Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

מדידת התנגדות סטרס חמצוני של Published: May 9, 2015 doi: 10.3791/52746
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Goodman Cancer Research Center, McGill University, 2Department of Biochemistry, McGill University

Abstract

סטרס חמצונים, אשר הוא התוצאה של חוסר איזון בין ייצור וסילוק רעלים של מיני חמצן מגיבים, הוא תורם עיקרי להפרעות אנושיות כרוניות, כוללים לב וכלי דם ומחלות ניווניות, סוכרת, הזדקנות וסרטן. לכן, חשוב ללמוד סטרס חמצונים לא רק במערכות תא אלא גם באמצעות כל האורגניזמים. ג elegans הוא אורגניזם מודל אטרקטיבי ללמוד את הגנטיקה של מסלולי חמצוני אות מתח התמרה, אשר השמורים ביותר מבחינה אבולוציונית.

כאן, אנו מספקים פרוטוקול למדידת התנגדות סטרס חמצונים בג elegans בנוזל. ריאגנטים לזמן קצר, ROS-התרמה כגון paraquat (PQ) ו- H 2 O 2 מומסים במאגר M9, ופתרונות aliquoted בבארות של צלחת microtiter 96 גם. L4 המסונכרן / מבוגרים צעירים ג בעלי החיים elegans מועברים לבארות (5-8 בעלי חיים / טוב) והישרדות נמדדתבכל שעה עד שרוב התולעים מתים. בעת ביצוע assay התנגדות סטרס חמצונים באמצעות ריכוז נמוך של לחץ בצלחות, הזדקנות עשויה להשפיע על התנהגותם של בעלי חיים על סטרס חמצונים, אשר עלול להוביל לפרשנות שגויה של הנתונים. עם זאת, בassay תאר במסמך זה, בעיה זה לא סביר שיתרחש שכן רק בעלי חיים מבוגרים צעירים L4 / נמצאים בשימוש. יתר על כן, פרוטוקול זה הוא זול ותוצאות מתקבלות ביום אחד, אשר הופך את הטכניקה הזאת אטרקטיבית למסכים גנטיים. בסך הכל, זה יעזור להבין מסלולי העברת אותות עקה חמצונית, שיכול להיות מתורגם לאפיון טוב יותר של הפרעות אנושיות הקשורים סטרס חמצונים.

Introduction

באאוקריוטים, זרחון חמצוני מתרחשים בשרשרת הובלת אלקטרונים של המיטוכונדריה הוא הנהג העיקרי של ייצור אנרגיה בצורה של ה- ATP. מיני חמצן מגיבים (ROS) הם תוצר לוואי טבעי של תהליך זה. למרות תפקידם החשוב כמולקולות איתות, ROS מוגזם יכול לגרום לנזק לדנ"א, carbonylation חלבון, וחמצון שומנים בדם. חוסר איזון בין ייצור וסילוק הרעלים ROS גורם ללחץ חמצוני, מה שמוביל לדלדול אנרגיה, נזק לתאים, וגורם לתא מוות 1,2. סטרס חמצונים תורמים להזדקנות וההתפתחות של מחלות מסכנות חיים רבות, כולל סרטן, סוכרת, לב וכלי דם ומחלות ניווניות 3-9.

תאים התפתחו אסטרטגיות הגנה האנזימטית ואינם אנזימטית כדי לשמור על רמות ROS נכונים ולהגן על בוחריהם מפני נזק חמצוני 1,2. סופראוקסיד דיסמוטאז אנזימים (SOD) לפעול ראשון לconveסופראוקסיד RT לH 2 O 2, אשר מאוחר יותר הופך למים על ידי catalase או אנזימי peroxidase. אסטרטגיות הגנה האנזימטית ללא כוללות בעיקר מולקולות המגיבות מהר יותר עם ROS בהשוואה למקרו-מולקולות תאיות, הגנה על מרכיבים תאיים חיוניים. למרות התפקיד המגן של ROS הטיהור אנזימים, כמה מולקולות ROS לברוח מנגנוני הגנה נוגדי חמצון ולגרום לנזק חמצוני. איתור, תיקון, והשפלה של המרכיבים התאיים הפגומים אסטרטגיות הגנה חיוניות בסטרס החמצונים 1,2.

מסלולי איתות מעורבים בהתנגדות ללחץ ומתח במיוחד חמצוני הם מאוד שמורים באבולוציה 10,11. בניגוד לניסויי תא תרבות שבה תנאי האורגניזם הם בתמונות באופן חלקי בלבד, המחקר של סטרס חמצונים באורגניזמים מודל 12,13 יש משמעות רבה. ג elegans הוא נמטודות חיים חופשיים שיכול להיות בקלות ובזול רחוב ללאשניחן בדשא חיידקים על תקשורת אגר. הוא קטן בגודלם (כ 1 מ"מ אורך) ובדרך כלל גדל כאנדרוגינוס דישון עצמי, המאפשר מניפולציות גנטיות. יש לה מחזור חיים מהיר ויכולת רבייה גבוהה, הפקה כ -300 צאצאים לדור, מה שהופך אותו לכלי רב עוצמה כדי לבצע מסכי גנטיים בקנה מידה גדולה 14. ג הגנום elegans הוא רצף באופן מלא ו40-50% מהגנים הם חזו להיות homologues של גנים הקשורים למחלות אנושיים 15-18. מציאה של גנים של עניין באמצעות RNAi היא מהירה וקל בג elegans. ג'ין את הרגולציה יכול להיות מושגת על ידי האכלת בעלי החיים א חיידקי coli כי נמל פלסמיד המבטא את RNA פעמיים תקועים שמכוון את ה- mRNA של עניין 19. לכן, קביעת תפקוד גן באמצעות מסכי RNAi בקנה מידה גדולה יש השפעה רבה על הבנת מחלות בבני אדם, כולל סרטן 20,21.

מחקרים של oהתנגדות מתח xidative בג elegans הוביל לזיהוי של מנגנוני שימור של התנגדות ללחץ חמצוני 13,22. כמה מסלולים המזוהים הם מסלולים נפוצים שלווסת אריכות ימים והתנגדות ללחצים אחרים, כמו גם כמו היפוקסיה, חום, ולחץ האוסמוטי. מסלולים אלה כוללים את איתות האינסולין, איתות TOR, וautophagy. מסלולים מרכזיים אחרים כרוכים סילוק רעלים של ROS כגון אנזימי סופראוקסיד דיסמוטאז ואנזימי catalase, או בתיקון נזק כגון חלבוני הלם חום ומלווה 11,13,22.

פרוטוקול זה מתאר כיצד לקבוע את ההתנגדות ללחץ חמצוני של ג elegans בנוזל. השתמשנו flcn-1 (ok975) וחיות בר-סוג להפגין הפרוטוקול מאז שהראינו בעבר התנגדות מוגברת ללחץ חמצוני על אובדן flcn-1 (ok975) בג elegans 23. יש לנו גם הראה כי התנגדות מוגברת זה תלויהעל AMPK וautophagy, ציר איתות שמשפר bioenergetics הסלולרי ומקדם התנגדות מתח 23. PQ הוא לחץ חמצוני שמפריע לשרשרת הובלת אלקטרונים כדי לייצר מיני חמצן מגיב 24. אותו assay יכול להיות מותאם ומקורות ROS אחרים או תרכובות יצירת ROS יכולים לשמש כגון H 2 O 2 וrotenone. מבחני דומים פותחו על צלחות שבו ריכוזים נמוכים של PQ משמשים 25,26. היתרון של assay זה הוא שזה מאוד מהר, ויכול להיות שהושגו התוצאות ביום אחד. בנוסף, ההיקף הכולל של נוזל המשמש לביצוע assay התנגדות סטרס החמצונים ב 96 צלחות גם הוא נמוך בהשוואה לנפח המשמש להכנת לוחות PQ המכיל. לפיכך, הסכום של PQ משמש הוא בassay הנוזלי הוא נמוך, שהופך את assay זול ומגביל את הייצור של פסולת רעילה. עם זאת, מגבלות של assay זה בהשוואה למבחני צלחת כוללות להck של מזון בassay הנוזלי והריכוז הנמוך של חמצן בנוזל בהשוואה לאוויר. אלה הם גורמים חשובים שבמקרים מסוימים, עלול להשפיע על התוצאות. לכן, המאשר שחזור תוך שימוש בשיטות אחרות של התנגדות ללחץ חמצוני מומלץ לתמוך תוצאות שהתקבלו בassay זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת ריאגנטים

  1. הכנת מדיה לג צמיחת elegans (במקרה זה, חיות בר-סוג ובעלי חיים flcn-1 (ok975) מוטציה).
    1. כן השתנה Bacto-peptone בלבד (MYOB) התערובת היבשה של Youngren המכילה 5.5 גרם של טריס HCl, 2.4 גרם של בסיס טריס, 31 גרם של Bactopetone, 20 גרם של NaCl ו0.08 גרם של כולסטרול. מערבבים היטב עם רעד.
      הערה: תערובת זו מספיקה כדי להכין 10 ליטר של מדיום MYOB.
      הערה: ניתן להשתמש בצלחות רגילה מדיום גידול (NGM) במקום צלחות MYOB 27. עם זאת, אותו הסוג של צלחות יש להשתמש להשוואות תקפות בין זנים ובין חזרות עצמאיות. בפרוטוקול זה, השתמשנו רק צלחות MYOB.
    2. הכן 1 ליטר של מדיום MYOB ידי הוספת 6 גרם של תערובת יבשה MYOB, 17 גרם של אגר ולעשות עד 1 ליטר עם H 2 O וחיטוי במשך 45 דקות ב 122 מעלות צלזיוס. יוצקים צלחות ולתת יבשים ב RT עבור 2 ימים.
    3. באמצעות טכניקה סטרילית, לחסן של cultu 100 מיליליטרמחדש של מדיום מרק LB עם E. חיידקים וcoli OP50 לגדול O / N על 37 מעלות צלזיוס.
    4. צלחות MYOB הזרע עם א חיידקי coli OP50. מאפשר לו לגדול ב RT במשך 48 שעות.
  2. הכנה לdownregulation גן באמצעות RNAi
    1. הכן צלחות RNAi האכלת MYOB. המשך כמו בשלבים 1.1.1 ו1.1.2. לאחר מעוקר, תאפשר הבינוני להתקרר לכ -55 מעלות צלזיוס ולהוסיף 1 מיליליטר של 1 β-D-1-thiogalactopyranoside M איזופרופיל (IPTG) ו 1 מיליליטר של 100 מ"מ אמפיצילין.
    2. פס ה coli HT115 חיידקים הפכו עם פלסמיד, שמבטא גם EV שליטה או RNAi flcn-1 ספציפי על אמפיצילין (50 מיקרוגרם / מיליליטר) / tetracyclin (15 מיקרוגרם / מיליליטר) אגר צלחות. לגדול תרבות O / N על 37 מעלות צלזיוס.
    3. פיק מושבות ולחסן E. coli HT115 חיידקים הפכו עם פלסמיד המבטא גם EV השליטה או flcn-1 RNAi הספציפי ולגדול תרבות במדיום LB / אמפיצילין (50 מיקרוגרם / מיליליטר) וO / N ב 37 & #176; C.
    4. צלחות זרע עם א coli HT115 EV חיידקים או חיידקי RNAi HT115 flcn-1.
      הערה: שמור צלחות 48 שעות בRT לפני השימוש. אם RNAi מציאה על ידי האכלה היא בתוקף, להשתמש בשיטות אחרות של משלוח של DS-רנ"א 28.
  3. גרימת סטרס חמצונים באמצעות paraquat (PQ):
    1. הכן חיץ M9 ידי ערבוב 3 גרם של KH 2 PO 4, 6 גרם של Na 2 HPO 4, 5 גרם של NaCl ו0.25 גרם של MgSO 4 · 7 H 2 O. להביא עד 1 ליטר עם מים מזוקקים. פתרון החיטוי במשך 45 דקות ב 122 מעלות צלזיוס בקבוקים ולאחסן ב RT.
    2. ביום של assay, להכין את פתרון M9 / PQ המכיל. לפרוטוקול זה, השתמש 100 מ"מ PQ (.1028 גרם של PQ המומס ב 4 מיליליטר של חיץ M9 ממלא צלחות גם כל 96 עם 40 μl של M9 / PQ בכל טוב).
      זהירות: PQ הוא תרכובת מסוכנת ורעילה ביותר. ידית על פי הנחיות מתאימות.
      הערה: בעת הפעלה של חדש הראשונהרכבת או מצב חדש, מומלץ assay הישרדות בהגדלת ריכוזים של PQ כדי לקבוע את הריכוז הטוב ביותר להשתמש כדי להרוג חיות בתוך 7-10 שעות.

2. הכנת אוכלוסיית L4 מסונכרנת-גיל

  1. העברה 20 הרמפרודיטים מבוגרים הרה להולדת לצלחת MYOB טרי זורעים עם E. חיידקי coli OP50. הכן כמה צלחות המבוססות על המספר של תולעי צורך במהלך assay.
  2. לאפשר להם להטיל ביצים במשך שעה 6 ולאחר מכן באמצעות תולעת חוט פלטינה לאסוף להסיר את האמהות. בדוק את הצלחות תחת מיקרוסקופ כדי להעריך את מספר הביצים שהוטלו.
  3. לאפשר הביצים לבקוע ולגדול ב 20 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות. בשלב זה, בעלי החיים נמצאים ב/ שלב בוגר מאוחר L4 צעיר. פיק אותו שלב חיות ולהעביר לבארות המכיל פתרון PQ.
    הערה: מאחר 48 הדגירה שעה חלה רק על מוטציות שגדלות באופן דומה לחיות בר-סוג, חשוב לפקח התפתחותיתשיעור מוטציות שנבדקו חדש כדי להבטיח שהיא עומדת בקצב הפיתוח בר-הסוג, אחרת, יש להשתמש בצירה זמן אחר.
  4. לחלופין, להשתמש בטכניקות סנכרון. צור אוכלוסייה מסונכרנת של תולעי זחלי L1 באמצעות פתרון hypochlorite (25 מיליליטר מים, 125 מיליליטר של 5.25% נתרן היפוכלוריט, 50 מיליליטר של 4 M NaOH; לעטוף בקבוק בנייר אלומיניום כדי לבודד מהאור). עם זאת, עבור assay זה, זה אינו מומלץ, שכן הלבנה אינטנסיבית עשויה להשפיע על התנהגותם של בעלי החיים במהלך assay.
    זהירות: טפל בפתרון hypochlorite על פי הנחיות.
    הערה: בעת שימוש RNAi להסדיר את הגן של עניין, לסנכרן את הרמפרודיטים כפי שתואר בסעיף 2, למעט העברת האמהות לצלחות RNAi זרע עם חיידקי RNAi הספציפיים. כאשר מציאה עם RNAi היא חלשה, האכלה למספר דורות מומלצת.

3. ביצוע סטרס חמצוני ההתנגדות Assay </ P>

  1. פיפטה 40 μl של פתרון 100 מ"מ PQ (מוכנים טרי) לכל גם צלחת 96 היטב. השתמש לפחות 12 בארות כמשכפל של כל תנאי (טיפול, מוטציה, וכו '). באמצעות איסוף תולעת חוט פלטינה, להעביר 5-8 חיות זחלי L4 לכל המציינים את שעת ההתחלה ושעת הסיום היטב.
  2. כאשר מתחיל מצב אחר, שים לב לשעת ההתחלה ושעת הסיום. מניחים את הצלחת על 20 מעלות צלזיוס בזמן הדגירה בין העברת התולעים ובקיע חיות מתות כעבור שעה מרגע ההתחלה.
  3. באמצעות מיקרוסקופ לנתח, לספור הישרדות כל שעה. נער בעדינות את הצלחת לפני שמתחיל לספור. מצביע תולעים שלא זזו, אפילו אחרי שהבחין באור בעוצמה גבוהה, כמו חיות מתות. כמו כן לציין את מספר בעלי החיים בחיים.
    הערה: כאשר מסתכלים על צורת תולעת, זנבות ותנועת הראש בהגדלה גבוהה, לעזור לקבוע תולעים מתים מחיים.
  4. חזור על פעולה זו בכל שעה עד שרוב התולעים מתים.
<class = "jove_title" p> 4. קביעת אחוז הישרדות בכל זמן נקודה

  1. לחשב את המספר הכולל של בעלי חיים לכל מצב על ידי הוספת המספר הכולל של בעלי חיים הועברו לכל גם. להתעלם מבעלי החיים שנפגעו או נהרגו על העברה.
  2. עבור כל נקודת זמן, לחשב את המספר הכולל של חיות מתות לכל מצב (סכום של חיות מתות בבארות 12). עבור כל נקודת זמן, לחשב את האחוז של מוות (מספר חיות מתות מחולקות במספר כולל של בעלי חיים וכפולים 100) ואחוז ההישרדות (100 מינוס מות אחוזים).
  3. חזור assay זה לפחות 3 פעמים עצמאיות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

השוואת wild-type ג elegans לflcn-1 (ok975) בעלי חיים מוטציה

כאן אנו משמשים 100 מ"מ PQ כדי לקבוע את ההתנגדות של ג wild-type elegans בעלי חיים בהשוואה לflcn-1 (ok975) אשר הוכח להתנגד סטרס חמצונים, חום, ואנוקסיה 23. לאחר 4 שעות של טיפול, 48.3% מברים-סוג שרד לעומת 77.8% הישרדות בflcn 1-חיות (ok975). כצפוי, flcn-1 (ok975) בעלי החיים מוטציה היו עמידים יותר בפני 100 מ"מ PQ בהשוואה לפרא-סוג (איור 2 ולוח 1).

השוואת חיות בר-סוג נמאס עם EV שליטה או flcn-1 חיידקי RNAi

דומה לתוצאות שהוצגו בסעיף הקודם, את הרגולציה של flcn-1 RNAi באמצעות הגדיל את ההתנגדות 100 מ"מ PQ. תוצאה זו מוכיחה כי את רגולציה של תפקוד גן באמצעות מחקה RNAi פסד של פונקציה מ ' utation (איור 2 ולוח 1).

איור 1
איור 1. איור סכמטי של השיטה של קביעת התנגדות ללחץ חמצוני ב 96 צלחות גם בג elegans.

/ בעלי חיים מסונכרנים L4 צעירים מבוגרים גדלו על צלחות MYOB והאכילו עם OP50 חיידקי החיידק מועברים לבארות של צלחת microtiter 96 היטב המכילה 100 מ"מ PQ והישרדות נמדדת לפי שעה עד מספר גדול של תולעים מתים. במקרה של knockdowns RNAi, באותו ההליך ואחריו פרט לכך שבעלי החיים המסונכרנים גדלים על צלחות בתוספת IPTG, וניזונים עם E. חיידקי coli HT115 מחסה פלסמיד שמציאת גן המטרה על ביטוי.

קבצים / ftp_upload / 52746 / 52746fig2.jpg "/>
הפסד איור 2. התנגדות FLCN-1 עולה לסטרס החמצונים בג elegans. (- B) הישרדות אחוזים עד 100 מ"מ PQ של () WT וflcn-1 (ok975) בעלי חיים ומוטציה (ב) WT בעלי החיים שטופלו בשליטה או flcn-1 RNAi.

הישרדות אחוזים עד 100 מ"מ PQ
שעה 1 מתח, RNAi אחוזים הישרדות (± סטיית תקן) P ערך מספר הניסויים מספר כולל של תולעים
WT 82.38 ± 1.31 0.0002 3 210
flcn-1 (ok975) 99.03 ± 1.67 3 224
WT; שליטה 91.70 ± 0.55 .0462 3 202
WT; flcn-1 (RNAi) 95.93 ± 2.48 3 207
2 שעות מתח, RNAi אחוזים הישרדות (± סטיית תקן) P ערך מספר הניסויים מספר כולל של תולעים
WT 72.13 ± 7.13 0.005 3 210
flcn-1 (ok975) 96.33 ± 2.28 3 224
WT; שליטה -80.27 ± 5.34 .0261 3 202
WT; flcn-1 (RNAi) 91.23 ± 1.42 3 207
3 שעות מתח, RNAi אחוזים הישרדות (± סטיית תקן) P ערך מספר הניסויים מספר כולל של תולעים
WT 55.37 ± 4.72 0.0004 3 210
flcn-1 (ok975) 87.00 ± 1.36 3 224
WT; שליטה 70.77 ± 3.50 0.0027 3 202
WT; flcn-1 (RNAi) 87.63 ± 2.67 3 207
4 שעות מתח, RNAi אחוזים הישרדות (± סטיית תקן) P ערך מספר הניסויים מספר כולל של תולעים
WT 48.30 ± 6.39 0.002 3 210
flcn-1 (ok975) 77.80 ± 3.12 3 224
WT; שליטה 63.77 ± 0.66 .0122 3 202
WT; flcn-1 (RNAi) -80.57 ± 6.68 3 207
5 שעות מתח, RNAi אחוזים הישרדות (± סטיית תקן) P ערך מספר הניסויים מספר כולל של תולעים
WT 41.60 ± 8.33 .0062 3
flcn-1 (ok975) 67.43 ± 1.42 3 224
WT; שליטה 60.53 ± 2.58 .0313 3 202
WT; flcn-1 (RNAi) 71.53 ± 5.24 3 207
6 שעות מתח, RNAi אחוזים הישרדות (± סטיית תקן) P ערך מספר הניסויים מספר כולל של תולעים
WT 34.86 ± 5.88 .0021 3 210
flcn-1 (ok975) 60.34 ± 2.05 3 224
WT; שליטה 44.43 ± 3.93 .0042 3 202
WT; flcn-1 (RNAi) 62.13 ± 3.44 3 207

סיכום 1. לוח תוצאות והניתוח סטטיסטי של התנגדות סטרס חמצונים מאיור 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

סי אלגנס הוא אורגניזם מודל אטרקטיבי ללמוד התנגדות מתח גנטי חמצוני in vivo שכן הוא יכול להיות בקלות בתרבית, ומהירות מוביל למספר רב של צאצאים זהים גנטי. מספר שיטות למדידת התנגדות סטרס חמצונים תוארו בעבר והם מבוססים על התוספים של צלחות תרבות עם מקורות ROS שונים כגון PQ, rotenone, H 2 O 2, וjuglone 25,26,29-32. כאן אנו מתארים פרוטוקול המודד התנגדות סטרס חמצונים בנוזל ב 96 צלחות גם באמצעות 100 מ"מ PQ. Assay דומה שבוצע על ידי אח גריר אל. 33. assay זה יכול להיות מותאם נוסף ללמוד סטרס חמצונים בנוזל באמצעות מקורות ROS אחרים. לדוגמא, שהראינו הפסד של התנגדות עליות flcn-1 לכמה 2 O 2 ריכוזי H כמו גם 23.

assay זה יכול להיות טכניly מאתגר לכמה זנים המציגים פגמי תנועתיות או שחייה-induced פנוטיפים שיתוק כגון זנים נושאים מוטציה בטרנספורטר דופאמין DAT-1 34. במקרה זה, חוסר היכולת להזיז מבלבלת שכן הוא לא בהכרח מתכוון ירד התנגדות חמצוני לחץ אלא פגם תנועתיות. יתר על כן, ספירה של חיות מתות אמור להסתיים בזהירות וחוקרים יש לשים לב לג פרטי התנהגות elegans כגון תנועות זנב, ותנועות ראש, או תנועות גוף גם איטיות. אם ריכוז PQ הוא גבוה מדי, וקינטיקה מותם של בעלי החיים היא מהירה מאוד, אפשר לשקול הפחתת הריכוז של PQ כדי לקבל שיעורי מוות איטיים יותר. חלק מבעלי החיים רגישים מאוד ללחץ חמצוני כגון aak-2 בעלי חיים מוטציה 26,33,35,36 ואילו אחרים הם עמידים מאוד כגון daf-2 בעלי חיים מוטציה 37. במקרה זה, מנסה לאמוד הישרדות עם עמיתים שוניםncentrations של PQ צריך להיחשב.

לניסויי RNAi, תוצאות שליליות יכולות להיות בגלל חוסר יעילות של טיפול RNAi. במקרה זה, מדידה של רמות ה- mRNA היא חיונית כדי לקבוע אם גן מציאה הוא מוצלח.

פרוטוקול זה יכול להיות מותאם נוסף להקרנת תפוקה גבוהה של עמידות סטרס חמצונים באמצעות גלאי שעוקב חי ההתנהגות של ג elegans ב38,39 נוזליים. פעולה זו עלולה לאפשר הניטור של הסיבולת של ג elegans ושחי ההתנהגות כגון תדירות של גוף כיפוף תחת לחץ חמצוני. שיעור גבוה יותר של תנועת גוף יכול להצביע על כושר תולעת גבוה יותר תחת לחץ.

מסלולים שיובילו לחמצוני התנגדות מתח אאוקריוטים התחתונים השמורים ביותר על פני אבולוציה וצמודות למחלות הקשורות ללחץ חמצוני והזדקנות בבני אדם. Mitohormesis וgeneratio המאוזןn של ROS חיוני להאריך את תוחלת חיים ולשפר את תוחלת בריאות. עם זאת, ROS המופרז הוא מזיק ביותר לתאים, רקמות / איברים, ואורגניזמים. מציאת מסלולים, שאם שינה, מספק איזון אופטימלי היא ROS כך חיונית והמסכים לתרופות המווסתים את ההתנגדות ללחץ חמצוני יכולים לסייע בפיתוח של תרופות למחלות מרובות עם המכנה המשותף: סטרס חמצוני. ביצוע ההקרנות הללו בג elegans הוא שיטת יתרון מהירה, זולה, ואמינה שיש פוטנציאל גדול וערך להבנה והטיפול במחלות אנושיות קשורות ללחץ חמצוני.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

אנו מכירים את מרכז Caenorhabditis הגנטיקה לג זני elegans. תמיכת מימון ניתן על ידי טרי פוקס מכון המחקר. אנחנו גם מכירים תמיכה שניתנה לEP מRolande ומרסל גוסלין בוגר Studentship ומענק אימון CIHR / FRSQ בFRN53888 חקר הסרטן של חקר סרטן תכנית הכשרת מקגיל המשולבת.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar bacteriological grade Multicell 800-010-LG
Bacteriological peptone Oxoid LP0037
Sodium chloride biotechnology grade Bioshop 7647-14-5
Cholesterol Sigma C8503-25G
UltraPure tris hydrochloride Invitrogen 15506-017
Tris aminomethane Bio Basic Canada Inc 77-86-1
IPTG Santa Cruz Biotechnology sc-202185A
Ampicillin Bioshop 69-52-3
Yeast extract Bio Basic Inc. 8013-01-2
Methyl viologen dichloride hydrate Aldrich chemistry 856177-1G
Petri dish 60 x15 mm Fisher FB0875713A
Pipet 10 ml Fisher 1367520
Potassium phosphate monobasic G-Biosciences RC-084
Magnesium sulfate heptahydrate Sigma M-5921
Sodium phosphate dibasic Bioshop 7558-79-4
Discovery v8 stereo zeiss microscope
96 well clear microtiter plate
flcn-1 RNAi source Ahringer Library

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schieber, M., Chandel, N. S. ROS function in redox signaling and oxidative stress. Curr Biol. 24, R453-R462 (2014).
  2. Alfadda, A. A., Sallam, R. M. Reactive oxygen species in health and disease. J Biomed Biotechnol. 2012, 936486 (2012).
  3. Finkel, T., Holbrook, N. J. Oxidants, oxidative stress and the biology of ageing. Nature. 408, 239-247 (2000).
  4. Di Carlo, M., Giacomazza, D., Picone, P., Nuzzo, D., San Biagio, P. L. Are oxidative stress and mitochondrial dysfunction the key players in the neurodegenerative diseases. Free Radic Res. 46, 1327-1338 (2012).
  5. Gandhi, S., Abramov, A. Y. Mechanism of oxidative stress in neurodegeneration. Oxid Med Cell Longev. 2012, 428010 (2012).
  6. Trushina, E., McMurray, C. T. Oxidative stress and mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases. Neuroscience. 145, 1233-1248 (2007).
  7. Touyz, R. M., Briones, A. M. Reactive oxygen species and vascular biology: implications in human hypertension. Hypertens Res. 34, 5-14 (2011).
  8. Gorrini, C., Harris, I. S., Mak, T. W. Modulation of oxidative stress as an anticancer strategy. Nat Rev Drug Discov. 12, 931-947 (2013).
  9. Sosa, V., et al. Oxidative stress and cancer: an overview. Ageing research reviews. 12, 376-390 (2013).
  10. Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. Reactive Oxygen Species and Aging in Caenorhabditis elegans: Causal or Casual Relationship. Antioxid Redox Signal. 13, 1911-1953 (2010).
  11. Baumeister, R., Schaffitzel, E., Hertweck, M. Endocrine signaling in Caenorhabditis elegans controls stress response and longevity. J Endocrinol. 190, 191-202 (2006).
  12. Markaki, M., Tavernarakis, N. Modeling human diseases in Caenorhabditis elegans. Biotechnol J. 5, 1261-1276 (2010).
  13. Rodriguez, M., Snoek, L. B., De Bono, M., Kammenga, J. E. Worms under stress: C. elegans stress response and its relevance to complex human disease and aging. Trends Genet. 29, 367-374 (2013).
  14. Hope, I. A. Practical approach series. , Oxford University Press. 282 (1999).
  15. C. elegans Sequencing Consortium. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science. 282, 2012-2018 (1998).
  16. Ahringer, J. Turn to the worm! Current opinion in genetics & development. 7, 410-415 (1997).
  17. Wheelan, S. J., Boguski, M. S., Duret, L., Makalowski, W. Human and nematode orthologs--lessons from the analysis of 1800 human genes and the proteome of Caenorhabditis elegans. Gene. 238, 163-170 (1999).
  18. Culetto, E., Sattelle, D. B. A role for Caenorhabditis elegans in understanding the function and interactions of human disease genes. Hum Mol Genet. 9, 869-877 (2000).
  19. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
  20. Lamitina, T. Functional genomic approaches in C. elegans. Methods Mol Biol. 351, 127-138 (2006).
  21. Poulin, G., Nandakumar, R., Ahringer, J. Genome-wide RNAi screens in Caenorhabditis elegans: impact on cancer research. Oncogene. 23, 8340-8345 (2004).
  22. Moreno-Arriola, E., et al. Caenorhabditis elegans: A Useful Model for Studying Metabolic Disorders in Which Oxidative Stress Is a Contributing Factor. Oxid Med Cell Longev. , 705253 (2014).
  23. Possik, E., et al. Folliculin regulates ampk-dependent autophagy and metabolic stress survival. PLoS Genet. 10, e1004273 (2014).
  24. Fukushima, T., Tanaka, K., Lim, H., Moriyama, M. Mechanism of cytotoxicity of paraquat. Environ Health Prev Med. 7, 89-94 (2002).
  25. Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. Superoxide dismutase is dispensable for normal animal lifespan. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 5785-5790 (2012).
  26. Schulz, T. J., et al. Glucose restriction extends Caenorhabditis elegans life span by inducing mitochondrial respiration and increasing oxidative stress. Cell Metab. 6, 280-293 (2007).
  27. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
  28. Timmons, L. Delivery methods for RNA interference in. C. elegans. Methods Mol Biol. 351, 119-125 (2006).
  29. Wang, B. Y., et al. Caenorhabditis elegans Eyes Absent Ortholog EYA-1 Is Required for Stress Resistance. Biochemistry (Mosc). 79, 653-662 (2014).
  30. Paz-Gomez, D., Villanueva-Chimal, E., Navarro, R. E. The DEAD Box RNA helicase VBH-1 is a new player in the stress response in C. elegans. PLoS One. 9, 97924 (2014).
  31. Ward, J. D., et al. Defects in the C. elegans acyl-CoA synthase, acs-3, and nuclear hormone receptor, nhr-25, cause sensitivity to distinct, but overlapping stresses. PLoS One. 9, 92552 (2014).
  32. Staab, T. A., Evgrafov, O., Knowles, J. A., Sieburth, D. Regulation of synaptic nlg-1/neuroligin abundance by the skn-1/Nrf stress response pathway protects against oxidative stress. PLoS Genet. 10, e1004100 (2014).
  33. Greer, E. L., et al. An AMPK-FOXO pathway mediates longevity induced by a novel method of dietary restriction in. C. elegans. Curr Biol. 17, 1646-1656 (2007).
  34. Allen, E., Walters, I. B., Hanahan, D. Brivanib, a dual FGF/VEGF inhibitor, is active both first and second line against mouse pancreatic neuroendocrine tumors developing adaptive/evasive resistance to VEGF inhibition. Clin Cancer Res. 17, 5299-5310 (2011).
  35. Apfeld, J., O'Connor, G., McDonagh, T., DiStefano, P. S., Curtis, R. The AMP-activated protein kinase AAK-2 links energy levels and insulin-like signals to lifespan in C. elegans. Genes Dev. 18, 3004-3009 (2004).
  36. Lee, H., et al. The Caenorhabditis elegans AMP-activated protein kinase AAK-2 is phosphorylated by LKB1 and is required for resistance to oxidative stress and for normal motility and foraging behavior. J Biol Chem. 283, 14988-14993 (2008).
  37. Honda, Y., Honda, S. The daf-2 gene network for longevity regulates oxidative stress resistance and Mn-superoxide dismutase gene expression in Caenorhabditis elegans. FASEB J. 13, 1385-1393 (1999).
  38. Restif, C., Metaxas, D. Tracking the swimming motions of C. elegans worms with applications in aging studies. Med Image Comput Comput Assist Interv. 11, 35-42 (2008).
  39. Buckingham, S. D., Sattelle, D. B. Fast, automated measurement of nematode swimming (thrashing) without morphometry. BMC Neurosci. 10, 84 (2009).

Tags

ביולוגיה תאית גיליון 99 סטרס חמצוני paraquat, מיני חמצן מגיבים מות האורגניזם מודל חיה נמטודות
מדידת התנגדות סטרס חמצוני של<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em&gt; בצלחות microtiter 96-היטב
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Possik, E., Pause, A. Measuring… More

Possik, E., Pause, A. Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates. J. Vis. Exp. (99), e52746, doi:10.3791/52746 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter