Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Измерение окислительного стрессоустойчивость Published: May 9, 2015 doi: 10.3791/52746
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Goodman Cancer Research Center, McGill University, 2Department of Biochemistry, McGill University

Abstract

Окислительный стресс, который является результатом дисбаланса между производством и детоксикации активных форм кислорода, является одной из основных причин хронических заболеваний у человека, в том числе сердечно-сосудистых и нейродегенеративных заболеваний, диабета, старения и рака. Таким образом, важно, чтобы изучить окислительный стресс не только в клеточных системах, но и с помощью целых организмов. С. Элеганс является привлекательной моделью организм изучать генетику окислительных трансдукции сигнала напряжения, которые высоко эволюционно консервативных.

Здесь мы предоставляем протокол для измерения окислительного стрессоустойчивости С. Элеганс в жидкости. Вкратце, РОС-индуцирующие реагенты, такие как паракват (PQ) и H 2 O 2 растворяют в буфере M9, и аликвоты растворов в лунках микротитрационного планшета 96 скважины. Синхронное L4 / молодой взрослый С. Элеганс животные передаются в лунки (5-8 животных / а) и выживание измеряетсякаждый час до тех пор, большинство червей не мертвы. При выполнении окислительный стресс сопротивления анализа с использованием низкой концентрации стресса в пластинах, старение может повлиять на поведение животных После окислительного стресса, который может привести к неправильной интерпретации данных. Тем не менее, в исследовании, описанном в данном документе, эта проблема вряд ли произойдет, поскольку используются только L4 / молодых взрослых животных. Кроме того, этот протокол является недорогим и результаты получены в один день, что делает эту технику привлекательной для генетических экранов. В целом, это поможет понять, окислительные пути сигнала напряжение трансдукции, которые могут быть переведены на более характеристик окислительного стресса связанный человека заболеваний.

Introduction

У эукариот, окислительного фосфорилирования происходит в электрон-транспортной цепи митохондрий является основным фактором производства энергии в форме АТФ. Активные формы кислорода (АФК) являются естественным побочным продуктом этого процесса. Несмотря на их важную роль в качестве сигнальных молекул, чрезмерное АФК может привести к повреждению ДНК, белков карбонилирования и окисления липидов. Дисбаланс между АФК и детоксикации вызывает окислительный стресс, что приводит к истощению энергии, клеточных повреждений, и запускает клеточную гибель 1,2. Окислительный стресс способствует старению и развитию многих угрожающих жизни заболеваний, включая рак, диабет, сердечно-сосудистые и нейродегенеративные заболевания 3-9.

Клетки развивались ферментативные и неферментативные стратегии защиты, чтобы поддерживать надлежащий уровень АФК и защитить своих избирателей от окислительного повреждения 1,2. Супероксиддисмутазы (СОД) ферменты действуют первым удобстRT супероксид-Н 2 О 2, который затем преобразуется в воде каталазы или пероксидазы ферментов. Номера ферментативные оборонные стратегии включают в себя в основном молекулы, которые реагируют быстрее с АФК по сравнению с клеточными макромолекулами, защищающих основные клеточные компоненты. Несмотря на защитной роли АФК детоксикации ферменты, некоторые молекулы АФК избежать антиоксидантными защитные механизмы и привести к окислительному повреждению. Обнаружение, ремонт и деградация поврежденных клеточных компонентов основных стратегий защиты во время окислительного стресса 1,2.

Сигнальных путей, участвующих в стрессоустойчивости и специально окислительного стресса высоко эволюционно консервативны 10,11. В отличие от экспериментов культивирования клеток, где организменном условия лишь частично воспроизведена, исследования окислительного стресса в модельных организмов 12,13 имеет большое значение. С Элеганс является свободно живущих нематод, которые могут быть легко и недорого культывается на бактериальной газон на агаре. Это небольшой по размеру (около 1 мм в длину) и нормально растет в качестве самостоятельного удобрения гермафродита, что облегчает генетические манипуляции. Он имеет быстрый жизненный цикл и высокую репродуктивную способность, производя около 300 потомков на поколение, что делает его мощным инструментом для выполнения масштабных генетических экраны 14. С. Элеганс генома полностью секвенировали и 40-50% генов, по прогнозам, будет гомологов болезни генов, ассоциированных с человека 15-18. Нокдаун генов интерес, используя RNAi является быстрым и легким в С. Элеганс. Джин вниз регулирование может быть достигнуто путем кормления животных Е. палочки бактерии, которые укрывают плазмиды, выражающее двухцепочечной РНК, которая нацелена на мРНК интерес 19. Таким образом, определение функции генов с использованием крупномасштабных RNAi экраны имеет большое влияние на понимание заболеваний человека, включая рак 20,21.

Исследования Oxidative стрессоустойчивость в С. Элеганс привели к идентификации консервативных механизмов резистентности к окислительному стрессу 13,22. Некоторые пути, выявленные общие пути, которые модулируют долговечность и устойчивость к другим стрессам, а также такие, как гипоксия, тепло, и осмотического стресса. Эти пути включают в себя секрецию инсулина, сигнализации TOR, и аутофагии. Другие ключевые пути привлечь детоксикации АФК, таких как супероксиддисмутаза ферментов и каталазы ферментов, или в репарации повреждений, таких как теплового шока и белков-шаперонов 11,13,22.

Этот протокол описывает, как определить устойчивость к окислительному стрессу С. Элеганс в жидкости. Мы использовали flcn-1 (ok975) и животных дикого типа, чтобы продемонстрировать протокол, так как мы показали ранее повышенную устойчивость к окислительному стрессу при потере flcn-1 (ok975) на C. Элеганс 23. Мы также показали, что повышенное сопротивление зависитна AMPK и аутофагии, оси сигнализации, что повышает клеточный биоэнергетику и способствует стрессоустойчивости 23. PQ является окислительный стресс, который влияет на электрон-транспортной цепи для производства видов реактивного кислорода 24. Анализ же могут быть адаптированы и другие источники ROS ROS или генерирующие соединения могут быть использованы, например, H 2 O 2 и ротенона. Аналогичные анализы были разработаны на пластинах, где низкие концентрации PQ используются 25,26. Преимущество такого анализа является то, что очень быстро, а результаты могут быть получены в один день. Кроме того, общий объем жидкости, используемой для выполнения окислительный стресс-устойчивости анализа в 96-луночных планшетах является низкой по сравнению с объемом, используемого для получения PQ-содержащие пластины. Таким образом, количество PQ используется в жидком тесте низкий, что делает этот анализ недорого и ограничивает производство токсичных отходов. Однако ограничения данного анализа по сравнению с пластинчатыми анализов включают ЛАCK пищи в жидком тесте и низкой концентрации кислорода в жидкости по сравнению с воздухом. Они являются важными факторами, которые в некоторых случаях, может повлиять на результаты. Таким образом, подтверждающие воспроизводимость с помощью других методов окислительного стресса сопротивления рекомендуется, чтобы поддержать результаты, полученные в этом тесте.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка реагентов

  1. Подготовка средств массовой информации для С. Рост Элеганс (в данном случае, животных дикого типа и flcn-1 (ok975) мутантных животных).
    1. Готовят изменены только Бакто-пептон (грецкий) сухой смеси, содержащей Youngren 5,5 г Трис HCl, 2,4 г трис-основани, 31 г Bactopetone, 20 г NaCl и 0,08 г холестерина. Хорошо перемешать, встряхивая.
      Примечание: Эта смесь является достаточным для получения 10 л MYOB среды.
      Примечание: Нормальные ростовую среду (НГМ) пластины может быть использован вместо грецкий пластин 27. Тем не менее, тот же тип пластины должны быть использованы для сравнения между действительными и штаммов между независимыми повторами. В этом протоколе, мы использовали только грецкий пластины.
    2. Подготовка 1 л MYOB среды путем добавления 6 г MYOB сухой смеси, 17 г агара и составляют до 1 л Н 2 О и автоклав в течение 45 мин при 122 ° С. Налейте пластин и дайте высохнуть при комнатной температуре в течение 2 дней.
    3. Использование стерильных, привить 100 мл cultuRe Л.Б. бульона среде с Е. палочка OP50 бактерии и расти O / N на 37 ° C.
    4. Семя MYOB пластины с Е. палочка OP50 бактерий. Позвольте ему расти при комнатной температуре в течение 48 ч.
  2. Подготовка к генной подавлением с использованием RNAi
    1. Подготовка грецкий РНК-интерференции кормления пластины. Действуйте, как в шагах 1.1.1 и 1.1.2. После автоклавирования среда позволяют охладиться до приблизительно 55 ° С и добавляют 1 мл 1 М изопропилового β-D-1-тиогалактопиранозида (IPTG) и 1 мл 100 мМ ампициллина.
    2. Е. подряд палочка HT115 бактерии, трансформированные плазмидой, которая экспрессирует либо управления EV или flcn-1 специфический RNAi на ампициллин (50 мкг / мл) / тетрациклин (15 мкг / мл) чашки с агаром. Выращивают культуры O / N при 37 ° С.
    3. Выберите колонии и привить Е. палочка HT115 бактерии, трансформированные плазмидой, которая выражает либо контроля Е.В. или flcn-1 РНК-интерференции конкретных и расти культуры в LB / ампициллин (50 мкг / мл) средних и O / N в 37 & #176; С.
    4. Семенной пластин с Е. палочка HT115 EV бактерии или HT115 flcn-1 RNAi бактерии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Держите пластины 48 ч при комнатной температуре перед использованием. Если РНК-интерференции нокдаун от кормления в эффективной, использовать другие методы доставки DS-РНК 28.
  3. Стимулирование окислительный стресс, используя параквата (PQ):
    1. Подготовьте M9 буфер путем смешивания 3 г КН 2 РО 4, 6 г Na 2 HPO 4, 5 г NaCl и 0,25 г MgSO 4 · 7Н 2 О. Принесите до 1 л дистиллированной воды. Автоклав раствор в течение 45 мин при 122 ° С и хранить при комнатной температуре бутылок.
    2. В день анализа, подготовить M9 / PQ-содержащий раствор. Для этого протокола, используйте 100 мМ PQ (0,1028 г PQ, растворенного в 4 мл M9 буфера заполняет весь 96-луночных с 40 мкл / M9 PQ на лунку).
      ВНИМАНИЕ: PQ является опасным и очень токсичен. Обращайтесь в соответствии с соответствующими руководящими принципами.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При первом запуске новых Sпоезд или новое состояние, рекомендуется для анализа выживаемости в увеличении концентрации PQ, чтобы определить наилучший концентрации, чтобы использовать для того, чтобы убить животных в 7-10 ч.

2. Подготовка Возраст синхронизированной L4 населения

  1. Передача 20 беременных взрослых гермафродитов на свежий MYOB пластины засеянного Е. палочка OP50 бактерий. Подготовьте несколько пластин в зависимости от количества червей, необходимых в процессе анализа.
  2. Позвольте им, чтобы отложить яйца в течение 6 ч, а затем с помощью платиновой проволоки червя выбрать Удалить матерей. Проверьте пластины под микроскопом, чтобы определить количество яиц.
  3. Разрешить яйца в люк и расти при 20 ° С в течение 48 ч. В это время, животные в конце L4 / молодой взрослой стадии. Выберите те же стадии животных и передать на PQ решений, содержащих скважин.
    Примечание: С 48 ч инкубации относится только к мутантам, которые растут так же, как у животных дикого типа, важно контролировать развитияСкорость недавно протестированных мутантов, чтобы обеспечить его соответствие темпов развития дикого типа, в противном случае, другие сроки должны быть использованы.
  4. Кроме того, использование методов синхронизации. Генерация синхронизированный население L1 личинок червей с использованием гипохлорита раствор (25 мл воды, 125 мл 5,25% раствора гипохлорита натрия, 50 мл 4 М NaOH; обернуть бутылку с алюминиевой фольгой, чтобы изолировать от света). Тем не менее, для этого анализа, не рекомендуется, так как интенсивное отбеливание может повлиять на поведение животных во время теста.
    ВНИМАНИЕ: Обращайтесь раствор гипохлорита в соответствии с руководящими принципами.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании RNAi вниз регулировать интерес ген, синхронизировать гермафродитов, как описано в разделе 2, за исключением передачи матерей к РНК-интерференции пластин, посеянных с конкретными бактерий РНК-интерференции. Когда нокдаун с РНК-интерференции является слабым, кормление нескольких поколений рекомендуется.

3. Выполнение окислительного стресса Сопротивление Пробирной </ P>

  1. Пипетка 40 мкл раствора мМ PQ 100 (полученного свежего) к каждой лунке 96-луночного планшета. Используйте по крайней мере 12 скважин, как повторяет каждого условия (лечения, мутанта, и т.д.). Использование платиновой проволоки червя выбор, передать 5-8 L4 личинок животных в каждую лунку с указанием времени начала и время окончания.
  2. При запуске еще одно условие, обратите внимание на время начала и время окончания. Поместите пластину на 20 ° C во время инкубации между передачи червей и забил мертвых животных через час с момента старта.
  3. Использование рассекает микроскоп, рассчитывать выживания каждый час. Слегка встряхните пластину, прежде чем начать рассчитывать. Укажите червей, которые не двигаются, даже после кровянистые выделения свет высокой интенсивности, а мертвых животных. Также укажите количество животных в живых.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Глядя на форму червя, хвосты и движения головы при сильном увеличении, поможет определить мертвые черви из живых.
  4. Повторите этот шаг каждый час, пока большинство червей не мертвы.
<р = класс "jove_title"> 4. Определение выживания Процент на каждый момент времени

  1. Рассчитать общее количество животных на каждое условие, добавив общее количество животных, передаваемых в каждую лунку. Не обращайте внимания на животных, которые были повреждены или погибли при передаче.
  2. Для каждого момента времени, вычислить общее количество погибших животных на каждое условие (сумма мертвых животных в 12 лунок). Для каждого момента времени, расчета процент смерти (число умерших животных, поделенное на общее число животных и умноженное на 100) и процент выживаемости (100 минус процент смерти).
  3. Повторите этот анализ не менее 3 независимых раза.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Сравнивая дикого типа С. Элеганс, чтобы flcn-1 (ok975) мутантных животных

Здесь мы использовали 100 мМ PQ для определения сопротивления дикого типа C. Элеганс животных по сравнению с flcn-1 (ok975), который, как было показано, чтобы противостоять окислительного стресса, тепла и аноксии 23. После 4 ч обработки, 48,3% дикого типа выжили, по сравнению с 77,8% выживаемости в flcn-1 (ok975) животных. Как и ожидалось, flcn-1 (ok975) мутантные животные были более стойкими к 100 мМ PQ сравнению с диким типом (рисунок 2 и таблица 1).

Сравнивая дикого типа животных кормили контрольной EV или flcn-1 RNAi бактерии

Как и в результате представленной в предыдущем разделе, вниз регулирования flcn-1 с помощью РНК-интерференции повышенной стойкости до 100 мм PQ. Этот результат показывает, что вниз регулирование функции гена, используя RNAi имитирует потери из-функций м utation (рисунок 2 и таблица 1).

Фигура 1
Рисунок 1. Схема фигура метода определения стрессоустойчивости окислительного в 96-луночных в C. Элеганс.

Синхронные L4 / молодые взрослые животные, выращенные на пластинах и грецкий кормили E. Coli OP50 бактерий передаются в лунки микротитрационного планшета с 96 а, содержащего 100 мМ PQ и выживания измеряется почасовая пока большое количество червей не мертвы. В случае РНК-интерференции нокдаун, та же самая процедура, за исключением того, что синхронизированные животных выращивают на пластинах с добавлением IPTG, и подаются с Е. палочка HT115 бактерии, несущие плазмиду, котора будет нокдаун гена-мишени при экспрессии.

Файлы / ftp_upload / 52746 / 52746fig2.jpg "/>
Рисунок 2. Потеря FLCN-1 повышает устойчивость к окислительному стрессу в С. Элеганс. (A - B) Процент выживаемости до 100 мм PQ (а) и масс-flcn 1 (ok975) мутантных животных и (б) мас животных, обработанных контролем или flcn-1 RNAi.

Процент выживаемости до 100 мм PQ
1 час Процедить, РНК-интерференции Процент выживания (± SD) Значение р Количество экспериментов Общее количество червей
вес 82,38 ± 1,31 0,0002 3 210
flcn-1 (ok975) 99.03 ± 1.67 3 224
вес; управления 91.70 ± 0.55 0,0462 3 202
мас; flcn-1 (RNAi) 95.93 ± 2.48 3 207
2 ч Процедить, РНК-интерференции Процент выживания (± SD) Значение р Количество экспериментов Общее количество червей
вес 72.13 ± 7.13 0,005 3 210
flcn-1 (ok975) 96.33 ± 2.28 3 224
вес; управления 80.27 ± 5.34 0,0261 3 202
мас; flcn-1 (RNAi) 91.23 ± 1.42 3 207
3 ч Процедить, РНК-интерференции Процент выживания (± SD) Значение р Количество экспериментов Общее количество червей
вес 55.37 ± 4.72 0,0004 3 210
flcn-1 (ok975) 87.00 ± 1.36 3 224
вес; управления 70.77 ± 3.50 0,0027 3 202
мас; flcn-1 (RNAi) 87.63 ± 2.67 3 207
4 ч Процедить, РНК-интерференции Процент выживания (± SD) Значение р Количество экспериментов Общее количество червей
вес 48.30 ± 6.39 0,002 3 210
flcn-1 (ok975) 77.80 ± 3.12 3 224
вес; управления 63.77 ± 0.66 0,0122 3 202
мас; flcn-1 (RNAi) 80.57 ± 6.68 3 207
5 ч Процедить, РНК-интерференции Процент выживания (± SD) Значение р Количество экспериментов Общее количество червей
вес 41.60 ± 8.33 0,0062 3
flcn-1 (ok975) 67.43 ± 1.42 3 224
вес; управления 60.53 ± 2.58 0,0313 3 202
мас; flcn-1 (RNAi) 71.53 ± 5.24 3 207
6 ч Процедить, РНК-интерференции Процент выживания (± SD) Значение р Количество экспериментов Общее количество червей
вес 34.86 ± 5.88 0,0021 3 210
flcn-1 (ok975) 60.34 ± 2.05 3 224
вес; управления 44.43 ± 3.93 0,0042 3 202
мас; flcn-1 (RNAi) 62.13 ± 3.44 3 207

Таблица 1. Резюме результатов и статистического анализа окислительного стрессоустойчивости на рисунке 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

C. Элеганс является привлекательным модельный организм для изучения генетически окислительный стресс устойчивость в естественных условиях, так как он может быть легко культивировать, и быстро приводит к большому количеству генетически идентичных потомков. Различные способы для измерения окислительного стресса сопротивление были описаны ранее, и они основаны на добавок культуральных планшетах с различных источников, таких как ROS PQ, ротеноном, H 2 O 2, и юглон 25,26,29-32. Здесь мы опишем протокол, который измеряет окислительный стресс сопротивление в жидкости в 96-луночных планшетах с использованием 100 мМ PQ. Подобный анализ был выполнен с помощью Greer соавт. 33. Этот анализ может быть дополнительно приспособлен для изучения окислительного стресса в жидкости с использованием других источников ROS. Например, мы показали, что потеря flcn-1 повышает устойчивость к нескольким H 2 O 2 концентрации, а также 23.

Этот анализ может быть техническимLY сложным для некоторых штаммов, которые отображают подвижности дефектов или плавание, вызванной паралич фенотип таких как штаммы, несущие мутации в дофамина DAT-1 34. В этом случае, неспособность двигаться в заблуждение, поскольку это не обязательно означает снизился окислительный стресс устойчивость, а, скорее дефект моторику. Кроме того, подсчет убитых животных должны быть тщательно завершены, и исследователи должны обратить внимание на C. Элеганс поведенческие детали, такие как движения хвостом, и движений головы, или даже медленными движениями тела. Если концентрация PQ слишком высока, и смерть кинетика животных очень быстро, можно было бы рассмотреть уменьшении концентрации PQ, чтобы получить более низкие скорости смерти. Некоторые животные очень чувствительны к окислительному стрессу, таких как ОАО ААК-2 мутантных животных 26,33,35,36 то время как другие обладают высокой устойчивостью, например, DAF-2 мутантных животных 37. В этом случае, анализируя выживание с другом соncentrations из PQ должны быть рассмотрены.

Для РНК-интерференции экспериментов, отрицательные результаты могут быть из-за неэффективности лечения РНК-интерференции. В этом случае измерение уровней мРНК необходимо, чтобы определить ген нокдаун ли успешным.

Этот протокол может быть дополнительно приспособлен для высокопроизводительного скрининга окислительного стресса сопротивления с использованием детектора, который отслеживает поведение плавания С. Элеганс в жидком 38,39. Это потенциально позволит контролировать выносливость С. Элеганс и поведение плавание, таких как частота изгибы тела в условиях окислительного стресса. Более высокие темпы движения тела может указывать на более высокий червь фитнес под напряжением.

Подготовка, которые приводят к окислительному стрессоустойчивости низших эукариот высоко консервативны по эволюции и связаны с окислительным стрессом заболеваний, ассоциированных и старения в организме человека. Mitohormesis и сбалансированный Generatioп АФК необходимы для продления срока службы и повышения продолжительности здоровья. Однако чрезмерное АФК является весьма разрушительным для клеток, тканей / органов и организмов. Поиск путей, что, если изменены, обеспечивают оптимальный баланс АФК Таким образом, важно и экраны для препаратов, которые модулируют сопротивление окислительному стрессу может помочь развитию лекарств для нескольких заболеваний с общим знаменателем: окислительного стресса. Выполнение этих показов в С. Элеганс является выгодным быстрый, недорогой и надежный способ, который имеет большой потенциал и значение для понимания и лечения заболеваний человека, связанных с окислительным стрессом.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Мы признаем Caenorhabditis генетический центр для C. штаммы Элеганс. Финансовая поддержка была предоставлена ​​Терри Фокс-исследовательского института. Мы также признаем, поддержку эксплуатацию ЕР от Роланд и Марсель Госслин Высшей студенчества и подготовки гранта CIHR / FRSQ в исследовании рака FRN53888 в Макгилл Комплексной программы подготовки исследования рака.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar bacteriological grade Multicell 800-010-LG
Bacteriological peptone Oxoid LP0037
Sodium chloride biotechnology grade Bioshop 7647-14-5
Cholesterol Sigma C8503-25G
UltraPure tris hydrochloride Invitrogen 15506-017
Tris aminomethane Bio Basic Canada Inc 77-86-1
IPTG Santa Cruz Biotechnology sc-202185A
Ampicillin Bioshop 69-52-3
Yeast extract Bio Basic Inc. 8013-01-2
Methyl viologen dichloride hydrate Aldrich chemistry 856177-1G
Petri dish 60 x15 mm Fisher FB0875713A
Pipet 10 ml Fisher 1367520
Potassium phosphate monobasic G-Biosciences RC-084
Magnesium sulfate heptahydrate Sigma M-5921
Sodium phosphate dibasic Bioshop 7558-79-4
Discovery v8 stereo zeiss microscope
96 well clear microtiter plate
flcn-1 RNAi source Ahringer Library

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schieber, M., Chandel, N. S. ROS function in redox signaling and oxidative stress. Curr Biol. 24, R453-R462 (2014).
  2. Alfadda, A. A., Sallam, R. M. Reactive oxygen species in health and disease. J Biomed Biotechnol. 2012, 936486 (2012).
  3. Finkel, T., Holbrook, N. J. Oxidants, oxidative stress and the biology of ageing. Nature. 408, 239-247 (2000).
  4. Di Carlo, M., Giacomazza, D., Picone, P., Nuzzo, D., San Biagio, P. L. Are oxidative stress and mitochondrial dysfunction the key players in the neurodegenerative diseases. Free Radic Res. 46, 1327-1338 (2012).
  5. Gandhi, S., Abramov, A. Y. Mechanism of oxidative stress in neurodegeneration. Oxid Med Cell Longev. 2012, 428010 (2012).
  6. Trushina, E., McMurray, C. T. Oxidative stress and mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases. Neuroscience. 145, 1233-1248 (2007).
  7. Touyz, R. M., Briones, A. M. Reactive oxygen species and vascular biology: implications in human hypertension. Hypertens Res. 34, 5-14 (2011).
  8. Gorrini, C., Harris, I. S., Mak, T. W. Modulation of oxidative stress as an anticancer strategy. Nat Rev Drug Discov. 12, 931-947 (2013).
  9. Sosa, V., et al. Oxidative stress and cancer: an overview. Ageing research reviews. 12, 376-390 (2013).
  10. Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. Reactive Oxygen Species and Aging in Caenorhabditis elegans: Causal or Casual Relationship. Antioxid Redox Signal. 13, 1911-1953 (2010).
  11. Baumeister, R., Schaffitzel, E., Hertweck, M. Endocrine signaling in Caenorhabditis elegans controls stress response and longevity. J Endocrinol. 190, 191-202 (2006).
  12. Markaki, M., Tavernarakis, N. Modeling human diseases in Caenorhabditis elegans. Biotechnol J. 5, 1261-1276 (2010).
  13. Rodriguez, M., Snoek, L. B., De Bono, M., Kammenga, J. E. Worms under stress: C. elegans stress response and its relevance to complex human disease and aging. Trends Genet. 29, 367-374 (2013).
  14. Hope, I. A. Practical approach series. , Oxford University Press. 282 (1999).
  15. C. elegans Sequencing Consortium. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science. 282, 2012-2018 (1998).
  16. Ahringer, J. Turn to the worm! Current opinion in genetics & development. 7, 410-415 (1997).
  17. Wheelan, S. J., Boguski, M. S., Duret, L., Makalowski, W. Human and nematode orthologs--lessons from the analysis of 1800 human genes and the proteome of Caenorhabditis elegans. Gene. 238, 163-170 (1999).
  18. Culetto, E., Sattelle, D. B. A role for Caenorhabditis elegans in understanding the function and interactions of human disease genes. Hum Mol Genet. 9, 869-877 (2000).
  19. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
  20. Lamitina, T. Functional genomic approaches in C. elegans. Methods Mol Biol. 351, 127-138 (2006).
  21. Poulin, G., Nandakumar, R., Ahringer, J. Genome-wide RNAi screens in Caenorhabditis elegans: impact on cancer research. Oncogene. 23, 8340-8345 (2004).
  22. Moreno-Arriola, E., et al. Caenorhabditis elegans: A Useful Model for Studying Metabolic Disorders in Which Oxidative Stress Is a Contributing Factor. Oxid Med Cell Longev. , 705253 (2014).
  23. Possik, E., et al. Folliculin regulates ampk-dependent autophagy and metabolic stress survival. PLoS Genet. 10, e1004273 (2014).
  24. Fukushima, T., Tanaka, K., Lim, H., Moriyama, M. Mechanism of cytotoxicity of paraquat. Environ Health Prev Med. 7, 89-94 (2002).
  25. Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. Superoxide dismutase is dispensable for normal animal lifespan. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 5785-5790 (2012).
  26. Schulz, T. J., et al. Glucose restriction extends Caenorhabditis elegans life span by inducing mitochondrial respiration and increasing oxidative stress. Cell Metab. 6, 280-293 (2007).
  27. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
  28. Timmons, L. Delivery methods for RNA interference in. C. elegans. Methods Mol Biol. 351, 119-125 (2006).
  29. Wang, B. Y., et al. Caenorhabditis elegans Eyes Absent Ortholog EYA-1 Is Required for Stress Resistance. Biochemistry (Mosc). 79, 653-662 (2014).
  30. Paz-Gomez, D., Villanueva-Chimal, E., Navarro, R. E. The DEAD Box RNA helicase VBH-1 is a new player in the stress response in C. elegans. PLoS One. 9, 97924 (2014).
  31. Ward, J. D., et al. Defects in the C. elegans acyl-CoA synthase, acs-3, and nuclear hormone receptor, nhr-25, cause sensitivity to distinct, but overlapping stresses. PLoS One. 9, 92552 (2014).
  32. Staab, T. A., Evgrafov, O., Knowles, J. A., Sieburth, D. Regulation of synaptic nlg-1/neuroligin abundance by the skn-1/Nrf stress response pathway protects against oxidative stress. PLoS Genet. 10, e1004100 (2014).
  33. Greer, E. L., et al. An AMPK-FOXO pathway mediates longevity induced by a novel method of dietary restriction in. C. elegans. Curr Biol. 17, 1646-1656 (2007).
  34. Allen, E., Walters, I. B., Hanahan, D. Brivanib, a dual FGF/VEGF inhibitor, is active both first and second line against mouse pancreatic neuroendocrine tumors developing adaptive/evasive resistance to VEGF inhibition. Clin Cancer Res. 17, 5299-5310 (2011).
  35. Apfeld, J., O'Connor, G., McDonagh, T., DiStefano, P. S., Curtis, R. The AMP-activated protein kinase AAK-2 links energy levels and insulin-like signals to lifespan in C. elegans. Genes Dev. 18, 3004-3009 (2004).
  36. Lee, H., et al. The Caenorhabditis elegans AMP-activated protein kinase AAK-2 is phosphorylated by LKB1 and is required for resistance to oxidative stress and for normal motility and foraging behavior. J Biol Chem. 283, 14988-14993 (2008).
  37. Honda, Y., Honda, S. The daf-2 gene network for longevity regulates oxidative stress resistance and Mn-superoxide dismutase gene expression in Caenorhabditis elegans. FASEB J. 13, 1385-1393 (1999).
  38. Restif, C., Metaxas, D. Tracking the swimming motions of C. elegans worms with applications in aging studies. Med Image Comput Comput Assist Interv. 11, 35-42 (2008).
  39. Buckingham, S. D., Sattelle, D. B. Fast, automated measurement of nematode swimming (thrashing) without morphometry. BMC Neurosci. 10, 84 (2009).

Tags

Клеточная биология выпуск 99 окислительный стресс паракват, организменном смерть модель животного нематод
Измерение окислительного стрессоустойчивость<em&gt; Caenorhabditis Элеганс</em&gt; В микротитровальных пластинках 96-а
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Possik, E., Pause, A. Measuring… More

Possik, E., Pause, A. Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates. J. Vis. Exp. (99), e52746, doi:10.3791/52746 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter