Summary
DNA及びタンパク質は、配列特異的親和性またはDNAまたはタンパク質トランスフェラーゼおよび合成補因子類似体を用いた蛍光レポーター基で標識される。酵素の補因子特異性に応じて、アジリジンまたは二活性化補助因子アナログは、一次元または二段階標識のために用いられる。
Abstract
S -Adenosyl -1-メチオニンメチオニン（AdoMetまたはSAM）依存性メチルトランスフェラーゼ（MTアーゼ）、DNA、RNA、タンパク質および小生体分子の特定の位置にあるAdoMetから活性化メチル基の転移を触媒する。この天然のメチル化反応は、補因子の合成類似体を用いてアルキル化反応の多種多様に拡張することができる。アジリジン環とのAdoMetの反応性のスルホニウム中心の交換は、様々なDNAメチルトランスフェラーゼによって、DNAと結合することができる補因子につながる。これらのアジリジン補助因子は、アデニン部分の異なる位置にレポーター基を搭載し、 私は DNA（笑顔DNA） のLアベルのINGを nduced ethyltransferase- のS equence固有のMのために使用することができる。典型的な例として、我々は、DNA MTアーゼM.BseCIとアジリジン補助因子6BAzのある5'-ATCG A T-3 '配列でpBR322プラスミドDNAのビオチン化のためのプロトコルを与える1ステップ。 ctivated Gの roups（MTAG） のm個のethyltransferase指向Tの ransferのために使用されるのAdoMet類似体の別のクラスの不飽和アルキル基の結果と活性化されたメチル基の拡張。拡張された側鎖はスルホニウム中心と不飽和結合によって活性化されるので、これらの補因子は、二重活性化のAdoMet類似体と呼ばれる。これらの類似体アジリジン補因子のようなDNAメチルトランスフェラーゼのための補因子としての機能だけでなく、RNA、タンパク質および小分子MTアーゼのみならず。これらは、典型的には、第2の化学工程でレポーター基で標識されているユニークな官能基を有するMTアーゼ基質の酵素的修飾に使用される。これは、ヒストンH3タンパク質の蛍光標識のためのプロトコルに例示されている。小さなプロパルギル基はのクリックラベルに続いてヒストンH3リジン4（H3K4）MTアーゼSET7 / 9によってタンパク質に補因子アナログSeAdoYnから転送されるTAMRAアジドとアルキニル化ヒストンH3。補因子類縁体とMTアーゼ媒介ラベリングは、識別とMTアーゼ基質の機能的研究ならびにDNAジェノタイピングとメチル化検出を含む多くのエキサイティングなアプリケーションを可能にする技術である。
Introduction
核酸、1,2およびタンパク質3,4の特異的な標識は、機能の特徴付け、医療診断及び（ナノ）バイオテクノロジーのための主要な関心事である。ここでは、S -adenosyl-L-メチオニン（AdoMetをまたはSAM）依存性メチルトランスフェラーゼ（MTアーゼ）に基づいており、これらの生体高分子のための酵素標識法を提示する。このクラスの酵素（EC 2.1.1。）は、核酸およびタンパク質の特定の残基の中の個々の求核位置（窒素、酸素、硫黄および炭素原子）を標的と自然補因子のAdoMet（ 図1A）5の活性化メチル基を転移する。また、MTアーゼは、親和性タグ、蛍光団又は他の標識（ 図1B）6との特異的標識のための合成補因子類縁体を利用することができます。のAdoMet類似体の2つのクラスが開発されてきた：Sの equence固有のM ethyltransferase-ためのアジリジン補助因子を私が Lのアベルる （笑顔）7とctivated のG roups のM ethyltransferase指向性T ransferのための二重活性化したのAdoMet類縁体（MTAG）8。
図1：メチルトランスフェラーゼ（MTアーゼ）によって触媒される反応は 、DNA、RNA、タンパク質および小生体分子を含む様々な基材への天然の補因子のAdoMet（SAM）からA.メチル基転移B.標識核酸およびタンパク質の/官能化（NNNNN =。 DNAのための塩基対、タンパク質についてのRNAおよびアミノ酸に対するヌクレオチド;緑色対象残基とMTアーゼのXXXXX =認識配列）合成補因子類似体。レポーター基を含むアジリジン補助因子（青球）特に標的残基に結合された配列は、（左）アデニン環にある取り付け及び二活性化のAdoMet類似体は、第二段階でバイオ直交クリック反応により標識することができる化学レポーターY（右）を担持する拡張アルキル鎖の転送につながる。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
アジリジン補助因子は、DNAメチルトランスフェラーゼで最適に動作する。それらは窒素原子9（またはNが 10,11 -mustard）の代わりに、スルホニウム中心の反応性基を有する3員環を含む。この窒素原子のプロトン化は、DNAと全体の補因子の共有結合につながる標的ヌクレオチドによる求核攻撃のためのアジリジン環を活性化させる。アデニン環にレポーター基を結合することにより、アジリジン補因子は、（一段階でDNAを標識するためにDNAメチルトランスフェラーゼと組み合わせて使用することができる
図2：M.BseCIと6BAzとDNAの配列特異的一工程ビオチン化 DNA MTアーゼM.BseCIは、二本鎖DNA配列5'-ATCG A T-3 'を認識し、自然に二アデニンのアミノ基をメチル化のAdoMetを使用して残留物（緑色）。アジリジン補助因子6BAzとの反応のコースが変更され、M.BseCIは、ターゲットアデニンとビオチン（青）を含めた全体の補因子を結合することによって、特定のDNAビオチン化を配列決定するためにつながる。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
二重活性化のAdoMet類似体は、不飽和側鎖の代わりに、スルホニウム中心におけるメチル基（ 図1B拡張含む）20。スルホニウム中心部へのβ位に不飽和二重または三重結合は、電子的に接合安定化により遷移状態の中不利な立体効果を補償します。スルホニウム中心と不飽和結合の両方が酵素転送のための側鎖を活性化するので、これらの補因子は、二重活性化のAdoMet類似体と命名した。典型的には、それらは、第二工程8,21において化学選択的標識のために、アミノ、アルキンとアジド基のようなユニークな化学基（化学レポーター）で側鎖を転送するために使用される。 RNAおよびタンパク質の追加のラベル付けを可能28 -一般的には、二重の活性化のAdoMet類似体は、RNA MTアーゼ22,23 DNA MTアーゼ8,20,21のためだけでなく、ための補因子およびタンパク質のMTアーゼ24としてだけではなく機能することができます。しかし、拡張された側鎖が立体的にメチル基より厳しいであり、タンパク質工学によってMTアーゼ活性部位を拡大することはしばしばある効率的な転送速度を得るために必要なEN。銅による化学的修飾を、以下のための酵素の転写時の遷移状態の1安定化および2反応性ハンドル：この問題に対する別の解決策は、小さなプロパルギル末端アルキンは、2つの機能を果たす基（3個の炭素）とのAdoMet類似体を使用することである触媒によるアジド - アルキン環（CuAAC）ケミストリーをクリックします。それは、結果のプロパルギルのAdoMet類縁体29は 、中性またはわずかに塩基性条件下でのみ限定された使用の非常に不安定であることが判明した。この欠点は、セレンと硫黄原子を置換することによって固定することができる。得られた補因子5 ' - [（ セレン ）[（3 S）-3-アミノ-3-カルボキシプロピル]プロプ-2- ynylselenonio] -5'-デオキシアデノシン（SeAdoYn、 図3）は、野生型DNAによって受け入れられ、RNA多くの場合、タンパク質工学の必要性を排除32 -とタンパク質MTアーゼ30。これは、蛍光プロ例示されるヒストンH3リジン4（H3K4）MTアーゼSET7 / 9 33（：二重に活性化補助因子を介して 2つの段階のタンパク質標識、図3、プロトコルセクション3を参照）での標識をTEIN。
図3：SET7 / 9、SeAdoYnとTAMRAアジドとヒストンH3の配列特異的二段階蛍光標識タンパク質MTアーゼSET7 / 9が自然のAdoMetを使用して、ヒストンH3のリジン4のアミノ基（H3K4、緑）をメチル化する。。二重活性化補助因子でSeAdoYn MTアーゼは、リジン残基に小さなプロパルギル基（赤）を転送する。接続された端末三重結合は、その後選択的にアジド誘導体化TAMRA（テトラメチルローダミン、青）フルオロフォアでバイオ直交クリック反応（銅触媒アジド - アルキン付加環、CuAAC）に変更されます。ロード/ 52014 / 52014fig3highres.jpg「ターゲット= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Protocol
1.一般手順
- ストアアジリジン補助因子（DMSO中）6BAzとタンパク質MTアーゼ-80℃でSET7 / 9と二重活性化補助因子SeAdoYnとDNA MTアーゼM.BseCI -20℃（50％グリセロール）を含むすべての他の試薬。
- 脱イオン水に吸光係数ε269nmで （6BAz）= 16000センチメートル-1 M -1およびε260nmの （SeAdoYn）= 15400センチメートル-1 M -1用いたUV /可視分光法を経由して 6BAzとSeAdoYnの濃度を決定する。吸光係数は、280nmでの直接吸収を介して利用可能である場合には、ブラッドフォードアッセイによってMTアーゼの濃度を決定するか。
- 酵素活性の損失を防ぐために、集中的なペッティングまたはボルテックスにより気泡を作成しないようにしてください。その代わりに、優しく上下にピペッティングにより混合します。
- DMSO中のストック溶液からアジリジン補助因子を追加する場合はアッセイにおける最終DMSO濃度は低いことを確認してください5％未満。常にDNAとの非特異的反応を防止するアッセイ緩衝液中の10mMのマグネシウムイオンが挙げられる。
- 酸性のストック溶液から二重に活性化補助因子を追加する場合はpH変化を回避し、アッセイ溶液のpHが大きく変化しないことを確認するために小容量（高濃縮ストック溶液）を使用します。彼らは必要な銅イオンの錯体形成によってクリック反応を妨害することができるので、アッセイ緩衝液中で、チオールを避けるため、 例えば 、βメルカプトエタノールまたはジチオスレイトール（DTT）。
アジリジン補因子を介した DNAの2つのステップのラベル
- M.BseCI DNA MTアーゼおよびアジリジン補助因子6BAzプラスミドDNAの配列特異的メチルトランスフェラーゼ誘発ラベルING（笑顔）。
- 20℃における補因子ソリューションを解凍し、氷上で反応混合物を準備します。
- 検定に加えて任意の非固有の変更を可視化するために、「補因子」の制御を行う、とAN＆＃8220。酵素」コントロールは、MTアーゼの準備は、自然補因子のAdoMetがないことを確認します。
- （100 mMトリス-塩酸を含む、100のMgCl 2、20 mMのβメルカプトエタノール、pH7.4）で10倍の修正バッファ、pBR322の2μL（0.5μgの/μL）、10当量のアッセイミックス2μlのために。 DNA上の認識配列（pBR322の中で1認識配列）と20μlの総体積内の60μMの最終濃度にアジリジン補助因子6BAzあたりM.BseCI。最後の補因子とDNA MTアーゼを追加します。
注：βメルカプトエタノールは、毒性、腐食性、環境に有害である。 - 「補因子」制御のために代わりにM.BseCIの脱イオン水を追加し、「酵素」コントロールには6BAzの代わりに脱イオン水を追加します。
- 優しく上下にピペッティングすることによって溶液を混合。
- 1時間55℃でチューブをインキュベートします。
- チューブの底にすべての液体を回収するための遠心分離を簡単に。
- DNA修飾を確認するための制限修飾アッセイ。
- 、80μlの脱イオン水および3.3液（100mMのトリス-HCl、50mMのMgCl 2を 、1 MのNaCl、1mg / mlのウシ血清アルブミン、pHが8.0を含む）10μlの10×R.TaqI緩衝液を混合して溶液を調製サーマス·アクアティクス （R.TaqI、10 U /μL）から制限エンドヌクレアーゼ（REase）。最後のステップでREaseを追加してください。
- 各チューブに2.1.7から10倍のR.のTaqIバッファと上から溶液（2.2.1）の28μLの2μlを添加する。
- 優しく上下にピペッティングすることによって溶液を混合。
- 30分間65℃でチューブをインキュベートします。
- チューブの底にすべての液体を回収するための遠心分離を簡単に。
- ストレプトアビジンとの電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）は、機能的な変更を確認します。
- 各チューブ（2.2.5）からの25μlのを削除し、ストレプトアビジンMに対するストレプトアビジン溶液（1 mMと2.4μlを添加するonomerの100mMのNa 2 HPO 4を含有するストレプトアビジン緩衝液中で、100mMのNaCl、pH7.5で、総ビオチンの4当量）。残りのチューブにストレプトアビジンバッファーの2.4を添加する。
- 1時間、37℃ですべてのチューブをインキュベートします。
- アガロースゲル電気泳動による分析。
- 各チューブに6Xローディングバッファー（0.25％ブロモフェノールブルー、30％グリセロール）の5μlを添加する。
- 優しく溶液を混合。
- 負荷（10,000倍ストック溶液から1×GelRedを含む0.5×TBE緩衝液中の1％アガロース）アガロースゲルのウェルに10μlの各サンプル。
- 約80 Vで0.5×TBE緩衝液でゲルを実行します。 1時間。
- フィルタ（540±50 nm）とを備えたCCDカメラ（312 nm）のUVテーブル上でDNAバンドを可視化する。
注：UV光が目や皮膚に損傷を与えている。
ダブル活性化補助因子を介した 3つの段階のタンパク質標識
- MethyltransfヒストンH3リジン4ラベリング（改質工程）のためのSET7 / 9と二重活性化補助因子SeAdoYnで活性化グループ（MTAG）の譲渡を消去し、指示した。
- コンポーネントを解凍し、氷上で反応混合物を準備します。注：必ずSeAdoYn劣化を避けるために冷却して続ける。
- アッセイに加えて、任意の非特異的改変を可視化するために、「補因子」制御を実行し、「酵素」制御は、蛍光プローブの非特異反応を除外する。
- 修正緩衝液（50mMのTris-HCl、5％グリセロール、pH8.5）中、10μMヒストンH3、10μMSET7 / 9及び600μMSeAdoYn（セレンの両エピマーの混合物）を含有するアッセイ溶液（20μl）を調製する。最後のステップでは、次に補因子とMTアーゼを追加します。
- 「補因子」コントロール3.1.3のようにアッセイ溶液を準備し、合成補助因子と競争する60 mMののAdoMetを追加します。 「酵素」制御のために代わりにSeAdoYnの脱イオン水を追加します。
- ゆっくり上下にピペッティングすることによって溶液を混合。 pHのストリップ（ - 10 pH範囲5）の上部のフィールドに各溶液1μlを添加してpHを確認してください。
- 2時間37℃でインキュベートする。
- 1：0.1％（w / v）のAPS、0.04％の（v / v）のTEMED 12％アクリルアミド/ビスアクリルアミド37.5 357 mMのビス - トリスpHが6.5〜6.8、：一方のゲルを実行して（12％SDSポリアクリルアミドゲルを調製で;ローディングゲル：357 mMのビス - トリスpHが6.5〜6.8、0.1％APS（w / v）の、0.04％（v / v）のTEMEDと5％アクリルアミド/ビスアクリルアミド37.5：1）。
注：アクリルアミド/ビスアクリルアミドは毒性と健康に危険である。この手順の間に手袋を着用してください。
- 銅触媒アジド-アルキン環（CuAAC）（標識工程） を介してヒストンH3でalkinylatedリジン4の化学標識。
- 修飾反応の終了は、3 mMのCuSO 4を、3 mMのトリス（3-ヒドロキシプロピルトリアゾリル）アミン（THPTA）、250mMのアスコルビン酸ナトリウムおよび6 mMのTAMRAアジドを含有する5倍クリックミックスを調製する直前20μlの総容量。
- CuAACを開始し、修飾反応をクエンチするために各チューブに調製したばかりの5倍のクリックミックスの5μlを添加する。
- ピペッティングにより穏やかに混合します。
- フォアの光退色を避けるために、光からアルミホイルで全てのチューブを保護します。
- 1時間20℃でインキュベートする。
- 無料のTAMRAフルオロフォアの過剰を除去するタンパク質沈殿。
- 34 -無料のTAMRAの蛍光団の集中的なゲル内蛍光によって蛍光ラベルヒストンH3のoutshiningを回避するために、タンパク質（3.3.4 3.3.2）の沈殿によって過剰蛍光団を取り除く。
- 簡単に各添加後、各チューブとボルテックスに75μlのメタノール、18.8μlのクロロホルムと50μlの脱イオン水を追加します。 5分間16000×gで遠心分離する。タンパク質が含まれている界面層を、乱すことなく上相を除去します。
- 私は残りの相に56.3μlのメタノールを追加します。nは5分間16000×gで各チューブ、ボルテックスと遠心機は、タンパク質をペレット化する。上清を取り除きます。ペレットを洗浄するには、この手順を繰り返します。
- 糸くずの出ない組織とのオープンチューブをカバーし、15のためにそれらを乾燥させ - 30分。
- SDS PAGE による分析。
- （20μlのSDSローディング緩衝液（50mMトリス-HCl、2.5％（w / v）のSDS、10％（v / v）グリセロール、320 mMのβメルカプトエタノールおよび0.05％で3.3.4から沈殿したタンパク質を溶解/ワットv）のブロモフェノールブルー、pHは6.8）。完全にピペットでチューブの壁をすすぐことによりペレットを溶解することを確認してください。
- 10分間95℃でサンプルをインキュベートし、それらを20℃まで冷却しましょう。
- チューブの底にすべての液体を回収するための遠心分離を簡単に。
- SDSポリアクリルアミドゲル（3.1.7）のウェルに各サンプルの全量をロードします。電気泳動用のバッファを実行しているようにSDSを（w / v）の50 mMのMOPS、50mMのTris-X（Tris塩基）、5mMのEDTA、0.1％を使用してください。
- 約120 Vでゲルを実行します。 90分。
- フィルタ（50ナノメートルの波長±540）を備えたCCDカメラを用いてUVテーブル（312 nm）の上のゲル内蛍光を可視化する。
注：UV光が目や皮膚に損傷を与えている。
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Representative Results
アジリジン補因子を介したDNAのワンステップラベリング
この例では、反応は、二本鎖の5'-ATCG A T-3 '配列内の第2のアデニン残基を変更し、pBR322プラスミド（ 図4A）上の1つの認識部位を持つDNA MTアーゼM.BseCI、を用いて行われる。プラスミド標識をテストするために、pBR322の制限エンドヌクレアーゼ（REase）R.TaqI（5'-TCGA-3 '）を用いてチャレンジされる。 R.TaqIはM.BseCIサイトに含まれているそのうちの一つのpBR322に7拠点を持っています。ラベリングが発生した場合は、M.BseCIサイトが切断および683塩基対（bp）との新しいフラグメントから保護される2つの他のフラグメントが消えている間（315と368 bp）を形成することになる。もちろん、対応する認識配列を有する他のDNAメチルトランスフェラーゼ異なるREasesにDNA標識を分析する際に使用すべきである。
図4Bのアガロースゲルは、明らかに見える示し683 BP（レーン3）との新しいフラグメントのンス。これはM.BseCIサイトのラベルが発生したことを示している。唯一のアッセイ（レーン3）は、このフラグメントを示しています。 「補因子」コントロール（レーン5）と同様に「酵素」コントロール（レーン7）は、このバンドが欠落している。それは自然な補因子AdoMetを酵素調製物中に存在しないことを示しているので、特に「酵素」の制御が重要である。標識反応の特異性は、（4Cの図4Bおよび詳細）ストレプトアビジンを添加した際の電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）によって実証される。 M.BseCIサイトのない他のすべての断片の移動度が（レーン6および8レーン4を比較）対照と比較して変化していないながら、683塩基対のインダストリアルが遅角さ。
図4：シーケンスM.BseCIと6BAzとpBR322プラスミドDNAの特定のビオチン化。認識M.BseCI（赤）とR.TaqI（緑）のための部位、ならびにDNAのR.TaqI。B.分析による制限後の塩基対（bp）の予想されるDNA断片の長さを示すpBR322のA.プラスミドマップアガロースゲル電気泳動による断片化とEMSA。 M =マーカー、レーン1および2：プラスミドDNAのみ、レーン3および4：アッセイ、レーン5および6：「補因子」コントロール、レーン7および8：「酵素」コントロール。レーン2、4、6、8、さらにストレプトアビジンが含まれている。B.からのインセットC.拡大は、 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
ダブル活性化補因子を介したタンパク質の二段階ラベリング
私たちは、ヒストンを選んだ二重活性化のAdoMet類縁体とMTアーゼ基質の二段階標識のための一例として、H3リジン4（H3K4）MTアーゼSET7 / 9と小さなSeAdoYn補因子。ヒストンH3基板（第1段階）、活性化プロパルギル基の酵素的転写後、末端アルキンは、化学的に（ 図3を比較）CuAACのクリックケミストリー（第二段階）で、アジド修飾されたTAMRAの蛍光体で標識されている。標識反応の分析は、SDS-PAGEおよびゲル内蛍光検出（ 図5A）によって行われる。アッセイ（レーン1）は、補因子の側鎖が正常に転送されたことを示すヒストンH3に対応する蛍光バンドとTAMRAの蛍光体で標識修飾タンパク質を示している。いいえバンドは、ヒストンH3のラベリングMTアーゼによって媒介されることを「補因子」と「酵素」のコントロール（レーン2および3）実証に表示されません。従って、非特異的な化学的標識は、単独補因子（第1工程）により、またはCuAAC（第二段階）の間に除外することができる。 「補因子」コントロールは、Dが行われているifferentlyワンステップDNA標識のためのプロトコルに比べ。ヒストンH3の沈殿がSET7 / 9の存在下でより効率的で、MTアーゼは、ローディングコントロールにおけるヒストンH3量の減少をもたらすことができるタンパク質を省略するためである。従って、我々はSeAdoYnと競合する自然な補因子のAdoMetの高濃度を追加しました。ヒストンH3の装填を容易に蛍光検出の後にクーマシーブルーでゲルを染色することによって制御することができる。
MTアーゼ基質はまた、第二の化学ステップ30において、アジド誘導体化ビオチンを用いてビオチンの代わりにフルオロフォアで標識することができる。タンパク質のビオチン化は、簡便に、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合アビジンを用いたウエスタンブロッティングにより分析する。これは、SET7 / 9、SeAdoYnとアジド修飾されたビオチン化ヒストンH3のビオチン化については、図5Bに示されている。レーン1でのアッセイは、標識されたヒストンH3のための明確なバンドを示す。 「酵素」（レーン2）のバンドが存在しないことと「補因子」コントロール（レーン3）は標識がMTアーゼに特異的であることを改めて示している。ウェスタンブロット分析は、タンパク質沈殿により過剰のビオチンを除去することを必要としないため、「補因子」制御は、単にタンパク質MTアーゼの非存在下で実施される。
図5：アジド誘導体化ラベルをクリック反応が続くタンパク質MTアーゼSET7 / 9とSeAdoYnとヒストンH3の標識。ビオチン化ヒストンH3およびアビジン-西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）コンジュゲートを用いたコントロールのローディング対照のためにクーマシーブルーでのヒストンH3およびコントロールならびに染色をTAMRAで標識した。B.ウェスタンブロット分析のA.ゲル内蛍光。実験条件は、（酵素的修飾における蛍光標識のためのものと非常に類似していた：6.581; MヒストンH3、10μMSET7 / 9、50mMのTris-HCl中600μMSeAdoYn、5mMのMgCl 2、5％グリセロール、pH9.0の、30℃、3時間。化学標識：0.6 mMのCuSO 4を、0.6 mMのTHPTA、50 mMのアスコルビン酸ナトリウム、1.2 mMのビオチン-アジド、37℃、1時間） この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
のDNA MTアーゼおよびアジリジン補助因子（笑顔DNA）を用いたDNAのワンステップ標識は堅牢な方法であるが、実験を計画する際にいくつかの側面を考慮すべきである。
アジリジン補助因子：M.BseCIとDNA標識用6BAz濃度は60であった。他のDNAメチルトランスフェラーゼを使用する場合は補因子の濃度は、20μMのがDNA MTアーゼM.TaqI 19で採用されていると低い例えば濃度を最適化する必要があります。低6BAz濃度は、ストレプトアビジン4倍過剰（アッセイにおけるビオチンの全体量に対する結合部位）を直接EMSAにより分析を妨害することなくREaseとのインキュベーション後に添加することができるという利点を有する。そうでない場合は、ビオチン化DNAを過剰補因子を除去し、アガロースゲル電気泳動の間にDNAの汚れを避けるために、精製されるべきである。 DMSO中のストック溶液からアジリジン補助因子を追加する場合ていることを確認し番目の最終DMSO濃度電子アッセイは、5％未満である。あまりにも多くのDMSOの酵素を不活性化することができます。常に劣化を回避するために、-80℃でアジリジン補助因子を保存する。
DNA MTアーゼは：DNAとアジリジン補因子の酵素的結合が強い製品阻害剤およびDNAメチルトランスフェラーゼは、化学量論的量で使用しなければならないにつながる可能性がある。そのため、常にDNA MTアーゼの1当量以上のものを使用します。ほとんどのDNAメチルトランスフェラーゼは、大規模な透析またはバッファ、大量の列に酵素を洗浄することにより除去される必要がバウンドのAdoMetと同時精製。 「酵素」コントロールがあるAdoMetはまだ酵素製剤中に存在するかどうかを教えてくれます。 M.BseCIによる標識はまた、37℃で一晩インキュベーションすることによって行うことができる。
修正バッファは：DNAとアジリジン補因子の非特異的反応を防止する緩衝液中の10mMのマグネシウムイオンを含む。マグネシウムイオンが混入してヌクレアーゼの活性化につながる場合は、バリウムイオンが代わりに追加される場合があります。
シーケンスのDNAの特異的な標識は、DNA笑顔だけでなく、Mタグを使用することができる。ここで、二重に活性化補助因子がDNAに特有の官能基を有する側鎖の酵素的転写のために使用される。これらの官能基は、 例えば、第一級アミンは、第二段階8,35,36にNHSエステル化学により、ビオチンまたは蛍光団を含むレポーター基の多種多様に修飾することができる。あるいはすでにレポーター基を含む大きな側鎖を有する二重活性化のAdoMet類似体を合成するために開始し、一段階でDNA標識のためにそれらを使用している。
二重活性化補助因子SeAdoYn有するタンパク質のための二段階Mタグ標識化手順が正常タンパク質メチルトランスフェラーゼ30,31の数が使用されてきた。ただし、以下のコメントは、実験を行う前に考慮されるべきである。
ダブル活性化した補因子：これらの補因子、海など、doYn、酸性条件と介護の下に格納され、修正液のpHが大幅に補因子の添加時に変更されないように注意しなければならない。我々は常にpHがストリップに修正溶液1μlを添加してpHをチェックし、pHが低すぎると、pHを調整するために水酸化ナトリウム溶液（50ミリモル）を少量加える。さらに、補因子類似体は、pH変化を避けるために少量で添加されるべきである。したがって、完全に変更するために必要な最小限の補因子の濃度は、他のMTアーゼに対して決定されるべきであり、高度に濃縮された補因子のストック溶液が好ましい。補因子の濃度は、典型的には、10μMおよび600μMの間で変化している。非アクティブなエピマーはしばしば達成するのが困難であるから、のAdoMet のSエピマーに対応する、硫黄またはセレンおよび生物学的に活性なエピマーの分離でエピマーの1：1混合物の二重活性化補助因子の化学合成は、典型的には、約1が得られる。このように、補因子の濃度は、一般的に異性体の混合物のために与えられた。二重活性化補助因子類似体は、室温で非常に不安定であり、-20℃で保存されるべきである。また、氷の上のストック溶液を解凍し、ピペット中に冷たいそれらを維持することを確認してください。彼らは、再び凍結することができるが、我々は分量を作ることをお勧め再現可能な活動を確保するために。
タンパク質MTアーゼ：メチルトランスフェラーゼが触媒量で使用することができる二重の活性化補助因子との変換のために。しかし、MTアーゼは自然な補因子のAdoMetと分-1の範囲でターンオーバー数を有する遅い酵素があることが多い。実用的な理由から、我々は、多くの場合、（通常は10分、2時間、20℃〜37℃で）インキュベーション時間および温度を、化学量論量のメチルトランスフェラーゼを使用して最小化する。 「補因子」コントロールがレポーター基及び検出の種類に応じて、変化する。 MTアーゼを標識化ビオチンは、単に省略され、分析、ウエスタンブロッティング（ 図5Bによって行うことができるための図5A）の酵素的転移を防止するために添加される。ヒストンH3の沈殿は、タンパク質の損失につながる場合は、SDS-PAGEを延長することができ、自由TAMRA蛍光団の過剰のブロモフェノールブルーフロント有するゲルを使い果たす。
変性バッファー：最適な酵素緩衝液を使用することができるが、チオール、ジチオスレイトール（DTT）、βメルカプトエタノールのように、避けるべきである。これらは、銅イオンと、bに結合し以下のCuAACのクリック反応をロック。
反応をクリックしCuAAC：TAMRA、アジの最終濃度は、アルキン濃度の2倍にする必要があります。生物学的抽出物を使用する場合、銅およびリガンド濃度が5mMの各まで増加されるべきである。 TAMRAアジドは、水中よりDMSO中で良い溶解性である。 DMSOの最終濃度が12％未満であることを確認してください。拡張インキュベーション時間は、SDSポリアクリルアミドゲル上のタンパク質損傷及び汚れにつながる可能性がある。このように、標識反応のいずれかのタンパク質の沈殿またはチオールの添加により停止されるべきである。
この2段階標識手順は、いずれかのウェスタンブロット検出（ 図5B）またはストレプトアビジン被覆磁気ビーズによる分離のためにビオチンとタンパク質MTアーゼ基質を標識するために使用することができる。また、二重活性化のAdoMet類似体は、DNA、RNAおよび対応するメチルトランスフェラーゼの小さな天然産物を標識するために使用することができる。
ve_content ">核酸およびタンパク質についての他のほとんどの標識方法と比較すると、MTアーゼ媒介性標識は、天然の基質を直接使用することができるという利点があり、更なる改変が必要とされない。もちろん、ケア天然基質がブロックされないように注意しなければならないまた、MTアーゼ媒介性標識、ビオチン、フルオロフォアまたは他の分子タグと同様に、メチルトランスフェラーゼのための標的を含むレポーター基の両方に関して非常に柔軟である。 インビボでの対応するMTアーゼ介してメチル化による。リベース、制限のためのデータベースエンドヌクレアーゼおよびDNAメチルトランスフェラーゼ、実験的に700以上が一覧表示されますが、2〜8個の塩基対37からの範囲の異なる認識配列の何百ものDNAメチルトランスフェラーゼを特徴とし、それはすべてのタイプの200以上の異なるMTアーゼはヒト細胞38で生成されることが期待される。重要な決定をMTアーゼ活性のためのAdoMet類似体は、酵素活性部位に適合するかどうかである。提示補因子6が、バズとSeAdoYn何らかのメチルトランスフェラーゼが容易にそれらを受け入れないことがあり、小さな反応性基を有するように設計されている。立体的により厳しい二重活性化のAdoMet類縁体、28 - 35 DNA、RNA 23およびタンパク質MTアーゼ25について示されているように、これらの例では、活性部位は、タンパク質工学によって拡大することができる。のAdoMet類縁体を用いたDNAとRNAの配列特異的標識、遺伝子型判定（DNAマッピング）36とメチル化検出39、DNA / RNAおよびDNA / RNA修飾酵素15と同様に（ナノ）バイオテクノロジー13用の機能研究のための主要な関心事である14および遺伝子送達19。配列特異的共有結合性DNA標識のための他の方法は、ターゲットデバイスとして、またはニックトランスレーションラベリングに続く配列特異的ニックエンドヌクレアーゼ（NEases）上で合成三重らせんを形成するオリゴデオキシ、ペプチド核酸またはヘアピンポリアミドに依存している。
具体的な二重活性化したのAdoMet類縁体とのタンパク質の標識は主にプロテオミクス研究への応用に向けられている、 例えば 、複雑な生物学的混合物27,28が、他のアプリケーションでのタンパク質MTアーゼのための新たな基質の同定は、機能的研究のように、また実現可能でなければなりません。 MTアーゼ媒介性標識は、主に、インビトロで 、精製メチルトランスフェラーゼを用いて行ってきたが、最近40報告されているように、標識はまた、生細胞中で達成することができる。もちろん、特定のタンパク質標識のために他の多くの方法が3,4用意されています。操作された細胞を使用した非天然アミノ酸の組み込みに加えて、それらは、典型的には、自己の標識タグで目的のタンパク質の遺伝子融合を必要とする/広報酵素媒介標識のためにoteinsまたはタグ。この点において、タンパク質メチルトランスフェラーゼのための基質としての短いペプチド配列は、 例えば、N末端 ヒストン尾部は、目的のタンパク質に融合させることができ、具体的にのAdoMet類似体および対応するタンパク質メチルトランスフェラーゼで標識された。
44 -最後に、小分子MTアーゼの生体触媒のレパートリーは、合成のAdoMet類縁体41と拡張することができます。これは、新規の生物学的活性のスクリーニングに興味深いアプリケーションを見つける必要が天然物、 例えば 、抗生物質またはポリケチド、に構造的多様性を導入するための新しいアプローチを表します。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6BAz | Synthesized according to Weinhold et al., Patent number US 8,129,106, published March 6, 2012. | ||
| β-Mercaptoethanol | Serva | 28625 | |
| Acetic acid | Fisher Scientific | 10304980 | |
| Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1 | Serva | 10688 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500100 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Serva | 13375 | |
| Bis-Tris | Gerbu | 1304 | |
| Boric acid | Gerbu | 1115 | |
| Bromophenol blue Na salt | Serva | 15375 | |
| Copper(II) sulfate | Aldrich | C1297 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | 10020090 | |
| Coomassie Brilliant Blue | Serva | 17525 | |
| EDTA disodium salt | Gerbu | 1034 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| GelRed (10,000x in water) | Biotium | 41003 | |
| Glycerol (99.5%) | Gerbu | 2006 | |
| FastRuler Low Range DNA Ladder | Thermo Scientific | SM1103 | |
| Histone H3 | Expression plasmid obtained from Dr. Philipp Voigt and Prof. Danny Reinberg; expression and isolation according to T. J. Richmond et al., J. Mol. Biol. 1997, 272, 301-311. | ||
| M.BseCI | Expression plasmid obtained from Dr. Michael Kokkinidis; expression and isolation according to Kapetaniou et al., Acta Cryst. 2006, F63, 12-14. | ||
| Methanol | Fisher Scientific | 10675112 | |
| Magnesiumchloride hexahydrate | J.T. Baker | 4003 | |
| MOPS | Gerbu | 1081 | |
| Sodium chloride | Gerbu | 1112 | |
| pH strip (Neutralit) | Merck | 1,095,330,001 | |
| pBR322 | Thermo Scientific | SD0041 | |
| R.TaqI (10 u/µl) | Thermo Scientific | ER0671 | |
| SeAdoYn | Synthesized according to Willnow et al., ChemBioChem 2012, 13, 1167-1173. | ||
| Set7/9 | Expression plasmid obtained from Prof. Danny Reinberg, expression and isolation according to D. Reinberg et al., Genes Dev.2002, 16, 479-489. | ||
| Streptavidin | Gerbu | 3058 | |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Sigma Life Science | A7631 | |
| SDS Granular | Gerbu | 1833 | |
| di-Sodium hydrogenphosphate | Merck | 106,586 | |
| TAMRA azide | Synthesized according to reference 30: Willnow et al., ChemBioChem 2012, 13, 1167-1173. | ||
| TaqI buffer (10x) | Thermo Scientific | B28 | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Acros Organics | 42058 | |
| Tris-HCl | Gerbu | 1028 | |
| Tris-X (TRIS-base) | Gerbu | 1018 | |
| Tris(3-hydroxypropyltriazolyl-methyl)amine (THPTA) | Sigma-Aldrich | 762342 |
References
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