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Biology

के oxidative तनाव प्रतिरोध को मापने Published: May 9, 2015 doi: 10.3791/52746
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Goodman Cancer Research Center, McGill University, 2Department of Biochemistry, McGill University

Abstract

उत्पादन और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों की detoxification के बीच असंतुलन का परिणाम है जो ऑक्सीडेटिव तनाव, हृदय और neurodegenerative रोगों, मधुमेह, उम्र बढ़ने, और कैंसर सहित पुराने मानव विकारों के लिए एक प्रमुख योगदान है। इसलिए, यह सेल प्रणाली में ही नहीं बल्कि पूरी जीवों का उपयोग कर न केवल oxidative तनाव का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण है। सी एलिगेंस अत्यधिक evolutionarily संरक्षित कर रहे हैं जो oxidative तनाव संकेत पारगमन रास्ते, की आनुवंशिकी के अध्ययन के लिए एक आकर्षक मॉडल जीव है।

यहाँ, हम सी में oxidative तनाव प्रतिरोध को मापने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान तरल में एलिगेंस। ऐसे Paraquat (पीक्यू) और एच 2 ओ 2 के रूप में संक्षेप में, आरओएस उत्प्रेरण अभिकर्मकों M9 बफर में भंग कर रहे हैं, और समाधान एक साथ 96 microtiter प्लेट के कुओं में aliquoted कर रहे हैं। सिंक्रनाइज़ L4 / युवा वयस्क सी एलिगेंस जानवरों के कुओं के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं (5-8 पशु / अच्छी तरह से) और अस्तित्व मापा जाता हैहर घंटे के सबसे कीड़े मर रहे हैं जब तक। डेटा के एक गलत व्याख्या करने के लिए ले जा सकता है, जो oxidative तनाव पर जानवरों के व्यवहार को प्रभावित कर सकता है, उम्र बढ़ने प्लेटों में तनाव की एक कम एकाग्रता का उपयोग कर एक oxidative तनाव प्रतिरोध परख प्रदर्शन करते हैं। हालांकि, इस के साथ साथ वर्णित परख में, इस समस्या को केवल L4 / युवा वयस्क जानवरों का इस्तेमाल किया जा रहा है के बाद से होने की संभावना नहीं है। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल सस्ती है और परिणाम आनुवंशिक स्क्रीन के लिए आकर्षक इस तकनीक renders जो एक दिन में प्राप्त कर रहे हैं। कुल मिलाकर, इस oxidative तनाव से जुड़े मानवीय विकारों के बेहतर लक्षण वर्णन में अनुवाद किया जा सकता है जो oxidative तनाव संकेत पारगमन रास्ते, समझने में मदद मिलेगी।

Introduction

यूकेरियोट्स में माइटोकॉन्ड्रिया के इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला में जगह ले जा ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण एटीपी के रूप में ऊर्जा उत्पादन का मुख्य चालक है। रिएक्टिव ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) इस प्रक्रिया का एक स्वाभाविक प्रतिफल हैं। संकेतन अणुओं के रूप में उनकी महत्वपूर्ण भूमिका के बावजूद, अत्यधिक आरओएस डीएनए की क्षति, प्रोटीन कार्बोनाइलीकरण, और लिपिड ऑक्सीकरण के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। आरओएस उत्पादन और detoxification के बीच एक असंतुलन ऊर्जा की कमी, सेलुलर क्षति की ओर जाता है जो oxidative तनाव का कारण बनता है, और कोशिका मृत्यु 1,2 हो सके। ऑक्सीडेटिव तनाव उम्र बढ़ने के लिए और कैंसर, मधुमेह, हृदय और neurodegenerative रोगों 3-9 सहित कई जानलेवा बीमारियों के विकास के लिए योगदान देता है।

सेल उचित आरओएस के स्तर को बनाए रखने के लिए और oxidative नुकसान 1,2 के खिलाफ अपने समर्थकों की रक्षा के लिए एंजाइमी और गैर एंजाइमी रक्षा रणनीतियों विकसित किया है। Superoxide dismutase (वतन) एंजाइमों conve के लिए पहला अधिनियमबाद में Catalase या peroxidase एंजाइमों द्वारा पानी में बदल जाती है जो एच 2 ओ 2, आरटी सुपरऑक्साइड। गैर एंजाइमी रक्षा रणनीतियों ज्यादातर आवश्यक सेलुलर घटकों की रक्षा सेलुलर अणुओं की तुलना में आरओएस के साथ तेजी से प्रतिक्रिया अणुओं है कि शामिल हैं। आरओएस एंजाइमों detoxifying के सुरक्षात्मक भूमिका के बावजूद, कुछ आरओएस अणुओं एंटीऑक्सीडेंट रक्षा तंत्र से बचने और oxidative नुकसान हो। जांच, मरम्मत, और क्षतिग्रस्त सेलुलर घटकों की गिरावट ऑक्सीडेटिव तनाव 1,2 के दौरान आवश्यक रक्षा रणनीतियों रहे हैं।

तनाव प्रतिरोध और विशेष रूप से ऑक्सीडेटिव तनाव में शामिल रास्ते संकेतन अत्यधिक evolutionarily 10,11 संरक्षित कर रहे हैं। जीवधारी शर्तों केवल आंशिक रूप से reproduced हैं जहां सेल संस्कृति प्रयोगों, 12,13 बड़ा महत्व है मॉडल जीवों में oxidative तनाव के अध्ययन के विपरीत सी। एलिगेंस संस्कृति को आसानी से और सस्ते में हो सकता है कि एक मुक्त रहने वाले निमेटोड हैअगर मीडिया पर एक जीवाणु लॉन पर खंडित। यह आकार में छोटा है, आम तौर पर (लगभग 1 लंबाई में मिमी) और आनुवंशिक जोड़तोड़ की सुविधा है, जो एक आत्म fertilizing उभयलिंगी, के रूप में बढ़ता है। यह एक तेजी से जीवन चक्र और एक उच्च प्रजनन क्षमता, पीढ़ी के बारे में प्रति 300 संतानों के उत्पादन में यह बड़े पैमाने पर आनुवंशिक स्क्रीन 14 प्रदर्शन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण बना रही है। सी. एलिगेंस जीनोम अनुक्रम पूरी तरह से किया जाता है और जीन का 40-50% मानव रोग जुड़े जीन 15-18 की homologues होने की भविष्यवाणी कर रहे हैं। आरएनएआई का उपयोग कर ब्याज की जीन की पछाड़ना तेजी से और सी में आसान है एलिगेंस। जीन नीचे विनियमन ई जानवरों को खिलाने के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है ब्याज 19 की mRNA लक्ष्य है कि डबल असहाय शाही सेना व्यक्त प्लाज्मिड बंदरगाह कि कोलाई बैक्टीरिया। इसलिए, बड़े पैमाने पर आरएनएआई स्क्रीन का उपयोग जीन समारोह के निर्धारण के कैंसर 20,21 सहित मानव रोगों को समझने पर काफी प्रभाव पड़ता है।

ओ के अध्ययनसी में xidative तनाव प्रतिरोध एलिगेंस ऑक्सीडेटिव तनाव 13,22 करने के लिए प्रतिरोध का संरक्षित तंत्र की पहचान करने के लिए नेतृत्व किया है। पहचान कुछ रास्ते हाइपोक्सिया, गर्मी, और आसमाटिक तनाव के रूप में अन्य तनाव के रूप में अच्छी तरह से इस तरह के दीर्घायु और प्रतिरोध मिलाना है कि आम रास्ते हैं। इन रास्ते इंसुलिन संकेतन, टो संकेतन, और भोजी शामिल हैं। अन्य प्रमुख रास्ते में इस तरह के, या नुकसान की मरम्मत में ऐसी गर्मी सदमे और निगरानी प्रोटीन 11,13,22 के रूप में superoxide dismutase एंजाइम और Catalase एंजाइमों के रूप में आरओएस के detoxification शामिल है।

इस प्रोटोकॉल सी के oxidative तनाव के लिए प्रतिरोध का निर्धारण करने के लिए बताता है कि कैसे तरल में एलिगेंस। हम पहले सी में के नुकसान पर flcn -1 (ok975) oxidative तनाव के लिए एक बढ़ा प्रतिरोध से पता चला है के बाद से हम प्रोटोकॉल का प्रदर्शन करने के लिए flcn -1 (ok975) और जंगली प्रकार के जानवरों का इस्तेमाल किया एलिगेंस 23। हम भी इस वृद्धि प्रतिरोध निर्भर करता है कि पता चला हैAMPK और भोजी, सेलुलर बायोइनरजेटिक्स में सुधार और तनाव प्रतिरोध 23 बढ़ावा देता है एक संकेतन धुरी पर। पीक्यू प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के 24 निर्माण करने के लिए इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला के साथ हस्तक्षेप है कि एक oxidative तनाव है। एक ही परख अनुकूलित किया जा सकता है और अन्य आरओएस स्रोतों या आरओएस पैदा करने यौगिकों एच 2 ओ 2 और rotenone रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। इसी प्रकार assays के पीक्यू की कम सांद्रता 25,26 उपयोग किया जाता है, जहां प्लेटों पर विकसित किया गया है। इस परख का लाभ यह बहुत तेजी से है, और परिणाम एक ही दिन में प्राप्त किया जा सकता है। साथ ही, 96 अच्छी तरह से प्लेट में oxidative तनाव प्रतिरोध परख करने के लिए इस्तेमाल तरल की कुल मात्रा पीक्यू युक्त प्लेटें तैयार करने के लिए इस्तेमाल की मात्रा की तुलना में कम है। इसलिए, इस्तेमाल किया पीक्यू की राशि तरल परख में है सस्ती परख renders और जहरीले कचरे के उत्पादन को सीमित करता है, जो कम है। हालांकि, थाली assays के रूप में की तुलना में इस परख की सीमाओं ला शामिलतरल परख में भोजन और तरल में ऑक्सीजन की कम एकाग्रता की सी हवा की तुलना में। ये कुछ मामलों में, परिणाम प्रभावित हो सकता है कि महत्वपूर्ण कारक हैं। इसलिए, इस परख में प्राप्त परिणामों का समर्थन करने की सिफारिश की है oxidative तनाव प्रतिरोध के अन्य तरीकों का उपयोग कर reproducibility की पुष्टि।

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Protocol

अभिकर्मकों के 1. तैयारी

  1. सी के लिए मीडिया की तैयारी (इस मामले में, जंगली प्रकार के जानवरों और flcn -1 (ok975) उत्परिवर्ती पशुओं में) एलिगेंस विकास।
    1. Tris एचसीएल की 5.5 ग्राम, Tris बेस के 2.4 ग्राम, Bactopetone के 31 ग्राम, NaCl के 20 ग्राम और कोलेस्ट्रॉल के 0.08 छ युक्त Youngren के केवल Bacto-peptone (MYOB) शुष्क मिश्रण संशोधित तैयार करते हैं। झटकों के साथ अच्छी तरह से मिलाएं।
      नोट: इस मिश्रण MYOB माध्यम के 10 एल तैयार करने के लिए पर्याप्त है।
      नोट: सामान्य मध्यम विकास (एन जी एम) प्लेटों MYOB प्लेटें 27 के बजाय प्रयोग किया जा सकता है। हालांकि, प्लेटों के एक ही प्रकार उपभेदों के बीच और स्वतंत्र दोहराता के बीच वैध तुलना के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए। इस प्रोटोकॉल में, हम केवल MYOB प्लेटों का इस्तेमाल किया।
    2. MYOB शुष्क मिश्रण की 6 ग्राम, अगर की 17 ग्राम जोड़कर MYOB माध्यम से 1 एल को तैयार है और 122 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट के लिए एच 2 हे और आटोक्लेव के साथ 1 एल अप करने के लिए बनाते हैं। प्लेटों डालो और 2 दिनों के लिए आरटी पर दो सूखी।
    3. बाँझ तकनीक का उपयोग करना, cultu की 100 मिलीलीटर टीका लगानाE के साथ लेग शोरबा माध्यम की पुनः कोलाई OP50 बैक्टीरिया और 37 डिग्री सेल्सियस पर हे / एन बढ़ता है।
    4. ई के साथ बीज MYOB प्लेटों कोलाई OP50 बैक्टीरिया। यह 48 घंटे के लिए आरटी पर विकसित करने के लिए अनुमति दें।
  2. आरएनएआई का उपयोग कर जीन डाउनरेगुलेशन के लिए तैयारी
    1. MYOB आरएनएआई खिला प्लेटें तैयार करें। चरणों 1.1.1 और 1.1.2 के रूप में आगे बढ़ें। वाष्पदावी के बाद, मध्यम के बारे में 55 डिग्री सेल्सियस के लिए शांत हो जाओ और जोड़ने के लिए अनुमति 1 एम isopropyl β-डी-1-thiogalactopyranoside (IPTG) और 100 मिमी एम्पीसिलीन के 1 मिलीलीटर के 1 मिलीलीटर।
    2. स्ट्रीक ई कोलाई HT115 नियंत्रण ईवी या प्लेटों अगर एम्पीसिलीन पर flcn -1 विशिष्ट आरएनएआई (50 माइक्रोग्राम / एमएल) / tetracyclin (15 माइक्रोग्राम / एमएल) या तो व्यक्त करता है जो एक प्लाज्मिड, साथ बदल बैक्टीरिया। 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति ओ / एन आगे बढ़ें।
    3. कालोनियों उठाओ और ई टीका लगाना कोलाई HT115 नियंत्रण ईवी या विशिष्ट आरएनएआई-1 flcn और या तो 37 & # पर लेग / एम्पीसिलीन (50 माइक्रोग्राम / एमएल) के मध्यम और ओ / एन में संस्कृति बढ़ने व्यक्त करता है जो एक प्लाज्मिड के साथ बदल बैक्टीरिया176, सी।
    4. ई के साथ बीज प्लेटें कोलाई HT115 ईवी बैक्टीरिया या HT115 flcn -1 आरएनएआई बैक्टीरिया।
      नोट: उपयोग से पहले आरटी पर प्लेटें 48 घंटा रखें। खिला द्वारा आरएनएआई पछाड़ना प्रभावी में है, तो DS-शाही सेना के 28 के वितरण के अन्य तरीकों का उपयोग करें।
  3. Paraquat (पीक्यू) का उपयोग oxidative तनाव उत्प्रेरण:
    1. पीओ 4 के.एच. 2 का 3 जी के मिश्रण से M9 बफर तैयार करें, ना 2 की 6 ग्राम HPO 4, NaCl के 5 ग्राम और MgSO 4 से 0.25 छ · 7 एच 2 ओ आसुत जल के साथ 1 एल अप करने के लिए ले आओ। आरटी पर 122 डिग्री सेल्सियस और दुकान की बोतलों पर 45 मिनट के लिए आटोक्लेव समाधान।
    2. परख के दिन, M9 / पीक्यू युक्त समाधान तैयार है। (M9 बफर के 4 मिलीलीटर में भंग पीक्यू की .1028 जी के प्रति अच्छी तरह M9 / पीक्यू के 40 μl के साथ एक पूरे 96 अच्छी तरह प्लेटें भर जाता है) इस प्रोटोकॉल के लिए, 100 मिमी पीक्यू का उपयोग करें।
      चेतावनी: पीक्यू एक खतरनाक और अत्यधिक विषाक्त यौगिक है। उचित दिशा निर्देशों के अनुसार संभाल लेना।
      नोट: जब पहली बार एक नया चल रहा हैट्रेन या एक नई शर्त, यह 7-10 घंटे के भीतर जानवरों को मारने के क्रम में उपयोग करने के लिए सबसे अच्छा एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए पीक्यू की सांद्रता बढ़ाने में जीवित रहने की परख करने के लिए सिफारिश की है।

आयु सिंक्रनाइज़ L4 जनसंख्या का 2. तैयारी

  1. ई के साथ वरीयता प्राप्त एक ताजा MYOB थाली पर स्थानांतरण 20 gravid वयस्क hermaphrodites कोलाई OP50 बैक्टीरिया। परख के दौरान जरूरत कीड़े की संख्या के आधार पर कई प्लेटें तैयार करें।
  2. उन्हें 6 घंटा और फिर माताओं को हटाने के लिए एक प्लैटिनम तार कीड़ा लेने का उपयोग करने के लिए अंडे देना करने की अनुमति दें। रखी अंडे की संख्या का आकलन करने के लिए खुर्दबीन के नीचे प्लेटों की जाँच करें।
  3. अंडे पक्षियों के बच्चे और 48 घंटे के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर विकसित करने के लिए अनुमति दें। इस समय, जानवरों के एक देर L4 / युवा वयस्क चरण में हैं। एक ही मंच जानवरों उठाओ और पीक्यू समाधान युक्त कुओं को हस्तांतरण।
    नोट: 48 घंटा ऊष्मायन केवल जंगली प्रकार के पशुओं के लिए इसी तरह के बढ़ने कि म्यूटेंट के लिए लागू होता है, यह विकास पर नजर रखने के लिए महत्वपूर्ण हैहाल में परीक्षण किया म्यूटेंट की दर यह जंगली प्रकार के विकास दर के लिए अन्यथा, अन्य समयसीमा इस्तेमाल किया जाना चाहिए अनुरूप सुनिश्चित करने के लिए।
  4. वैकल्पिक रूप से, तुल्यकालन तकनीक का उपयोग करें। हाइपोक्लोराइट समाधान का उपयोग एल 1 लार्वा कीड़े की सिंक्रनाइज़ जनसंख्या उत्पन्न (25 मिलीलीटर पानी, 5.25% सोडियम हाइपोक्लोराइट के 125 मिलीलीटर, 4 एम NaOH के 50 मिलीलीटर, प्रकाश से अलग करने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी के साथ बोतल लपेट)। तीव्र विरंजन परख के दौरान जानवरों के व्यवहार को प्रभावित कर सकता है के बाद से हालांकि, इस परख के लिए, यह अनुशंसित नहीं है।
    चेतावनी: दिशा निर्देशों के अनुसार हाइपोक्लोराइट समाधान संभाल लेना।
    नोट: नीचे, ब्याज की जीन को विनियमित विशिष्ट आरएनएआई बैक्टीरिया के साथ वरीयता प्राप्त आरएनएआई प्लेटों के लिए माताओं के हस्तांतरण के अपवाद के साथ, धारा 2 में वर्णित के रूप में hermaphrodites सिंक्रनाइज़ करने के लिए आरएनएआई का उपयोग करते समय। आरएनएआई साथ पछाड़ना कमजोर है, कई पीढ़ियों के लिए खिला की सिफारिश की है।

3. oxidative तनाव प्रतिरोध परख <प्रदर्शन/ P>

  1. पिपेट एक 96 अच्छी तरह से थाली की हर अच्छी तरह से करने के लिए (नए सिरे से तैयार) 100 मिमी पीक्यू समाधान के 40 μl। हर हालत (उपचार, उत्परिवर्ती, आदि) की प्रतिकृति के रूप में कम से कम 12 कुओं का प्रयोग करें। एक प्लैटिनम तार कीड़ा लेने का उपयोग करना, हर अच्छी तरह से प्रारंभ समय और समाप्ति समय का संकेत करने के लिए 5-8 L4 लार्वा जानवरों हस्तांतरण।
  2. एक और शर्त शुरू, प्रारंभ समय और समाप्ति समय ध्यान दें। प्रारंभ समय से एक घंटे बाद मरे हुए जानवरों के कीड़े के हस्तांतरण और स्कोरिंग के बीच ऊष्मायन समय में 20 डिग्री सेल्सियस पर थाली रखें।
  3. विदारक माइक्रोस्कोप का उपयोग, अस्तित्व हर घंटा गिनती। धीरे गिनती करने के लिए शुरू करने से पहले थाली हिला। मरे हुए जानवरों के रूप में, यहां तक ​​कि एक उच्च तीव्रता प्रकाश खोलना के बाद, कदम नहीं है कि कीड़े इंगित करें। इसके अलावा जीवित जानवरों की संख्या से संकेत मिलता है।
    नोट: उच्च वृद्धि पर कीड़ा आकार, पूंछ और सिर आंदोलन को देखते हुए, जिंदा से मृत कीड़े निर्धारित करने में मदद।
  4. सबसे कीड़े मर रहे हैं जब तक इस चरण को हर घंटे दोहराएँ।
<पी वर्ग = "jove_title"> 4। हर समय बिंदु पर जीवन रक्षा प्रतिशत का निर्धारण

  1. अच्छी तरह से हर को हस्तांतरित जानवरों की कुल संख्या जोड़कर हालत प्रति जानवरों की कुल संख्या की गणना। क्षतिग्रस्त अथवा स्थानांतरण के बाद मारे गए हैं कि जानवरों पर ध्यान न दें।
  2. हर समय बिंदु के लिए, (12 कुओं में मरे हुए जानवरों का योग) हालत प्रति मरे हुए जानवरों की कुल संख्या की गणना। हर समय बिंदु के लिए, और अस्तित्व (100 शून्य प्रतिशत मृत्यु) का प्रतिशत (मरे हुए जानवरों 100 से जानवरों की कुल संख्या से विभाजित है और गुणा की संख्या) की मौत के प्रतिशत की गणना।
  3. इस परख कम से कम 3 स्वतंत्र बार दोहराएँ।

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Representative Results

मुकाबले जंगली प्रकार सी एलिगेंस flcn -1 (ok975) उत्परिवर्ती जानवरों

यहाँ हम जंगली प्रकार सी के विरोध को निर्धारित करने के लिए 100 मिमी पीक्यू इस्तेमाल किया oxidative तनाव, गर्मी, और अनॉक्सिता 23 का विरोध करने के लिए दिखाया गया है जो flcn -1 (ok975) की तुलना में एलिगेंस जानवरों। इलाज के 4 घंटा, जंगली प्रकार की 48.3% के बाद बच के रूप में flcn -1 (ok975) पशुओं में 77.8% अस्तित्व की तुलना में। जैसी कि उम्मीद थी, flcn -1 (ok975) उत्परिवर्ती जानवरों जंगली प्रकार (चित्रा 2 और 1 टेबल) की तुलना में 100 मिमी पीक्यू के लिए प्रतिरोधी थे।

नियंत्रण ईवी से तंग आ चुके हैं या flcn -1 आरएनएआई बैक्टीरिया जंगली प्रकार के जानवरों की तुलना

का उपयोग कर आरएनएआई 100 मिमी पीक्यू के लिए प्रतिरोध वृद्धि हुई flcn-1 के नियमन के नीचे पिछले अनुभाग में प्रस्तुत परिणाम के समान। इस परिणाम आरएनएआई mimics के नुकसान के समारोह मीटर का उपयोग जीन समारोह की कि नीचे विनियमन दर्शाता utation (चित्रा 2 और 1 टेबल)।

चित्र 1
सी में 96 अच्छी तरह से प्लेट में oxidative तनाव प्रतिरोध दृढ़ संकल्प की विधि चित्रा 1. योजनाबद्ध आंकड़ा एलिगेंस।

MYOB प्लेटों पर वृद्धि हुई है और ई कोलाई OP50 बैक्टीरिया से तंग आ चुके सिंक्रनाइज़ L4 / युवा वयस्क जानवरों 100 मिमी पीक्यू युक्त एक 96 अच्छी तरह से microtiter प्लेट के कुओं के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं और कीड़े की एक बड़ी संख्या में मर रहे हैं जब तक जीवित रहने की प्रति घंटा मापा जाता है। आरएनएआई knockdowns के मामले में, एक ही प्रक्रिया सिंक्रनाइज़ जानवरों IPTG के साथ पूरक प्लेटों पर बड़े हो रहे हैं, सिवाय इसके कि पीछा किया जाता है, और ई के साथ तंग आ चुके हैं अभिव्यक्ति पर लक्ष्य जीन पछाड़ना होगा कि प्लाज्मिड को शरण देने कोलाई बैक्टीरिया HT115।

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सी में oxidative तनाव को FLCN -1 बढ़ जाती है प्रतिरोध की चित्रा 2. घटाने एलिगेंस। - जानवर नियंत्रण के साथ इलाज या flcn -1 आरएनएआई WT के 100 मिमी पीक्यू (ए) WT और flcn -1 (ok975) उत्परिवर्ती जानवरों और (ख) से (ए बी) प्रतिशत अस्तित्व।

प्रतिशत अस्तित्व 100 मिमी पीक्यू के लिए
1 घंटे तनाव, आरएनएआई प्रतिशत जीवन रक्षा (एसडी ±) पी मूल्य प्रयोगों की संख्या कीड़े की कुल संख्या
WT 82.38 ± 1.31 0.0002 3 210
flcn -1 (ok975) 99.03 ± 1.67 3 224
WT; नियंत्रण 91.70 ± 0.55 0.0462 3 202
WT; flcn -1 (आरएनएआई) 95.93 ± 2.48 3 207
2 घंटा तनाव, आरएनएआई प्रतिशत जीवन रक्षा (एसडी ±) पी मूल्य प्रयोगों की संख्या कीड़े की कुल संख्या
WT 72.13 ± 7.13 0.005 3 210
flcn -1 (ok975) 96.33 ± 2.28 3 224
WT; नियंत्रण 80.27 ± 5.34 0.0261 3 202
WT; flcn -1 (आरएनएआई) 91.23 ± 1.42 3 207
3 घंटा तनाव, आरएनएआई प्रतिशत जीवन रक्षा (एसडी ±) पी मूल्य प्रयोगों की संख्या कीड़े की कुल संख्या
WT 55.37 ± 4.72 0.0004 3 210
flcn -1 (ok975) 87.00 ± 1.36 3 224
WT; नियंत्रण 70.77 ± 3.50 0.0027 3 202
WT; flcn -1 (आरएनएआई) 87.63 ± 2.67 3 207
4 घंटा तनाव, आरएनएआई प्रतिशत जीवन रक्षा (एसडी ±) पी मूल्य प्रयोगों की संख्या कीड़े की कुल संख्या
WT 48.30 ± 6.39 0.002 3 210
flcn -1 (ok975) 77.80 ± 3.12 3 224
WT; नियंत्रण 63.77 ± 0.66 0.0122 3 202
WT; flcn -1 (आरएनएआई) 80.57 ± 6.68 3 207
5 घंटा तनाव, आरएनएआई प्रतिशत जीवन रक्षा (एसडी ±) पी मूल्य प्रयोगों की संख्या कीड़े की कुल संख्या
WT 41.60 ± 8.33 0.0062 3
flcn -1 (ok975) 67.43 ± 1.42 3 224
WT; नियंत्रण 60.53 ± 2.58 0.0313 3 202
WT; flcn -1 (आरएनएआई) 71.53 ± 5.24 3 207
6 घंटा तनाव, आरएनएआई प्रतिशत जीवन रक्षा (एसडी ±) पी मूल्य प्रयोगों की संख्या कीड़े की कुल संख्या
WT 34.86 ± 5.88 0.0021 3 210
flcn -1 (ok975) 60.34 ± 2.05 3 224
WT; नियंत्रण 44.43 ± 3.93 0.0042 3 202
WT; flcn -1 (आरएनएआई) 62.13 ± 3.44 3 207

परिणाम और चित्रा 2 से ऑक्सीडेटिव तनाव प्रतिरोध का सांख्यिकीय विश्लेषण की तालिका 1. सारांश।

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Discussion

सी.एलेगन्स यह आसानी से संवर्धित किया जा सकता है के बाद से vivo में आनुवंशिक रूप से ऑक्सीडेटिव तनाव प्रतिरोध का अध्ययन करने के लिए एक आकर्षक मॉडल जीव है, और तेजी से आनुवंशिक रूप से समान संतानों की एक बड़ी संख्या को जाता है। Oxidative तनाव प्रतिरोध को मापने के लिए कई तरीकों पहले से वर्णित किया गया है और वे इस तरह पीक्यू, rotenone, एच 2 ओ 2, और juglone 25,26,29-32 के रूप में विभिन्न आरओएस स्रोतों के साथ संस्कृति प्लेटों की पूरकता पर आधारित हैं। यहाँ हम 100 मिमी पीक्यू का उपयोग कर 96 अच्छी तरह से प्लेट में में तरल ऑक्सीडेटिव तनाव प्रतिरोध उपाय है कि एक प्रोटोकॉल का वर्णन। इसी तरह की परख ग्रीर एट अल। 33 के द्वारा प्रदर्शन किया गया है। यह परख आगे अन्य आरओएस स्रोतों का उपयोग तरल में oxidative तनाव का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, हम के रूप में अच्छी तरह से 23 कई एच 2 ओ 2 सांद्रता के लिए flcn -1 बढ़ जाती है प्रतिरोध की है कि नुकसान दिखाया है।

यह परख तकनीकी हो सकता हैly की गतिशीलता दोष या प्रदर्शित करने वाले कुछ उपभेदों के लिए चुनौतीपूर्ण ऐसे डोपामिन ट्रांसपोर्टर DAT-1 34 में एक उत्परिवर्तन ले उपभेदों के रूप में पक्षाघात phenotypes के स्विमिंग प्रेरित किया। इस मामले में, ले जाने के लिए असमर्थता यह जरूरी ऑक्सीडेटिव तनाव प्रतिरोध बल्कि एक गतिशीलता दोष में कमी आई मतलब यह नहीं है के बाद से भ्रामक है। इसके अलावा, मरे हुए जानवरों की गिनती ध्यान से पूरा किया और शोधकर्ताओं सी की ओर ध्यान देने के लिए किया जाना चाहिए ऐसे पूंछ आंदोलनों, और सिर आंदोलनों, या यहां तक कि धीमी गति से शरीर की गतिविधियों के रूप में एलिगेंस व्यवहार विवरण। पीक्यू एकाग्रता बहुत अधिक है, और जानवरों की मौत कैनेटीक्स बहुत तेजी से होता है, तो एक धीमी मौत दर प्राप्त करने के क्रम में पीक्यू की एकाग्रता को कम करने पर विचार हो सकता है। दूसरों को ऐसे DAF-2 उत्परिवर्ती पशुओं 37 के रूप में अत्यधिक प्रतिरोधी रहे हैं, जबकि कुछ जानवरों ऐसी AAK-2 उत्परिवर्ती पशुओं 26,33,35,36 के रूप में oxidative तनाव के प्रति बेहद संवेदनशील हैं। इस मामले में, विभिन्न सह के साथ जीवित रहने की परख करने की क्रियापीक्यू की ncentrations विचार किया जाना चाहिए।

आरएनएआई प्रयोगों के लिए, नकारात्मक परिणाम आरएनएआई उपचार का एक अक्षमता की वजह से हो सकता है। इस मामले में, mRNA स्तर की माप पछाड़ना जीन सफल होता है या नहीं यह निर्धारित करने के लिए आवश्यक है।

इस प्रोटोकॉल के आगे सी की तैराकी व्यवहार पटरियों एक डिटेक्टर का उपयोग oxidative तनाव प्रतिरोध की उच्च throughput प्रदर्शन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है तरल 38,39 में एलिगेंस। इस संभावित सी के धीरज की निगरानी के लिए सक्षम होगा एलिगेंस और oxidative तनाव के तहत झुकने शरीर की आवृत्ति के रूप में इस तरह के स्विमिंग व्यवहार। शरीर आंदोलन की उच्च दर तनाव के तहत उच्च कीड़ा फिटनेस का संकेत मिलता है।

कम यूकेरियोट्स में तनाव प्रतिरोध ऑक्सीडेटिव कि नेतृत्व करने के रास्ते अत्यधिक विकास भर में संरक्षित कर रहे हैं और oxidative तनाव से जुड़े रोगों और मानव में उम्र बढ़ने से जुड़ी हैं। Mitohormesis और संतुलित GENERATIOआरओएस के एन उम्र बढ़ाने और स्वास्थ्य अवधि को बेहतर बनाने के लिए आवश्यक हैं। हालांकि, अत्यधिक आरओएस कोशिकाओं, ऊतकों / अंगों, और जीवों के लिए बेहद हानिकारक है। बदल दिया है, तो एक इष्टतम आरओएस संतुलन प्रदान करते हैं, कि रास्ते ढूँढना इस प्रकार आवश्यक है और oxidative तनाव के लिए प्रतिरोध मिलाना है कि दवाओं के लिए स्क्रीन आम विभाजक के साथ कई रोगों के लिए इलाज के विकास में मदद कर सकते हैं: ऑक्सीडेटिव तनाव। सी में इन चोकर प्रदर्शन एलिगेंस समझ और oxidative तनाव से जुड़ा हुआ मानव रोगों के उपचार के लिए महान क्षमता और मूल्य है कि एक लाभप्रद है, तेजी से सस्ती और विश्वसनीय तरीका है।

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Acknowledgments

हम सी के लिए Caenorhabditis जेनेटिक्स केंद्र स्वीकार करते हैं एलिगेंस उपभेदों। धन का समर्थन टेरी फॉक्स अनुसंधान संस्थान द्वारा प्रदान किया गया। हम यह भी Rolande और मार्सेल Gosselin ग्रेजुएट छात्रवृत्ति और मैकगिल एकीकृत कैंसर रिसर्च ट्रेनिंग प्रोग्राम के कैंसर रिसर्च FRN53888 में CIHR / FRSQ प्रशिक्षण अनुदान से ईपी के लिए दी समर्थन स्वीकार करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar bacteriological grade Multicell 800-010-LG
Bacteriological peptone Oxoid LP0037
Sodium chloride biotechnology grade Bioshop 7647-14-5
Cholesterol Sigma C8503-25G
UltraPure tris hydrochloride Invitrogen 15506-017
Tris aminomethane Bio Basic Canada Inc 77-86-1
IPTG Santa Cruz Biotechnology sc-202185A
Ampicillin Bioshop 69-52-3
Yeast extract Bio Basic Inc. 8013-01-2
Methyl viologen dichloride hydrate Aldrich chemistry 856177-1G
Petri dish 60 x15 mm Fisher FB0875713A
Pipet 10 ml Fisher 1367520
Potassium phosphate monobasic G-Biosciences RC-084
Magnesium sulfate heptahydrate Sigma M-5921
Sodium phosphate dibasic Bioshop 7558-79-4
Discovery v8 stereo zeiss microscope
96 well clear microtiter plate
flcn-1 RNAi source Ahringer Library

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सेलुलर जीवविज्ञान अंक 99 ऑक्सीडेटिव तनाव Paraquat, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों जीवधारी मौत पशु मॉडल निमेटोड
के oxidative तनाव प्रतिरोध को मापने<em&gt; Caenorhabditis एलिगेंस</em&gt; 96 अच्छी तरह से microtiter प्लेट्स में
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Possik, E., Pause, A. Measuring… More

Possik, E., Pause, A. Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates. J. Vis. Exp. (99), e52746, doi:10.3791/52746 (2015).

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