3 "ויש לו אתר הכרה אחד על פלסמיד pBR322 (איור 4 א). כדי לבדוק תיוג פלסמיד, pBR322 הוא קרא תיגר עם endonuclease ההגבלה (REase) R.TaqI (5'-TCGA-3 "). יש R.TaqI שבעה אתרים בpBR322, שאחד מהם כלול באתר M.BseCI. אם תיוג מתרחש, אתר M.BseCI יהיה מוגן נגד מחשוף ושבר חדש עם 683 זוגות בסיסים (bp) יהווה בעוד שני שברים אחרים ייעלמו (315 ו -368 נ"ב). כמובן, בעת ניתוח תיוג DNA עם REases שונה MTases DNA האחר עם רצפי הכרה מקביל צריך להיות מועסק.

ג'ל agarose באיור 4 מציג את מופיע באופן ברוראהה של בר חדש עם 683 נ"ב (מסלול 3). זה מוכיח כי תיוג של אתר M.BseCI התרחש. רק assay (המסלול 3) מראה שבר זה. שליטת "הקו-הפקטור" (המסלול 5), כמו גם את השליטה "האנזים" (מסלול 7) חסרות הלהקה הזו. במיוחד השליטה "האנזים" היא חשובה משום שהיא מוכיחה כי הקו-הפקטורים הטבעיים AdoMet אינה נוכח בהכנת האנזים. הספציפיות של תגובת התיוג מודגמת על ידי assay משמרת electromobility (Emsa) על תוספת של streptavidin (איור 4 ופירוט ב4C). Electromobility של bp 683 הוא מפגר בזמן שהניידות של כל ברים האחרים בלי אתר M.BseCI בהשוואה ללא שינוי בבקרה (השווה מסלול 4 עם נתיבים 6 ו -8).

איור 4
איור 4: רצףbiotinylation הספציפי של DNA פלסמיד pBR322 עם M.BseCI ו6BAz. מפת א פלסמיד של pBR322 מראה אתרי הכרה לM.BseCI (אדום) וR.TaqI (ירוק), כמו גם את אורכו של שברי DNA צפויים בזוגות בסיסים (bp) לאחר הגבלה עם ניתוח R.TaqI. .ב DNA פיצול וEmsa על ידי ג'ל אלקטרופורזה agarose. M = Marker, מסלולים 1 ו -2: פלסמיד דנ"א רק, מסלולים 3 ו -4: assay, נתיבי 5 ו -6: שליטה "קו-פקטור", נתיבי 7 ו -8: שליטת "האנזים". Lanes 2, 4, 6 ו -8 בנוסף מכיל streptavidin. ג מוגדל הבלעה מB. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

תיוג שני שלבים של חלבונים באמצעות קו-פקטורים הופעל זוגי

כדוגמא לתיוג שני שלבים של MTase מצעים עם אנלוגים מופעלים כפולים AdoMet בחרנו היסטוןליזין H3 4 (H3K4) MTase Set7 / 9 והקו-פקטורי SeAdoYn הקטנים. לאחר העברה האנזימטית של קבוצת propargyl מופעלת על מצע H3 היסטון (השלב ​​הראשון), alkyne המסוף שכותרתו כימית עם טמרה fluorophore-אזיד שונה על ידי הכימיה CuAAC קליק (שלב שני) (השווה איור 3). ניתוח של תגובת התיוג נעשה על ידי SDS-PAGE וגילוי הקרינה ב- ג'ל (איור 5 א). Assay (מסלול 1) תערוכות להקת ניאון המתאימה להיסטון H3 מצביע על כך ששרשרת הצד של הקו-הפקטור הועברה בהצלחה והחלבון המהונדס שכותרתו עם fluorophore טמרה. אין להקות נראות ב" הקו-הפקטור "ובקרות" אנזים "(נתיבים 2 ו -3) מדגימות תיוג של היסטון H3 מתווך על ידי MTase. לכן, תיוג כימי שאינו ספציפי או על ידי הקו-הפקטור לבד (השלב ​​הראשון) או בCuAAC (שלב שני) ניתן לשלול. שליטת "הקו-הפקטור" מתבצעת דifferently מאשר בפרוטוקול תיוג DNA צעד אחד. סיבה לכך הוא משקעים של היסטון H3 הוא יעילים יותר בנוכחות Set7 / 9 והשמטת החלבון MTase יכול להוביל לכמויות מופחתות של היסטון H3 בשליטת הטעינה. לפיכך, הוספנו ריכוז גבוה של AdoMet cofactor הטבעית להתחרות עם SeAdoYn. טעינה של היסטון H3 ניתן לשלוט בקלות על ידי צביעת ג'ל עם Coomassie הכחול לאחר גילוי הקרינה.

יכולים גם להיות שכותרתו מצעי MTase עם ביוטין במקום fluorophores באמצעות ביוטין-derivatized אזיד בשלב הכימי השני 30. Biotinylation של חלבונים מנותחים בנוחות על ידי מערבי סופג עם avidin peroxidase מצומדות חזרת. זו מוצגת באיור 5 ב לbiotinylation של היסטון H3 עם Set7 / 9, SeAdoYn וביוטין-אזיד שונה. Assay בנתיב 1 מציג להקה ברורה להיסטון H3 שהכותרת. ההיעדרות של להקות ב" האנזים "(מסלול 2)ושליטה "קו-פקטור" (מסלול 3) מדגימה שוב התיוג שהוא ספציפי לMTase. שליטת "הקו-הפקטור" מתבצעת בפשטות בהעדר MTase החלבון כי ניתוח הכתם המערבי אינו דורש ההסרה של ביוטין העודף על ידי משקעים חלבון.

איור 5
איור 5: תיוג של היסטון H3 עם החלבון MTase Set7 / 9 וSeAdoYn אחריו תגובות לחצו עם תוויות-derivatized אזיד. א הקרינה בג'ל של ניתוח כתם B. המערבי טמרה שכותרת H3 היסטון ובקרות, כמו גם צביעה עם Coomassie הכחול לטעינה מלאה. של היסטון H3 biotinylated ובקרות באמצעות המצומד avidin-חזרת peroxidase (HRP). תנאי ניסוי היו מאוד דומים לאלה של תיוג הקרינה ב( שינוי האנזימטית: 6.581; H3 היסטון M, 10 מיקרומטר Set7 / 9, 600 מיקרומטר SeAdoYn, ב -50 מ"מ טריס-HCl, 5 מ"מ MgCl 2, 5% גליצרול, pH 9.0, 30 ° C, 3 שעות; תיוג כימי:. 0.6 מ"מ 4 CuSO, 0.6 מ"מ THPTA, ascorbate נתרן 50 מ"מ, 1.2 מ"מ ביוטין-אזיד, 37 ° C, 1 שעה) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

תיוג צעד אחד של DNA עם MTases DNA וקו-פקטורי aziridine (DNA מחייך) הוא שיטה חזקה אבל כמה היבטים יש לשקול בעת תכנון הניסוי.

קו-פקטור Aziridine: ריכוז 6BAz לתיוג DNA עם M.BseCI היה 60 מיקרומטר. בעת השימוש בMTases DNA האחר ריכוז הקו-הפקטור צריך להיות מותאם, ריכוזים למשל נמוך כמו 20 מיקרומטר להיות מועסק עם DNA MTase M.TaqI 19. יש ריכוזים נמוכים 6BAz היתרון שעודף פי ארבעה של streptavidin (אתרי קישור ביחס לכל הכמות של ביוטין בassay) ניתן להוסיף ישירות לאחר דגירה עם REase מבלי להפריע לניתוח על ידי Emsa. אחרת DNA biotinylated צריך להיות מטוהר להסיר cofactor העודפת ולהימנע מריחות של ה- DNA בג'ל אלקטרופורזה agarose. בעת הוספת קו-פקטורי aziridine מפתרונות מניות בDMSO לוודא כי ריכוז DMSO הסופי בהassay הדואר הוא פחות מ -5%. יותר מדי DMSO יכול להשבית אנזימים. תמיד לאחסן aziridine קו-פקטורים ב -80 ° C, כדי למנוע השפלה.

DNA MTase: צימוד אנזימתי של קו-פקטורי aziridine עם DNA יכול להוביל למעכבי מוצר חזקים וMTases DNA צריך להיות בשימוש בכמויות stoichiometric. לכן תמיד להשתמש שווה יותר מ 1 של DNA MTase. רוב MTases DNA copurify עם AdoMet הקשור אשר צריך להיות הוסר על ידי דיאליזה נרחבת או שטיפת האנזימים על עמודה עם כמויות גדולות של חיץ. שליטת "האנזים" תגיד אם AdoMet עדיין קיים בהכנת האנזים. תיוג עם M.BseCI יכול להיעשות גם על ידי דגירה במשך הלילה על 37 מעלות צלזיוס.

חיץ שינוי: כלול 10 יוני מגנזיום מ"מ במאגר כדי למנוע תגובות הלא ספציפיות של קו-פקטורי aziridine עם DNA. אם יוני מגנזיום יוביל להפעלה של nucleases זיהום, יוני בריום אפשר להוסיף במקום.

לתיוג הספציפי הרצף של DNA מחייך לא רק DNA, אלא גם יכול להיות מועסק mTAG. קו-פקטורים כאן כפול מופעלים משמשים להעברה האנזימטית של רשתות בצד עם קבוצות פונקציונליות ייחודיות ל- DNA. קבוצות אלה פונקציונליים, אמינים ראשוניים לדוגמא, יכולות להיות שונה עם מגוון רחב של קבוצות כתב, לרבות ביוטין או fluorophores, על ידי הכימיה אסתר NHS בשלב שני 8,35,36. לחלופין יש לנו התחלנו לסנתז אנלוגים AdoMet מופעלים כפולים עם צד רשתות גדולות כבר מכילות את קבוצת הכתב והשתמשתי בהם לתיוג DNA בשלב אחד.

שני שלבי הליך תיוג mTAG לחלבונים עם הקו-הפקטורים כפולים מופעלים SeAdoYn שמש בהצלחה עם מספר MTases חלבון 30,31. עם זאת, יש לקחת בחשבון את הדברים הבאים לפני ביצוע הניסוי.

קו-פקטורים כפולים הופעלו: קו-פקטורים אלה, כולל יםdoYn, מאוחסנים בתנאים ובטיפול חומצי יש לנקוט שpH של תמיסת השינוי אינו משנה באופן משמעותי על תוספת קו-פקטור. אנחנו תמיד לבדוק את ה- pH על ידי הוספת 1 μl של פתרון השינוי לרצועת pH ו, אם pH נמוך מדי, להוסיף כמויות קטנות של פתרון נתרן הידרוקסידי (50 מ"מ) כדי להתאים את ה- pH. בנוסף יש להוסיף אנלוגים cofactor בנפח נמוך, כדי למנוע שינויי pH. לפיכך, ריכוזי קו-פקטור מינימאליים דרושים לשינוי מלא צריכים להיקבע לMTases אחר ופתרונות מניות קו-פקטור מרוכז מאוד עדיפים. ריכוזי קו-פקטור מגוונים בדרך כלל בין 10 מיקרומטר ו -600 מיקרומטר. הסינתזה הכימית של קו-פקטורים מופעלים כפולים בדרך כלל תשואות 1 כ: תערובת 1 של epimers בגופרית או סלניום והפרדה של אפימר הפעיל מבחינה ביולוגית, המקביל ל-epimer S של AdoMet, מאפימר פעיל הוא לעתים קרובות קשה להשגה. לפיכך, ריכוזי קו-פקטור הםבדרך כלל ניתן לתערובת של איזומרים. אנלוגים cofactor מופעלים זוגי הם די יציבים בטמפרטורת חדר וצריכים להיות מאוחסנים ב -20 ° C. כמו כן, ודא להפשיר פתרונות המניות על קרח ולשמור אותם קר בpipetting. הם יכולים להיות קפוא שוב אבל כדי להבטיח פעילות לשחזור אנו ממליצים לעשות aliquots.

MTase חלבון: לשינויים בקו-פקטורים כפולים מופעל MTases ניתן להשתמש בכמויות קטליטי. עם זאת, לעתים קרובות MTases אנזימים איטיים שיש מספרי מחזור ב-1 מגוון דקות עם AdoMet cofactor הטבעית. מסיבות מעשיות לעתים קרובות אנו משתמשים בכמויות MTases stoichiometric ולצמצם את זמן דגירה וטמפרטורה (בדרך כלל 10 דקות לשעה 2 ו- 20 ° C עד 37 ° C). שליטת "הקו-הפקטור" משתנה, בהתאם לסוג של קבוצת כתב וגילוי. ליוטין תיוג MTase הוא פשוט הושמט וניתוח יכול להיעשות על ידי מערביים סופג (איור 5 (איור 5 א). עם זאת, אם משקעים של היסטון H3 מובילים לאובדן של חלבון, SDS-PAGE יכול להתארך ועודף של fluorophore טמרה החופשי ייגמר ג'ל עם החזית הכחולה bromphenol.

חיץ שינוי: חיץ האנזים האופטימלי ניתן להשתמש, אבל thiols, כמו dithiothreitol (DTT) וβ-mercaptoethanol, יש להימנע. הם נקשרים ליוני נחושת וb לנעול את התגובה לחץ CuAAC הבאה.

CuAAC לחץ תגובה: הריכוז הסופי של אזיד טמרה צריך להיות גבוה פי שניים ריכוז alkyne. בעת השימוש בתמציות ביולוגיות ריכוז הנחושת ויגנד צריך להיות מוגבר עד 5 מ"מ כל אחד. אזיד טמרה הוא טוב יותר מסיס בDMSO מאשר במים. ודא שהריכוז הסופי של DMSO הוא פחות מ -12%. פעמים דגירה ממושכות יכולות לגרום לנזק חלבון ומריחות על הג'ל polyacrylamide SDS. לפיכך, תגובת התיוג יש להפסיק או על ידי משקעים חלבון או תוספת של thiols.

גם הליך תיוג שני שלבים זה יכול לשמש כדי לתייג מצעי MTase חלבון עם ביוטין או לגילוי מערבי כתם (איור 5) או בידוד עם חרוזים מגנטיים streptavidin מצופה. בנוסף, ניתן להשתמש אנלוגים כפולים מופעלים AdoMet לתייג DNA, RNA ומוצרים טבעיים קטנים עם MTases המקביל.

ve_content "> בהשוואה למרבית שיטות תיוג האחרות לחומצות גרעין וחלבונים, יש תיוג תיווך MTase היתרון שמצעי ילידים יכולים לשמש באופן ישיר וללא שינוי נוסף נדרש. כמובן, יש להקפיד שהמצעים הטבעיים אינם חסומים על ידי מתילציה דרך MTase מקביל in vivo. בנוסף, תיוג תיווך MTase הוא מאוד גמיש הן מבחינת קבוצות כתב, הכוללות ביוטין, fluorophores או תגים מולקולריים אחרים, כמו גם יעדים לMTases. REBASE, בסיס נתונים להגבלה endonucleases וMTases DNA, מפרט יותר מ -700 MTases DNA בניסוי התאפיין במאות רצפי הכרה שונים הנעים 2-8 נ"ב 37 והוא צפוי כי יותר מ -200 MTases שונה מכל הסוגים מיוצרים בתאים האנושיים 38. גורם חשוב לפעילות MTase הוא האם אנלוגי AdoMet משתלב באתר הפעיל של האנזים. למרות הקו-הפקטורים מוצגים 6באז וSeAdoYn נועדו לי קבוצות תגובתי קטנות, כמה MTases אולי לא בקלות לקבל אותם. במקרים אלה האתרים הפעילים יכולים להיות מוגדלים על ידי הנדסת חלבון כפי שהוכיחו במשך 35 DNA, RNA 23 וMTases חלבון 25 - 28 עם אנלוגים AdoMet sterically תובעניים יותר הופעלו כפולים.

תיוג ספציפי רצף של DNA ו- RNA עם אנלוגים AdoMet הוא עניין גדול עבור genotyping (מיפוי DNA) 36 ומתילציה זיהוי 39, מחקרים תפקודיים של DNA / RNA ו- DNA אנזימי שינוי-RNA / 15 כמו גם לביוטכנולוגיה (ננו) 13, 14 ומסירת גן 19. שיטות אחרות לתיוג DNA רצף ספציפי קוולנטיים להסתמך על oligodeoxynucleotides הסינתטי המשולש יוצר סליל, חומצות גרעין פפטיד או polyamides סיכת הראש כמכשירי מיקוד או על endonucleases הרצף הספציפי nicking (NEases) ואחריו תיוג תרגום ניק. 37) מוגבלים שהופך את התיוג בתיווך MTase DNA יותר כללי.

תיוג ספציפי של חלבונים עם אנלוגים כפולים מופעלים AdoMet הופנה בעיקר כלפי יישומים במחקר proteomic, למשל זיהוי של מצעים חדשים לMTases חלבון בתערובות ביולוגיות מורכבות 27,28, אבל יישומים אחרים, כמו לימודים פונקציונליים, צריכים גם להיות ריאלי. למרות תיוג תיווך MTase שבוצע בעיקר בMTases המטוהר במבחנה, תיוג יכול גם להיות מושגת בתאים חיים כפי שדווח לאחרונה 40. כמובן, שיטות רבות אחרות לתיוג חלבון ספציפי זמינות 3,4. חוץ מזה שילוב של חומצות אמינו לא טבעיות תוך שימוש בתאים מהונדסים בדרך כלל הם דורשים שילובים גנטיים של החלבון של עניין עם תגי תיוג עצמי / יחסי ציבורoteins או תגי תיוג בתיווך אנזים. מבחינה זו רצפי פפטיד קצר המשמשים כמצעים לMTases חלבון, היסטון זנבות למשל N-terminal, יכולים להיות התמזגו חלבון של עניין ובמיוחד שכותרתו עם אנלוגים AdoMet וMTases חלבון המתאים.

לבסוף, רפרטואר biocatalytic של MTases מולקולה הקטנה ניתן להרחיב עם AdoMet הסינתטי אנלוגים 41-44. זה מייצג גישה חדשה להציג גיוון מבני למוצרים טבעיים, אנטיביוטיקה או polyketides למשל, שאמורה למצוא יישומים מעניינים בהקרנה לפעילות ביולוגית חדשה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6BAz Synthesized according to Weinhold et al., Patent number US 8,129,106, published March 6, 2012.
β-Mercaptoethanol Serva 28625
Acetic acid Fisher Scientific 10304980
Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1 Serva 10688
UltraPure Agarose Invitrogen 16500100
Ammonium persulfate (APS) Serva 13375
Bis-Tris Gerbu 1304
Boric acid Gerbu 1115
Bromophenol blue Na salt Serva 15375
Copper(II) sulfate Aldrich C1297
Chloroform Fisher Scientific 10020090
Coomassie Brilliant Blue Serva 17525
EDTA disodium salt Gerbu 1034
Ethanol Merck 100983
GelRed (10,000x in water) Biotium 41003
Glycerol (99.5%) Gerbu 2006
FastRuler Low Range DNA Ladder Thermo Scientific SM1103
Histone H3 Expression plasmid obtained from Dr. Philipp Voigt and Prof. Danny Reinberg; expression and isolation according to T. J. Richmond et al., J. Mol. Biol. 1997, 272, 301-311.
M.BseCI Expression plasmid obtained from Dr. Michael Kokkinidis; expression and isolation according to Kapetaniou et al., Acta Cryst. 2006, F63, 12-14.
Methanol Fisher Scientific 10675112
Magnesiumchloride  hexahydrate J.T. Baker 4003
MOPS Gerbu 1081
Sodium chloride Gerbu 1112
pH strip (Neutralit) Merck 1,095,330,001
pBR322 Thermo Scientific SD0041
R.TaqI (10 u/µl) Thermo Scientific ER0671
SeAdoYn Synthesized according to Willnow et al., ChemBioChem 2012, 13, 1167-1173.
Set7/9 Expression plasmid obtained from Prof. Danny Reinberg, expression and isolation according to D. Reinberg et al., Genes Dev.2002, 16, 479-489.
Streptavidin Gerbu 3058
(+)-Sodium L-ascorbate Sigma Life Science A7631
SDS Granular Gerbu 1833
di-Sodium hydrogenphosphate Merck 106,586
TAMRA azide Synthesized according to reference 30: Willnow et al., ChemBioChem 2012, 13, 1167-1173.
TaqI buffer (10x) Thermo Scientific B28
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) Acros Organics 42058
Tris-HCl Gerbu 1028
Tris-X (TRIS-base) Gerbu 1018
Tris(3-hydroxypropyltriazolyl-methyl)amine (THPTA) Sigma-Aldrich 762342

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gottfried, A., Weinhold, E. Sequence-specific covalent labelling of DNA. Biochem. Soc. Trans. 39, 623-628 (2011).
  2. Zohar, H., Muller, S. J. Labeling DNA for single-molecule experiments: methods of labeling internal specific sequences on double-stranded DNA. Nanoscale. 3, 3027-3039 (2011).
  3. Hinner, M. J., Johnsson, K. How to obtain labeled proteins and what to do with them. Curr. Opin. Biotechnol. 21, 766-776 (2010).
  4. Wua, Y. -W., Goody, R. S. Probing protein function by chemical modification. J. Pept. Sci. 16, 514-523 (2010).
  5. Struck, A. -W., Thompson, M. L., Wong, L. S., Micklefield, J. S-Adenosyl-methionine-dependent methyltransferases: Highly versatile enzymes in biocatalysis, biosynthesis and other biotechnological applications. ChemBioChem. 13, 2642-2655 (2012).
  6. Klimasauskas, S., Weinhold, E. A new tool for biotechnology: AdoMet-dependent methyltransferases. Trends Biotechnol. 25, 99-104 (2007).
  7. Pljevaljcic, G., Schmidt, F., Weinhold, E. Sequence-specific Methyltransferase-Induced Labeling of DNA (SMILing DNA). ChemBioChem. 5, 265-269 (2004).
  8. Lukinavicius, G., Lapiene, V., Stasevskij, Z., Dalhoff, C., Weinhold, E., Klimasauskas, S. Targeted labeling of DNA by methyltransferase-directed Transfer of Activated Groups (mTAG). J. Am. Chem. Soc. 129, 2758-2759 (1021).
  9. Pignot, M., Siethoff, C., Linscheid, M., Weinhold, E. Coupling of a nucleoside with DNA by a methyltransferase. Angew. Chem. Int. Ed. 37, 2888-2891 (1998).
  10. Weller, R. L., Rajski, S. R. Design, synthesis, and preliminary biological evaluation of a DNA methyltransferase-directed alkylating agent. ChemBioChem. 7, 243-245 (2006).
  11. Du, Y., Hendrick, C. E., Frye, K. S., Comstock, L. R. Fluorescent DNA Labeling by N-Mustard Analogues of S-adenosyl-l-methionine. ChemBioChem. 13, 2225-2233 (2012).
  12. Pljevaljcic, G., Schmidt, F., Scheidig, A. J., Lurz, R., Weinhold, E. Quantitative labeling of long plasmid DNA with nanometer precision. ChemBioChem. 8, 1516-1519 (1002).
  13. Wilkinson, S., et al. Molecular scale architecture: engineered three- and four-way junctions. Bioconjugate Chem. 19, 470-475 (2008).
  14. Braun, G., et al. Enzyme-directed positioning of nanoparticles on large DNA templates. Bioconjugate Chem. 19, 476-479 (2008).
  15. Kim, S., et al. Enzymatically incorporated genomic tags for optical mapping of DNA binding proteins. Chem. Int. Ed. 51, 3578-3581 (2012).
  16. Rina, M., Bouriotis, V. Cloning purification and characterization of the BseCI DNA methyltransferase from Bacillus stearothermophilus. Gene. 133, 91-94 (1993).
  17. Sequence-specific detection of methylation in biomolecules. US Patent. Weinhold, E., Meier, T., Düfel, H., Markert-Hahn, C., Schmuck, R. , 8,129,106 (2012).
  18. Pljevaljcic, G., Pignot, M., Weinhold, E. Design of a new fluorescent cofactor for DNA methyltransferases and sequence-specific labeling of DNA. J. Am. Chem. Soc. 125, 3492-3410 (2003).
  19. Schmidt, F. H. -G., Hüben, M., Gider, B., Renault, F., Teulade-Fichou, M. -P., Weinhold, E. Sequence-specific Methyltransferase-Induced Labelling (SMILing) of plasmid DNA for studying cell transfection. Bioorg. Med. Chem. 16, 40-48 (2008).
  20. Dalhoff, C., Lukinavicius, G., Klimasauskas, S., Weinhold, E. Direct transfer of extended groups from synthetic cofactors by DNA methyltransferases. Nat. Chem. Biol. 2, 31-32 (2006).
  21. Lukinavicius, G., Tomkuviene, M., Masevicius, V., Klimasauskas, S. Enhanced chemical stability of AdoMet analogues for improved methyltransferase-directed labeling of DNA. ACS Chem. Biol. 8, 1134-1139 (2013).
  22. Motorin, Y., et al. Expanding the chemical scope of RNA:methyltransferases to site-specific alkynylation of RNA for click labeling. Nucleic Acids Res. 39, 1943-1952 (1943).
  23. Schulz, D., Holstein, J. M., Rentmeister, A. A chemo-enzymatic approach for site-specific modification of the RNA cap. Angew. Chem. Int. Ed. 52, 7874-7878 (2013).
  24. Peters, W., et al. Enzymatic site-specific functionalization of protein methyltransferase substrates with alkynes for click labeling. Angew. Chem. Int. Ed. 49, 5170-5173 (2010).
  25. Islam, K., Zheng, W., Yu, H., Deng, H., Luo, M. Expanding cofactor repertoire of protein lysine methyltransferase for substrate labeling. ACS Chem. Biol. 6, 679-684 (2011).
  26. Wang, R., Zheng, W., Yu, H., Deng, H., Luo, M. Labeling substrates of protein arginine methyltransferase with engineered enzymes and matched S-adenosyl-l-methionine analogues. J. Am. Chem. Soc. 133, 7648-7651 (2011).
  27. Islam, K., et al. Bioorthogonal profiling of protein methylation using azido derivative of S-adenosyl-l-methionine. J. Am. Chem. Soc. 134, 5909-5915 (2012).
  28. Islam, K., et al. Defining efficient enzyme-cofactor pairs for bioorthogonal profiling of protein methylation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 16778-16783 (2013).
  29. Binda, O., Boyce, M., Rush, J. S., Palaniappan, K. K., Bertozzi, C. R., Gozani, O. A chemical method for labeling lysine methyltransferase substrates. ChemBioChem. 12, 330-334 (2011).
  30. Willnow, S., Martin, M., Lüscher, B., Weinhold, E. A selenium-based click AdoMet analogue for versatile substrate labeling with wild-type protein methyltransferases. ChemBioChem. 13, 1167-1173 (2012).
  31. Bothwell, I. R., et al. Se-Adenosyl-l-selenomethionine cofactor analogue as a reporter of protein methylation. J. Am. Chem. Soc. 134, 14905-14912 (2012).
  32. Tomkuviene, M., Clouet-d’Orval, B., Cerniauskas, I., Weinhold, E., Klimasauskas, S. Programmable sequence-specific click-labeling of RNA using archaeal box C/D RNP methyltransferases. Nucleic Acids Res. 40, 6765-6773 (2012).
  33. Nishioka, K., et al. Set9, a novel histone H3 methyltransferase that facilitates transcription by precluding histone tail modifications required for heterochromatin formation. Genes Dev. 16, 479-489 (2002).
  34. Clark, P. M., et al. Direct in-gel fluorescence detection and cellular imaging of O-GlcNAc-modified proteins. J. Am. Chem. Soc. 130, (2008).
  35. Lukinavicius, G., Lapinaite, A., Urbanaviciute, G., Gerasimaite, R., Klimasauskas, S. Engineering the DNA cytosine-5 methyltransferase reaction for sequence-specific labeling of DNA. Nucleic Acids Res. 40, 11594-11602 (2012).
  36. Neely, R. K., Dedecker, P., Hotta, J., Urbanaviciute, G., Klimasauskas, S., Hofkens, J. DNA fluorocode: A single molecule, optical map of DNA with nanometre resolution. Chem. Sci. 1, 453-460 (2010).
  37. Roberts, R. J., Vincze, T., Posfai, J., Macelis, D. REBASE-a database for DNA restriction and modification: enzymes, genes and genomes. Nucleic Acids Res. 38, 234-236 (2010).
  38. Petrossian, T. C., Clarke, S. G. Uncovering the human methyltransferasome. Mol. Cell. Proteomics. 10, 1-12 (2011).
  39. Kriukiene, E., et al. DNA unmethylome profiling by covalent capture of CpG sites. Nat. Commun. 4, 2190 (2013).
  40. Wang, R., et al. Profiling genome-wide chromatin methylation with engineered posttranslation apparatus within living cells. J. Am. Chem. Soc. 135, 1048-1056 (2013).
  41. Zhang, C., Weller, R. L., Thorson, J. S., Rajski, S. R. Natural product diversification using a non-natural cofactor analogue of S-adenosyl-l-methionine. J. Am. Chem. Soc. 128, 2760-2761 (2006).
  42. Stecher, H., et al. Biocatalytic Fiedel-Crafts alkylation using non-natural cofactors. Angew. Chem. Int. Ed. 48, 9546-9548 (2009).
  43. Lee, B. W. K., Sun, H. G., Zang, T., Kim, B. J., Alfaro, J. F., Zhou, Z. S. Enzyme-catalyzed transfer of a ketone group from an S-adenosylmethionine analogue: A tool for the functional analysis of methyltransferases. J. Am. Chem. Soc. 132, 3642-3643 (2010).
  44. Winter, J. M., et al. Expanding the structural diversity of polyketides by exploring the cofactor tolerance of an inline methyltransferase domain. Org. Lett. 15, 3774-3777 (2013).

Tags

ביוכימיה גיליון 93, AdoMet SAM קו-פקטור aziridine קו-פקטור כפול הופעל methyltransferase מתילציה DNA מתילציה החלבון תיוג ביוטין תיוג הקרינה מחייך mTAG
תיוג רצף ספציפי של חומצות גרעין וחלבונים עם Methyltransferases ואנלוגים כקו-פקטורים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hanz, G. M., Jung, B., Giesbertz,… More

Hanz, G. M., Jung, B., Giesbertz, A., Juhasz, M., Weinhold, E. Sequence-specific Labeling of Nucleic Acids and Proteins with Methyltransferases and Cofactor Analogues. J. Vis. Exp. (93), e52014, doi:10.3791/52014 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter