Summary
DNA e proteine sono la sequenza-specifica etichettati con affinità o gruppi reporter fluorescente con DNA o proteine metiltransferasi e analoghi cofattore sintetici. A seconda della specificità cofattore di enzimi, aziridina o doppi analoghi cofattore attivati sono impiegati per l'etichettatura di uno o due step.
Abstract
S -Adenosyl-L-metionina (SAM) o AdoMet metiltransferasi-dipendente (MTase) catalizzano il trasferimento del gruppo metilico attivato dal AdoMet a specifiche posizioni in DNA, RNA, proteine e piccole biomolecole. Questa reazione di metilazione naturale può essere espansa a un'ampia varietà di reazioni di alchilazione con analoghi sintetici cofattore. Sostituzione del centro solfonio reattiva di AdoMet con un anello di aziridina conduce cofattori accoppiabili con DNA da vari MTases DNA. Questi cofattori aziridina possono essere equipaggiati con gruppi reporter diverse posizioni della frazione adenina e utilizzati per S-specific equence M ethyltransferase- I nduced L Abel zione del DNA (sorridendo DNA). Come esempio tipico diamo un protocollo per biotinilazione di pBR322 plasmide DNA sequenza 5'-ATCG A T-3 'con il DNA MTase M.BseCI e il cofattore aziridina 6BAz inun passo. Estensione del gruppo metilico attivato con insaturi gruppi alchil risultati in un'altra classe di analoghi AdoMet che sono utilizzati per m ethyltransferase diretto T rasferimento di un ctivated ruppi G (MTAG). Poiché le catene laterali estesi vengono attivati dal centro solfonio e il legame insaturo, questi cofattori sono chiamati analoghi AdoMet doppio attivati. Questi analoghi funzione non solo come cofattori per DNA MTases, come cofattori aziridina, ma anche per RNA, proteine e piccole molecole MTases. Essi sono tipicamente utilizzati per modificazione enzimatica di substrati MTase con gruppi funzionali uniche che sono contrassegnati con gruppi del reporter in una seconda fase chimica. Questo è esemplificato in un protocollo per l'etichettatura di fluorescenza di proteine istone H3. Un piccolo gruppo propargile viene trasferito dal SeAdoYn cofattore analogica alla proteina dalla lisina istone H3 4 (H3K4) MTase Set7 / 9 seguito da etichettatura clic delalkynylated H3 istone con TAMRA azide. Etichettatura MTase-mediata con analoghi cofattore è una tecnologia abilitante per molte applicazioni interessanti, tra cui l'identificazione e lo studio funzionale di substrati MTase e genotipizzazione del DNA e rilevazione metilazione.
Introduction
Etichettatura specifica degli acidi nucleici e proteine 1,2 3,4 è di grande interesse per le caratterizzazioni funzionali, diagnosi medica e (nano) biotecnologie. Qui vi presentiamo un metodo enzimatico di etichettatura per questi biopolimeri che si basa su S -adenosyl-L-metionina (SAM AdoMet o) metiltransferasi-dipendente (MTases). Questa classe di enzimi (EC 2.1.1.) Rivolge singole posizioni nucleofili (azoto, ossigeno, zolfo e atomi di carbonio) all'interno specifici residui di acidi nucleici e proteine e naturalmente trasferisce il gruppo metilico attivato della AdoMet cofattore (Figura 1A) 5. Inoltre, MTases possono utilizzare analoghi cofattore sintetici per l'etichettatura specifico con tag affinità, fluorofori o altre etichette (Figura 1B) 6. Sono stati sviluppati due classi di analoghi AdoMet: cofattori Aziridine per S equence-specifica M ethyltransferase- I L abel ing (sorridendo) 7 e doppie analoghi attivati AdoMet per m ethyltransferase diretto T rasferimento di un ruppi G ctivated (MTAG) 8.
Figura 1: reazioni catalizzate da metiltransferasi (MTases) A. metile trasferimento gruppo dal cofattore naturale AdoMet (SAM) per vari substrati, tra cui il DNA, RNA, proteine e piccole biomolecole B. Etichettatura / funzionalizzazione di acidi nucleici e proteine (NNNNN =.. coppie di basi di DNA, RNA nucleotidi per e aminoacidi delle proteine; XXXXX = sequenza di riconoscimento del MTase con residuo di destinazione in verde) con analoghi cofattore sintetici. Cofattori aziridina contenenti un gruppo giornalista (sfera blu)collegata all'anello di adenina sono sequenza specificamente accoppiato con il residuo di destinazione (a sinistra) e analoghi doppio attivato AdoMet comportare un trasferimento del catene alchiliche estese trasportano un giornalista chimica Y (a destra), che può essere etichettato da bioorthogonal reazione scatto in una seconda fase. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Cofattori aziridina funzionano meglio con DNA MTases. Essi contengono un anello di tre termini con un atomo di azoto 9 (o un N -mustard 10,11) invece del centro solfonio gruppo reattivo. Protonazione di questo atomo di azoto attiva il azirdinico per l'attacco nucleofilo dal nucleotide obiettivo che porta ad accoppiamento covalente di tutta cofattore con DNA. Collegando gruppi giornalista all'anello adenina cofattori aziridina possono essere utilizzati in combinazione con DNA MTases etichettare DNA in un solo passo (
Figura 2:. Sequenza specifica biotinilazione un passo del DNA con M.BseCI e 6BAz Il DNA MTase M.BseCI riconosce la doppia elica sequenza di DNA 5'-ATCG A T-3 'e naturalmente metila il gruppo amminico del secondo adenina residuo (verde) con AdoMet. Con il cofattore aziridinico 6BAz il corso della reazione viene modificato e M.BseCI porta alla specifica sequenza biotinilazione DNA accoppiando tutta cofattore inclusi biotina (blu) con l'adenina destinazione. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Doppia analoghi AdoMet attivati contiene estese catene laterali insature invece di un gruppo metile al centro solfonio (Figura 1B 20. Il legame doppio o triplo insaturo in β-position al centro solfonio compensa elettronicamente effetti sterici sfavorevoli all'interno dello stato di transizione di stabilizzazione coniugativo. Dal momento che sia il centro solfonio e il legame insaturo attivare la catena laterale per il trasferimento enzimatico, questi cofattori sono stati nominati analoghi AdoMet doppio attivati. In genere, essi sono utilizzati per trasferire catene laterali con gruppi unici chimici (giornalisti chimici), come gruppi di aminoacidi, alchini e azide, per l'etichettatura chemio-selettivo in una seconda fase 8,21. In generale, analoghi a doppia attivato AdoMet non può funzionare solo come cofattori per DNA MTases 8,20,21 ma anche per RNA MTases 22,23 e MTases proteine 24-28 permettendo etichettatura supplementare di RNA e proteine. Tuttavia, le catene laterali estese sono stericamente più esigenti di un gruppo metile e allargando le MTase siti attivi di proteine di ingegneria è often necessaria per ottenere velocità di trasferimento efficienti. Un'altra soluzione a questo problema è di utilizzare un analogo AdoMet con un piccolo gruppo propargile (tre atomi di carbonio) in cui l'alchino terminale ha due funzioni: 1. Stabilizzazione dello stato di transizione durante il trasferimento enzimatica e 2. maniglia reattiva per seguenti modificazioni chimiche di rame catalizzata cicloaddizione azide-alchino (CuAAC) clicca chimica. Si è scoperto che il propargilico risultante AdoMet analogico 29 è abbastanza instabile in condizioni di neutralità o leggermente di base e di scarsa utilità. Questo inconveniente può essere risolto sostituendo l'atomo di zolfo con selenio. Il cofattore risultante 5 '- [(Se) [(3 S) -3-ammino-3-carbossipropil] prop-2-ynylselenonio] -5'-deossiadenosina (SeAdoYn, figura 3) è accettata da wild-type DNA, RNA e MTases proteine 30-32 che abolisce la necessità di ingegneria proteica in molti casi. Questo è esemplificato da fluorescenza pro etichettatura proteina con la lisina istone H3 4 (H3K4) MTase Set7 / 9 33 (Figura 3, vedere la sezione protocollo 3: etichettatura proteina Two-step con cofattori doppie attivati).
Figura 3:. In due fasi un'etichettatura specifica fluorescenza-Sequenza dell'istone H3 con Set7 / 9, SeAdoYn e TAMRA azide La proteina MTase Set7 / 9 metila naturalmente il gruppo amminico di lisina 4 a dell'istone H3 (H3K4, verde) con AdoMet. Con il cofattore doppio attivato SeAdoYn il MTase trasferisce un piccolo gruppo propargile (rosso) per il residuo di lisina. Il legame terminale collegato tripla è poi selettivamente modificata in una reazione click bioorthogonal (azide-alkyne cicloaddizione di rame-catalizzata, CuAAC) con azide-derivatizzata TAMRA (tetrametilrodamina, blu) fluoroforo.Carico / 52014 / 52014fig3highres.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Protocol
1. Istruzioni generali
- Conservare aziridina cofattore 6BAz (in DMSO) e di proteine MTase Set7 / 9 a -80 ° C e tutti gli altri reagenti tra cui doppio attivato cofattore SeAdoYn e DNA MTase M.BseCI (nel 50% glicerolo) a -20 ° C.
- Determinare la concentrazione di 6BAz e SeAdoYn tramite spettroscopia UV / Vis utilizzando i coefficienti di estinzione ε 269nm (6BAz) = 16000 centimetri -1 m -1 e ε 260nm (SeAdoYn) = 15400 centimetri -1 M -1 in acqua deionizzata. Determinare la concentrazione di MTases dal saggio Bradford o, se il coefficiente di estinzione è disponibile, tramite assorbimento diretto a 280 nm.
- Cercate di evitare di creare bolle pipettando intensivo o vortex per prevenire la perdita di attività enzimatica. Invece, mescolare delicatamente pipettando su e giù.
- Quando si aggiungono cofattori aziridina da soluzioni di riserva in DMSO fare in modo che la concentrazione DMSO finale nel test è menoal 5%. Includere sempre 10 ioni magnesio mm nella tampone per evitare reazioni aspecifiche con DNA.
- Quando si aggiungono cofattori doppie attivati da soluzioni stock acide utilizzare piccoli volumi (soluzioni stock altamente concentrati) per evitare variazioni di pH e di fare in modo che il pH della soluzione test non cambia in modo significativo. Evitare tioli, ad esempio, β-mercaptoetanolo o ditiotreitolo (DTT), in tampone perché possono interferire con la reazione di scatto per complessazione degli ioni rame richiesti.
2. One-step Etichettatura del DNA tramite aziridina Cofattori
- Metiltransferasi-Induced Label ing specifici Sequence (sorridendo) di plasmide DNA con M.BseCI MTase DNA e aziridina cofattore 6BAz.
- Scongelare la soluzione cofattore a 20 ° C e preparare le miscele di reazione in ghiaccio.
- Oltre al dosaggio effettuare un controllo "cofattore", di visualizzare le modifiche specifiche non e un & #8220; enzima "controllo, per assicurarsi che la preparazione MTase è libero di naturale AdoMet cofattore.
- Per il mix dosaggio di 2 ml di 10x tampone di modifica (contenente 100 mM Tris-HCl, 100 mM MgCl 2, 20 mM β-mercaptoetanolo, pH 7,4), 2 ml di pBR322 (0,5 mg / mL), 10 eq. M.BseCI per sequenza di riconoscimento sul DNA (sequenza 1 riconoscimento in pBR322) e il cofattore aziridina 6BAz ad una concentrazione finale di 60 mM in un volume totale di 20 microlitri. Aggiungere cofattore e MTase DNA scorso.
NOTE: β-Mercaptoethanol è tossico, corrosivo e dannosi per l'ambiente. - Per il controllo "cofattore" aggiungere acqua deionizzata invece di M.BseCI e per il controllo "enzima" aggiungere acqua deionizzata al posto di 6BAz.
- Mescolare le soluzioni pipettando gentilmente su e giù.
- Incubare le provette a 55 ° C per 1 ora.
- Centrifugare brevemente per raccogliere tutto il liquido sul fondo delle provette.
- Test restrizione-modificazione per verificare la modifica del DNA.
- Preparare una soluzione mescolando 10 microlitri tampone 10x R.TaqI (contenente 100 mM Tris-HCl, 50 mM MgCl 2, 1 M NaCl, 1 mg / ml di albumina di siero bovino, pH 8,0), 80 microlitri di acqua deionizzata e 3,3 ml di endonucleasi di restrizione (REase) da Thermus aquaticus (R.TaqI, 10 U / ml). Assicurarsi di aggiungere il REase nell'ultimo passaggio.
- Per ogni tubo da 2.1.7 aggiungere 2 ml di 10x tampone R. TaqI e 28 ml di soluzione dall'alto (2.2.1).
- Mescolare le soluzioni pipettando gentilmente su e giù.
- Incubare le provette a 65 ° C per 30 min.
- Centrifugare brevemente per raccogliere tutto il liquido sul fondo delle provette.
- Assay spostamento elettromobilità (EMSA) con streptavidina per verificare la modifica funzionale.
- Rimuovere 25 microlitri da ogni provetta (2.2.5) e aggiungere 2,4 ml di una soluzione di streptavidina (1 mM rispetto alla streptavidina monomer in tampone contenente streptavidina 100 mM Na 2 HPO 4, NaCl 100 mM, pH 7,5; 4 equivalenti di biotina totale). Aggiungere 2,4 ml di tampone streptavidina ai rimanenti tubi.
- Incubare tutte le provette a 37 ° C per 1 ora.
- Analisi tramite elettroforesi su gel di agarosio.
- Aggiungere 5 ml di tampone di caricamento 6x (0,25% blu di bromofenolo, 30% glicerolo) ad ogni provetta.
- Mescolare le soluzioni delicatamente.
- Carico 10 microlitri di ciascun campione nei pozzetti di un gel di agarosio (1% agarosio in tampone TBE 0,5x contenente 1x GelRed da una soluzione 10.000X magazzino).
- Eseguire il gel in tampone TBE 0.5x con 80 V per circa. 1 ora.
- Visualizzare bande di DNA su un tavolo UV (312 nm) con una telecamera CCD dotata di filtro (540 ± 50 nm).
NOTA: la luce UV è dannoso per gli occhi e la pelle.
3. Due-passo Protein Labeling via Cofattori doppie Attivato
- MethyltransfTrasferimento di gruppi attivati (MTAG) con Set7 / 9 e doppio attivato cofattore SeAdoYn per dell'istone H3 lisina 4 Etichettatura (fase di modifica) cancella-Diretto.
- Scongelare i componenti e preparare le miscele di reazione sul ghiaccio. NOTA: Tenere sempre SeAdoYn raffreddato per evitare il degrado.
- Oltre al dosaggio effettuare un controllo "cofattore", di visualizzare le modifiche non specifiche, e un controllo "enzima", di escludere reazioni non specifiche della sonda fluorescente.
- Preparare una soluzione test (20 microlitri) contenente tampone modifica (50 mM Tris-HCl, 5% glicerolo, pH 8,5), 10 micron istone H3, 10 micron Set7 / 9 e 600 micron SeAdoYn (miscela di entrambi epimeri al selenio). Negli ultimi passi aggiungere cofattore e poi MTase.
- Per il controllo "cofattore" preparare una soluzione test come in 3.1.3 e aggiungere 60 AdoMet mM di competere con il cofattore sintetico. Per il controllo "enzima" aggiungere acqua deionizzata al posto di SeAdoYn.
- Mescolare le soluzioni lentamente pipettando su e giù. Controllare il pH aggiungendo 1 ml di ciascuna soluzione di campo superiore di una striscia pH (range pH di 5 - 10).
- Incubare a 37 ° C per 2 ore.
- Nel frattempo preparare un gel SDS gel di poliacrilammide al 12% (in esecuzione: 357 Bis-Tris pH 6,5-6,8 mM, 0,1% (w / v) APS, 0,04% (v / v) TEMED e 12% acrilammide / bisacrilammide 37.5: 1 ; loading gel: 357 Bis-Tris pH 6,5-6,8 mM, 0,1% (w / v) APS, 0,04% (v / v) TEMED e 5% acrilammide / bisacrilammide 37,5: 1).
NOTA: L'acrilamide / bisacrilammide è tossico e la salute pericolosi. Indossare guanti durante questa procedura.
- Etichettatura chimica di lisina alkinylated 4 in H3 via azide-alkyne cicloaddizione (CuAAC) (step etichettatura) di rame-catalizzata.
- Poco prima della fine della reazione modifica preparare una miscela contenente 3 5x click CuSO 4 mM, tris 3 mM (3-idrossipropil-triazolylmethyl) ammina (THPTA), 250 mM ascorbato di sodio e 6 mM TAMRA azide convolume totale di 20 microlitri.
- Aggiungere 5 ml di 5x click mix preparato fresco ogni provetta per avviare il CuAAC e placare la reazione di modifica.
- Mescolare delicatamente pipettando su e giù.
- Proteggere tutti i tubi con un foglio di alluminio dalla luce per evitare fotometabolismo del fluoroforo.
- Incubare a 20 ° C per 1 ora.
- Protein precipitazioni per rimuovere l'eccesso di libera TAMRA fluoroforo.
- Per evitare eclissare della fluorescenza etichettati istone H3 da intensa fluorescenza in gel di libera TAMRA fluoroforo, eliminare l'eccesso di fluoroforo per precipitazione delle proteine (3.3.2 - 3.3.4) 34.
- Aggiungere 75 ml di metanolo, 18,8 ml cloroformio e 50 ml di acqua deionizzata ad ogni provetta e vortex brevemente dopo ogni aggiunta. Centrifugare a 16.000 g per 5 min. Rimuovere la fase superiore senza disturbare lo strato di interfaccia, che contiene la proteina.
- Aggiungere 56,3 ml di metanolo al rimanente fase in ogni provetta, vortex e centrifugare a 16.000 xg per 5 min a pellet proteina. Rimuovere il surnatante. Ripetere questo passaggio per lavare il pellet.
- Coprire i tubi aperti con un panno che non lasci residui e lasciare asciugare per 15-30 min.
- Analisi tramite SDS PAGE.
- Sciogliere proteine precipitate da 3.3.4 in 20 microlitri tampone di SDS carico (50 mM Tris-HCl, 2,5% (w / v) di SDS, 10% (v / v) di glicerolo, 320 mM β-mercaptoetanolo e 0,05% (w / v) blu bromofenolo, pH 6,8). Assicurati di sciogliere completamente il pellet sciacquando le pareti dei tubi con una pipetta.
- Incubare i campioni a 95 ° C per 10 minuti e lasciate raffreddare a 20 ° C.
- Centrifugare brevemente per raccogliere tutto il liquido sul fondo delle provette.
- Caricare l'intero importo di ogni campione nei pozzetti di un gel di poliacrilammide SDS (3.1.7). Utilizzare 50 MOPS mM, 50 mM Tris-X (Tris-base), 5 mM EDTA, 0,1% (w / v) di SDS come tampone di corsa per elettroforesi.
- Eseguire il gel con 120 V per circa. 90 min.
- Visualizzare la fluorescenza in-gel su un tavolo UV (312 nm) con una telecamera CCD dotata di filtro (540 nm ± 50 nm).
NOTA: la luce UV è dannoso per gli occhi e la pelle.
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Representative Results
One-step Etichettatura del DNA tramite aziridina Cofattori
Questa reazione viene effettuata ad esempio con il DNA MTase M.BseCI, che modifica il secondo residuo di adenina nel doppio filamento 5'-ATCG A T-3 'sequenza ed ha un sito di riconoscimento sul plasmide pBR322 (Figura 4A). Per verificare l'etichettatura plasmide, pBR322 è sfidato con la endonucleasi di restrizione (REase) R.TaqI (5'-TCGA-3 '). R.TaqI ha sette siti pBR322, uno dei quali è incluso nel sito M.BseCI. Se si verifica l'etichettatura, il sito M.BseCI sarà protetto contro scissione e di un nuovo frammento con 683 coppie di basi (pb) formerà mentre altri due frammenti scompariranno (315 e 368 bp). Naturalmente, quando si analizza l'etichettatura DNA con altri MTases DNA diversi REases con sequenze di riconoscimento corrispondenti dovrebbero essere impiegati.
Il gel di agarosio in figura 4B mostra chiaramente la comparsazione di un nuovo frammento di 683 bp (corsia 3). Questo dimostra che l'etichettatura del sito M.BseCI verificato. Solo il test (corsia 3) mostra questo frammento. Il controllo "cofattore" (corsia 5) e il controllo "enzima" (corsia 7) mancano questa banda. Specialmente il controllo "enzima" è importante perché dimostra che il cofattore naturale AdoMet non è presente nel preparato enzimatico. Specificità della reazione di marcatura è dimostrato da test spostamento elettromobilità (EMSA) l 'aggiunta di streptavidina (Figura 4B e dettaglio in 4C). Elettromobilità di 683 bp è ritardato, mentre la mobilità di tutti gli altri frammenti senza sito M.BseCI è invariato rispetto ai controlli (confrontare corsia 4 con corsie 6 e 8).
Figura 4: Sequencespecifica biotinilazione di pBR322 plasmide DNA con M.BseCI e 6BAz. A. plasmide pBR322 che mostra la mappa di siti di riconoscimento per M.BseCI (rosso) e R.TaqI (verde) e la lunghezza di frammenti di DNA attesi in paia di basi (bp) dopo restrizione con R.TaqI. B. Analisi del DNA frammentazione e EMSA mediante elettroforesi su gel di agarosio. M = Marker, corsie 1 e 2: DNA plasmide solo, corsie 3 e 4: test, corsie 5 e 6: il controllo 'cofattore', corsie 7 e 8: controllo 'enzima'. Lanes 2, 4, 6 e 8 contengono inoltre streptavidina. C. allargata inserto da B. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Two-step Etichettatura di proteine tramite Cofattori doppie Attivato
Ad esempio per l'etichettatura in due fasi di MTase substrati con analoghi doppio attivato AdoMet abbiamo scelto l'istoneLisina H3 4 (H3K4) MTase Set7 / 9 e la piccola SeAdoYn cofattore. Dopo il trasferimento enzimatica del gruppo propargile attivato al substrato istone H3 (primo passo), l'alchino terminale è etichettata chimicamente con una azide modificato TAMRA fluoroforo da CuAAC click chemistry (seconda fase) (confrontare Figura 3). Analisi della reazione di marcatura avviene mediante SDS-PAGE e la rilevazione della fluorescenza a-gel (Figura 5A). Il saggio (corsia 1) mostra una banda fluorescente corrispondente istone H3 indica che la catena laterale del cofattore è stato trasferito con successo e la proteina modificata marcato con il fluoroforo TAMRA. Nessun bande sono visibili nella "cofattore" e controlli "enzimi" (corsie 2 e 3), che dimostrano che l'etichettatura dell'istone H3 è mediata dal MTase. Pertanto, l'etichettatura chimica non specifica sia dalla sola cofattore (primo passo) o durante CuAAC (seconda fase) può essere esclusa. Il controllo "cofattore" viene eseguita differently rispetto al protocollo per l'etichettatura del DNA di uno stadio. Questo perché precipitazione di istone H3 è più efficiente in presenza di Set7 / 9 e omettendo la proteina MTase può portare a quantità ridotte di istone H3 nel controllo di carico. Così, abbiamo aggiunto una elevata concentrazione di naturale AdoMet cofattore di competere con SeAdoYn. Caricamento dell'istone H3 può essere facilmente controllato dalla colorazione del gel con Coomassie blu dopo il rilevamento della fluorescenza.
MTase substrati possono essere etichettati con biotina invece di fluorofori utilizzando biotina-azide derivatizzato nella seconda fase chimico 30. Biotinilazione di proteine è convenientemente analizzati mediante Western blotting con perossidasi-coniugato avidina. Ciò è mostrato nella Figura 5B per la biotinilazione di istone H3 con Set7 / 9, SeAdoYn e biotina-azide modificato. Il saggio in corsia 1 mostra una banda chiara per l'H3 istone etichetta. L'assenza di bande nel "enzima" (corsia 2)e "cofattore" controllo (corsia 3) dimostra ancora una volta che l'etichettatura è specifico per il MTase. Il controllo "cofattore" viene eseguita solo in assenza di proteine MTase perché l'analisi Western blot non richiede la rimozione dell'eccesso biotina per precipitazione delle proteine.
Figura 5: Etichettatura dell'istone H3 con la proteina MTase Set7 / 9 e SeAdoYn seguita da reazioni click con etichette azide-derivatizzata. A. In-gel fluorescenza TAMRA marcato istone H3 e controlli, nonché colorazione con Coomassie blu per il controllo di carico. B. occidentale blot di biotinilato H3 istoni e controlli utilizzando avidina-perossidasi di rafano (HRP). Condizioni sperimentali sono stati molto simili a quelli per l'etichettatura di fluorescenza in A (modificazione enzimatica: 6.581; M istone H3, 10 pM Set7 / 9, 600 pM SeAdoYn, in 50 mM Tris-HCl, 5 mM MgCl 2, 5% glicerolo, pH 9.0, 30 ° C, 3 h; etichettatura chimica:. 0.6 CuSO mm 4, 0.6 THPTA mm, 50 mm ascorbato di sodio, 1,2 mm biotina-azide, 37 ° C, 1 ora) Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Etichettatura in un unico passaggio di DNA con MTases DNA e cofattori aziridina (DNA sorridendo) è un metodo robusto ma alcuni aspetti deve essere considerato al momento di pianificare l'esperimento.
Cofattore Aziridine: La concentrazione 6BAz per l'etichettatura del DNA con M.BseCI era di 60 micron. Quando si utilizzano altri MTases DNA la concentrazione cofattore dovrebbe essere ottimizzato, ad esempio concentrazioni partire da 20 micron sono stati impiegati con il MTase DNA M.TaqI 19. Concentrazioni basse 6BAz hanno il vantaggio che un eccesso quadruplice streptavidina (siti rispetto all'intera quantità di biotina nel saggio di legame) può essere aggiunto direttamente dopo incubazione con REase senza interferire con analisi EMSA. Altrimenti il DNA biotinilato deve essere purificato per rimuovere l'eccesso cofattore ed evitare sbavature del DNA durante l'elettroforesi su gel di agarosio. Quando si aggiungono cofattori aziridina da soluzioni di riserva in DMSO assicurarsi che la concentrazione finale di DMSO in the dosaggio è inferiore al 5%. Troppo DMSO può inattivare enzimi. Conservare sempre aziridina cofattori a -80 ° C per evitare il degrado.
MTase DNA: accoppiamento enzimatica di cofattori aziridina con DNA può portare a forti inibitori del prodotto e le MTases DNA devono essere utilizzati in quantità stechiometriche. Pertanto utilizzare sempre più di 1 equivalente di MTase DNA. La maggior parte MTases DNA copurify con bound AdoMet che deve essere rimosso dalla vasta dialisi o lavando gli enzimi su una colonna con grandi volumi di tampone. Il controllo "enzima" dirà se AdoMet è ancora presente nel preparato enzimatico. Etichettatura con M.BseCI può essere effettuata anche mediante incubazione per una notte a 37 ° C.
Buffer Modifica: include 10 ioni magnesio mM nel buffer per evitare reazioni aspecifiche di cofattori aziridina con il DNA. Se ioni magnesio portano all'attivazione della nucleasi contaminanti, ioni bario potrebbero essere aggiunti invece.
Per l'etichettatura specifica sequenza di DNA non solo sorridente DNA, ma anche MTAG può essere impiegato. Qui cofattori doppia attivati vengono utilizzati per il trasferimento enzimatica di catene laterali con gruppi funzionali uniche al DNA. Questi gruppi funzionali, per esempio ammine primarie, possono essere modificati con un'ampia varietà di gruppi giornalista, tra biotina o fluorofori, da NHS ester chimica in una seconda fase 8,35,36. In alternativa, abbiamo iniziato a sintetizzare doppio analoghi AdoMet attivati con le grandi catene laterali già contenenti il gruppo giornalista e utilizzati per l'etichettatura di DNA in un solo passo.
I due fasi MTAG procedura di etichettatura per le proteine con la doppia cofattore attivato SeAdoYn è stato utilizzato con successo con un numero di MTases proteine 30,31. Tuttavia, le seguenti osservazioni devono essere considerati prima di eseguire l'esperimento.
Doppio cofattore attivato: questi cofattori, tra cui il SeadoYn, sono conservati in condizioni e cure acide devono essere prese che il pH della soluzione modifica non cambia in modo significativo su cofattore aggiunta. Abbiamo sempre controllare il pH aggiungendo 1 ml di soluzione di modifica una striscia pH e, se il pH è troppo basso, aggiungere piccole quantità di soluzione di idrossido di sodio (50 mM) per regolare il pH. Inoltre analoghi cofattore devono essere aggiunti in un volume basso per evitare variazioni di pH. Così, le concentrazioni minime cofattore necessari per la modifica completa devono essere determinati per altri MTases e soluzioni cofattore azionari altamente concentrati sono preferiti. Le concentrazioni cofattore sono in genere varia tra i 10 micron e 600 micron. La sintesi chimica di cofattori doppio attivato produce tipicamente un approssimativamente 1: 1 miscela di epimeri a zolfo o selenio e separazione del epimero biologicamente attiva, corrispondente alla -epimer S di AdoMet, dal epimero inattiva è spesso difficile da ottenere. Così, le concentrazioni sono cofattoretipicamente espressa una miscela di isomeri. Doppia analoghi cofattore attivati sono piuttosto instabili a temperatura ambiente e deve essere conservato a -20 ° C. Assicuratevi anche di scongelare le soluzioni madre sul ghiaccio e tenerli freddo durante il pipettaggio. Possono essere congelati di nuovo, ma per garantire l'attività riproducibili si consiglia di effettuare aliquote.
Proteine MTase: Per trasformazioni con cofattori doppio attivati i MTases possono essere utilizzati in quantità catalitiche. Tuttavia, MTases sono spesso enzimi lenti con numero di fatturato nel min -1 gamma con la naturale AdoMet cofattore. Per ragioni pratiche spesso usiamo gli MTases in quantità stechiometriche e ridurre al minimo il tempo di incubazione e la temperatura (in genere 10 minuti a 2 ore e 20 ° C a 37 ° C). Il controllo "cofattore" varia, a seconda del tipo di gruppo reporter e rilevamento. Per biotina etichettatura del MTase viene semplicemente omesso e analisi può essere effettuata mediante Western blotting (Figura 5B (Figura 5A). Tuttavia, se la precipitazione dell'istone H3 porta alla perdita di proteine, SDS-PAGE può essere esteso ed eccesso di libera TAMRA fluoroforo si esaurirà del gel con il blu di bromofenolo anteriore.
Tampone modif: Il buffer enzimatica ottimale può essere utilizzato, ma tioli, come ditiotreitolo (DTT) e β-mercaptoetanolo, dovrebbero essere evitati. Si legano a ioni e b rame bloccare la seguente reazione click CuAAC.
CuAAC clicca reazione: La concentrazione finale di TAMRA azide dovrebbe essere due volte superiore alla concentrazione alkyne. Quando si utilizza estratti biologici la concentrazione di rame e legante deve essere aumentata fino a 5 mm ciascuno. TAMRA azide è meglio solubile in DMSO che in acqua. Assicurarsi che la concentrazione finale di DMSO è inferiore al 12%. Tempi di incubazione estesi possono portare a danni proteine e macchie sul gel poliacrilammide SDS. Pertanto, la reazione di marcatura dovrebbe essere sia fermato da precipitazione delle proteine o aggiunta di tioli.
Questa procedura etichettatura due fasi può anche essere utilizzato per etichettare substrati proteine MTase con biotina o per il rilevamento occidentale blot (Figura 5B) o di isolamento con perline magnetiche rivestite di streptavidina. Inoltre, doppie analoghi AdoMet attivi possono essere utilizzati per etichettare DNA, RNA e piccoli prodotti naturali con MTases corrispondenti.
ve_content "> Rispetto alla maggior parte degli altri metodi di etichettatura per gli acidi nucleici e proteine, l'etichettatura MTase mediata ha il vantaggio che supporti nativi possono essere utilizzati direttamente e non è necessaria alcuna ulteriore modifica. Ovviamente, occorre fare attenzione che i substrati naturali non siano bloccate metilazione attraverso una corrispondente MTase in vivo. Inoltre, etichettatura MTase-mediata è molto flessibile sia in termini di gruppi giornalista, che includono biotina, fluorofori o altri tag molecolari, così come bersagli per MTases. REBASE, una base di dati per la restrizione endonucleasi e DNA MTases, elenca oltre 700 sperimentalmente caratterizzati MTases DNA con centinaia di differenti sequenze di riconoscimento che vanno da due a otto bp 37 e si prevede che oltre 200 differenti MTases di tutti i tipi sono prodotte nella cellula umana 38. Un determinante importante per l'attività MTase è se l'analogo AdoMet si inserisce nel sito attivo dell'enzima. Anche se i cofattori presentati 6Baz e SeAdoYn sono progettati per avere piccoli gruppi reattivi, alcuni MTases non possono facilmente accettarli. In questi casi, i siti attivi potrebbero essere ampliati mediante ingegneria proteica come è stato dimostrato per il DNA 35, 23 e RNA MTases proteine 25 - 28 con stericamente più impegnative doppie analoghi AdoMet attivati. Un'etichettatura specifica sequenza di DNA e RNA con analoghi AdoMet è di grande interesse per la genotipizzazione (mappatura del DNA) 36 e la metilazione di rilevamento 39, studi funzionali di DNA / RNA e DNA / RNA enzimi che modificano 15 e per (nano) biotecnologie 13, 14 e la consegna del gene 19. Altri metodi per la specifica etichettatura DNA covalente sequenza affidano oligonucleotidi sintetici tripla elica che forma, acidi nucleici peptidici o poliammidi tornanti come dispositivi di targeting o su sequenze specifiche endonucleasi intaccare (NEases) seguito da etichettatura traduzione nick.
Etichettatura specifico di proteine con doppi analoghi AdoMet attivati è stato diretto principalmente verso le applicazioni nel campo della ricerca proteomica, ad esempio, l'identificazione di nuovi substrati per MTases proteine in complessi miscele biologiche 27,28, ma altre applicazioni, come studi funzionali, dovrebbe anche essere fattibile. Anche se l'etichettatura MTase-mediata è stata principalmente eseguita con MTases purificati in vitro, l'etichettatura può essere raggiunto anche in cellule viventi, come è stato riportato di recente 40. Naturalmente, molti altri metodi per l'etichettatura specifica proteina sono disponibili 3,4. Oltre incorporazione di amminoacidi non naturali utilizzando cellule ingegnerizzate che in genere richiedono fusioni genetiche della proteina di interesse con le etichette auto-etichettatura / proteins o tag per l'etichettatura degli enzimi-mediata. A questo proposito sequenze peptidiche breve servono come substrati per MTases proteine, code istoni esempio N-terminale, possono essere fuse ad una proteina di interesse e specificamente etichettati con analoghi AdoMet e corrispondenti MTases proteine.
Infine, il repertorio biocatalitico di piccoli MTases molecola può essere ampliato con AdoMet sintetico analoghi della 41-44. Questo rappresenta un nuovo approccio per introdurre diversità strutturale in prodotti naturali, ad esempio antibiotici o polichetidi, che dovrebbe trovare interessanti applicazioni nello screening per le attività biologiche nuove.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6BAz | Synthesized according to Weinhold et al., Patent number US 8,129,106, published March 6, 2012. | ||
| β-Mercaptoethanol | Serva | 28625 | |
| Acetic acid | Fisher Scientific | 10304980 | |
| Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1 | Serva | 10688 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500100 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Serva | 13375 | |
| Bis-Tris | Gerbu | 1304 | |
| Boric acid | Gerbu | 1115 | |
| Bromophenol blue Na salt | Serva | 15375 | |
| Copper(II) sulfate | Aldrich | C1297 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | 10020090 | |
| Coomassie Brilliant Blue | Serva | 17525 | |
| EDTA disodium salt | Gerbu | 1034 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| GelRed (10,000x in water) | Biotium | 41003 | |
| Glycerol (99.5%) | Gerbu | 2006 | |
| FastRuler Low Range DNA Ladder | Thermo Scientific | SM1103 | |
| Histone H3 | Expression plasmid obtained from Dr. Philipp Voigt and Prof. Danny Reinberg; expression and isolation according to T. J. Richmond et al., J. Mol. Biol. 1997, 272, 301-311. | ||
| M.BseCI | Expression plasmid obtained from Dr. Michael Kokkinidis; expression and isolation according to Kapetaniou et al., Acta Cryst. 2006, F63, 12-14. | ||
| Methanol | Fisher Scientific | 10675112 | |
| Magnesiumchloride hexahydrate | J.T. Baker | 4003 | |
| MOPS | Gerbu | 1081 | |
| Sodium chloride | Gerbu | 1112 | |
| pH strip (Neutralit) | Merck | 1,095,330,001 | |
| pBR322 | Thermo Scientific | SD0041 | |
| R.TaqI (10 u/µl) | Thermo Scientific | ER0671 | |
| SeAdoYn | Synthesized according to Willnow et al., ChemBioChem 2012, 13, 1167-1173. | ||
| Set7/9 | Expression plasmid obtained from Prof. Danny Reinberg, expression and isolation according to D. Reinberg et al., Genes Dev.2002, 16, 479-489. | ||
| Streptavidin | Gerbu | 3058 | |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Sigma Life Science | A7631 | |
| SDS Granular | Gerbu | 1833 | |
| di-Sodium hydrogenphosphate | Merck | 106,586 | |
| TAMRA azide | Synthesized according to reference 30: Willnow et al., ChemBioChem 2012, 13, 1167-1173. | ||
| TaqI buffer (10x) | Thermo Scientific | B28 | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Acros Organics | 42058 | |
| Tris-HCl | Gerbu | 1028 | |
| Tris-X (TRIS-base) | Gerbu | 1018 | |
| Tris(3-hydroxypropyltriazolyl-methyl)amine (THPTA) | Sigma-Aldrich | 762342 |
References
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