Summary
DNA和蛋白质序列特异性标记的亲和力，或使用DNA或蛋白质的甲基和合成的辅助因子的类似物的荧光报告基团。取决于酶，氮丙啶或双活化的辅助因子类似物的辅因子特异性的用于一个或两个步骤的标签。
Abstract
S -Adenosyl -1-甲硫氨酸（的AdoMet或SAM）依赖性甲基转移（转移酶）催化激活甲基来自的AdoMet中的DNA，RNA，蛋白质和小生物分子转移到特定的位置。这种自然甲基化反应可扩展到各种各样的使用合成的辅助因子的类似物的烷基化反应。更换的AdoMet的反应性锍中心与氮丙啶环的导致辅因子可加上由各种DNA MTases的DNA。这些氮丙啶辅助因子可配记者团在腺嘌呤部分的不同位置，并用于ethyltransferase- EP3受体激动剂诱导DNA（笑DNA） 的 L-阿贝尔ING S equence 专用的M。作为一个典型的例子，我们给出一个协议的pBR322的质粒DNA的生物素化在5'- ATCG T-3'序列与该DNA转移酶M.BseCI和氮丙啶辅因子6BAz在一个步骤。延长活化甲基与不饱和烷基结果另一类的AdoMet类似物的是用以米 ethyltransferase定向T的一个ctivatedģroups（MTAG）转让（BOT）的。由于延长侧链由锍中心和不饱和键激活时，这些辅因子被称为双活化的AdoMet类似物。这些类似物不仅用作辅因子用于DNA MTases，如氮丙啶辅因子，而且还用于RNA，蛋白质和小分子MTases。它们通常用于转移酶底物与在第二化学步骤标记报告基团独特的官能团的酶促修饰。这被例示在一个协议组蛋白H3蛋白质的荧光标记。一个小炔基是从辅因子类似物SeAdoYn由组蛋白H3赖氨酸4（H3K4）转移酶SET7 / 9随后的单击标签转移到蛋白质炔基化组蛋白H3与TAMRA叠氮化物。与辅酶类似物转移酶介导的标签是一个有利的技术，许多令人兴奋的应用，包括识别和功能研究转移酶底物，以及DNA基因分型和甲基化检测。
Introduction
核酸1,2和蛋白质3,4特定的标签是功能性表征，医学诊断和（纳米）生物技术重大利益的。在这里，我们对这些生物聚合物是基于 S -adenosyl -1-甲硫氨酸（的AdoMet或SAM）依赖性甲基转移（MTases）提出了一种酶标记方法。这类酶（EC 2.1.1。）的目标的核酸和蛋白质的特定残基中的各个位置上的亲核（氮，氧，硫和碳原子）和自然传输的辅助因子的AdoMet（ 图1A）5的活化的甲基。此外，MTases可以利用合成的辅助因子的类似物与亲和标记，荧光团或其它标签（ 图1B）6特异性标记。已经开发了两个班的AdoMet类似物：氮丙啶辅助因子局长 equence 专用的M ethyltransferase- 我 L阿贝尔荷兰国际集团 （笑）7和双启动的AdoMet类似物对M ethyltransferase定向T的一个 ctivated 摹 roups转让（BOT）（MTAG）8。
图1：反应由甲基转移（MTases）从天然辅因子的AdoMet（SAM）的各种基材，包括DNA，RNA，蛋白质和小生物分子A.甲基转移的核酸和蛋白质B.标识/官能（NNNNN = 催化。碱基对的DNA，核苷酸的RNA和氨基酸的蛋白质; XXXXX =识别与绿色目标残渣），与合成辅酶类似物转移酶的序列。含记者组氮丙啶辅助因子（蓝色球）附着到腺嘌呤环是序列与靶残基（左）和双 - 活化的AdoMet类似物具体地说耦合导致传送携带化学记者Y（右），它可以通过在第二步骤中生物正交点击反应进行标记扩展烷基链。 请点击此处查看该图的放大版本。
氮丙啶辅助因子与DNA MTases效果最好。它们含有与氮原子9（或N -mustard 10,11）代替锍中心作为反应性基团的3元环。该氮原子的质子化激活的氮丙啶环用于由靶核苷酸从而导致共价全辅因子与DNA的偶联亲核攻击。通过将报告基团到腺嘌呤环的氮丙啶的辅助因子，可以组合使用与DNA MTases以在一个步骤中标记的DNA（
图2：DNA与M.BseCI和6BAz序列特异性一步法生物素化的DNA转移酶M.BseCI识别双链DNA序列5'-ATCG T-3'和自然甲基化的第二腺嘌呤的氨基残渣（绿色）使用的AdoMet。随着氮丙啶辅6BAz的反应过程被改变，M.BseCI导致通过耦合整个辅助因子包括生物素（蓝色）与目标腺嘌呤测序特异的DNA生物素化。 请点击此处查看该图的放大版本。
双活化的AdoMet类似物包含扩展的不饱和侧链而不是在锍中心甲基（ 图1B ）20。不饱和双键或三键的β位置到锍中心电子补偿由共轭稳定化中的过渡状态不利位阻效应。因为两者的锍中心和不饱和键激活侧链酶促转移，这些辅因子被命名为双活化的AdoMet类似物。通常情况下，它们被用来在第二步骤8,21传送侧链具有独特的化学基团（化学记者），象氨基，炔和叠氮基团，化学-选择性标记。在一般情况下，双启动的AdoMet类似物不仅可以用作辅助因子DNA MTases 8,20,21也为RNA MTases 22,23和蛋白质MTases 24 - 28，允许RNA和蛋白质的额外的标签。然而，在扩展侧链立体比甲基更苛刻的和扩大的转移酶的活性位点由蛋白质工程是经常连接需要获得有效的传输速率。另一个解决这个问题的方法是使用一个的AdoMet类似物具有小炔基（3个碳原子），其中所述末端炔提供两个功能：酶促转移期间1.稳定过渡态和2反应手柄以下由铜化学修饰催化叠氮炔环加成（CuAAC）点击化学。原来，产生的丙炔的AdoMet模拟29只在有限的使用中性或弱碱性条件下，相当不稳定。这个缺点可以固定通过用硒代替硫原子。所得的辅助因子的5' - [（Se）的[（3 S）-3-氨基-3-羧基丙基〕丙-2- ynylselenonio〕-5'-脱氧腺苷（SeAdoYn， 图3）由野生型DNA的接受，核糖核酸和蛋白质MTases 30 - 32，其废除在许多情况下，需要进行蛋白质工程。这是通过荧光亲例举蛋白标记的组蛋白H3赖氨酸4（H3K4）转移酶SET7 / 9 33（ 图3，看到协议部3： 通过双活化的辅助因子的两步蛋白标记）。
图3：序列特异性的两步荧光组蛋白H3与SET7 / 9的标签，SeAdoYn和TAMRA叠氮化物的蛋白质转移酶SET7 / 9自然甲基化使用的AdoMet的氨基中的组蛋白H3的赖氨酸4的（H3K4，绿色）。与双活化的辅助因子SeAdoYn的转移酶转移一个小炔基（红色）与赖氨酸残基。所附终端三键，然后有选择地修改在生物正交点击反应（铜 - 催化的叠氮化物 - 炔环加成，CuAAC）与叠氮化物衍生化TAMRA（四甲基，蓝）的荧光团。加载/ 52014 / 52014fig3highres.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。
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Protocol
1.一般说明
- 商店氮丙啶辅因子6BAz（在DMSO中）和蛋白质转移酶SET7 / 9在-80℃，所有其他试剂包括双活化的辅助因子SeAdoYn和DNA转移酶M.BseCI（在50％甘油）在-20℃下。
- 使用消光系数ε269nm（6BAz）=16000厘米-1 M -1和ε260nm处 （SeAdoYn）=15400厘米-1 M -1，在去离子水通过紫外/可见光谱确定6BAz和SeAdoYn的浓度。通过Bradford测定法在280nm确定MTases的浓度，或者，如果消光系数是可用的， 通过直接吸收。
- 尽量避免产生气泡密集移液器或涡流，以防止酶失去活性。相反，轻轻吹打上下混合。
- 当从储备溶液的DMSO加入氮丙啶辅因子确保测定中的终DMSO浓度为少超过5％。总是包含在试验缓冲液，以防止非特异性反应用DNA的10mM镁离子。
- 当从酸性储备溶液添加双活化的辅助因子使用小体积（高度浓缩的储备溶液），以避免pH值的变化，并确保所述测定溶液的pH值不显著变化。避免硫醇， 例如 ，β巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT），在测定缓冲液中，因为它们可以用通过所需要的铜离子络合点击干扰反应。
DNA 通过氮丙啶辅因子2.一步法标签
- 序列特异性甲基转移酶诱导标签ING（笑）质粒DNA与DNA M.BseCI和转移酶的辅助因子氮丙啶的6BAz。
- 解冻，在20℃的辅因子溶液中，制备反应混合物在冰上。
- 除了测定执行“辅因子”控制，以可视化的任何非特定的修改，以及一个＆＃8220;酶“的控制，以确保在转移酶制剂是不含天然辅因子的AdoMet的。
- 用于测定混合物2微升10×修饰缓冲液（含有100mM的Tris-HCl，100mM的MgCl 2的，20毫β巯基乙醇，pH为7.4），2微升的pBR322（0.5微克/微升），10当量的。 M.BseCI每对DNA识别序列（在pBR322中1识别序列）和氮丙啶辅因子6BAz为60微米的最终浓度为20微升的总体积内。添加辅助因子与DNA转移酶最后。
注：β巯基乙醇是有毒的，腐蚀性，破坏环境。 - 对于“辅”控制加去离子水，而不是M.BseCI并为“酶”控件添加的，而不是6BAz去离子水。
- 轻轻吹打上下混合溶液。
- 孵育管在55℃下1小时。
- 短暂离心以收集所有的液体在管的底部。
- 限制修饰测定以验证DNA修饰。
- 通过混合10微升10×R.TaqI缓冲液（含有100mM的Tris-HCl，50mM的氯化镁 ，1M氯化钠，1毫克/毫升牛血清白蛋白，pH 8.0）中，80微升去离子水和3.3微升的制备溶液限制性内切酶（REase）从水生栖热菌 （R.TaqI，10U /微升）。确保添加了REase中的最后一步。
- 从2.1.7每管加入2微升的10×R。TaqI位缓冲液和28微升溶液从上方（2.2.1）。
- 轻轻吹打上下混合溶液。
- 孵育管在65℃下进行30分钟。
- 短暂离心以收集所有的液体在管的底部。
- 有链霉亲和电动汽车变动分析（EMSA）来验证功能修改。
- 从各管（2.2.5）中取出25微升，加入2.4微升的链霉亲和解决方案（1毫米相对于链霉米onomer在含有100mM的Na 2 HPO 4的链霉缓冲液，100 mM氯化钠，pH值7.5; 4现金等价物共计生物素）。加入2.4微升链霉缓冲到剩余管中。
- 孵育所有试管在37℃下1小时。
- 通过琼脂糖凝胶电泳分析。
- 添加5微升的6×加样缓冲液（0.25％溴酚蓝，30％甘油）到每个管中。
- 轻轻的混合解决方案。
- 负载10微升各样品进琼脂糖凝胶（1％琼脂糖在0.5×TBE缓冲液含有1x GelRed从10000原液）的孔中。
- 运行在0.5X TBE缓冲凝胶具有80 V约。 1小时。
- 可视化上的UV表（312纳米）用CCD照相机装有一个过滤器（540±50毫微米）的DNA条带。
注：UV光损害眼睛和皮肤。
通过双激活辅因子3.两步蛋白标记
- Methyltransf擦除导演的活化基团（MTAG）与SET7 / 9和双激活辅SeAdoYn转移的组蛋白H3赖氨酸4标记（改性工序）。
- 解冻的组件，并准备将反应混合物在冰上。注意：始终保持SeAdoYn冷却，以免恶化。
- 除了测定执行“辅因子”控制，以可视化的任何非特定的修改，以及一个“酶”的控制，以排除荧光探针的非特异性反应。
- 制备含有改性缓冲液（50mM的Tris-HCl，5％甘油，pH值8.5），10μM组蛋白H3，10μMSET7 / 9和600μMSeAdoYn（在硒两个差向异构体的混合物）的测定溶液（20微升）。在过去的步骤添加辅酶，然后转移酶。
- 对于“辅”控制准备检测解决方案的3.1.3，并添加60毫米的AdoMet的合成辅酶竞争。对于“酶”控件添加的，而不是SeAdoYn去离子水。
- 通过慢慢地上下吹打混匀的解决方案。加入1微升每个解决方案，以pH值带（ - 10 pH范围5）的上现场检查pH值。
- 孵育在37℃下2小时。
- 与此同时制备一个12％的SDS聚丙烯酰胺凝胶（凝胶运行：357毫的Bis-Tris pH值6.5-6.8，0.1％（重量/体积）的APS，0.04％（体积/体积）TEMED和12％丙烯酰胺/双丙烯酰胺37.5：1 ;装载凝胶：357毫的Bis-Tris pH值6.5-6.8，0.1％（重量/体积）的APS，0.04％（体积/体积）TEMED和5％丙烯酰胺/双丙烯酰胺37.5：1）。
注：丙烯酰胺/双丙烯酰胺是有毒的，有害健康。在此过程中，应戴上手套。
- alkinylated赖氨酸4的通过铜催化的叠氮化物-炔环加成（CuAAC）（标记步骤）化学标记中组蛋白H3。
- 只是改性反应结束之前制备含有3mM的硫酸铜 ，3毫三（3-羟基丙基三唑基甲基）胺（THPTA），250毫抗坏血酸钠和6毫TAMRA叠氮化物用5倍点击混合的20微升总体积。
- 加入5微升新鲜制备的5×点击混合到每个管中以启动CuAAC和骤冷的改性反应。
- 吹打向上和向下轻轻混匀。
- 保护用铝箔所有管从光，以避免光致漂白的荧光团。
- 孵育在20℃进行1小时。
- 蛋白质沉淀，以除去过量的游离TAMRA荧光团。
- 34 -为了避免荧光标记的组蛋白H3通过密集的凝胶荧光自由TAMRA荧光的风头甚至盖过，由蛋白质（3.3.4 3.3.2）的沉淀去除多余的荧光。
- 添加75微升甲醇，18.8微升氯仿和50微升每次加入后短暂的去离子水，以每管并涡旋。离心在16000×g离心5分钟。除去上层相，而不会干扰所述界面层，其中包含的蛋白质。
- 添加56.3微升甲醇剩余期n各自管中，涡旋并离心在16000×g离心5分钟以沉淀蛋白质。去除上清。重复此步骤，洗涤沉淀。
- 覆盖开放管与无尘组织，让他们干15 - 30分钟。
- 通过 SDS-PAGE分析。
- 溶解从3.3.4所述沉淀的蛋白质在20μlSDS上样缓冲液（50mM的Tris-HCl，2.5％（重量/体积）SDS，10％（体积/体积）甘油，320毫β巯基乙醇和0.05％（重量/ ⅴ）溴酚蓝，pH6.8）中。一定要通过冲洗管的壁用吸管完全溶解沉淀。
- 孵育样品在95℃下进行10分钟，并让它们向下冷却到20℃。
- 短暂离心以收集所有的液体在管的底部。
- 加载每个样品的总量成SDS聚丙烯酰胺凝胶（3.1.7）的孔中。使用的50mM MOPS，50毫摩尔Tris-X（Tris碱），5毫摩尔EDTA，0.1％（重量/体积）SDS作为电泳缓冲液电泳。
- 运行与120 V凝胶约。 90分钟。
- 可视化在凝胶上荧光的UV表（312纳米）用CCD照相机装有一个过滤器（540毫微米±50纳米）。
注：UV光损害眼睛和皮肤。
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Representative Results
DNA通过氮丙啶辅因子一步法标签
本实施例中进行反应用DNA转移酶M.BseCI，该修改的双链5'- ATCG T-3'序列中的第二个腺嘌呤残基和具有一个识别位点上的pBR322的质粒（ 图4A）。为了测试质粒标签，pBR322中是用限制性内切酶（REase）R.TaqI（5'-TCGA-3'）的挑战。 R.TaqI具有七个位点上的pBR322，其中之一包括在M.BseCI站点。如果出现标签，所述M.BseCI站点将被保护，以防止裂解，并与683个碱基对（bp）的一个新的片段将形成，而其他两个片段会消失（315和368碱基对）。当然，当与其它DNA MTases不同REases与相应的识别序列分析DNA标记应该采用。
在图4B中的琼脂糖凝胶清楚地显示了显示ANCE与683碱基对（泳道3）一种新的片段。这表明M.BseCI部位标记发生。仅在测定（泳道3）示出了该片段。的“辅因子”控制（泳道5），以及在“酶”的控制（泳道7）缺少该频带。特别是“酶”的控制是重要的，因为它表明，天然辅因子的AdoMet不存在于酶制剂。标记反应的特异性是证明（在4C图4B和细节）电动汽车变动分析（EMSA）后加入链霉。而所有其他的片段而不M.BseCI部位迁移率不变相比，对照组（比较泳道4泳道6和8）的683碱基对的电动汽车被延迟。
图4：序列的的pBR322质粒DNA M.BseCI和6BAz特定生物素化。 pBR322的A.质粒图谱示出识别位M.BseCI（红色）和R.TaqI（绿色），以及在碱基对（bp）预期的DNA片段的限制性内与DNA的R.TaqI。B.分析后的长度碎片和EMSA通过琼脂糖凝胶电泳。 M =标记，泳道1和2：质粒DNA只，泳道3和4：测定中，泳道5和6：“辅因子”控制，泳道7和8：“酶”的控制。道2，4，6，8还包含链霉亲和。C.扩大插图来自B. 请点击此处查看该图的放大版本。
蛋白质通过双激活辅因子两步标签
作为转移酶的二步标记，例如，衬底的双活化的AdoMet类似物我们选择了组蛋白H3赖氨酸4（H3K4）转移酶SET7 / 9和小SeAdoYn辅助因子。活化的炔基的酶促转移到组蛋白H3基板（第一工序）后，终端炔化学标记的叠氮化物修饰的TAMRA的荧光团通过CuAAC点击化学（第二工序）（比较图3）。标记反应的分析通过SDS-PAGE进行，在凝胶荧光检测（ 图5A）。该分析（泳道1）示出了对应于组蛋白H3指示该辅因子的侧链已成功传送和标有TAMRA的荧光团修饰的蛋白的荧光带。无带是可见的，在“辅因子”和“酶”对照（泳道2和3）显示出组蛋白H3的该标记被转移酶介导的。因此，非特异性化学标记或者通过单独的辅因子（第一步骤）或CuAAC（第二步骤）中，可以排除。在“辅”控制，执行ðifferently比在协议一步法DNA标记。这是因为组蛋白H3的沉淀是在SET7 / 9的存在和省略蛋白转移酶可以导致在装载控制组蛋白H3的减少量的效率更高。因此，我们加入了高浓度的天然辅因子的AdoMet与SeAdoYn竞争。组蛋白H3的装载可以通过染色用考马斯蓝的凝胶荧光检测之后被容易地控制。
转移酶底物还可以通过使用叠氮化物衍生化的生物素中的第二化学步骤30用生物素标记，而不是荧光团。蛋白的生物素化便利地通过用辣根过氧化物酶缀合的抗生物素蛋白Western印迹法分析。这显示在图5B中为组蛋白H3与SET7 / 9，SeAdoYn和叠氮化物-生物素修饰的生物素化。在泳道1中的试验示出了用于标记的组蛋白H3清晰带。在“酶”的情况下频带的（泳道2）和“辅因子”控制（泳道3）再次表明，标记是特异性的转移酶。只是在没有蛋白质转移酶所执行的“辅”控制，因为Western blot分析，不需要去除多余的生物素的蛋白质沉淀。
图5：组蛋白H3与蛋白质转移酶SET7 / 9和SeAdoYn接着点击反应与叠氮化物衍生化的标签标记。 A.在凝胶荧光的生物素化的组蛋白H3和使用抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶（HRP）缀合物对照TAMRA标记的组蛋白H3和控制以及染色用考马斯蓝对样对照。B. Western印迹分析。实验条件非常相似的那些方法荧光标记，在A（酶改性：6.581，M组蛋白H3，10μMSET7 / 9，600μMSeAdoYn，在50mM的Tris-HCl，5mM的氯化镁 ，5％甘油，pH为9.0，30℃，3小时;化学标记：0.6毫米硫酸铜 ，0.6毫米THPTA，50毫米抗坏血酸钠，1.2毫米生物素叠氮化物，37°C，1小时）， 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
DNA与DNA MTases和氮丙啶辅助因子（笑DNA）中的一个步骤的标签是一个强大的方法，但计划实验时，有些方面应该考虑。
氮丙啶辅：用于DNA标记的6BAz浓度M.BseCI为60微米。当使用其它DNA MTases辅因子浓度应被优化， 例如 ，浓度低至20μM的已使用用该DNA转移酶M.TaqI 19。低6BAz浓度具有四倍过量的链霉（结合位点相对于生物素在测定的总量）的能够孵育REase后直接加入不与分析由EMSA干扰的优点。否则的生物素化的DNA应提纯以除去多余的辅助因子和避免在琼脂糖凝胶电泳该DNA的拖尾现象。当现货解决方案DMSO添加氮丙啶辅助因子，确保在日终DMSO浓度Ë测定是小于5％。太多DMSO可灭活酶。始终将氮丙啶辅助因子在-80℃，以避免退化。
脱氧核糖核酸转移酶：氮丙啶辅因子与DNA的酶促耦合可导致强烈的产物抑制剂和该DNA MTases具有化学计量的量使用。因此，应始终使用超过1当量DNA转移酶的。大多数DNA MTases copurify与需要由广泛透析或洗涤酶上具有大体积的缓冲液的柱去除结合的AdoMet。在“酶”控制会告诉的AdoMet是否仍然存在于酶制剂。标记与M.BseCI也可以通过在37℃下进行过夜。
修改缓冲器：包括在缓冲，以防止氮丙啶辅因子的非特异性反应用DNA的10mM镁离子。如果镁离子导致活化污染核酸酶，钡离子可能会添加代替。
对于DNA的序列特异性标记不仅微笑的DNA，但也MTAG可以使用。这里双活化辅因子被用于侧链的具有独特的官能团的酶促转移至的DNA。这些官能团， 如伯胺，可与各种各样的报告基团，包括在第二步骤8,35,36生物素或荧光团，通过NHS酯化学的修改。另外，我们已经开始合成双激活的AdoMet类似物与已经含有记者组大侧链和在一个步骤中使用它们的DNA标记。
用于与双活化的辅助因子SeAdoYn蛋白两步MTAG标记过程已成功地用于与许多蛋白质MTases 30,31的。但是，下面的意见应进行实验之前予以考虑。
双激活辅：这些辅助因子，包括海Doyn上，在酸性条件下和护理下保存，必须采取的修饰溶液的pH值不显著在辅因子除了改变。我们总是通过加入1微升修饰溶液至pH条的检查pH值，如果pH值太低，加入少量的氢氧化钠溶液（50毫米），以调节pH。除了辅因子类似物应当在低体积被加入，以避免pH值的变化。因此，需要全面修改最少的辅助因子的浓度应确定为其它MTases和高度集中的辅股票方案的首选。辅因子浓度为10μM和600μM之间通常变化。双活化的辅助因子的化学合成通常产生约1：差向异构体的1:1混合物在硫或硒及生物活性差向异构体的分离，相应于的AdoMet 的 S-差向异构体，从非活动差向异构体往往难以实现。因此，辅助因子浓度通常给定为异构体的混合物。双活化的辅助因子类似物是相当不稳定的，在室温下，应保存在-20℃。另外，还要确保解冻的股票解决方案上的冰和移液过程中让他们感冒。他们可以再次被冻结，而是要确保我们建议以等分重复性的活动。
蛋白质转移酶：对于双活化的辅助因子的MTases可以在催化量使用的变换。然而，MTases往往具有在分-1范围与天然辅因子的AdoMet转换数缓慢酶。基于实际的原因，我们常常使用化学计量的量的MTases并尽量减少温育时间和温度（通常为10分钟至2小时和20℃至37℃）。的“辅因子”控制而变化，这取决于报告基团和检测的类型。用于生物素标记的转移酶被简单地省略和分析可以通过Western印迹（ 图5B来完成图5A）的酶促转移被执行的“辅因子”的控制。但是，如果组蛋白H3的沉淀导致蛋白质的损失，SDS-PAGE可以扩展和过量的游离TAMRA的荧光团将耗尽与溴酚蓝前面的凝胶。
像二硫苏糖醇（DTT）和β巯基乙醇，应避免的最适酶缓冲器都可以使用，但硫醇，：修改缓冲器 。它们结合到铜离子和b锁定以下CuAAC点击反应。
CuAAC点击反应：TAMRA叠氮化物的最终浓度应为两倍高炔浓度。当使用生物中提取铜和配体浓度应增加高达每5毫米。 TAMRA叠氮化物是较好的溶于DMSO中比在水中。确保DMSO的终浓度小于12％。延长孵育时间可导致蛋白质损伤和拖尾现象的SDS聚丙烯酰胺凝胶。因此，该标记反应应或者通过蛋白质沉淀或加成硫醇的停止。
这两个步骤的标记过程也可用于标记蛋白转移酶底物与生物素无论是Western印迹检测（ 图5B）或隔离用链亲和素包被的磁珠。此外，双活化的AdoMet类似物可以用于与对应MTases标记的DNA，RNA和小的天然产物。
ve_content“>比起大多数其他标记方法用于核酸和蛋白质，转移酶介导的标记具有的优点是天然底物可直接使用，无需进一步的修改。当然，必须小心使天然底物未被阻止通过在体内的相应转移酶甲基化。此外，转移酶介导的标记是非常灵活的无论是在报告基团，其中包括生物素，荧光团或其他的分子标记，以及目标MTases的条款。REBASE，用于限制数据的基础上核酸内切酶和DNA MTases，列出了超过700实验表征的DNA MTases具有数百个不同的识别序列包括两到八个碱基对37的与预期所有类型的200多个不同MTases产生在人细胞38。一个重要的决定因素为转移酶的活性是的AdoMet类似物是否装配到酶活性位点，虽然提出了辅因子6BAZ和SeAdoYn被设计成具有小的反应性基团，部分MTases可能不容易接受。在这些情况下，活性位点可以通过蛋白质工程作为扩大已被证明对DNA的35，23的RNA和蛋白质MTases 25 - 28与空间位更苛刻的双活化的AdoMet类似物。 DNA和RNA用的AdoMet类似物的序列特异性标记是用于基因分型（脱氧核糖核酸映射）主要兴趣36和甲基化检测39中，DNA / RNA和DNA / RNA的修饰酶15以及用于（纳米）生物技术13的功能性研究， 14和基因递送19。其他方法进行序列特异性的共价DNA标记依靠合成三螺旋形成寡核苷酸，肽核酸或发夹聚酰胺作为靶向设备或序列特异性内切核酸酶切口（NEases），随后加入切口平移标记。
双活化的AdoMet类似物蛋白的特异性标记已经主要针对在蛋白质组学研究中，对蛋白质MTases在复杂的生物混合物27,28新基材如识别应用，但其它的应用，如功能性研究，也应该是可行的。虽然转移酶介导的标记已经主要在体外纯化MTases进行，标签也可以实现在活细胞作为最近已经报道40。当然，有许多其他方法用于特定蛋白标记可用3,4。除了使用经改造的细胞的非天然氨基酸掺入它们通常需要与自标记标签感兴趣的蛋白质的基因融合物/ PRoteins或标签为酶介导的标记。在这方面，作为用于蛋白质MTases基板的短肽序列， 例如 ，N末端 的组蛋白尾部，可以融合到感兴趣的蛋白质，并与的AdoMet类似物和相应蛋白质MTases特异性标记。
最后，小分子MTases生物催化剧目可以合成的AdoMet扩大类似物41 - 44。这代表了一种新的方法来引入结构的多样性为天然产品， 如抗生素或聚酮类化合物，它应该寻找新的生物活性有趣的应用程序的筛选。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6BAz | Synthesized according to Weinhold et al., Patent number US 8,129,106, published March 6, 2012. | ||
| β-Mercaptoethanol | Serva | 28625 | |
| Acetic acid | Fisher Scientific | 10304980 | |
| Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1 | Serva | 10688 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500100 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Serva | 13375 | |
| Bis-Tris | Gerbu | 1304 | |
| Boric acid | Gerbu | 1115 | |
| Bromophenol blue Na salt | Serva | 15375 | |
| Copper(II) sulfate | Aldrich | C1297 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | 10020090 | |
| Coomassie Brilliant Blue | Serva | 17525 | |
| EDTA disodium salt | Gerbu | 1034 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| GelRed (10,000x in water) | Biotium | 41003 | |
| Glycerol (99.5%) | Gerbu | 2006 | |
| FastRuler Low Range DNA Ladder | Thermo Scientific | SM1103 | |
| Histone H3 | Expression plasmid obtained from Dr. Philipp Voigt and Prof. Danny Reinberg; expression and isolation according to T. J. Richmond et al., J. Mol. Biol. 1997, 272, 301-311. | ||
| M.BseCI | Expression plasmid obtained from Dr. Michael Kokkinidis; expression and isolation according to Kapetaniou et al., Acta Cryst. 2006, F63, 12-14. | ||
| Methanol | Fisher Scientific | 10675112 | |
| Magnesiumchloride hexahydrate | J.T. Baker | 4003 | |
| MOPS | Gerbu | 1081 | |
| Sodium chloride | Gerbu | 1112 | |
| pH strip (Neutralit) | Merck | 1,095,330,001 | |
| pBR322 | Thermo Scientific | SD0041 | |
| R.TaqI (10 u/µl) | Thermo Scientific | ER0671 | |
| SeAdoYn | Synthesized according to Willnow et al., ChemBioChem 2012, 13, 1167-1173. | ||
| Set7/9 | Expression plasmid obtained from Prof. Danny Reinberg, expression and isolation according to D. Reinberg et al., Genes Dev.2002, 16, 479-489. | ||
| Streptavidin | Gerbu | 3058 | |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Sigma Life Science | A7631 | |
| SDS Granular | Gerbu | 1833 | |
| di-Sodium hydrogenphosphate | Merck | 106,586 | |
| TAMRA azide | Synthesized according to reference 30: Willnow et al., ChemBioChem 2012, 13, 1167-1173. | ||
| TaqI buffer (10x) | Thermo Scientific | B28 | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Acros Organics | 42058 | |
| Tris-HCl | Gerbu | 1028 | |
| Tris-X (TRIS-base) | Gerbu | 1018 | |
| Tris(3-hydroxypropyltriazolyl-methyl)amine (THPTA) | Sigma-Aldrich | 762342 |
References
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