Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

قياس مقاومة الاكسدة من Published: May 9, 2015 doi: 10.3791/52746
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Goodman Cancer Research Center, McGill University, 2Department of Biochemistry, McGill University

Abstract

الاكسدة، الذي هو نتيجة لاختلال التوازن بين الإنتاج وإزالة السموم من أنواع الاكسجين التفاعلية، هو المساهم الرئيسي في اضطرابات البشرية المزمنة، بما في ذلك القلب والأوعية الدموية والأمراض العصبية، ومرض السكري، والشيخوخة، والسرطان. وبالتالي، فمن المهم دراسة الاكسدة ليس فقط في الأنظمة الخلية ولكن أيضا باستخدام الكائنات كلها. C. ايليجانس هو كائن نموذجا جذابا لدراسة علم الوراثة من المؤكسدة مسارات نقل الإشارة الإجهاد، والتي يتم حفظها للغاية من الناحية التطورية.

هنا، ونحن نقدم بروتوكول لقياس مقاومة الاكسدة في C. ايليجانس في السائل. تذاب لفترة وجيزة، ROS الذي يحفز الكواشف مثل الباراكوات (PQ) وH 2 O 2 في المخزن M9، وaliquoted الحلول في الآبار لوحة microtiter 96 أيضا. L4 متزامنة / الشباب البالغين C. يتم نقل الحيوانات ايليجانس إلى الآبار (5-8 الحيوانات / جيد) ويتم قياس البقاء على قيد الحياةكل ساعة حتى معظم الديدان قد لقوا حتفهم. عند إجراء مقاومة الاكسدة فحص باستخدام تركيز منخفض من الضغوطات في لوحات، والشيخوخة قد تؤثر على سلوك الحيوانات على الاكسدة، والتي يمكن أن تؤدي إلى تفسير غير صحيح من البيانات. ومع ذلك، في مقايسة الموصوفة هنا، هذه المشكلة غير المحتمل أن يحدث منذ تستخدم فقط L4 / حيوانات الشباب البالغين. وعلاوة على ذلك، وهذا البروتوكول هو غير مكلف ويتم الحصول على نتائج في يوم واحد، مما يجعل هذه التقنية جذابة للشاشات الوراثية. عموما، هذا سوف يساعد على فهم الأكسدة مسارات إشارة التوتر تنبيغ، التي يمكن ترجمتها إلى توصيف أفضل للأكسدة اضطرابات البشرية المرتبطة الإجهاد.

Introduction

في حقيقيات النوى، الفسفرة المؤكسدة التي تجري في سلسلة نقل الإلكترون من الميتوكوندريا هي المحرك الرئيسي لإنتاج الطاقة في شكل ATP. أنواع الاكسجين التفاعلية (ROS) هي نتاج طبيعي لهذه العملية. على الرغم من الدور الهام الذي يقومون به كما يشير الجزيئات، يمكن أن الإفراط ROS تؤدي إلى تلف الحمض النووي والبروتينات كربنلة، وأكسدة الدهون. اختلال التوازن بين الإنتاج ROS وإزالة السموم يسبب الإجهاد التأكسدي، الأمر الذي يؤدي إلى استنزاف الطاقة، وتلف الخلايا، ويؤدي موت الخلايا 1،2. يساهم الإجهاد التأكسدي الشيخوخة وتطوير العديد من الأمراض التي تهدد الحياة بما في ذلك السرطان والسكري والقلب والأوعية الدموية والأمراض العصبية 3-9.

وقد تطورت الخلايا استراتيجيات الدفاع الأنزيمية وغير الأنزيمية للحفاظ على مستويات ROS المناسبة وحماية ناخبيهم من التلف التأكسدي 1،2. الفائق (الاحمق) الانزيمات تعمل أول من conveRT الفائق إلى H 2 O 2، والتي يتم تحويلها لاحقا إلى المياه عن طريق الكاتلاز أو الانزيمات البيروكسيديز. وتشمل استراتيجيات الدفاع غير الأنزيمية معظمهم من الجزيئات التي تتفاعل بشكل أسرع مع ROS بالمقارنة مع الجزيئات الخلوية، وحماية المكونات الخلوية الأساسية. على الرغم من الدور الوقائي للROS إزالة السموم والإنزيمات، وبعض الجزيئات ROS هربا من آليات الدفاع المضادة للأكسدة، وتؤدي إلى الضرر التأكسدي. كشف وإصلاح، وتدهور المكونات الخلوية التالفة واستراتيجيات الدفاع الأساسية خلال الاكسدة 1،2.

مسارات إشارات تشارك في مقاومة التوتر والإجهاد التأكسدي على وجه التحديد هي موضع الحفظ تطويريا 10،11. على عكس تجارب زراعة الخلية حيث ترد إلا بصورة جزئية الظروف عضوي، ودراسة الاكسدة في الكائنات النموذج 12،13 لها أهمية كبيرة. C. ايليجانس هو الخيطية حرة المعيشة التي يمكن أن تكون بسهولة وبتكلفة زهيدة طريق مسدودبناءه من جديد على العشب البكتيرية على وسائل الإعلام أجار. انها صغيرة في الحجم (حوالي 1 ملم في الطول) وعادة ينمو باعتباره خنثى-التسميد الذاتي، مما يسهل التلاعب الجيني. أنه يحتوي على دورة الحياة السريعة والقدرة على الإنجاب عالية، تنتج نحو 300 ذرية في جيل، مما يجعلها أداة قوية لأداء شاشات الوراثية على نطاق واسع (14). وC. والتسلسل ايليجانس الجينوم بالكامل وتوقع 40-50٪ من الجينات لتكون المتماثلات من الأمراض المرتبطة الجينات البشرية 15-18. ضربة قاضية للجينات ذات الاهتمام باستخدام رني هي سريعة وسهلة في C. ايليجانس. الجيني أسفل اللائحة يمكن أن يتحقق عن طريق تغذية الحيوانات E. البكتيريا القولونية التي تأوي البلازميد معربا عن RNA المزدوج تقطعت بهم السبل التي تستهدف مرنا من الفائدة 19. لذلك، وتحديد وظيفة الجين باستخدام شاشات رني على نطاق واسع له تأثير كبير على فهم الأمراض التي تصيب الإنسان بما في ذلك السرطان 20،21.

دراسات سمقاومة الإجهاد xidative في C. أدت ايليجانس إلى تحديد آليات الحفظ لمقاومة الاكسدة 13،22. بعض المسارات التي تم تحديدها هي مسارات المشتركة التي تعدل طول العمر ومقاومة للضغوط أخرى أيضا مثل نقص الأكسجين والحرارة والضغط الاسموزي. وتشمل هذه المسارات إشارات الأنسولين، TOR الإشارات، والالتهام الذاتي. وتشمل مسارات رئيسية أخرى إزالة السموم من ROS مثل الانزيمات الفائق الفائق والإنزيمات الكاتلاز، أو في إصلاح الأضرار مثل الصدمة الحرارية والبروتينات كوصي 11،13،22.

يصف هذا البروتوكول كيفية تحديد مقاومة الاكسدة من C. ايليجانس في السائل. كنا flcn-1 (ok975) والبرية من نوع الحيوانات للتدليل على البروتوكول منذ أظهرنا سابقا زيادة مقاومة الاكسدة عند فقدان flcn-1 (ok975) في C. ايليجانس 23. لقد أظهرنا أيضا أن هذه المقاومة تعتمد زيادةعلى AMPK والالتهام الذاتي، محور الإشارات التي تعمل على تحسين الطاقة الحيوية الخلوية ويعزز مقاومة الإجهاد 23. PQ هو الإجهاد التأكسدي الذي يتداخل مع سلسلة نقل الإلكترون لإنتاج أنواع الاكسجين التفاعلية 24. ويمكن أن تتكيف نفس الفحص ويمكن استخدام مصادر ROS أخرى أو ROS المركبات توليد مثل H 2 O 2 و روتينون. وقد وضعت فحوصات مماثلة على لوحات التي تستخدم فيها تركيزات منخفضة من PQ 25،26. الاستفادة من هذا الاختبار هو أنه سريع جدا، ويمكن الحصول على النتائج في يوم واحد. بالإضافة إلى ذلك، إجمالي حجم السائل المستخدم لأداء المقاومة الاكسدة فحص في 96 لوحات جيدة منخفضة بالمقارنة مع حجم المستخدمة في إعداد PQ التي تحتوي على لوحات. ولذلك، فإن كمية PQ المستخدمة في فحص السائل منخفضة، مما يجعل فحص غير مكلف ويحد من إنتاج النفايات السامة. ومع ذلك، القيود المفروضة على هذا الاختبار بالمقارنة مع المقايسات لوحة تشمل لاالمسيخ الطعام في فحص السائل وأقل تركيز الأوكسجين في السائل بالمقارنة مع الهواء. هذه هي العوامل الهامة التي في بعض الحالات، قد تؤثر على النتائج. لذلك، مؤكدا استنساخ باستخدام وسائل أخرى للمقاومة الاكسدة ويوصى لدعم النتائج التي تم الحصول عليها في هذا الاختبار.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد الكواشف

  1. إعداد وسائل الاعلام للC. ايليجانس النمو (في هذه الحالة، والحيوانات البرية من نوع والحيوانات flcn-1 (ok975) متحولة).
    1. استعد تعديلها إلا Bacto-ببتون (MYOB) مزيج Youngren والجافة التي تحتوي على 5.5 غرام من تريس حمض الهيدروكلوريك، و 2.4 غرام من قاعدة تريس، 31 غرام من Bactopetone، 20 غرام من كلوريد الصوديوم و 0.08 غرام من الكولسترول. تخلط جيدا مع اهتزاز.
      ملاحظة: هذا المزيج هو كاف لإعداد 10 L من MYOB المتوسطة.
      ملاحظة: يمكن استخدام عادي متوسط ​​النمو (NGM) لوحات بدلا من لوحات MYOB 27. ومع ذلك، فإن نفس النوع من لوحات يجب أن تستخدم لمقارنات صحيحة بين السلالات وبين يكرر مستقلة. في هذا البروتوكول، ونحن تستخدم فقط لوحات MYOB.
    2. إعداد 1 L من MYOB المتوسطة وذلك بإضافة 6 غرام من MYOB المزيج الجاف، 17 غرام من أجار وجعل ما يصل الى 1 L مع H 2 O والأوتوكلاف لمدة 45 دقيقة في 122 درجة مئوية. صب لوحات واسمحوا الجافة في RT لمدة 2 أيام.
    3. باستخدام تقنية معقمة، تطعيم 100 مل من cultuإعادة من مرق LB المتوسطة مع E. البكتيريا القولونية OP50 وتنمو O / N عند 37 درجة مئوية.
    4. لوحات MYOB البذور مع E. البكتيريا القولونية OP50. السماح لها أن تنمو في RT لمدة 48 ساعة.
  2. استعدادا لdownregulation الجينات باستخدام رني
    1. إعداد MYOB لوحات رني الرضاعة. المضي قدما كما هو الحال في الخطوات 1.1.1 و1.1.2. بعد التعقيم، والسماح للمتوسطة ليبرد إلى حوالي 55 درجة مئوية، وإضافة 1 مل من 1 M الآيزوبروبيل β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) و 1 مل من 100 ملي الأمبيسلين.
    2. خط E. القولونية HT115 البكتيريا تحولت مع البلازميد، والذي يعبر إما السيطرة أو flcn EV-1 رني خاص على الأمبيسلين (50 ميكروغرام / مل) / تتراسايكلين (15 ميكروغرام / مل) أجار لوحات. تنمو ثقافة O / N عند 37 درجة مئوية.
    3. اختيار المستعمرات وتطعيم E. القولونية HT115 البكتيريا تحولت مع البلازميد الذي يعبر إما السيطرة أو flcn EV-1 رني محددة وتنمو الثقافة في LB / الأمبيسلين (50 ميكروغرام / مل) والمتوسطة O / N عند 37 & #176؛ C.
    4. لوحات البذور مع E. البكتيريا القولونية HT115 EV أو HT115 flcn-1 البكتيريا رني.
      ملاحظة: حافظ على لوحات 48 ساعة على RT قبل الاستخدام. إذا رني ضربة قاضية من قبل الرضاعة في فعالية استخدام وسائل أخرى للتسليم DS-RNA 28.
  3. حمل الاكسدة باستخدام الباراكوات (PQ):
    1. إعداد العازلة M9 عن طريق خلط 3 غرام من KH 2 PO 4 و 6 غرام من نا 2 هبو 4، 5 غرام من كلوريد الصوديوم و 0.25 غرام من MgSO 4 · 7 H 2 O. حتى تصل الى 1 L مع الماء المقطر. حل الأوتوكلاف لمدة 45 دقيقة في 122 درجة مئوية، وتخزين الزجاجات على RT.
    2. في يوم الفحص، وإعداد حل M9 / PQ التي تحتوي على. لهذا البروتوكول، استخدم 100 ملي PQ (0.1028 غرام من PQ الذائبة في 4 مل من العازلة M9 يسد كامل 96 لوحات جيدا مع 40 ميكرولتر من M9 / PQ لكل بئر).
      تنبيه: PQ هو مركب خطرة وشديدة السمية. التعامل وفقا للمبادئ التوجيهية الملائمة.
      ملاحظة: عند تشغيل أولا الجديدالقطار أو شرطا جديدا، فمن المستحسن لفحص البقاء على قيد الحياة في زيادة تركيزات PQ لتحديد أفضل تركيز لاستخدامها من أجل قتل الحيوانات في غضون 7-10 ساعة.

2. إعداد العمر متزامنة-L4 السكان

  1. نقل 20 المنحرفين الكبار حامل لوحة MYOB جديدة مع المصنف E. البكتيريا القولونية OP50. إعداد لوحات عدة استنادا إلى عدد من الديدان اللازمة أثناء الفحص.
  2. تسمح لهم لوضع البيض لمدة 6 ساعة ثم استخدام دودة سلك البلاتين الإختيار إزالة الأمهات. تحقق لوحات تحت المجهر لتقدير عدد البيض الذي تضعه.
  3. السماح للفقس البيض وتنمو عند 20 درجة مئوية لمدة 48 ساعة. في هذا الوقت، والحيوانات في أواخر L4 / الشباب مرحلة البلوغ. اختيار الحيوانات نفس المرحلة ونقل إلى الآبار التي تحتوي على حل PQ.
    ملاحظة: منذ 48 ساعة حضانة ينطبق فقط على المسوخ التي تنمو على نحو مماثل لالبرية من نوع الحيوانات، فمن المهم رصد التنمويةمعدل طفرات اختبار حديثا لضمان توافقه مع معدل التنمية النوع البري، وإلا، يجب استخدام الجداول الزمنية الأخرى.
  4. بدلا من ذلك، استخدام تقنيات التزامن. توليد السكان متزامنة من الديدان L1 اليرقات باستخدام محلول هيبوكلوريت (25 مل من الماء و 125 مل من 5.25٪ هيبوكلوريت الصوديوم، و 50 مل من 4 M هيدروكسيد الصوديوم؛ التفاف زجاجة مع رقائق الألومنيوم لعزل من الضوء). ومع ذلك، لهذا الاختبار، فمن غير المستحسن، لأن التبييض المكثف قد تؤثر على سلوك الحيوانات أثناء الفحص.
    تنبيه: التعامل مع محلول هيبوكلوريت فقا للمبادئ التوجيهية.
    ملاحظة: عند استخدام رني إلى أسفل تنظيم الجينات في المصالح، مزامنة المنحرفين كما هو موضح في الباب 2، باستثناء نقل الأمهات إلى لوحات رني المصنف مع البكتيريا محددة رني. عندما ضربة قاضية مع رني ضعيفة، فمن المستحسن التغذية لأجيال متعددة.

3. المسرحية الإجهاد التأكسدي المقاومة الفحص </ P>

  1. ماصة 40 ميكرولتر من 100 ملي PQ الحل (إعداد الطازجة) إلى كل بئر من 96 لوحة جيدا. استخدام لا يقل عن 12 بئرا كما يعيد كل حالة (العلاج، متحولة، وما إلى ذلك). باستخدام دودة اختيار سلك البلاتين، ونقل 5-8 الحيوانات L4 اليرقات على كل جانب مما يدل على وقت البدء ووقت الانتهاء.
  2. عند بدء شرط آخر، لاحظ وقت البدء ووقت الانتهاء. وضع لوحة في 20 درجة مئوية في فترة حضانة بين نقل الديدان وسجل الحيوانات النافقة بعد ساعة من وقت البدء.
  3. باستخدام مجهر تشريح، عد بقاء كل ساعة. يهز بلطف لوحة قبل البدء في العد. تشير الديدان التي لا تتحرك، حتى بعد اكتشاف ضوء عالي الكثافة، والحيوانات النافقة. يشير أيضا إلى عدد من الحيوانات على قيد الحياة.
    ملاحظة: عند النظر إلى شكل دودة، والذيول وحركة الرأس في تضخم عالية، تساعد في تحديد الديدان الميتة من على قيد الحياة.
  4. كرر هذه الخطوة كل ساعة حتى معظم الديدان قد لقوا حتفهم.
<ص الطبقة = "jove_title"> 4. تقرير من البقاء على قيد الحياة نسبة في كل مرة نقطة

  1. حساب العدد الكلي للحيوانات في حالة بإضافة العدد الكلي للحيوانات نقلها إلى كل جانب. تجاهل الحيوانات التي تضررت أو قتل على النقل.
  2. لكل نقطة زمنية، وحساب العدد الكلي للحيوانات الميتة في حالة (مجموع الحيوانات النافقة في 12 بئرا). لكل نقطة زمنية، وحساب النسبة المئوية للموت (عدد الحيوانات النافقة مقسوما على العدد الكلي للحيوانات ومضروبا 100) ونسبة البقاء على قيد الحياة (100 ناقص الموت في المئة).
  3. كرر هذا الاختبار 3 مرات على الأقل مستقلة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

مقارنة البرية من نوع C. ايليجانس إلى flcn-1 (ok975) الحيوانات متحولة

نحن هنا تستخدم 100 ملي PQ لتحديد المقاومة البرية من نوع C. ايليجانس الحيوانات مقارنة flcn-1 (ok975) وهو ما ثبت لمقاومة الاكسدة، والحرارة، ونقص الأكسجين 23. بعد 4 ساعات من العلاج، 48.3٪ من النوع البري على قيد الحياة بالمقارنة مع٪ 77.8 البقاء على قيد الحياة في 1 flcn (ok975) الحيوانات. كما هو متوقع، flcn-1 (ok975) كانت الحيوانات متحولة أكثر مقاومة إلى 100 ​​ملي PQ مقارنة البرية من نوع (الشكل 2 والجدول 1).

مقارنة البرية من نوع الحيوانات التي تتغذى على السيطرة EV أو البكتيريا رني 1-flcn

وعلى غرار النتيجة المعروضة في القسم السابق، بانخفاض تنظيم flcn-1 باستخدام رني زيادة المقاومة إلى 100 ​​ملي PQ. هذه النتيجة توضح أن التنظيم أسفل وظيفة الجينات باستخدام يقلد رني الخسارة من وظيفة م utation (الشكل 2 والجدول 1).

الشكل 1
الشكل 1. الشكل التخطيطي لطريقة الأكسدة تقرير مقاومة الإجهاد في 96 لوحات جيدة في C. ايليجانس.

يتم نقل متزامنة L4 / الشباب الحيوانات الكبار نمت على لوحات MYOB وتتغذى على البكتيريا القولونية E. OP50 إلى الآبار لوحة microtiter 96 جيدا تحتوي على 100 ​​ملي PQ ويقاس بقاء كل ساعة حتى عدد كبير من الديدان قد لقوا حتفهم. في حالة knockdowns رني، ويتبع نفس الإجراء إلا أن الحيوانات متزامنة تزرع على لوحات تستكمل مع IPTG، ويتم تغذية مع E. البكتيريا القولونية HT115 إيواء البلازميد التي من شأنها أن ضربة قاضية الجينات المستهدفة على التعبير.

الملفات / ftp_upload / 52746 / 52746fig2.jpg "/>
الشكل 2. فقدان المقاومة FLCN-1 الزيادات الاكسدة في C. ايليجانس. (A - B) نسبة البقاء على قيد الحياة إلى 100 ​​ملي PQ من (A) WT وflcn-1 (ok975) الحيوانات متحولة و (B) وزن الحيوانات تعامل مع سيطرة أو flcn-1 رني.

البقاء على قيد الحياة في المئة الى 100 ​​ملي PQ
1 ساعة سلالة، رني البقاء على قيد الحياة في المئة (± SD) P القيمة عدد من التجارب إجمالي عدد الديدان
بالوزن 82.38 ± 1.31 0.0002 3 210
flcn-1 (ok975) 99.03 ± 1.67 3 224
بالوزن؛ مراقبة 91.70 ± 0.55 0.0462 3 202
بالوزن؛ flcn-1 (رني) 95.93 ± 2.48 3 207
2 ساعة سلالة، رني البقاء على قيد الحياة في المئة (± SD) P القيمة عدد من التجارب إجمالي عدد الديدان
بالوزن 72.13 ± 7.13 0.005 3 210
flcn-1 (ok975) 96.33 ± 2.28 3 224
بالوزن؛ مراقبة 80.27 ± 5.34 0.0261 3 202
بالوزن؛ flcn-1 (رني) 91.23 ± 1.42 3 207
3 ساعة سلالة، رني البقاء على قيد الحياة في المئة (± SD) P القيمة عدد من التجارب إجمالي عدد الديدان
بالوزن 55.37 ± 4.72 0.0004 3 210
flcn-1 (ok975) 87.00 ± 1.36 3 224
بالوزن؛ مراقبة 70.77 ± 3.50 0.0027 3 202
بالوزن؛ flcn-1 (رني) 87.63 ± 2.67 3 207
4 ساعة سلالة، رني البقاء على قيد الحياة في المئة (± SD) P القيمة عدد من التجارب إجمالي عدد الديدان
بالوزن 48.30 ± 6.39 0.002 3 210
flcn-1 (ok975) 77.80 ± 3.12 3 224
بالوزن؛ مراقبة 63.77 ± 0.66 0.0122 3 202
بالوزن؛ flcn-1 (رني) 80.57 ± 6.68 3 207
5 ساعة سلالة، رني البقاء على قيد الحياة في المئة (± SD) P القيمة عدد من التجارب إجمالي عدد الديدان
بالوزن 41.60 ± 8.33 0.0062 3
flcn-1 (ok975) 67.43 ± 1.42 3 224
بالوزن؛ مراقبة 60.53 ± 2.58 0.0313 3 202
بالوزن؛ flcn-1 (رني) 71.53 ± 5.24 3 207
6 ساعة سلالة، رني البقاء على قيد الحياة في المئة (± SD) P القيمة عدد من التجارب إجمالي عدد الديدان
بالوزن 34.86 ± 5.88 0.0021 3 210
flcn-1 (ok975) 60.34 ± 2.05 3 224
بالوزن؛ مراقبة 44.43 ± 3.93 0.0042 3 202
بالوزن؛ flcn-1 (رني) 62.13 ± 3.44 3 207

الجدول 1. ملخص النتائج والتحليل الإحصائي للمقاومة الاكسدة من الشكل 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

C. ايليجانس هو كائن نموذجا جذابا لدراسة مقاومة الاكسدة في الجسم الحي وراثيا لأنه يمكن أن يكون مثقف بسهولة، ويؤدي إلى عدد كبير من نسل متطابقة وراثيا بسرعة. أساليب متعددة لقياس مقاومة الاكسدة وقد وصفت في وقت سابق، وأنها تستند إلى مكملات لوحات الثقافة مع مختلف مصادر ROS مثل PQ، روتينون، H 2 O 2، وجغلون 25،26،29-32. نحن هنا وصف البروتوكول الذي يقيس الأكسدة المقاومة الضغط في السائل في 96 لوحات جيدة باستخدام 100 ملي PQ. وقد أجريت فحص مماثل من قبل جرير وآخرون. 33. هذا الاختبار يمكن زيادة تكييفها لدراسة الاكسدة في السائل باستخدام مصادر ROS الأخرى. على سبيل المثال، لقد أظهرنا أن فقدان flcn-1 زيادة المقاومة للعديد من H 2 O 2 تركيزات وكذلك 23.

هذا الاختبار يمكن أن تكون الفنيلاي تحدي لبعض السلالات التي تعرض عيوب الحركة أو السباحة التي يسببها الظواهر الشلل مثل سلالات يحمل طفرة في نقل الدوبامين دات-1 34. في هذه الحالة، وعدم القدرة على تحريك مربكة لأنه لا يعني بالضرورة انخفاض المقاومة الاكسدة بل عيب الحركة. وعلاوة على ذلك، عد الحيوانات النافقة ينبغي أن يستكمل بعناية ولها الباحثون أن تولي اهتماما لC. ايليجانس تفاصيل السلوكية مثل حركات الذيل، وحركات الرأس، أو حركات الجسم حتى بطيئة. إذا كان تركيز PQ مرتفع جدا، وحركية الموت من الحيوانات سريعة جدا، يمكن للمرء أن ينظر في خفض تركيز PQ من أجل الحصول على معدلات الوفاة أبطأ. بعض الحيوانات حساسة للغاية للالاكسدة مثل AAK-2 الحيوانات متحولة 26،33،35،36 حين أن البعض الآخر شديدة المقاومة مثل داف 2 الحيوانات متحولة 37. في هذه الحالة، البقاء على قيد الحياة مع زملاء مختلف يعايروينبغي النظر ncentrations من PQ.

للتجارب رني، يمكن أن تكون نتائج سلبية يرجع إلى عدم فعالية العلاج رني. في هذه الحالة، وقياس مستويات مرنا ضروري لتحديد ما إذا كانت الجينات ضربة قاضية ناجحا.

هذا البروتوكول يمكن تكييفها كذلك لارتفاع الفرز الإنتاجية للمقاومة الاكسدة باستخدام كاشف أن يقيس السلوك السباحة C. ايليجانس في السائل 38،39. وهذا من شأنه تمكين يحتمل رصد التحمل من C. ايليجانس وسلوك السباحة مثل تواتر الجسم الانحناء تحت الاكسدة. ارتفاع معدلات حركة الجسم يمكن أن تشير إلى ارتفاع اللياقة البدنية دودة تحت الضغط.

يتم حفظها الممرات التي تؤدي إلى الأكسدة المقاومة التوتر في حقيقيات النوى أقل غاية في جميع أنحاء التطور وترتبط بالأمراض المرتبطة الاكسدة والشيخوخة لدى البشر. Mitohormesis وgeneratio متوازنن من ROS ضرورية لإطالة عمر وتحسين القدرة على الصحة. ومع ذلك، والإفراط ROS غير ضارة جدا للخلايا والأنسجة / أجهزة والكائنات الحية. إيجاد مسارات، أنه إذا غيرت، وتوفير التوازن الأمثل ROS بالتالي من الضروري وشاشات للأدوية التي تعدل المقاومة للإجهاد التأكسدي يمكن أن يساعد في تطوير علاجات لأمراض متعددة مع قاسم مشترك: الاكسدة. تنفيذ هذه العروض في C. ايليجانس هو وسيلة سريعة وغير مكلفة، ويمكن الاعتماد عليها من المفيد أن لديها امكانات كبيرة وقيمة لفهم وعلاج الأمراض التي تصيب الإنسان مرتبطة الاكسدة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

نعترف مركز علم الوراثة انواع معينة لC. سلالات ايليجانس. وقدمت الدعم المالي من قبل معهد بحوث فوكس تيري. علينا أيضا أن نعترف الدعم الممنوح للEP من Rolande ومارسيل غوسلين العليا Studentship ومنحة التدريب CIHR / FRSQ في FRN53888 أبحاث السرطان من برنامج التدريب أبحاث السرطان ماكجيل المتكاملة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar bacteriological grade Multicell 800-010-LG
Bacteriological peptone Oxoid LP0037
Sodium chloride biotechnology grade Bioshop 7647-14-5
Cholesterol Sigma C8503-25G
UltraPure tris hydrochloride Invitrogen 15506-017
Tris aminomethane Bio Basic Canada Inc 77-86-1
IPTG Santa Cruz Biotechnology sc-202185A
Ampicillin Bioshop 69-52-3
Yeast extract Bio Basic Inc. 8013-01-2
Methyl viologen dichloride hydrate Aldrich chemistry 856177-1G
Petri dish 60 x15 mm Fisher FB0875713A
Pipet 10 ml Fisher 1367520
Potassium phosphate monobasic G-Biosciences RC-084
Magnesium sulfate heptahydrate Sigma M-5921
Sodium phosphate dibasic Bioshop 7558-79-4
Discovery v8 stereo zeiss microscope
96 well clear microtiter plate
flcn-1 RNAi source Ahringer Library

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schieber, M., Chandel, N. S. ROS function in redox signaling and oxidative stress. Curr Biol. 24, R453-R462 (2014).
  2. Alfadda, A. A., Sallam, R. M. Reactive oxygen species in health and disease. J Biomed Biotechnol. 2012, 936486 (2012).
  3. Finkel, T., Holbrook, N. J. Oxidants, oxidative stress and the biology of ageing. Nature. 408, 239-247 (2000).
  4. Di Carlo, M., Giacomazza, D., Picone, P., Nuzzo, D., San Biagio, P. L. Are oxidative stress and mitochondrial dysfunction the key players in the neurodegenerative diseases. Free Radic Res. 46, 1327-1338 (2012).
  5. Gandhi, S., Abramov, A. Y. Mechanism of oxidative stress in neurodegeneration. Oxid Med Cell Longev. 2012, 428010 (2012).
  6. Trushina, E., McMurray, C. T. Oxidative stress and mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases. Neuroscience. 145, 1233-1248 (2007).
  7. Touyz, R. M., Briones, A. M. Reactive oxygen species and vascular biology: implications in human hypertension. Hypertens Res. 34, 5-14 (2011).
  8. Gorrini, C., Harris, I. S., Mak, T. W. Modulation of oxidative stress as an anticancer strategy. Nat Rev Drug Discov. 12, 931-947 (2013).
  9. Sosa, V., et al. Oxidative stress and cancer: an overview. Ageing research reviews. 12, 376-390 (2013).
  10. Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. Reactive Oxygen Species and Aging in Caenorhabditis elegans: Causal or Casual Relationship. Antioxid Redox Signal. 13, 1911-1953 (2010).
  11. Baumeister, R., Schaffitzel, E., Hertweck, M. Endocrine signaling in Caenorhabditis elegans controls stress response and longevity. J Endocrinol. 190, 191-202 (2006).
  12. Markaki, M., Tavernarakis, N. Modeling human diseases in Caenorhabditis elegans. Biotechnol J. 5, 1261-1276 (2010).
  13. Rodriguez, M., Snoek, L. B., De Bono, M., Kammenga, J. E. Worms under stress: C. elegans stress response and its relevance to complex human disease and aging. Trends Genet. 29, 367-374 (2013).
  14. Hope, I. A. Practical approach series. , Oxford University Press. 282 (1999).
  15. C. elegans Sequencing Consortium. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science. 282, 2012-2018 (1998).
  16. Ahringer, J. Turn to the worm! Current opinion in genetics & development. 7, 410-415 (1997).
  17. Wheelan, S. J., Boguski, M. S., Duret, L., Makalowski, W. Human and nematode orthologs--lessons from the analysis of 1800 human genes and the proteome of Caenorhabditis elegans. Gene. 238, 163-170 (1999).
  18. Culetto, E., Sattelle, D. B. A role for Caenorhabditis elegans in understanding the function and interactions of human disease genes. Hum Mol Genet. 9, 869-877 (2000).
  19. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
  20. Lamitina, T. Functional genomic approaches in C. elegans. Methods Mol Biol. 351, 127-138 (2006).
  21. Poulin, G., Nandakumar, R., Ahringer, J. Genome-wide RNAi screens in Caenorhabditis elegans: impact on cancer research. Oncogene. 23, 8340-8345 (2004).
  22. Moreno-Arriola, E., et al. Caenorhabditis elegans: A Useful Model for Studying Metabolic Disorders in Which Oxidative Stress Is a Contributing Factor. Oxid Med Cell Longev. , 705253 (2014).
  23. Possik, E., et al. Folliculin regulates ampk-dependent autophagy and metabolic stress survival. PLoS Genet. 10, e1004273 (2014).
  24. Fukushima, T., Tanaka, K., Lim, H., Moriyama, M. Mechanism of cytotoxicity of paraquat. Environ Health Prev Med. 7, 89-94 (2002).
  25. Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. Superoxide dismutase is dispensable for normal animal lifespan. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 5785-5790 (2012).
  26. Schulz, T. J., et al. Glucose restriction extends Caenorhabditis elegans life span by inducing mitochondrial respiration and increasing oxidative stress. Cell Metab. 6, 280-293 (2007).
  27. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
  28. Timmons, L. Delivery methods for RNA interference in. C. elegans. Methods Mol Biol. 351, 119-125 (2006).
  29. Wang, B. Y., et al. Caenorhabditis elegans Eyes Absent Ortholog EYA-1 Is Required for Stress Resistance. Biochemistry (Mosc). 79, 653-662 (2014).
  30. Paz-Gomez, D., Villanueva-Chimal, E., Navarro, R. E. The DEAD Box RNA helicase VBH-1 is a new player in the stress response in C. elegans. PLoS One. 9, 97924 (2014).
  31. Ward, J. D., et al. Defects in the C. elegans acyl-CoA synthase, acs-3, and nuclear hormone receptor, nhr-25, cause sensitivity to distinct, but overlapping stresses. PLoS One. 9, 92552 (2014).
  32. Staab, T. A., Evgrafov, O., Knowles, J. A., Sieburth, D. Regulation of synaptic nlg-1/neuroligin abundance by the skn-1/Nrf stress response pathway protects against oxidative stress. PLoS Genet. 10, e1004100 (2014).
  33. Greer, E. L., et al. An AMPK-FOXO pathway mediates longevity induced by a novel method of dietary restriction in. C. elegans. Curr Biol. 17, 1646-1656 (2007).
  34. Allen, E., Walters, I. B., Hanahan, D. Brivanib, a dual FGF/VEGF inhibitor, is active both first and second line against mouse pancreatic neuroendocrine tumors developing adaptive/evasive resistance to VEGF inhibition. Clin Cancer Res. 17, 5299-5310 (2011).
  35. Apfeld, J., O'Connor, G., McDonagh, T., DiStefano, P. S., Curtis, R. The AMP-activated protein kinase AAK-2 links energy levels and insulin-like signals to lifespan in C. elegans. Genes Dev. 18, 3004-3009 (2004).
  36. Lee, H., et al. The Caenorhabditis elegans AMP-activated protein kinase AAK-2 is phosphorylated by LKB1 and is required for resistance to oxidative stress and for normal motility and foraging behavior. J Biol Chem. 283, 14988-14993 (2008).
  37. Honda, Y., Honda, S. The daf-2 gene network for longevity regulates oxidative stress resistance and Mn-superoxide dismutase gene expression in Caenorhabditis elegans. FASEB J. 13, 1385-1393 (1999).
  38. Restif, C., Metaxas, D. Tracking the swimming motions of C. elegans worms with applications in aging studies. Med Image Comput Comput Assist Interv. 11, 35-42 (2008).
  39. Buckingham, S. D., Sattelle, D. B. Fast, automated measurement of nematode swimming (thrashing) without morphometry. BMC Neurosci. 10, 84 (2009).

Tags

علم الأحياء الخلوي، العدد 99، الاكسدة، الباراكوات،
قياس مقاومة الاكسدة من<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em&gt; في 96-جيدا لوحات عيار مكروي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Possik, E., Pause, A. Measuring… More

Possik, E., Pause, A. Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates. J. Vis. Exp. (99), e52746, doi:10.3791/52746 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter