Summary
ДНК и белки-последовательность специально помечены близости или люминесцентных репортер групп с использованием ДНК или белка-метилтрансферазы и синтетические аналоги кофактора. В зависимости от кофактора специфики ферментов, азиридина или двойных активированных аналогов кофактора используются для одно- или двухступенчатой маркировки.
Abstract
S -Adenosyl-L-метионин (AdoMet или SAM) зависимых метилтрансферазы (МТАазе) катализируют перенос активированного метильной группы от AdoMet к отдельным позициям в ДНК, РНК, белков и малых биомолекул. Это естественная реакция метилирования может быть расширена до широкого спектра реакций алкилирования с использованием синтетических аналогов кофактора. Замена реактивной сульфониевой центре AdoMet с Азиридиновое кольцо приводит к кофакторов, которые могут быть в сочетании с различными ДНК MTases ДНК. Эти кофакторы азиридиновые может быть оснащен репортерных групп в различных положениях аденина и используется для S equence конкретных М ethyltransferase- Я nduced л Abel Ing ДНК (ДНК улыбается). В качестве типичного примера приведем протокол для биотинилирования pBR322 плазмиды ДНК в последовательности 5'-ATCG Т-3 "с ДНК МТАазе M.BseCI и азиридинового кофактора 6BAz водин шаг. Расширение активированного метильной группы с ненасыщенных алкильных групп приводит к другому классу AdoMet аналогов, которые используются для м ethyltransferase-направленный Т ransfer Л ctivated G roups (MTAG). Поскольку расширенные боковые цепи активируются сульфониевой центра и ненасыщенной связи, эти кофакторы называются дважды активированные аналоги AdoMet. Эти аналоги не только в качестве кофакторов ДНК MTases, как азиридиновых кофакторов, но и для РНК, белков и малых MTases молекулы. Они обычно используются для модификации ферментативной МТАазы субстратов с уникальными функциональными группами, которые меченных репортерных групп во втором химическом этапе. Это видно на примере протокола для флуоресценции маркировки гистона H3 белка. Небольшой пропаргил группы передается от аналогового кофактором SeAdoYn с белком в гистона Н3 лизина 4 (H3K4) МТАазы Set7 / 9 с последующим щелчком маркировкиalkynylated гистонов H3 с TAMRA азида. МТАазе-опосредованной маркировки с кофактора аналогов технологией для многих интересных приложений, включая идентификацию и функциональный изучения МТАазе субстратов, а также генотипирования ДНК и обнаружения метилирования.
Introduction
Удельный маркировка нуклеиновых кислот 1,2 и белков 3,4 представляет большой интерес для функциональных характеристик, медицинской диагностики и (нано) биотехнологии. Здесь мы представляем ферментативного метода маркировки для этих биополимеров, который основан на S -adenosyl-L-метионина (AdoMet или SAM) -зависимых метилтрансфераз (MTases). Этот класс ферментов (EC 2.1.1.) Цели отдельных нуклеофильные позиции (азот, кислород, сера и атомами углерода) в пределах конкретных остатков нуклеиновых кислот и белков, и, естественно, передает активированного метильной группы кофактора AdoMet (1А) 5. Кроме того, MTases могут использовать синтетические аналоги кофактором для конкретного маркировки со сродством теги, флуорофорами или других меток (рис 1б) 6. Два класса AdoMet аналогов были разработаны: Азиридин кофакторов для S equence специфической M ethyltransferase- I L Абель Инг (улыбается) 7 и двухместные активированные аналоги AdoMet для м ethyltransferase-направленного T ransfer Л ctivated G roups (Мечел Трейдинг АГ) 8.
Рисунок 1: реакций, катализируемых метилтрансфераз (MTases) Групповой трансфер А. Метил из природного кофактора AdoMet (SAM) на различных подложках, включая ДНК, РНК, белков и малых биомолекул Б. Маркировка / функционализации нуклеиновых кислот и белков (NNNNN =.. пар оснований для ДНК, нуклеотиды РНК и аминокислот для белков; XXXXX = последовательность признание МТАазе с целевой остатка в зеленый) с синтетическими аналогами кофактора. Азиридин кофакторов содержащие репортер группу (синий шар)прикреплен к аденин кольце последовательность специально в сочетании с целевой остаток (слева) и дважды активируется аналогов AdoMet привести к передаче расширенных алкильных цепей, несущих Chemical Reporter Y (справа), которые могут быть помечены bioorthogonal реакции мыши на втором этапе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Азиридин алгебраические лучше всего работают с ДНК MTases. Они содержат трехчленное кольцо с атомом азота 9 (или N -mustard 10,11) вместо сульфониевого центра, реактивная группа. Протонирование этого атома азота активирует Азиридиновое кольцо для нуклеофильной атаки по целевой нуклеотид, что приводит к ковалентного связывания всей кофактора с ДНК. Присоединив репортерных групп в кольце аденин азиридиновые кофакторы могут быть использованы в сочетании с ДНК MTases маркировать ДНК в одну стадию (
Рисунок 2:. Последовательность, специфичную один шаг биотинилирование ДНК с M.BseCI и 6BAz ДНК МТАазы M.BseCI распознает последовательность двухцепочечной ДНК 5'-ATCG Т-3 'и, естественно, метилирует аминогруппы второй аденина Остаток (зеленый) с помощью AdoMet. С азиридинового кофактора 6BAz ходом реакции изменяется и M.BseCI приводит к последовательностью, специфичной биотинилирование ДНК путем связывания всю кофактор в том числе биотин (синий) с целевой аденина. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Двойные активированные аналоги AdoMet содержат расширенные ненасыщенные боковые цепи вместо метильной группы в сульфониевого центра (рисунок 1b 20. Ненасыщенные двойную или тройную связь в β-положении к сульфониевых центра компенсирует неблагоприятные стерических эффектов в переходном состоянии от конъюгативного стабилизации. Так как сульфоний центр и ненасыщенные связи активировать боковую цепь для ферментативного переноса, эти алгебраические были названы дважды активированные аналоги AdoMet. Как правило, они используются для передачи боковые цепи с уникальными химических групп (химические репортеров), как и аминокислоты, алкинов и азид групп, для химико-селективный маркировки на втором этапе 8,21. В общем, двойные активированные аналоги AdoMet не может работать только в качестве кофакторов ДНК MTases 8,20,21, но и для РНК MTases 22,23 и белковых MTases 24 - 28 позволяет дополнительно маркировки РНК и белков. Тем не менее, расширенные боковые цепи являются стерически более жесткими, чем метильной группой и расширение МТАазы активные участки от белка инженерии частоан требуется для получения эффективных скорости передачи. Другое решение этой проблемы состоит в использовании аналога AdoMet с небольшим пропаргил группы (три атомов углерода), где терминал алкина выполняет две функции: 1. стабилизации переходного состояния во время передачи ферментативной и реактивной 2. ручкой для следующей химической модификации от медью катализируемой азид-алкин циклоприсоединения (CuAAC) нажмите химию. Выяснилось, что в результате пропаргиловой AdoMet аналог 29 является довольно нестабильны в нейтральной или слегка щелочной среде, и только ограниченное применение. Этот недостаток можно исправить, заменив атом серы с селеном. Полученный кофактором 5 '- [(Se) [(3S) -3-амино-3-карбоксипропил] проп-2-ynylselenonio] -5'-дезоксиаденозин (SeAdoYn, рисунок 3) принимается дикого типа ДНК, РНК, и белковые MTases 30 - 32, которые отменяют необходимость белковой инженерии во многих случаях. Это подтверждается флуоресценции про белок маркировка с гистона H3 лизина 4 (H3K4) МТАазе Set7 / 9 33 (рис 3, смотрите раздел протокола 3: маркировка двухступенчатой белка, с помощью двойного активированных кофакторов).
Рисунок 3:. Последовательность конкретных двухступенчатый флуоресценции маркировки гистона Н3 с Set7 / 9, SeAdoYn и TAMRA азид белок МТАазы Set7 / 9, естественно метилирует аминогруппы лизина 4 в гистона Н3 (H3K4, зеленый), используя AdoMet. С двойной активирована кофактора SeAdoYn МТАазы передает небольшой пропаргил группу (красный) до остатка лизина. Прилагается терминал тройная связь выборочно модифицировать в bioorthogonal реакции мыши (медно-катализируемой азид-алкин циклоприсоединения, CuAAC) азидной-производные TAMRA (тетраметилродамин, синий) флюорофора.нагрузка / 52014 / 52014fig3highres.jpg "TARGET =" _ пустое "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Общие инструкции
- Магазин азиридин кофактором 6BAz (в ДМСО), и белок МТАазы Set7 / 9 при -80 ° С, и все другие реагенты, включая двойной активирована кофактора SeAdoYn и ДНК МТАазы M.BseCI (в 50% глицерина) при -20 ° С.
- Определите концентрацию 6BAz и SeAdoYn с помощью UV / VIS спектроскопии с использованием коэффициентов экстинкции ε 269nm (6BAz) = 16000 см -1 М -1 и ε 260 нм (SeAdoYn) = 15400 см -1 М -1 в деионизированной воде. Определить концентрацию MTases с помощью анализа Брэдфорда или, если коэффициент экстинкции доступен, с помощью прямого поглощения при 280 нм.
- Старайтесь избегать образования пузырьков от интенсивного пипетки или вортексе для предотвращения потери ферментативной активности. Вместо этого, перемешать, осторожно пипеткой вверх и вниз.
- При добавлении кофакторов азиридиновые из маточных растворов в ДМСО убедиться, что конечная концентрация ДМСО в анализе составляет менеечем на 5%. Всегда включать 10 мМ ионы магния в буфере для анализа, чтобы предотвратить неспецифические реакции с ДНК.
- При добавлении двойные активированные кофакторов из кислых маточных растворов используют небольшие объемы (в высоких концентрациях растворы), чтобы избежать изменения рН и убедитесь, что рН раствора анализа существенно не изменится. Избегайте тиолы, например, β-меркаптоэтанол или дитиотреитол (DTT), в буфере для анализа, поскольку они могут помешать реакции щелчок комплексообразования необходимых ионов меди.
2. Один шаг Маркировка ДНК с помощью Азиридин кофакторами
- Последовательность конкретных метилтрансферазы-индуцированной Этикетка ING (улыбается) плазмидной ДНК с M.BseCI ДНК МТАазе и азиридин кофактора 6BAz.
- Оттепель кофактора раствора при 20 ° С и подготовить реакционные смеси на льду.
- В дополнение к анализа выполнить контроль "кофактора", чтобы визуализировать любые неспецифические изменения, а & #8220; фермент "контроль, чтобы убедиться, что подготовка МТАазе свободен от природного кофактора AdoMet.
- Для анализа смеси 2 мкл 10х буфера (модификации, содержащей 100 мМ Трис-HCl, 100 мМ MgCl 2, 20 мМ β-меркаптоэтанола, рН 7,4), 2 мкл pBR322 (0,5 мкг / мкл), 10 экв. M.BseCI в последовательности узнавания на ДНК последовательности (1 распознавания в pBR322) и азиридинового кофактора 6BAz до конечной концентрации 60 мкМ в общем объеме 20 мкл. Добавить кофактором и ДНК МТАазе в прошлом.
ПРИМЕЧАНИЕ: β-меркаптоэтанол является токсичным, коррозии и вредным для окружающей среды. - Для контроля »кофактора" Добавить деионизированной воды вместо M.BseCI и для "фермент" контроля добавить деионизированной воды вместо 6BAz.
- Смешайте решения осторожно пипеткой вверх и вниз.
- Инкубировать пробирки при 55 ° С в течение 1 часа.
- Центрифуга кратко, чтобы собрать все жидкости в нижней части трубы.
- Рестрикции-модификации анализ, чтобы проверить модификации ДНК.
- Готовят раствор путем смешивания 10 мкл 10х буфера (R.TaqI, содержащий 100 мМ Трис-HCl, 50 мМ MgCl 2, 1 М NaCl, 1 мг / мл бычьего сывороточного альбумина, рН 8,0), 80 мкл деионизированной воды и 3,3 мкл рестрикции (REase) из Thermus адиайсиз (R.TaqI, 10 U / мкл). Убедитесь в том, чтобы добавить REase на последней стадии.
- В каждую пробирку с 2.1.7 добавить 2 мкл 10х Р. TaqI буфер и 28 мкл раствора сверху (2.2.1).
- Смешайте решения осторожно пипеткой вверх и вниз.
- Инкубировать пробирки при 65 ° С в течение 30 мин.
- Центрифуга кратко, чтобы собрать все жидкости в нижней части трубы.
- Электромобилей сдвиг (тест EMSA) стрептавидином проверить функциональную модификацию.
- Удалить 25 мкл из каждой пробирки (2.2.5) и добавить 2,4 мкл стрептавидина решения (1 мМ по отношению к стрептавидин- мonomer в стрептавидин буфера, содержащего 100 мМ Na 2 HPO 4, 100 мМ NaCl, рН 7,5; 4 эквивалентов общей биотин). Добавить 2,4 мкл стрептавидина буфера для остальных труб.
- Инкубируйте все пробирки при 37 ° С в течение 1 часа.
- Анализ с помощью электрофореза в агарозном геле.
- Добавить 5 мкл 6x буфера для нанесения (0,25% бромфенола синего, 30% глицерина) в каждую пробирку.
- Смешайте решения осторожно.
- Добавить 10 мкл каждого образца в лунки агарозном геле (1% агарозы в 0.5x КЭ буфера, содержащего 1x GelRed из 10,000x маточного раствора).
- Запустите гель в 0,5 × КЭ буфера с 80 V прим. 1 час.
- Визуализация полос ДНК на УФ таблицы (312 нм) с ПЗС-камерой, снабженной фильтром (540 ± 50 нм).
ПРИМЕЧАНИЕ: УФ-излучение повреждает глаза и кожу.
3. Двухступенчатая белка маркировки с помощью двойного Активированные кофакторы
- Methyltransfстереть-направленного переноса активированных групп (Мечел Трейдинг АГ) с Set7 / 9 и дважды активируется кофактора SeAdoYn для гистона H3 лизина 4 маркировка (стадии модификации).
- Оттепель компонентов и подготовки реакционных смесей на льду. ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда держите SeAdoYn охлаждением, чтобы избежать деградации.
- В дополнение к анализа выполнить контроль "кофактора", чтобы визуализировать любые неспецифические изменения, и "фермент" контроль, чтобы исключить неспецифические реакции флуоресцентного зонда.
- Подготовка Анализируемый раствор (20 мкл), содержащий модификации буфера (50 мМ Трис-HCl, 5% глицерина, рН 8,5), 10 мкМ гистон H3, 10 мкМ Set7 / 9 и 600 мкМ SeAdoYn (смесь обоих эпимеров в селена). В последних шагов добавить кофактор, а затем МТАазе.
- Для контроля »кофактора" подготовить решение в тестах в 3.1.3 и добавить 60 мм AdoMet конкурировать с синтетическим кофактора. Для контроля "фермент" добавить деионизированной воды вместо SeAdoYn.
- Смешайте решения медленно пипетки вверх и вниз. Проверка рН путем добавления 1 мкл каждого раствора в верхней области в полосе рН (диапазон рН 5 - 10).
- Инкубируют при 37 ° С в течение 2 ч.
- В то же время подготовить 12% SDS полиакриламидном геле (гель работает: 357 мМ бис-Трис, рН 6.5-6.8, 0.1% (вес / объем) APS, 0,04% (объем / объем) TEMED и 12% акриламида / бис-акриламида 37,5: 1 ; загрузка гель: 357 мМ бис-Трис рН 6.5-6.8, 0.1% (вес / объем) APS, 0,04% (объем / объем) тетраметилендиамин и 5% акриламида / бис-акриламида 37,5: 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: акриламид / бис-акриламида является токсичным и здоровье опасными. Надевайте перчатки во время этой процедуры.
- Химическая маркировка alkinylated лизина 4 в гистона H3 по медному катализируемой азид-алкин циклоприсоединения (CuAAC) (маркировки шаг).
- Перед конце реакции модификации подготовить 5x щелчок смеси, содержащей 3 мМ CuSO 4, 3 мМ трис (3-гидроксипропил-triazolylmethyl) амин (THPTA), 250 мМ аскорбата натрия и 6 мМ азида с TAMRAОбщий объем 20 мкл.
- Добавить 5 мкл свежеприготовленного 5x мыши смеси в каждую пробирку, чтобы начать CuAAC и гашения реакции модификации.
- Осторожно перемешать с помощью пипетки вверх и вниз.
- Защитите все трубы с алюминиевой фольгой от света, чтобы избежать фото-отбеливание флуорофора.
- Инкубируют при 20 ° С в течение 1 часа.
- Белок осадков удалить избыток свободного TAMRA флюорофора.
- Чтобы избежать затмевая флуоресцентного помечены гистона H3 по интенсивной в геле флуоресценции свободного TAMRA флюорофора, удалить излишки флуорофора путем осаждения белков (3.3.2 - 3.3.4) 34.
- Добавить 75 мкл метанола, 18,8 мкл хлороформа и 50 мкл деионизованной воды в каждую пробирку и вихря на короткое после каждого добавления. Центрифуга при 16000 х г в течение 5 мин. Удалить верхнюю фазу, не нарушая интерфейс слой, который содержит белок.
- Добавить 56,3 мкл метанола в оставшейся фазе яп каждая трубка, вихревые и центрифуге при 16000 х г в течение 5 мин для осаждения белка. Удалить супернатант. Повторите этот шаг, чтобы смыть таблетку.
- Обложка открытые трубы с безворсовой ткани и дайте им высохнуть в течение 15 - 30 мин.
- Анализ с помощью SDS-PAGE.
- Растворить осажденных белков из 3.3.4 в 20 мкл SDS загрузки буфера (50 мМ Трис-HCl, 2,5% (вес / объем) SDS, 10% (об / об) глицерина, 320 мМ β-меркаптоэтанола и 0,05% (вес / V) бромфенол синий, рН 6,8). Убедитесь в том, чтобы полностью растворить таблетку путем промывки стенок труб с помощью пипетки.
- Инкубируйте образцы при 95 ° С в течение 10 мин и позволить им остыть до 20 ° С.
- Центрифуга кратко, чтобы собрать все жидкости в нижней части трубы.
- Загрузите всю сумму каждого образца в лунки в полиакриламидном геле SDS (3.1.7). Использование 50 мМ MOPS, 50 мМ Трис-X (Трис-основание), 5 мМ ЭДТА, 0,1% (вес / объем) SDS, как работает буфер для электрофореза.
- Запустите гель с 120 V в течение ок. 90 мин.
- Визуализация флуоресценцию в геле на УФ таблицы (312 нм) с ПЗС-камерой, снабженной фильтром (540 нм ± 50 нм).
ПРИМЕЧАНИЕ: УФ-излучение повреждает глаза и кожу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Один шаг Маркировка ДНК с помощью Азиридин кофакторами
В этом примере реакцию проводят с ДНК МТАазы M.BseCI, который изменяет второй аденин остаток в 5'-ATCG Т-3 'последовательности двунитевой и имеет один сайт узнавания на плазмиде pBR322 (фиг.4А). Чтобы проверить плазмиды маркировки, pBR322, стоит задача с рестриктазой (REase) R.TaqI (5'-TCGA-3 '). R.TaqI имеет семь объектов pBR322, один из которых входит в сайте M.BseCI. Если маркировка происходит, сайт M.BseCI будут защищены от расщепления и новый фрагмент с 683 парами оснований (п.о.) будет образовывать а два другие фрагменты исчезнет (315 и 368 пар оснований). Конечно, при анализе ДНК-маркирование с другими MTases ДНК различных REases с соответствующими последовательностями распознавания следует использовать.
Агарозном геле на фиг.4В ясно показывает, появляютсявение нового фрагмента с 683 б.п. (дорожка 3). Это свидетельствует о том, что маркировка сайта M.BseCI произошло. Только анализ (дорожка 3) показывает этот фрагмент. Контроль "кофактора" (дорожка 5), а также "фермент" контроль (полоса 7) отсутствуют эту группу. Особенно контроль "фермент" имеет важное значение, поскольку она показывает, что природный кофактор AdoMet не присутствует в ферментного препарата. Специфичность реакции маркировки свидетельствует электромобилей сдвига анализа (EMSA) при добавлении стрептавидином (фиг.4В и 4С подробно). Электромобилей в 683 п.о. замедляется, а подвижность всех других фрагментов без сайта M.BseCI не изменяется по сравнению с контрольной группой (сравните полосы 4 с дорожками 6 и 8).
Рисунок 4: Последовательностьконкретных Биотинилирование pBR322 плазмиды ДНК с M.BseCI и 6BAz. А. карта плазмиды pBR322 показывая сайты узнавания для M.BseCI (красный) и R.TaqI (зеленый), а также длину ожидаемых фрагментов ДНК в парах оснований (АД) при ограничении с R.TaqI. Б. Анализ ДНК фрагментация и EMSA с помощью электрофореза в агарозном геле. M = Маркер, дорожки 1 и 2: плазмидной ДНК только, полосы 3 и 4: анализ, дорожки 5 и 6: контроль »кофактором ', дорожки 7 и 8: КОНТРОЛЬ» фермента. Дорожки 2, 4, 6 и 8 дополнительно содержать стрептавидин. C. Увеличенная вставка из В. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Двухступенчатая Маркировка белков, с помощью двойного Активированные кофакторы
В качестве примера для двухступенчатой маркировки МТАазе подложках с двойным активирована аналогов AdoMet мы выбрали гистоновH3 лизина 4 (H3K4) МТАазе Set7 / 9 и небольшая SeAdoYn кофактором. После ферментативного переноса активированной пропаргил группы в гистона Н3 подложки (первый этап), терминал алкина химически помечены азид-модифицированный TAMRA флуорофора по CuAAC мыши химии (второй этап) (сравните рисунок 3). Анализ реакционной смеси маркировки выполняется с помощью ДСН-ПААГ и гель-детектирования флуоресценции (5А). Анализ (дорожка 1) показывает, флуоресцентный полосу, соответствующую гистона Н3, указывающее, что боковая цепь кофактора успешно переданы и модифицированного белка, меченного флуорофором TAMRA. Нет полосы не видны в "кофактора" и "фермент" контроля (дорожки 2 и 3), демонстрирующих, что маркировка гистона Н3 опосредуется МТАазы. Поэтому, неспецифический химическая маркировка либо только кофактора (первый этап) или во время CuAAC (вторая стадия) может быть исключена. Контроль "кофактор" выполняется differently, чем в протоколе для одностадийного маркировки ДНК. Это происходит потому, что осаждение гистона Н3 является более эффективным в присутствии Set7 / 9 и опуская белок МТАазы может привести к снижению количества гистона Н3 в управления загрузкой. Таким образом, мы добавили высокую концентрацию природного кофактора AdoMet конкурировать с SeAdoYn. Загрузка гистона Н3 можно легко контролировать путем окрашивания геля кумасси синим после обнаружения флуоресценции.
МТАазы субстраты могут быть также помечены с биотином, а не с помощью флуорофоров азида-производные биотина во второй химической стадии 30. Биотинилирование удобно белков анализировали с помощью Вестерн-блоттинга с пероксидазой хрена, конъюгированным авидином. Это показано на фиг.5В для биотинилирования гистона Н3 с Set7 / 9, SeAdoYn и азида модифицированного биотином. Анализ в полосе 1 показывает четкую полосу для меченого гистона H3. Отсутствие полосы в "фермент" (дорожка 2)и "кофактор" контроль (дорожка 3) в очередной раз демонстрирует, что маркировка является специфическим для МТАазе. Контроль "кофактора" просто выполнены в отсутствие белка МТАазы поскольку Вестерн-блот-анализ не требует удаления избыточного биотина осаждением белка.
Рисунок 5: Маркировка гистона H3 с белком МТАазе Set7 / 9 и SeAdoYn с последующим щелчком реакций с азида-производные этикеток. А. В-гель флуоресценции TAMRA-меченого гистон H3 и управления, а также окрашивание кумасси голубым для управления загрузкой. Б. Вестерн-блот-анализа биотинилированного гистона Н3 и управления с использованием авидин-пероксидаза хрена (HRP) конъюгата. Экспериментальные условия были очень похожи на те, для флуоресценции маркировки в A (ферментативной модификации: 6.581; М гистона Н3, 10 мкМ Set7 / 9, 600 мкМ SeAdoYn, в 50 мМ Трис-HCl, 5 мМ MgCl 2, 5% глицерина, рН 9,0, 30 ° С, 3 ч; химическая маркировка:. 0,6 мм CuSO 4, 0,6 мМ THPTA, 50 мМ аскорбата натрия, 1,2 мМ биотин-азид, 37 ° C, 1 час) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Один шаг маркировки ДНК с MTases ДНК и азиридиновых кофакторов (улыбается ДНК) является надежным методом, но некоторые аспекты следует учитывать при планировании эксперимента.
Азиридин кофактором: концентрация 6BAz для маркировки ДНК с M.BseCI был 60 мкм. При использовании других MTases ДНК концентрация кофактором должны быть оптимизированы, например такие низкие концентрации, как 20 мкМ были использованы с ДНК МТАазе M.TaqI 19. Низкие концентрации 6BAz есть то преимущество, что в четыре раза превышение стрептавидином (сайты связывания в отношении всей суммы биотина в анализе) может быть непосредственно добавлен после инкубации с REase без вмешательства с анализом при EMSA. В противном случае биотинилированный ДНК должны быть очищены для удаления избытка кофактор и избежать размытия ДНК при электрофорезе в агарозном геле. При добавлении азиридиновых кофакторов от маточных растворов в ДМСО убедитесь, что конечная концентрация ДМСО в гое анализ является менее чем на 5%. Слишком много ДМСО могут инактивировать ферменты. Однако каждый азиридиновые кофакторов при -80 ° С, чтобы избежать деградации.
ДНК МТАазы: Ферментативный связь азиридиновых кофакторов с ДНК может привести к сильным ингибиторам продукта и MTases ДНК должны быть использованы в стехиометрических количествах. Поэтому всегда используйте более 1 эквивалент ДНК МТАазе. Большинство MTases ДНК copurify со связанными AdoMet, которая должна быть удалена обширным диализа или мытья ферментов на колонке с большими объемами буфера. "Фермент" контроль покажет, смогут ли AdoMet все еще присутствует в ферментного препарата. Маркировка с M.BseCI также может быть сделано путем инкубации в течение ночи при 37 ° С.
Модификация буфер: Включить 10 мМ ионы магния в буфере для предотвращения неспецифических реакций азиридиновых кофакторов с ДНК. Если ионы магния приводит к активации загрязняющих нуклеаз, ионы бария могут быть добавлены вместо.
Не только для конкретной последовательности маркировки ДНК улыбается ДНК, но также MTAG могут быть использованы. Здесь дважды Активированные кофакторы используются для ферментативного передачи боковых цепей с уникальных функциональных групп в ДНК. Эти функциональные группы, например, первичные амины, могут быть модифицированы с широким разнообразием репортерных групп, в том числе биотин или флуорофоров, по химии эфира NHS на второй стадии 8,35,36. В качестве альтернативы мы начали синтезировать двойные активированные аналоги AdoMet с большими боковыми цепями, уже содержащие репортерный группу и использовать их для маркировки ДНК в одну стадию.
Двухступенчатый MTAG процедура маркировки белков с двойной активированного кофактора SeAdoYn успешно использован с рядом белков MTases 30,31. Тем не менее, следующие замечания должны быть рассмотрены до проведения эксперимента.
Двухместный активирована кофактором: Эти кофакторы, в том числе моряdoYn, хранятся в кислых условиях и необходимо позаботиться о том, что рН раствора модификации, существенно не меняется при кофактора того. Мы всегда проверить рН путем добавления 1 мкл модификации раствора до рН полосы и, если значение рН слишком низкое, добавить небольшое количество раствора гидроксида натрия (50 мм), чтобы довести рН. Кроме того кофакторов аналоги должны быть добавлены в небольшом объеме, чтобы избежать изменения рН. Таким образом, минимальные концентрации кофакторов, необходимых для полного модификации должны быть определены для других MTases и предпочтительны высококонцентрированные растворы кофактора. Концентрации кофактора, как правило, варьируется от 10 микрон и 600 мкм. Химический синтез двойных Активированные кофакторы, как правило, дает приблизительно 1: 1 смесь эпимеров в серу или селен и разделения биологически активного эпимера, соответствующий S -эпимера из AdoMet, из неактивного эпимера часто трудно достичь. Таким образом, концентрация кофакторов являютсякак правило, приведены для смеси изомеров. Двойные активированные аналоги кофакторов весьма неустойчивы при комнатной температуре и следует хранить при -20 ° С. Также убедитесь, что оттепели растворы на льду и держать их холодно во время пипетки. Они могут быть заморожены снова, но для обеспечения воспроизводимых деятельность, мы рекомендуем, чтобы аликвот.
Белок МТАазы: Для преобразований с двойными Активированные кофакторы в MTases могут быть использованы в каталитических количествах. Тем не менее, MTases часто медленные ферменты, имеющие номера с оборота в мин -1 диапазона с естественной кофактора AdoMet. По практическим причинам часто используют MTases в стехиометрических количествах, и свести к минимуму время инкубации и температуру (обычно от 10 минут до 2 часов и 20 ° С до 37 ° С). Контроль "кофактора" варьируется в зависимости от типа группы-репортера и обнаружения. Для маркировки биотином МТАазы просто опущен, и анализ может быть осуществлен с помощью Вестерн-блоттинга (фиг.5В (фиг.5А). Однако, если количество осадков гистона H3 приводит к потере белка, SDS-PAGE может быть расширен и избыток свободного TAMRA флюорофора будет работать из геля с бромфенолового синий фронт.
Модификация буфера: буфер оптимальным фермент может быть использован, но тиолы, как дитиотреитола (DTT) и β-меркаптоэтанола, следует избегать. Они связываются с ионами меди и б заблокировать следующий CuAAC реакцию мыши.
CuAAC нажмите реакцию: конечная концентрация TAMRA азида должна быть в два раза выше, чем алкинов концентрации. При использовании биологических экстрактов меди и лиганд концентрация должна быть увеличена до 5 мм каждая. TAMRA азид лучше растворимы в ДМСО, чем в воде. Убедитесь, что конечная концентрация ДМСО менее чем на 12%. Развернутый время инкубации может привести к повреждению белков и размазывается по полиакриламидном геле SDS. Таким образом, реакция маркировка должна быть либо остановлен осаждения белка или добавления тиолов.
Эта процедура двухступенчатого маркировки также может быть использован для обозначения белка МТАазы субстраты с биотином или для обнаружения Вестерн-блот (фиг.5В) или выделения с покрытыми стрептавидином магнитные гранулы. Кроме того, двойные активированные аналоги AdoMet могут быть использованы для обозначения ДНК, РНК и небольшие натуральные продукты с соответствующими MTases.
ve_content "> По сравнению с большинством других методов маркировки для нуклеиновых кислот и белков, МТАазы-опосредованной маркировки имеет то преимущество, что носители субстраты могут быть непосредственно использованы и никаких дальнейших изменений не требуется. Конечно, необходимо соблюдать осторожность, что природные субстраты не заблокированы метилированием через соответствующий МТАазы в естественных условиях. Кроме того, МТАазы-опосредованной маркировки является очень гибким как с точки зрения репортерных групп, которые включают в себя биотин, флуорофоров или другие молекулярные метки, а также задачи по MTases. перебазирования, база данных для ограничения эндонуклеазы и ДНК MTases, насчитывает более 700 экспериментально охарактеризованные MTases ДНК с сотнями различных последовательностей распознавания от 7:58 б.п. 37, и ожидается, что более 200 различных MTases всех типов образуются в человеческой клетке 38. важным фактором, определяющим для МТАазе деятельности, соответствует ли аналог AdoMet в активном центре фермента. Хотя представленных кофакторов 6Баз и SeAdoYn разработаны, чтобы иметь небольшие реактивные группы, некоторые MTases не может легко принять их. В этих случаях активные сайты могут быть увеличены белковой инженерии, как было продемонстрировано на ДНК 35 РНК 23 и белковых MTases 25 - 28 с пространственно более требовательных двойных активированных аналогов AdoMet. Последовательность конкретных маркировки ДНК и РНК с AdoMet аналогов представляет большой интерес для генотипирования (ДНК) отображения 36 и метилирование обнаружения 39, функциональных исследований ДНК / РНК и ДНК / РНК-модификации ферментов 15, а также для нано (13) биотехнологии, 14 и доставки гена 19. Другие способы последовательности конкретного ковалентной маркировки ДНК полагаться на синтетических тройной спирали формирования олигодезоксинуклеотидов, пептидные нуклеиновые кислоты или шпильки полиамидов, как, нацеленных устройств или на последовательности конкретных перекреста эндонуклеаз (NEases), а затем по нику перевода маркировки.
Удельный маркировка белков с двойными активированных аналогов AdoMet была в основном направлена на применение в протеомного исследований, например, выявлению новых подложек для белковых MTases в сложных биологических смесей 27,28, но другие приложения, как функциональных исследований, также должны быть осуществимо. Хотя МТАазы-опосредованной маркировки была в основном выполнена с очищенными MTases в пробирке, маркировка также может быть достигнуто в живых клетках, как было сообщено недавно 40. Конечно, многие другие методы специфической мечения белков имеются 3,4. Кроме включения неприродных аминокислот с использованием сконструированных клетках, они обычно требуют генетические слитые интересующего белка с собственной маркировки меток / прoteins или метки фермент-опосредованной маркировки. В этом отношении короткие пептидные последовательности, служащие в качестве субстратов для белковых MTases, например N-концевые гистонов, может быть слит с представляющим интерес белком и специально помечены AdoMet аналогов и соответствующего белка MTases.
Наконец, биокаталитическая репертуар маленьких MTases молекула может быть расширена с помощью синтетического AdoMet аналогов 41 - 44. Это представляет собой новый подход к введению структурное разнообразие в природных продуктов, например, антибиотиков или поликетидов, которые должны найти интересные приложения для скрининга новых биологических видов деятельности.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6BAz | Synthesized according to Weinhold et al., Patent number US 8,129,106, published March 6, 2012. | ||
| β-Mercaptoethanol | Serva | 28625 | |
| Acetic acid | Fisher Scientific | 10304980 | |
| Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1 | Serva | 10688 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500100 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Serva | 13375 | |
| Bis-Tris | Gerbu | 1304 | |
| Boric acid | Gerbu | 1115 | |
| Bromophenol blue Na salt | Serva | 15375 | |
| Copper(II) sulfate | Aldrich | C1297 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | 10020090 | |
| Coomassie Brilliant Blue | Serva | 17525 | |
| EDTA disodium salt | Gerbu | 1034 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| GelRed (10,000x in water) | Biotium | 41003 | |
| Glycerol (99.5%) | Gerbu | 2006 | |
| FastRuler Low Range DNA Ladder | Thermo Scientific | SM1103 | |
| Histone H3 | Expression plasmid obtained from Dr. Philipp Voigt and Prof. Danny Reinberg; expression and isolation according to T. J. Richmond et al., J. Mol. Biol. 1997, 272, 301-311. | ||
| M.BseCI | Expression plasmid obtained from Dr. Michael Kokkinidis; expression and isolation according to Kapetaniou et al., Acta Cryst. 2006, F63, 12-14. | ||
| Methanol | Fisher Scientific | 10675112 | |
| Magnesiumchloride hexahydrate | J.T. Baker | 4003 | |
| MOPS | Gerbu | 1081 | |
| Sodium chloride | Gerbu | 1112 | |
| pH strip (Neutralit) | Merck | 1,095,330,001 | |
| pBR322 | Thermo Scientific | SD0041 | |
| R.TaqI (10 u/µl) | Thermo Scientific | ER0671 | |
| SeAdoYn | Synthesized according to Willnow et al., ChemBioChem 2012, 13, 1167-1173. | ||
| Set7/9 | Expression plasmid obtained from Prof. Danny Reinberg, expression and isolation according to D. Reinberg et al., Genes Dev.2002, 16, 479-489. | ||
| Streptavidin | Gerbu | 3058 | |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Sigma Life Science | A7631 | |
| SDS Granular | Gerbu | 1833 | |
| di-Sodium hydrogenphosphate | Merck | 106,586 | |
| TAMRA azide | Synthesized according to reference 30: Willnow et al., ChemBioChem 2012, 13, 1167-1173. | ||
| TaqI buffer (10x) | Thermo Scientific | B28 | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Acros Organics | 42058 | |
| Tris-HCl | Gerbu | 1028 | |
| Tris-X (TRIS-base) | Gerbu | 1018 | |
| Tris(3-hydroxypropyltriazolyl-methyl)amine (THPTA) | Sigma-Aldrich | 762342 |
References
- Gottfried, A., Weinhold, E.
- Zohar, H., Muller, S. J. Labeling DNA for single-molecule experiments: methods of labeling internal specific sequences on double-stranded DNA. Nanoscale. 3, 3027-3039 (2011).
- Hinner, M. J., Johnsson, K. How to obtain labeled proteins and what to do with them. Curr. Opin. Biotechnol. 21, 766-776 (2010).
- Wua, Y. -W., Goody, R. S. Probing protein function by chemical modification. J. Pept. Sci. 16, 514-523 (2010).
- Struck, A. -W., Thompson, M. L., Wong, L. S., Micklefield, J. S-Adenosyl-methionine-dependent methyltransferases: Highly versatile enzymes in biocatalysis, biosynthesis and other biotechnological applications. ChemBioChem. 13, 2642-2655 (2012).
- Klimasauskas, S., Weinhold, E. A new tool for biotechnology: AdoMet-dependent methyltransferases. Trends Biotechnol. 25, 99-104 (2007).
- Pljevaljcic, G., Schmidt, F., Weinhold, E. Sequence-specific Methyltransferase-Induced Labeling of DNA (SMILing DNA). ChemBioChem. 5, 265-269 (2004).
- Lukinavicius, G., Lapiene, V., Stasevskij, Z., Dalhoff, C., Weinhold, E., Klimasauskas, S. Targeted labeling of DNA by methyltransferase-directed Transfer of Activated Groups (mTAG). J. Am. Chem. Soc. 129, 2758-2759 (1021).
- Pignot, M., Siethoff, C., Linscheid, M., Weinhold, E. Coupling of a nucleoside with DNA by a methyltransferase. Angew. Chem. Int. Ed. 37, 2888-2891 (1998).
- Weller, R. L., Rajski, S. R. Design, synthesis, and preliminary biological evaluation of a DNA methyltransferase-directed alkylating agent. ChemBioChem. 7, 243-245 (2006).
- Du, Y., Hendrick, C. E., Frye, K. S., Comstock, L. R. Fluorescent DNA Labeling by N-Mustard Analogues of S-adenosyl-l-methionine. ChemBioChem. 13, 2225-2233 (2012).
- Pljevaljcic, G., Schmidt, F., Scheidig, A. J., Lurz, R., Weinhold, E. Quantitative labeling of long plasmid DNA with nanometer precision. ChemBioChem. 8, 1516-1519 (1002).
- Wilkinson, S., et al. Molecular scale architecture: engineered three- and four-way junctions. Bioconjugate Chem. 19, 470-475 (2008).
- Braun, G., et al. Enzyme-directed positioning of nanoparticles on large DNA templates. Bioconjugate Chem. 19, 476-479 (2008).
- Kim, S., et al. Enzymatically incorporated genomic tags for optical mapping of DNA binding proteins. Chem. Int. Ed. 51, 3578-3581 (2012).
- Rina, M., Bouriotis, V. Cloning purification and characterization of the BseCI DNA methyltransferase from Bacillus stearothermophilus. Gene. 133, 91-94 (1993).
- Sequence-specific detection of methylation in biomolecules. US Patent. Weinhold, E., Meier, T., Düfel, H., Markert-Hahn, C., Schmuck, R. , 8,129,106 (2012).
- Pljevaljcic, G., Pignot, M., Weinhold, E. Design of a new fluorescent cofactor for DNA methyltransferases and sequence-specific labeling of DNA. J. Am. Chem. Soc. 125, 3492-3410 (2003).
- Schmidt, F. H. -G., Hüben, M., Gider, B., Renault, F., Teulade-Fichou, M. -P., Weinhold, E. Sequence-specific Methyltransferase-Induced Labelling (SMILing) of plasmid DNA for studying cell transfection. Bioorg. Med. Chem. 16, 40-48 (2008).
- Dalhoff, C., Lukinavicius, G., Klimasauskas, S., Weinhold, E. Direct transfer of extended groups from synthetic cofactors by DNA methyltransferases. Nat. Chem. Biol. 2, 31-32 (2006).
- Lukinavicius, G., Tomkuviene, M., Masevicius, V., Klimasauskas, S. Enhanced chemical stability of AdoMet analogues for improved methyltransferase-directed labeling of DNA. ACS Chem. Biol. 8, 1134-1139 (2013).
- Motorin, Y., et al. Expanding the chemical scope of RNA:methyltransferases to site-specific alkynylation of RNA for click labeling. Nucleic Acids Res. 39, 1943-1952 (1943).
- Schulz, D., Holstein, J. M., Rentmeister, A. A chemo-enzymatic approach for site-specific modification of the RNA cap. Angew. Chem. Int. Ed. 52, 7874-7878 (2013).
- Peters, W., et al. Enzymatic site-specific functionalization of protein methyltransferase substrates with alkynes for click labeling. Angew. Chem. Int. Ed. 49, 5170-5173 (2010).
- Islam, K., Zheng, W., Yu, H., Deng, H., Luo, M. Expanding cofactor repertoire of protein lysine methyltransferase for substrate labeling. ACS Chem. Biol. 6, 679-684 (2011).
- Wang, R., Zheng, W., Yu, H., Deng, H., Luo, M. Labeling substrates of protein arginine methyltransferase with engineered enzymes and matched S-adenosyl-l-methionine analogues. J. Am. Chem. Soc. 133, 7648-7651 (2011).
- Islam, K., et al. Bioorthogonal profiling of protein methylation using azido derivative of S-adenosyl-l-methionine. J. Am. Chem. Soc. 134, 5909-5915 (2012).
- Islam, K., et al. Defining efficient enzyme-cofactor pairs for bioorthogonal profiling of protein methylation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 16778-16783 (2013).
- Binda, O., Boyce, M., Rush, J. S., Palaniappan, K. K., Bertozzi, C. R., Gozani, O. A chemical method for labeling lysine methyltransferase substrates. ChemBioChem. 12, 330-334 (2011).
- Willnow, S., Martin, M., Lüscher, B., Weinhold, E. A selenium-based click AdoMet analogue for versatile substrate labeling with wild-type protein methyltransferases. ChemBioChem. 13, 1167-1173 (2012).
- Bothwell, I. R., et al. Se-Adenosyl-l-selenomethionine cofactor analogue as a reporter of protein methylation. J. Am. Chem. Soc. 134, 14905-14912 (2012).
- Tomkuviene, M., Clouet-d’Orval, B., Cerniauskas, I., Weinhold, E., Klimasauskas, S. Programmable sequence-specific click-labeling of RNA using archaeal box C/D RNP methyltransferases. Nucleic Acids Res. 40, 6765-6773 (2012).
- Nishioka, K., et al. Set9, a novel histone H3 methyltransferase that facilitates transcription by precluding histone tail modifications required for heterochromatin formation. Genes Dev. 16, 479-489 (2002).
- Clark, P. M., et al. Direct in-gel fluorescence detection and cellular imaging of O-GlcNAc-modified proteins. J. Am. Chem. Soc. 130, (2008).
- Lukinavicius, G., Lapinaite, A., Urbanaviciute, G., Gerasimaite, R., Klimasauskas, S. Engineering the DNA cytosine-5 methyltransferase reaction for sequence-specific labeling of DNA. Nucleic Acids Res. 40, 11594-11602 (2012).
- Neely, R. K., Dedecker, P., Hotta, J., Urbanaviciute, G., Klimasauskas, S., Hofkens, J. DNA fluorocode: A single molecule, optical map of DNA with nanometre resolution. Chem. Sci. 1, 453-460 (2010).
- Roberts, R. J., Vincze, T., Posfai, J., Macelis, D. REBASE-a database for DNA restriction and modification: enzymes, genes and genomes. Nucleic Acids Res. 38, 234-236 (2010).
- Petrossian, T. C., Clarke, S. G.
- Kriukiene, E., et al. DNA unmethylome profiling by covalent capture of CpG sites. Nat. Commun. 4, 2190 (2013).
- Wang, R., et al. Profiling genome-wide chromatin methylation with engineered posttranslation apparatus within living cells. J. Am. Chem. Soc. 135, 1048-1056 (2013).
- Zhang, C., Weller, R. L., Thorson, J. S., Rajski, S. R. Natural product diversification using a non-natural cofactor analogue of S-adenosyl-l-methionine. J. Am. Chem. Soc. 128, 2760-2761 (2006).
- Stecher, H., et al. Biocatalytic Fiedel-Crafts alkylation using non-natural cofactors. Angew. Chem. Int. Ed. 48, 9546-9548 (2009).
- Lee, B. W. K., Sun, H. G., Zang, T., Kim, B. J., Alfaro, J. F., Zhou, Z. S. Enzyme-catalyzed transfer of a ketone group from an S-adenosylmethionine analogue: A tool for the functional analysis of methyltransferases. J. Am. Chem. Soc. 132, 3642-3643 (2010).
- Winter, J. M., et al. Expanding the structural diversity of polyketides by exploring the cofactor tolerance of an inline methyltransferase domain. Org. Lett. 15, 3774-3777 (2013).
