Abstract
Oksidativt stress, noe som er et resultat av en ubalanse mellom produksjon og avgiftning av reaktive oksygenforbindelser, er en stor bidragsyter til kroniske menneskelige lidelser, inkludert hjerte- og nevrodegenerative sykdommer, diabetes, aldring og kreft. Derfor er det viktig å studere oksidativt stress, ikke bare i cellesystemer, men også ved hjelp av hele organismer. C. elegans er et attraktivt modellorganisme for å studere genetikk av oksidativt stress signaltransduksjonsveiene, som er høyt evolusjonært konserverte.
Her gir vi en protokoll for å måle oksidativt stress motstand i C. elegans i væske. I korthet ROS-induserende reagenser slik som paraquat (PQ) og H 2 O 2 oppløses i M9 buffer, og løsningene blir alikvotert i brønnene i en 96 brønners mikrotiterplate. Synkronisert L4 / ung voksen C. elegans dyr blir overført til brønnene (5-8 dyr / brønn) og overlevelse måleshver time før de fleste ormer er døde. Når du utfører en oksidativt stress motstand analyse ved hjelp av en lav konsentrasjon av stressfaktorer i plater, aldring kan påvirke atferden til dyrene ved oksidativt stress, som kan føre til en uriktig tolkning av dataene. Men i analysen beskrevet her, er dette problem lite sannsynlig siden bare L4 / unge voksne dyr brukes. Dessuten er denne protokollen billig og resultater blir oppnådd på en dag, noe som gjør denne teknikk attraktivt for genetiske skjermer. Samlet sett vil dette bidra til å forstå oksidativt stress signaltransduksjonsveier, som kan oversettes til bedre karakterisering av oksidativt stress-forbundet menneskelige lidelser.
Introduction
I eukaryoter, er oksydativ fosforylering finner sted i elektrontransportkjeden i mitokondriene hoveddrivkraften for energiproduksjon i form av ATP. Reaktive oksygenarter (ROS) er et naturlig biprodukt av denne prosessen. Til tross for sin viktige rolle som signalmolekyler, kan overdreven ROS føre til DNA-skader, protein karbonyleringskatalysator, og lipid oksidasjon. En ubalanse mellom ROS produksjon og avgiftning forårsaker oksidativt stress, noe som fører til energitap, celleskade, og utløser celledød 1,2. Oksidativt stress bidrar til aldring og til utvikling av mange livstruende sykdommer, inkludert kreft, diabetes, kardiovaskulære og neurodegenerative sykdommer 3-9.
Cellene har utviklet seg enzymatiske og ikke-enzymatiske forsvarsstrategier for å opprettholde riktig ROS nivåer og for å beskytte sine velgere mot oksidativ skade 1,2. Superoksiddismutase (SOD) enzymer handle først å convert superoksyd i H 2 O 2, som senere omdannes til vann med katalase eller peroksidase enzymer. Ikke enzymatiske forsvarsstrategier omfatter stort sett molekyler som reagerer raskere med ROS i forhold til cellulære makromolekyler, som beskytter viktige cellulære komponenter. Til tross for den beskyttende rollen ROS avgifte enzymer, noen ROS molekyler unnslippe antioksidantforsvarsmekanismer og føre til oksidativ skade. Deteksjon, reparasjon, og nedbrytning av de skadede cellulære komponenter er viktige forsvarsstrategier i løpet av oksidativt stress 1,2.
Signalveier involvert i stresstoleranse og spesielt oksidativt stress er høyt evolusjonært konservert 10,11. I motsetning til cellekultur eksperimenter der organisme vilkår er bare delvis gjengitt, studiet av oksidativt stress i modellorganismer 12,13 har stor betydning. C. elegans er en frittlevende nematode som kan være enkelt og billig Cultured på en bakteriell plenen på agar medier. Det er liten i størrelse (ca. 1 mm i lengde) og vokser normalt som en selv-gjødsling hermaphrodite, noe som letter genetiske manipulasjoner. Den har en rask livssyklus og høy reproduksjonsevne, som produserer ca 300 avkom per generasjon, noe som gjør det til et kraftig verktøy for å utføre storskala genetiske skjermer 14. C. elegans genomet er fullstendig sekvensert, og 40-50% av genene er anslått å være homologer av humane sykdomsassosierte gener 15-18. Knockdown av gener av interesse å bruke RNAi er rask og enkel i C. elegans. Gene nedregulering kan oppnås ved å mate dyr E. coli-bakterier som havn et plasmid uttrykker dobbeltrådet RNA som er rettet mot mRNA av interesse 19. Derfor fastsettelse av gen-funksjon ved hjelp av storskala RNAi skjermer har stor innvirkning på forståelsen av menneskelige sykdommer, inkludert kreft 20,21.
Studier av oxidative stresstoleranse i C. elegans har ført til identifisering av konserverte mekanismene for resistens mot oksidativt stress 13,22. Noen veier er identifisert er vanlige veier som modulerer lang levetid og motstand mot andre påkjenninger, så vel som hypoksi, varme og osmotisk stress. Disse veier inkluderer insulinsignaleringen, TOR signalering, og autofagi. Andre viktige veier bære avgiftning av ROS som superoksyddismutase enzymer og katalase enzymer, eller skade reparasjon eksempel varmesjokk og chaperonproteiner 11,13,22.
Denne protokollen beskriver hvordan å bestemme motstand mot oksidativt stress i C. elegans i væske. Vi brukte flcn-1 (ok975) og villtype-dyr for å demonstrere protokollen, siden vi tidligere har vist et øket motstand mot oksidativt stress ved tap av flcn-1 (ok975) i C. elegans 23. Vi har også vist at denne økte motstand avhengerpå AMPK og autofagi, et signal akse som forbedrer cellulære bioenergi og fremmer stresstoleranse 23. PQ er en oksidativ stressfaktor som forstyrrer elektrontransportkjeden til å produsere reaktive oksygenforbindelser 24. Den samme analysen kunne tilpasses og andre ROS-kilder eller ROS-genererende forbindelser som kan brukes, for eksempel H 2 O 2 og rotenon. Lignende analyser er blitt utviklet på platene der lave konsentrasjoner av PQ brukes 25,26. Fordelen med denne analyse er at den er meget rask, og resultatene kan oppnås i en dag. I tillegg, er det totale volumet av væske som brukes til å utføre den oksidative stresstoleranse analyse i 96-brønners plater lavt i forhold til volumet som brukes for å fremstille PQ-inneholdende plater. Derfor er mengden av PQ anvendes i væskemetoden er lav, hvilket gjør analysen billig og begrenser produksjonen av giftig avfall. Imidlertid begrensninger i denne analyse sammenlignet med plate analyser inkluderer de lack av mat i væskemetoden og den lavere konsentrasjon av oksygen i væsken i forhold til luft. Dette er viktige faktorer som i noen tilfeller kan påvirke resultatene. Derfor bekrefter reproduserbarheten ved hjelp av andre metoder for oksidativt stress motstand anbefales å støtte resultatene oppnådd i denne analysen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utarbeidelse av reagenser
- Utarbeidelse av media for C. elegans vekst (i dette tilfelle, vill-type dyr og flcn-1 (ok975) mutante dyr).
- Forbered Modifisert Youngren Eneste Bacto-pepton (myob) tørrblanding inneholdende 5,5 g Tris HCl, 2,4 g Tris-base, 31 g Bactopetone, 20 g NaCl og 0,08 g av kolesterol. Bland godt med risting.
MERK: Denne blandingen er tilstrekkelig til å forberede 10 liter MYOB medium.
MERK: normal vekst medium (NGM) plater kan brukes i stedet for platene 27 MYOB. Imidlertid bør den samme type plater benyttes for gyldige sammenligninger mellom stammene og mellom uavhengige gjentas. I denne protokollen, brukte vi bare MYOB plater. - Forbered 1 liter myob medium ved å tilsette 6 g myob tørrblanding, 17 g agar og fyll opp til 1 liter med H2O og autoklav i 45 minutter ved 122 ° C. Hell platene og la det tørke ved romtemperatur i 2 dager.
- Bruk steril teknikk, inokulere 100 ml Culture av LB buljong medium med E. coli OP50 bakterier og vokse O / N ved 37 ° C.
- Seed MYOB plater med E. coli OP50 bakterier. La det vokse ved RT i 48 timer.
- Forbered Modifisert Youngren Eneste Bacto-pepton (myob) tørrblanding inneholdende 5,5 g Tris HCl, 2,4 g Tris-base, 31 g Bactopetone, 20 g NaCl og 0,08 g av kolesterol. Bland godt med risting.
- Forberedelse til genet nedregulering ved hjelp av RNAi
- Forbered MYOB RNAi-fôring plater. Fortsett som i trinn 1.1.1 og 1.1.2. Etter autoklavering, la mediet avkjøles til ca 55 ° C og tilsett 1 ml av 1 M isopropyl β-D-1-tiogalaktopyranosid (IPTG) og 1 ml av 100 mM ampicillin.
- Streak E. coli HT115 bakterier transformert med et plasmid som uttrykker enten kontroll eller EV flcn-en spesifikk RNAi på Ampicillin (50 ug / ml) / tetracyclin (15 ug / ml) agarplater. Grow kultur O / N ved 37 ° C.
- Plukke kolonier og vaksinere E. coli HT115 bakterier transformert med et plasmid som uttrykker enten kontroll eller EV flcn-en spesifikk RNAi og vokse i kultur LB / ampicillin (50 ug / ml) medium og O / N ved 37 & #176; C.
- Seed plater med E. coli HT115 EV bakterier eller HT115 flcn-en RNAi bakterier.
MERK: Hold plater 48 timer ved romtemperatur før bruk. Hvis RNAi knockdown ved fôring er i effektiv, bruker andre metoder for levering av ds-RNA 28.
- Indusere oksidativt stress ved hjelp paraquat (PQ):
- Forbered M9 buffer ved å blande 3 g KH 2PO 4, 6 g Na 2 HPO 4, 5 g NaCl og 0,25 g MgSO4 · 7 H 2 O. Ta opp til 1 liter med destillert vann. Autoklav-løsning i 45 minutter ved 122 ° C og lagre flasker ved RT.
- På dagen for analysen, forberede M9 / PQ-inneholdende oppløsning. For denne protokollen, å bruke 100 mM PQ (0,1028 g PQ oppløst i 4 ml av M9 buffer fyller en hel 96-brønners plater med 40 ul av M9 / PQ per brønn).
FORSIKTIG: PQ er en farlig og svært giftig sammensatte. Håndtak i henhold til hensiktsmessige retningslinjer.
MERK: Når du først kjører en ny stog eller en ny tilstand, er det anbefalt å analysere overlevelse i økende konsentrasjoner av PQ for å bestemme den beste konsentrasjonen til bruk for å drepe dyrene i løpet av 7-10 timer.
2. Utarbeidelse av Age-synkronisert L4 Befolkning
- Transfer 20 gravid voksne hermafroditter til en frisk MYOB plate seeded med E. coli OP50 bakterier. Forbered flere plater basert på antall ormer som trengs i løpet av analysen.
- La dem legge egg i 6 timer og deretter bruke en platinatråd orm plukke fjerne mødre. Sjekk platene under mikroskop for å vurdere antall egg lagt.
- La eggene klekkes og vokse ved 20 ° C i 48 timer. På dette tidspunkt dyrene er i en sen L4 / unge voksne stadium. Plukk samme scene dyr og overføre til løsning holdig brønnene PQ.
MERK: Siden 48 timers inkubering gjelder bare for mutanter som vokser på samme måte som villtype dyr, er det viktig å overvåke utviklingsfrekvensen av nylig testet mutanter for å sikre at den er i samsvar med villtype-utvikling hastighet, ellers bør andre tidslinjer benyttes. - Alternativt kan du bruke synkroniserings teknikker. Generere synkroniserte populasjon av L1 larver ormer ved hjelp av hypokloritt-oppløsning (25 ml vann, 125 ml av 5,25% natrium-hypokloritt, 50 ml 4 M NaOH, vikle flaske med aluminiumsfolie for å isolere mot lys). Men for denne analysen, er det ikke anbefalt, fordi intens blekemidler kan påvirke oppførselen til dyrene under analysen.
FORSIKTIG: Håndter hypoklorittoppløsning henhold til retningslinjene.
MERK: Når du bruker RNAi å nedregulere det aktuelle genet, synkronisere hermafroditter som beskrevet i punkt 2, med unntak av overføring av mødrene til RNAi plater seeded med de spesifikke RNAi bakterier. Når knockdown med RNAi er svak, er fôring for flere generasjoner anbefales.
3. Utføre Oksidativt stress Resistance analysen </ P>
- Pipetter 40 ul av 100 mM PQ (fremstilt frisk) til hver brønn i en 96-brønners plate. Bruk minst 12 brønner som replikerer for hver tilstand (behandling, mutant, etc.). Ved hjelp av en platinatråd orm plukke, overføre 5-8 L4 larver dyr til hvert godt indikerer starttid og sluttid.
- Når du starter en annen tilstand, merk starttid og sluttid. Sett platen ved 20 ° C i inkubasjonstiden mellom overføre ormer og scoret døde dyr en time senere fra starttidspunktet.
- Bruke disseksjonsmikroskop, telle overlevelse hver time. Rist plate før du begynner å telle. Indikerer ormer som ikke beveger seg, selv etter å fange en høy intensitet lys, som døde dyr. Også angir antall dyr i live.
MERK: Ser på ormen form, haler og hodebevegelser ved høy forstørrelse, bidra til å bestemme døde ormer fra live. - Gjenta dette trinnet hver time før de fleste ormer er døde.
- Beregn det totale antall dyr pr tilstand ved tilsetning av det totale antall dyr som ble overført til hver brønnen. Ignorer dyr som er skadet eller drept ved overføring.
- For hvert tidspunkt, å beregne det totale antall døde dyr pr tilstand (sum av døde dyr i de 12 brønner). For hvert tidspunkt, å beregne prosentandelen av døde (antall døde dyr dividert med totalt antall dyr, og multiplisert med 100), og prosentvis overlevelse (100 minus prosent død).
- Gjenta denne analysen minst tre uavhengige ganger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sammenligning av vill-type C. elegans til flcn-1 (ok975) muterte dyr
Her har vi brukt 100 mM PQ for å bestemme motstanden av villtype C. elegans dyr sammenlignet med flcn-1 (ok975) som har blitt vist å motstå oksidativt stress, varme og anoksi 23. Etter 4 timers behandling, 48,3% av vill-type overlevde i forhold til 77,8% overlevelse i flcn-1 (ok975) dyr. Som forventet, flcn-1 (ok975) mutante dyr var mer resistente mot 100 mM PQ sammenlignet med villtype (figur 2 og tabell 1).
Sammenligning av vill type dyr fôret med kontroll EV eller flcn-en RNAi bakterier
I likhet med resultatet presentert i forrige avsnitt, nedregulering av flcn-en ved hjelp av RNAi økt motstand mot 100 mM PQ. Dette resultatet viser at nedregulering av gen-funksjon ved hjelp av RNAi ligner tap-av-funksjon m utation (figur 2 og tabell 1).
Figur 1. Skjematisk figur av metoden for oksidativt stress motstandsbestemmelse i 96-brønners plater i C. elegans.
Synkroniserte L4 / unge voksne dyr dyrket på MYOB plater og som ble matet med E. coli OP50 bakterier overføres til brønnene i en 96 brønners mikrotiterplate inneholdende 100 mM PQ og overlevelse måles hver time inntil et stort antall ormer er døde. I tilfelle av RNAi knock-out er den samme prosedyre fulgt med unntagelse av at de synkroniserte dyrene blir dyrket på plater supplert med IPTG, og blir matet med E. HT115 coli bakterier som bærer plasmidet som skal knockdown målgenet ved ekspresjon.
filer / ftp_upload / 52746 / 52746fig2.jpg "/>
Figur 2. Tap av FLCN-1 øker motstanden mot oksidativt stress i C. elegans. (A - B) Prosent overlevelse til 100 mM PQ av (A) wt og flcn-1 (ok975) muterte dyr og (B) wt dyr behandlet med kontroll eller flcn-en RNAi.
| Prosent overlevelse til 100 mM PQ | |||||
| 1 time | Strain, RNAi | Prosent overlevelse (± SD) | P Verdi | Antall eksperimenter | Totalt antall ormer |
| wt | 82,38 ± 1,31 | 0,0002 | 3 | 210 | |
| flcn-1 (ok975) | 99,03 ± 1,67 | 3 224 | |||
| vekt; kontroll | 91,70 ± 0,55 | 0,0462 | 3 | 202 | |
| vekt, flcn-1 (RNAi) | 95,93 ± 2,48 | 3 | 207 | ||
| 2 timer | Strain, RNAi | Prosent overlevelse (± SD) | P Verdi | Antall eksperimenter | Totalt antall ormer |
| wt | 72.13 ± 7.13 | 0,005 | 3 | 210 | |
| flcn-1 (ok975) | 96,33 ± 2,28 | 3 | 224 | ||
| vekt; kontroll | 80,27 ± 5,34 | 0,0261 | 3 | 202 | |
| vekt, flcn-1 (RNAi) | 91,23 ± 1,42 | 3 | 207 | ||
| 3 hr | Strain, RNAi | Prosent overlevelse (± SD) | P Verdi | Antall eksperimenter | Totalt antall ormer |
| wt | 55.37 ± 4.72 | 0,0004 | 3 | 210 | |
| flcn-1 (ok975) | 87.00 ± 1.36 | 3 | 224 | ||
| vekt; kontroll | 70.77 ± 3.50 | 0,0027 | 3 | 202 | |
| vekt, flcn-1 (RNAi) | 87,63 ± 2,67 | 3 | 207 | ||
| 4 timer | Strain, RNAi | Prosent overlevelse (± SD) | P Verdi | Antall eksperimenter | Totalt antall ormer |
| wt | 48.30 ± 6.39 | 0,002 | 3 | 210 | |
| flcn-1 (ok975) | 77.80 ± 3.12 | 3 | 224 | ||
| vekt; kontroll | 63.77 ± 0.66 | 0,0122 | 3 | 202 | |
| vekt, flcn-1 (RNAi) | 80,57 ± 6,68 | 3 | 207 | ||
| 5 timer | Strain, RNAi | Prosent overlevelse (± SD) | P Verdi | Antall eksperimenter | Totalt antall ormer |
| wt | 41.60 ± 8.33 | 0,0062 | 3 | ||
| flcn-1 (ok975) | 67,43 ± 1,42 | 3 | 224 | ||
| vekt; kontroll | 60,53 ± 2,58 | 0,0313 | 3 | 202 | |
| vekt, flcn-1 (RNAi) | 71,53 ± 5,24 | 3 | 207 | ||
| 6 hr | Strain, RNAi | Prosent overlevelse (± SD) | P Verdi | Antall eksperimenter | Totalt antall ormer |
| wt | 34,86 ± 5,88 | 0,0021 3 | 210 | ||
| flcn-1 (ok975) | 60.34 ± 2.05 | 3 | 224 | ||
| vekt; kontroll | 44.43 ± 3.93 | 0,0042 | 3 | 202 | |
| vekt, flcn-1 (RNAi) | 62,13 ± 3,44 | 3 | 207 | ||
Tabell 1. Oppsummering av resultater og statistisk analyse av oksidativt stress motstand fra figur 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
C. elegans er en attraktiv modellorganisme for å studere genetisk oksidativt stress resistens in vivo, siden det lett kan dyrkes, og hurtig fører til et stort antall genetisk identiske avkom. Flere metoder for å måle oksidativt stress motstand er tidligere blitt beskrevet, og de er basert på den supplering av dyrkningsskåler med ROS forskjellige kilder som PQ, rotenon, H 2 O 2, og Juglone 25,26,29-32. Her beskriver vi en protokoll som måler oksidativt stress motstand i væsken i 96-brønners plater med 100 mM PQ. En lignende analyse ble utført av Greer et al., 33. Denne analysen kan bli ytterligere tilpasset for å studere oksidativt stress i væsken ved hjelp av andre ROS kilder. For eksempel har vi vist at tap av flcn-1 øker motstanden mot flere H 2 O 2-konsentrasjoner samt 23.
Denne analysen kan være tekniskly utfordrende for noen stammer som viser motilitet feil eller svømme indusert lammelser fenotyper som stammer som bærer en mutasjon i dopamin transporter dat-1 34. I dette tilfellet er den manglende evne til å bevege seg forvirrende fordi det betyr ikke nødvendigvis redusert oksidativt stress motstand, men snarere en motilitet defekt. Videre bør telling av døde dyr være nøye gjennomført og forskere må ta hensyn til C. elegans atferds detaljer som halebevegelser og hodebevegelser, eller til og med langsomme bevegelser. Dersom PQ konsentrasjonen er for høy, og dødskinetikken for dyrene er svært raskt, kan man vurdere å redusere konsentrasjonen av PQ for å få lavere dødelighet. Noen dyr er ekstremt følsomme for oksidativt stress som AAK 2-muterte dyr 26,33,35,36, mens andre er meget motstandsdyktige for eksempel DAF-2 muterte dyr 37. I dette tilfellet, analysering av overlevelse med forskjellig concentrations av PQ bør vurderes.
For RNAi eksperimenter, kan negative resultater skyldes en ineffektivitet av RNAi behandlingen. I dette tilfellet, er måling av mRNA-nivåer nødvendig for å bestemme om genet knockdown er vellykket.
Denne protokollen kan bli ytterligere tilpasset for high throughput screening av oksidativt stress motstand ved hjelp av en detektor som sporer svømme oppførselen til C. elegans i flytende 38,39. Dette vil potensielt gjøre det mulig overvåking av utholdenhet C. elegans og svømmeatferd som frekvens av kroppen bøyd etter oksidativt stress. Høyere forekomst av kroppsbevegelse kan indikere høyere orm trenings under stress.
Trasé som fører til oksidativt stress motstand i lavere eukaryoter er høyt konservert over utviklingen og er knyttet til oksidativt stress-assosierte sykdommer og aldring hos mennesker. Mitohormesis og balanserte genen av ROS er avgjørende for å forlenge levetid og bedre helse span. Imidlertid er overdreven ROS meget skadelig for celler, vev / organer, og organismer. Å finne veier, at hvis forandret, gir en optimal ROS balanse er derfor viktig, og skjermene for medikamenter som modulerer motstanden mot oksidativt stress kan bidra til utvikling av kurer for flere sykdommer med fellesnevneren: oksidativt stress. Utfører disse screenings i C. elegans er en fordelaktig rask, billig og pålitelig metode som har stort potensial og verdi for forståelse og behandling av menneskelige sykdommer knyttet til oksidativt stress.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi erkjenner Caenorhabditis Genetics Center for C. elegans stammer. Økonomisk støtte ble gitt av Terry Fox Research Institute. Vi erkjenner også støtte gitt til EP fra Rolande og Marcel Gosselin Graduate Student og CIHR / FRSQ opplæring tilskuddet i kreftforskning FRN53888 av McGill Integrated Cancer Research Training Program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar bacteriological grade | Multicell | 800-010-LG | |
| Bacteriological peptone | Oxoid | LP0037 | |
| Sodium chloride biotechnology grade | Bioshop | 7647-14-5 | |
| Cholesterol | Sigma | C8503-25G | |
| UltraPure tris hydrochloride | Invitrogen | 15506-017 | |
| Tris aminomethane | Bio Basic Canada Inc | 77-86-1 | |
| IPTG | Santa Cruz Biotechnology | sc-202185A | |
| Ampicillin | Bioshop | 69-52-3 | |
| Yeast extract | Bio Basic Inc. | 8013-01-2 | |
| Methyl viologen dichloride hydrate | Aldrich chemistry | 856177-1G | |
| Petri dish 60 x15 mm | Fisher | FB0875713A | |
| Pipet 10 ml | Fisher | 1367520 | |
| Potassium phosphate monobasic | G-Biosciences | RC-084 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | M-5921 | |
| Sodium phosphate dibasic | Bioshop | 7558-79-4 | |
| Discovery v8 stereo zeiss microscope | |||
| 96 well clear microtiter plate | |||
| flcn-1 RNAi source | Ahringer Library |
References
- Schieber, M., Chandel, N. S. ROS function in redox signaling and oxidative stress. Curr Biol. 24, R453-R462 (2014).
- Alfadda, A. A., Sallam, R. M. Reactive oxygen species in health and disease. J Biomed Biotechnol. 2012, 936486 (2012).
- Finkel, T., Holbrook, N. J. Oxidants, oxidative stress and the biology of ageing. Nature. 408, 239-247 (2000).
- Di Carlo, M., Giacomazza, D., Picone, P., Nuzzo, D., San Biagio, P. L. Are oxidative stress and mitochondrial dysfunction the key players in the neurodegenerative diseases. Free Radic Res. 46, 1327-1338 (2012).
- Gandhi, S., Abramov, A. Y.
- Trushina, E., McMurray, C. T. Oxidative stress and mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases. Neuroscience. 145, 1233-1248 (2007).
- Touyz, R. M., Briones, A. M. Reactive oxygen species and vascular biology: implications in human hypertension. Hypertens Res. 34, 5-14 (2011).
- Gorrini, C., Harris, I. S., Mak, T. W. Modulation of oxidative stress as an anticancer strategy. Nat Rev Drug Discov. 12, 931-947 (2013).
- Sosa, V., et al. Oxidative stress and cancer: an overview. Ageing research reviews. 12, 376-390 (2013).
- Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. Reactive Oxygen Species and Aging in Caenorhabditis elegans: Causal or Casual Relationship. Antioxid Redox Signal. 13, 1911-1953 (2010).
- Baumeister, R., Schaffitzel, E., Hertweck, M. Endocrine signaling in Caenorhabditis elegans controls stress response and longevity. J Endocrinol. 190, 191-202 (2006).
- Markaki, M., Tavernarakis, N. Modeling human diseases in Caenorhabditis elegans. Biotechnol J. 5, 1261-1276 (2010).
- Rodriguez, M., Snoek, L. B., De Bono, M., Kammenga, J. E. Worms under stress: C. elegans stress response and its relevance to complex human disease and aging. Trends Genet. 29, 367-374 (2013).
- Hope, I. A. Practical approach series. , Oxford University Press. 282 (1999).
- C. elegans Sequencing Consortium. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science. 282, 2012-2018 (1998).
- Ahringer, J.
- Wheelan, S. J., Boguski, M. S., Duret, L., Makalowski, W. Human and nematode orthologs--lessons from the analysis of 1800 human genes and the proteome of Caenorhabditis elegans. Gene. 238, 163-170 (1999).
- Culetto, E., Sattelle, D. B. A role for Caenorhabditis elegans in understanding the function and interactions of human disease genes. Hum Mol Genet. 9, 869-877 (2000).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
- Lamitina, T. Functional genomic approaches in C. elegans. Methods Mol Biol. 351, 127-138 (2006).
- Poulin, G., Nandakumar, R., Ahringer, J. Genome-wide RNAi screens in Caenorhabditis elegans: impact on cancer research. Oncogene. 23, 8340-8345 (2004).
- Moreno-Arriola, E., et al. Caenorhabditis elegans: A Useful Model for Studying Metabolic Disorders in Which Oxidative Stress Is a Contributing Factor. Oxid Med Cell Longev. , 705253 (2014).
- Possik, E., et al. Folliculin regulates ampk-dependent autophagy and metabolic stress survival. PLoS Genet. 10, e1004273 (2014).
- Fukushima, T., Tanaka, K., Lim, H., Moriyama, M.
- Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. Superoxide dismutase is dispensable for normal animal lifespan. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 5785-5790 (2012).
- Schulz, T. J., et al. Glucose restriction extends Caenorhabditis elegans life span by inducing mitochondrial respiration and increasing oxidative stress. Cell Metab. 6, 280-293 (2007).
- Brenner, S.
- Timmons, L. Delivery methods for RNA interference in. C. elegans. Methods Mol Biol. 351, 119-125 (2006).
- Wang, B. Y., et al. Caenorhabditis elegans Eyes Absent Ortholog EYA-1 Is Required for Stress Resistance. Biochemistry (Mosc). 79, 653-662 (2014).
- Paz-Gomez, D., Villanueva-Chimal, E., Navarro, R. E. The DEAD Box RNA helicase VBH-1 is a new player in the stress response in C. elegans. PLoS One. 9, 97924 (2014).
- Ward, J. D., et al. Defects in the C. elegans acyl-CoA synthase, acs-3, and nuclear hormone receptor, nhr-25, cause sensitivity to distinct, but overlapping stresses. PLoS One. 9, 92552 (2014).
- Staab, T. A., Evgrafov, O., Knowles, J. A., Sieburth, D. Regulation of synaptic nlg-1/neuroligin abundance by the skn-1/Nrf stress response pathway protects against oxidative stress. PLoS Genet. 10, e1004100 (2014).
- Greer, E. L., et al. An AMPK-FOXO pathway mediates longevity induced by a novel method of dietary restriction in. C. elegans. Curr Biol. 17, 1646-1656 (2007).
- Allen, E., Walters, I. B., Hanahan, D. Brivanib, a dual FGF/VEGF inhibitor, is active both first and second line against mouse pancreatic neuroendocrine tumors developing adaptive/evasive resistance to VEGF inhibition. Clin Cancer Res. 17, 5299-5310 (2011).
- Apfeld, J., O'Connor, G., McDonagh, T., DiStefano, P. S., Curtis, R. The AMP-activated protein kinase AAK-2 links energy levels and insulin-like signals to lifespan in C. elegans. Genes Dev. 18, 3004-3009 (2004).
- Lee, H., et al. The Caenorhabditis elegans AMP-activated protein kinase AAK-2 is phosphorylated by LKB1 and is required for resistance to oxidative stress and for normal motility and foraging behavior. J Biol Chem. 283, 14988-14993 (2008).
- Honda, Y., Honda, S. The daf-2 gene network for longevity regulates oxidative stress resistance and Mn-superoxide dismutase gene expression in Caenorhabditis elegans. FASEB J. 13, 1385-1393 (1999).
- Restif, C., Metaxas, D. Tracking the swimming motions of C. elegans worms with applications in aging studies. Med Image Comput Comput Assist Interv. 11, 35-42 (2008).
- Buckingham, S. D., Sattelle, D. B. Fast, automated measurement of nematode swimming (thrashing) without morphometry. BMC Neurosci. 10, 84 (2009).
