Abstract
O stress oxidativo, que é o resultado de um desequilíbrio entre a produção e a desintoxicação de espécies reactivas de oxigénio, é um dos principais contribuintes para doenças humanas crónicas, incluindo doenças cardiovasculares e neurodegenerativas, diabetes, envelhecimento e cancro. Portanto, é importante para estudar o stress oxidativo, não só em sistemas de células, mas também utilizando organismos inteiros. C. elegans é um organismo modelo atraente para estudar a genética de vias de transdução de sinal de estresse oxidativo, que são altamente conservadas evolutivamente.
Aqui, nós fornecemos um protocolo para medir a resistência ao estresse oxidativo em C. elegans em líquido. Reagentes Resumidamente, ROS-indutores, tais como paraquato (PQ) e H 2 O 2 são dissolvidos em tampão M9, e soluções são aliquotadas em cavidades de uma placa de microtitulação de 96 poços. L4 sincronizado / adulto jovem C. elegans animais são transferidos para os poços (5-8 animais / poço) e é medida a sobrevivênciaa cada hora até que a maioria dos worms estão mortos. Ao realizar um ensaio de resistência ao estresse oxidativo utilizando uma baixa concentração de estressores em placas, o envelhecimento pode influenciar o comportamento dos animais sobre o estresse oxidativo, o que poderia levar a uma interpretação incorrecta dos dados. No entanto, no ensaio aqui descrito, este problema é improvável de ocorrer uma vez que apenas L4 / animais adultos, jovens estão sendo usados. Além disso, este protocolo é barato e resultados são obtidos em um dia, o que torna esta técnica atraente para telas genéticos. No geral, isso irá ajudar a compreender vias de transdução de sinal de estresse oxidativo, que poderia ser traduzido em melhor caracterização de doenças humanas associadas a estresse oxidativo.
Introduction
Em eucariotas, fosforilação oxidativa ocorrendo na cadeia de transporte de elétrons da mitocôndria é o principal motor da produção de energia na forma de ATP. Espécies reativas de oxigênio (ROS) são um subproduto natural do processo. Apesar do seu importante papel como moléculas de sinalização, excessiva de ROS pode levar a danos no ADN, carbonilação de proteínas, e a oxidação de lípidos. Um desequilíbrio entre a produção de ROS e desintoxicação faz com que o stress oxidativo, o que conduz à depleção da energia, lesão celular, e provoca a morte celular 1,2. O estresse oxidativo contribui para o envelhecimento e para o desenvolvimento de muitas doenças potencialmente fatais, incluindo câncer, diabetes, doenças cardiovasculares e neurodegenerativas 3-9.
As células desenvolveram estratégias de defesa enzimáticos e não enzimáticos para manter os níveis de ROS adequadas e proteger os seus constituintes contra dano oxidativo 1,2. Superóxido dismutase (SOD) enzimas agem primeiro a convert superóxido a H 2 O 2, que é posteriormente convertida em água pela catalase ou enzimas peroxidase. Estratégias de defesa não enzimáticas incluem principalmente moléculas que reagem mais rapidamente com ROS, em comparação com macromoléculas celulares, protegendo os componentes celulares essenciais. Apesar do papel protetor da ROS desintoxicação enzimas, algumas moléculas ROS escapar dos mecanismos de defesa antioxidante e levar a danos oxidativos. Detecção, reparação e degradação dos componentes celulares danificados são estratégias essenciais da defesa durante o estresse oxidativo 1,2.
Vias de sinalização envolvidas na resistência ao estresse e estresse oxidativo especificamente são altamente evolutivamente conservada 10,11. Ao contrário de experimentos de cultura de células, onde as condições organismal são apenas parcialmente reproduzido, o estudo do estresse oxidativo em organismos modelo 12,13 tem um grande significado. C. elegans é um nematóide de vida livre que pode ser fácil e barata cultured em um gramado bacteriana no meio de ágar. É pequeno no tamanho (cerca de 1 mm de comprimento) e, normalmente, cresce como um hermafrodita auto-fertilizar, o que facilita as manipulações genéticas. Tem um ciclo de vida rápido e uma alta capacidade reprodutiva, produzindo cerca de 300 descendentes por geração, tornando-se uma ferramenta poderosa para executar telas genéticos de larga escala 14. A C. elegans genoma está completamente sequenciado e 40-50% dos genes é previsível que sejam homólogos de genes associados a doenças humanas 15-18. O knockdown de genes de interesse utilizando RNAi é rápida e fácil em C. elegans. Gene para baixo regulamento poderia ser alcançado através da alimentação de animais a E. bactérias coli que abrigam um plasmídeo que expressa o ARN de cadeia dupla que tem como alvo o mRNA de interesse 19. Portanto, a determinação da função do gene usando telas de RNAi em grande escala tem um grande impacto na compreensão das doenças humanas, incluindo câncer 20,21.
Estudos de Oresistência ao estresse xidative em C. elegans levaram à identificação de mecanismos conservadas de resistência ao stress oxidativo 13,22. Algumas vias são identificadas vias comuns que modulam a longevidade e resistência a outros tipos de stress, bem como a hipóxia, calor, e stress osmótico. Estas vias incluem a sinalização de insulina, a sinalização TOR, e autofagia. Outras vias importantes envolvem desintoxicação de ROS como enzimas superóxido dismutase e enzimas catalase, ou na reparação de danos, tais como proteínas de choque térmico e acompanhar 11,13,22.
Este protocolo descreve como para determinar a resistência ao stress oxidativo de C. elegans em líquido. Nós usamos flcn-1 (ok975) e animais de tipo selvagem para demonstrar o protocolo já que mostramos anteriormente um aumento da resistência ao estresse oxidativo após a perda de flcn-1 (ok975) em C. elegans 23. Também mostraram que este aumento da resistência dependeem AMPK e autofagia, um eixo de sinalização que melhora bioenergética celular e promove a resistência ao estresse 23. PQ é um estressor oxidativo que interfere com a cadeia de transporte de elétrons para produzir espécies reativas de oxigênio 24. O mesmo ensaio pode ser adaptado e outras fontes de ROS ou compostos que geram ROS poderia ser utilizado tal como H 2 O 2 e rotenona. Ensaios semelhantes foram desenvolvidas em placas onde as baixas concentrações de PQ são utilizados 25,26. A vantagem deste teste é que ele é muito rápido, e os resultados podem ser obtidos em apenas um dia. Além disso, o volume total de líquido utilizado para realizar o ensaio de resistência ao estresse oxidativo em placas de 96 poços é baixo quando comparado com o volume utilizado para preparar-PQ contendo placas. Portanto, a quantidade de PQ usado é no ensaio de líquido é baixa, o que torna o ensaio pouco dispendioso e limita a produção de resíduos tóxicos. No entanto, limitações deste ensaio em comparação com ensaios em placa incluem o lack de alimento no líquido de ensaio e a menor concentração de oxigénio no líquido, em comparação com o ar. Estes são factores importantes que, em alguns casos, podem influenciar os resultados. Portanto, confirmando a reprodutibilidade utilizando outros métodos de resistência ao estresse oxidativo é recomendado para suportar os resultados obtidos neste ensaio.
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Protocol
1. Preparação dos Reagentes
- Preparação da mídia para C. crescimento elegans (neste caso, os animais selvagens e animais flcn-1 (ok975) mutantes).
- Prepare modificado apenas de Bacto-peptona (BOYM) mistura seca do Youngren contendo 5,5 g de Tris-HCl, 2,4 g de base Tris, 31 g de Bactopetone, 20 g de NaCl e 0,08 g de colesterol. Misture bem com agitação.
NOTA: Esta mistura é suficiente para preparar 10 L de meio de MYOB.
NOTA: placas normais meio de crescimento (NGM) poderia ser usado em vez de MYOB placas 27. No entanto, o mesmo tipo de placas deve ser utilizada para comparações válidas entre estirpes e entre as repetições independentes. Neste protocolo, nós só usamos placas MYOB. - Prepare 1 L de meio BOYM por adição de 6 g de BOYM mistura seca, 17 g de ágar e perfazer o volume de 1 litro com H 2 O e autoclave durante 45 min a 122 ° C. Verter em placas e deixar secar à temperatura ambiente durante 2 dias.
- Utilizando uma técnica estéril, inocular 100 ml de culture de meio de caldo LB com E. bactérias coli OP50 e crescer O / N a 37 ° C.
- Placas MYOB semente com E. bactérias coli OP50. Deixe-a crescer à temperatura ambiente durante 48 horas.
- Prepare modificado apenas de Bacto-peptona (BOYM) mistura seca do Youngren contendo 5,5 g de Tris-HCl, 2,4 g de base Tris, 31 g de Bactopetone, 20 g de NaCl e 0,08 g de colesterol. Misture bem com agitação.
- Preparação para a regulação negativa do gene usando RNAi
- Prepare MYOB placas RNAi-alimentação. Proceder como em passos 1.1.1 e 1.1.2. Após autoclavagem, permitir que o meio arrefeça até cerca de 55 ° C e adiciona-se 1 ml de 1 M de isopropilo β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) e 1 ml de 100 mM de ampicilina.
- Streak E. coli HT115 bactérias transformadas com um plasmídeo que exprime ou EV ou controlo RNAi flcn-1 específico em ampicilina (50 ug / mL) / tetraciclina (15 ug / ml) em placas de agar. Crescer a cultura O / N a 37 ° C.
- Escolha colônias e inocular E. coli HT115 bactérias transformadas com um plasmídeo que exprime ou EV ou controlo flcn-1 RNAi específico e crescer a cultura em LB / ampicilina (50 ug / ml) e meio O / N a 37 & #176; C.
- Placas de sementes com E. coli HT115 EV bactérias ou HT115 flcn-1 bactérias de ARNi.
NOTA: Manter placas de 48 horas à temperatura ambiente antes do uso. Se RNAi knockdown por alimentação é eficaz em, utilizar outros métodos de entrega da ARN-DS 28.
- Induzir o estresse oxidativo utilizando paraquat (PQ):
- Preparar tampão M9 por mistura de 3 g de KH 2 PO 4, 6 g de Na 2 HPO 4, 5 g de NaCl e 0,25 g de MgSO 4 7 · H2O Traga até 1 L com água destilada. Solução em autoclave durante 45 min a 122 ° C e armazenar garrafas à TA.
- No dia do ensaio, preparar a solução de M9 / PQ contendo. Para este protocolo, utilizar PQ 100 mM (0,1028 g de PQ dissolvido em 4 ml de tampão M9 preenche toda uma placas de 96 poços com 40 ul de M9 / PQ por poço).
CUIDADO: PQ é um composto altamente tóxico e perigoso. Manusear de acordo com as orientações adequadas.
NOTA: Quando a primeira a executar um novo scomboio ou de uma nova condição, recomenda-se a ensaio de sobrevivência em concentrações crescentes de PQ para determinar a melhor concentração de usar, a fim de matar os animais dentro de 7-10 horas.
2. Preparação de Age-sincronizado L4 População
- Transferir 20 hermafroditas adultas grávidas a uma placa de MYOB fresco semeado com E. bactérias coli OP50. Prepare várias placas com base no número de vermes necessários durante o ensaio.
- Permitir-lhes a pôr ovos durante 6 horas e em seguida, usando um worm fio de platina picareta remover as mães. Verificar as placas sob o microscópio para avaliar o número de ovos postos.
- Permitir que os ovos para chocar e crescer a 20 ° C durante 48 h. Neste momento, os animais estão em um L4 / estágio final adulto jovem. Escolha mesmos animais de palco e transferir para os poços contendo a solução PQ.
Observação: Uma vez que 48 horas de incubação só se aplica aos mutantes que crescem de forma semelhante aos animais de tipo selvagem, que é importante monitorizar de desenvolvimentotaxa de mutações recentemente testados para garantir que está de acordo com a taxa de desenvolvimento de tipo selvagem, de outra forma, outras linhas de tempo deve ser utilizado. - Alternativamente, a utilização de técnicas de sincronização. Gerar população sincronizada de vermes larvas L1 utilizando solução de hipoclorito (25 ml de água, 125 ml de hipoclorito de sódio a 5,25%, 50 ml de NaOH 4 M; embrulhar garrafa com folha de alumínio para isolar da luz). No entanto, para este ensaio, não é recomendável, uma vez que o branqueamento intenso pode afectar o comportamento dos animais durante o ensaio.
CUIDADO: Manusear solução de hipoclorito de acordo com as diretrizes.
NOTA: Ao usar o RNAi para regular para baixo o gene de interesse, sincronizar os hermafroditas, como descrito na seção 2, com excepção da transferência das mães para placas de RNAi semeados com as bactérias específicas de RNAi. Quando o knockdown com o RNAi é fraca, recomenda alimentação para várias gerações.
3. Realização do Estresse Oxidativo Resistência Ensaio </ P>
- Pipetar 40 ml da solução de 100 mM de PQ (preparada) a cada poço de uma placa de 96 poços. Utilize pelo menos 12 poços com réplicas de todas as condições (tratamento, mutante, etc.). Usando um verme picareta fio de platina, transferir 5-8 animais larvas L4 para cada bem indicando o horário de início e fim do tempo.
- Ao iniciar uma outra condição, anote o horário de início e fim do tempo. Colocar a placa a 20 ° C no tempo de incubação entre transferindo os vermes e marcando animais mortos uma hora mais tarde a partir da hora de início.
- Utilizando o microscópio de dissecação, a contagem de sobrevivência a cada hora. Agite ligeiramente a placa antes de iniciar a contagem. Indique vermes que não se movem, mesmo após avistar uma luz de alta intensidade, como animais mortos. Além disso, indique o número de animais vivos.
NOTA: Olhando forma verme, caudas e movimento da cabeça em alta ampliação, ajudar a determinar de vermes mortos vivos. - Repita este passo a cada hora até que a maioria dos worms estão mortos.
- Calcular o número total de animais por estado somando o número total de animais transferidas para cada poço. Ignore os animais que estão danificados ou mortos após a transferência.
- Para cada ponto de tempo, calcular o número total de animais mortos por condição (soma de animais mortos nos 12 poços). Para cada ponto de tempo, calcular a percentagem de morte (número de animais mortos, dividido pelo número total de animais e multiplicado por 100) e percentagem de sobrevivência (100 menos a morte por cento).
- Repetir este ensaio pelo menos três vezes independentes.
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Representative Results
Comparando-tipo selvagem C. elegans para flcn-1 (ok975) animais mutantes
Aqui utilizou-se 100 mM de PQ para determinar a resistência de tipo selvagem C. elegans animais em comparação com flcn-1 (ok975), que foi mostrado para resistir ao estresse oxidativo, calor e anoxia 23. Após 4 h de tratamento, 48,3% da do tipo selvagem sobreviveram, em comparação com 77,8% de sobrevivência em-um (flcn ok975) animais. Como esperado, flcn-1 (ok975) animais mutantes foram mais resistentes a PQ 100 mM em comparação com o tipo selvagem (Figura 2 e Tabela 1).
Comparando do tipo selvagem animais alimentados com controle EV ou bactérias RNAi um flcn-
Semelhante ao resultado apresentado na seção anterior, para baixo regulamento do flcn-1 utilizando RNAi aumentou a resistência ao PQ 100 mM. Este resultado demonstra que a regulação para baixo da função do gene usando imita RNAi perda de função m utation (Figura 2 e Tabela 1).
Figura 1. Figura esquemática do método de determinação de resistência ao estresse oxidativo em placas de 96 poços em C. elegans.
Sincronizada L4 / animais jovens adultos crescidos em placas de MYOB e alimentados com bactérias E. coli OP50 são transferidas para os poços de uma placa de microtitulação de 96 poços contendo 100 mM de PQ e a sobrevivência é medida a cada hora até que um grande número de vermes são mortos. No caso de ARNi knockdowns, o mesmo procedimento é seguido, excepto que os animais sincronizados são cultivadas em placas suplementadas com IPTG, e são alimentados com a E. coli bactérias portadoras do plasmídeo HT115 que o knockdown após expressão do gene alvo.
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Figura 2. Perda de resistência FLCN-1 aumenta o estresse oxidativo em C. elegans. (A - B) A percentagem de sobreviventes a PQ 100 mM de (A) em peso e flcn-1 (ok975) animais mutantes e (B) em peso animais tratados com controlo ou flcn-1 RNAi.
| A percentagem de sobrevivência de 100 mM de PQ | |||||
| 1 hr | Strain, RNAi | Percentagem de Sobrevivência (± SD) | P Valor | Número de experiências | Número total de vermes |
| peso | 82,38 ± 1,31 | 0,0002 | 3 | 210 | |
| flcn-1 (ok975) | 99,03 ± 1,67 | 3 224 | |||
| em peso; ao controle | 91,70 ± 0,55 | 0,0462 | 3 | 202 | |
| em peso; flcn-1 (RNAi) | 95,93 ± 2,48 | 3 | 207 | ||
| 2 hr | Strain, RNAi | Percentagem de Sobrevivência (± SD) | P Valor | Número de experiências | Número total de vermes |
| peso | 72,13 ± 7,13 | 0,005 | 3 | 210 | |
| flcn-1 (ok975) | 96,33 ± 2,28 | 3 | 224 | ||
| em peso; ao controle | 80,27 ± 5,34 | 0,0261 | 3 | 202 | |
| em peso; flcn-1 (RNAi) | 91,23 ± 1,42 | 3 | 207 | ||
| 3 hr | Strain, RNAi | Percentagem de Sobrevivência (± SD) | P Valor | Número de experiências | Número total de vermes |
| peso | 55,37 ± 4,72 | 0,0004 | 3 | 210 | |
| flcn-1 (ok975) | 87,00 ± 1,36 | 3 | 224 | ||
| em peso; ao controle | 70,77 ± 3,50 | 0,0027 | 3 | 202 | |
| em peso; flcn-1 (RNAi) | 87,63 ± 2,67 | 3 | 207 | ||
| 4 hr | Strain, RNAi | Percentagem de Sobrevivência (± SD) | P Valor | Número de experiências | Número total de vermes |
| peso | 48,30 ± 6,39 | 0,002 | 3 | 210 | |
| flcn-1 (ok975) | 77,80 ± 3,12 | 3 | 224 | ||
| em peso; ao controle | 63,77 ± 0,66 | 0,0122 | 3 | 202 | |
| em peso; flcn-1 (RNAi) | 80,57 ± 6,68 | 3 | 207 | ||
| 5 h | Strain, RNAi | Percentagem de Sobrevivência (± SD) | P Valor | Número de experiências | Número total de vermes |
| peso | 41,60 ± 8,33 | 0,0062 | 3 | ||
| flcn-1 (ok975) | 67,43 ± 1,42 | 3 | 224 | ||
| em peso; ao controle | 60,53 ± 2,58 | 0,0313 | 3 | 202 | |
| em peso; flcn-1 (RNAi) | 71,53 ± 5,24 | 3 | 207 | ||
| 6 hr | Strain, RNAi | Percentagem de Sobrevivência (± SD) | P Valor | Número de experiências | Número total de vermes |
| peso | 34,86 ± 5,88 | 0,0021 3 | 210 | ||
| flcn-1 (ok975) | 60,34 ± 2,05 | 3 | 224 | ||
| em peso; ao controle | 44,43 ± 3,93 | 0,0042 | 3 | 202 | |
| em peso; flcn-1 (RNAi) | 62,13 ± 3,44 | 3 | 207 | ||
Tabela 1. Resumo dos resultados e análise estatística do estresse oxidativo resistência a partir da Figura 2.
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Discussion
C. elegans é um organismo modelo atractivo para estudar a resistência ao estresse oxidativo geneticamente in vivo, uma vez que podem ser facilmente cultivadas e rapidamente leva a um grande número de descendentes geneticamente idênticos. Vários métodos para medir a resistência de stress oxidativo têm sido anteriormente descrita e que se baseiam na suplementação de placas de cultura com várias fontes de ROS, como a PQ, rotenona, H 2 O 2, e juglona 25,26,29-32. Aqui nós descrevemos um protocolo que mede a resistência ao estresse oxidativo em líquido em placas de 96 poços utilizando PQ 100 mM. Um ensaio semelhante foi realizada por Greer et ai. 33. Este ensaio pode ser ainda adaptado para estudar o stress oxidativo no líquido usando outras fontes de ROS. Por exemplo, demonstramos que a perda de flcn-1 aumenta a resistência a várias concentrações de O 2 2 H bem como 23.
Este ensaio poderia ser técnicoly desafio para algumas cepas que apresentam defeitos de motilidade ou natação induzida paralisia fenótipos, tais como estirpes que transportam uma mutação no transportador de dopamina dat-1 34. Neste caso, a incapacidade de se mover é confusa uma vez que não significa, necessariamente, diminuição da resistência de stress oxidativo, mas sim um defeito motilidade. Além disso, a contagem de animais mortos devem ser cuidadosamente preenchidos e os investigadores têm de prestar atenção ao C. elegans detalhes comportamentais, tais como movimentos de cauda, e movimentos de cabeça, ou mesmo movimentos corporais lentos. Se a concentração de PQ é muito alta, e a cinética da morte dos animais é muito rápida, pode-se considerar a diminuição da concentração de PQ, de modo a obter as taxas de mortalidade mais lentas. Alguns animais são extremamente sensíveis ao stress oxidativo, tais como 2-AAK animais mutantes 26,33,35,36, enquanto outros são altamente resistentes, tais como DAF-2 37 animais mutantes. Neste caso, o ensaio de sobrevivência com co diferentencentrations de PQ deve ser considerada.
Para as experiências de ARNi, resultados negativos pode ser devido a uma ineficiência do tratamento de RNAi. Neste caso, a medição dos níveis de mRNA é essencial para determinar se o gene knockdown é bem sucedido.
Este protocolo pode ser ainda adaptado para triagem de alto rendimento de resistência ao estresse oxidativo utilizando um detector que controla o comportamento de natação de C. elegans em líquido 38,39. Isso seria potencialmente permitir o monitoramento da resistência de C. elegans eo comportamento de natação tais como frequência de corpo dobra sob estresse oxidativo. Taxas mais elevadas de movimento do corpo podem indicar maior aptidão verme sob estresse.
Vias que levam à resistência de stress oxidativo em eucariotas inferiores são altamente conservadas através de evolução e estão ligados a doenças associadas ao stress oxidativo e envelhecimento em humanos. Mitohormesis e o generatio equilibradan de ROS são essenciais para estender o tempo e melhorar a extensão de saúde. No entanto, o excesso de ROS é altamente prejudicial para as células, tecidos / órgãos e organismos. Encontrar caminhos, que, se alteradas, fornecer um equilíbrio óptimo ROS é, portanto, essencial e as telas de drogas que modulam a resistência ao estresse oxidativo poderia ajudar o desenvolvimento de curas para várias doenças com o denominador comum: o estresse oxidativo. A execução dessas projeções em C. elegans é um método rápido, barato e confiável vantajoso que tem um grande potencial e valor para a compreensão e tratamento de doenças humanas associadas ao estresse oxidativo.
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Acknowledgments
Reconhecemos o Centro de Genética Caenorhabditis para C. estirpes elegans. Suporte O financiamento foi fornecido pelo Instituto de Pesquisa Fox Terry. Agradecemos também o apoio concedido à EP da Rolande e Marcel Gosselin Graduate Studentship ea bolsa de formação CIHR / FRSQ em FRN53888 do Programa Integrado de Formação McGill Cancer Research investigação do cancro.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar bacteriological grade | Multicell | 800-010-LG | |
| Bacteriological peptone | Oxoid | LP0037 | |
| Sodium chloride biotechnology grade | Bioshop | 7647-14-5 | |
| Cholesterol | Sigma | C8503-25G | |
| UltraPure tris hydrochloride | Invitrogen | 15506-017 | |
| Tris aminomethane | Bio Basic Canada Inc | 77-86-1 | |
| IPTG | Santa Cruz Biotechnology | sc-202185A | |
| Ampicillin | Bioshop | 69-52-3 | |
| Yeast extract | Bio Basic Inc. | 8013-01-2 | |
| Methyl viologen dichloride hydrate | Aldrich chemistry | 856177-1G | |
| Petri dish 60 x15 mm | Fisher | FB0875713A | |
| Pipet 10 ml | Fisher | 1367520 | |
| Potassium phosphate monobasic | G-Biosciences | RC-084 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | M-5921 | |
| Sodium phosphate dibasic | Bioshop | 7558-79-4 | |
| Discovery v8 stereo zeiss microscope | |||
| 96 well clear microtiter plate | |||
| flcn-1 RNAi source | Ahringer Library |
References
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