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Biology

の酸化ストレス抵抗を測定 Published: May 9, 2015 doi: 10.3791/52746
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Goodman Cancer Research Center, McGill University, 2Department of Biochemistry, McGill University

Abstract

活性酸素種の産生と解​​毒の間の不均衡の結果である酸化ストレスは、心血管および神経変性疾患、糖尿病、老化、および癌を含む慢性ヒトの疾患、の主要な原因です。したがって、細胞系においても全生物を使用していないだけで酸化ストレスを研究することが重要である。C.エレガンスは、高度に進化的に保存されている酸化ストレスシグナル伝達経路の遺伝学を研究するための魅力的なモデル生物です。

ここでは、Cの酸化ストレス耐性を測定するためのプロトコルを提供します液体中のエレガンス 。簡単に言えば、そのようなパラコート（PQ）およびH 2 O 2などのROS誘導試薬はM9緩衝液に溶解され、溶液は、96ウェルマイクロタイタープレートのウェルに等分されます。シンクロナイズドL4 /若年成人C.エレガンス動物をウェルに転送される（5~8匹/ウェル）、生存率が測定されますほとんどのワームは死んでいるまで、毎時間。プレート内のストレッサーの低濃度を使用して、酸化ストレス耐性アッセイを行う場合には、高齢化は、データの誤った解釈につながる可能性が酸化ストレス、時に動物の行動に影響を与える可能性があります。しかしながら、本明細書に記載のアッセイで、この問題は、L4 /若い成体動物を使用しているので、発生しにくいです。また、このプロトコルは、安価であり、その結果、遺伝的スクリーニングのための魅力的なこの技術をレンダリング一日で得られます。全体的に、これは、酸化ストレスに関連するヒト疾患のより良好な特徴付けに変換することができ、酸化ストレスシグナル伝達経路を理解するのに役立ちます。

Introduction

真核生物では、ミトコンドリアの電子伝達系で起こる酸化的リン酸化は、ATPの形でエネルギー生産の主な要因です。活性酸素種（ROS）は、このプロセスの自然な副産物です。シグナル伝達分子としての重要な役割にもかかわらず、過剰なROSは、DNA損傷、タンパク質のカルボニル化、および脂質酸化につながることができます。 ROS産生と解毒の間の不均衡は、エネルギーの枯渇につながる酸化ストレス、細胞の損傷を引き起こし、細胞死1,2をトリガします。酸化ストレスは老化および癌、糖尿病、心血管および神経変性疾患3-9を含む多くの生命を脅かす疾患の発展に貢献しています。

細胞は適切なROSレベルを維持し、酸化的損傷1,2に対してその成分を保護するために酵素的および非酵素的防御戦略を進化させてきました。スーパーオキシドジスムターゼ（SOD）の酵素はconveに第一幕RTスーパーオキシド後カタラーゼまたはペルオキシダーゼ酵素によって水に変換されるH 2 O 2へ。非酵素的な防衛戦略は、主に必須の細胞成分を保護する細胞高分子と比較して、ROSと速く反応する分子を含みます。 ROS解毒酵素の保護の役割にもかかわらず、いくつかのROS分子は、抗酸化防御機構を脱出し、酸化的損傷につながります。検出、修復、および損傷した細胞成分の分解は、酸化ストレス1,2間に本質的な防御戦略です。

ストレス耐性、特に酸化ストレスに関与するシグナル伝達経路は、進化的に高度10,11に保存されています。生物の条件が部分的にしか再現されている細胞培養実験とは異なり、モデル生物における酸化ストレスの研究12,13は、大きな意義を持っている。C.エレガンスは、CUL、容易かつ安価にすることができます自由生活線虫であります寒天培地上の細菌叢上tured。それは、（長さ約1mm）小型で、通常の遺伝子操作を容易に自己受精ふたなり、として成長します。それは大規模な遺伝子スクリーニング14を実行するための強力なツール作り、世代あたり約300の子孫を生成する、迅速なライフサイクルと高い生殖能力を有しています。 C.エレガンスゲノムが完全に配列決定され、遺伝子の40〜50％は、ヒトの疾患関連遺伝子15〜18の相同体であると予測されます。 RNAiを用いて、目的の遺伝子のノックダウンは、迅速かつCで簡単です。 エレガンス。遺伝子のダウンレギュレーションはE.動物に供給することによって達成することができます関心19のmRNAを標的とする二本鎖RNAを発現するプラスミドを保有する大腸菌細菌。そのため、大規模なRNAiスクリーニングを使用して、遺伝子機能の決意は、癌20,21を含むヒトの疾患を理解する上で大きな影響を与えています。

Oの研究Cでxidativeストレス耐性エレガンスは、酸化ストレスに対する抵抗13,22の保存されたメカニズムの同定につながりました。同定されたいくつかの経路は、低酸素、熱、および浸透圧ストレスなど、他のストレスに長寿と抵抗を調節する一般的な経路です。これらの経路は、インスリンシグナル伝達、TORシグナリング、およびオートファジーを含みます。その他の主な経路は、そのような、または損傷修復におけるこのような熱ショックタンパク質とシャペロン11,13,22としてスーパーオキシドジスムターゼ酵素とカタラーゼ酵素としてROSの解毒を伴います。

このプロトコルは、Cの酸化ストレスに対する抵抗性を決定する方法について説明します液体中のエレガンス 。我々は以前Cでflcn-1（ok975）の喪失時の酸化ストレスに対する抵抗性の増加を示しているので、私たちはプロトコルを示すためにflcn-1（ok975）と野生型動物を使用しましたエレガンス 23。また、この増加した抵抗性が依存することを示していますAMPKとオートファジーは、細胞生体エネルギーを改善し、ストレス耐性23を促進するシグナル伝達軸上。 PQは、反応性酸素種24を生成するために電子伝達系を妨害する酸化的ストレッサーです。同じアッセイを適合させることができ、他のROS源またはROSの生成化合物は、H 2 O 2およびロテノンとして使用することができます。同様のアッセイは、PQの低濃度は25,26を使用しているプレート上で開発されています。このアッセイの利点は、非常に高速であり、結果は、一日で得られることがあります。さらに、96ウェルプレート中の酸化ストレス耐性アッセイを行うために使用される液体の総体積はPQ含有プレートを調製するために使用される量に比べて低いです。したがって、使用PQの量は、液体アッセイであり、安価なアッセイをレンダリングし、有害廃棄物の生産を制限する、低いです。しかし、プレートアッセイと比較して、このアッセイの制限はラを含みます液体アッセイにおける食品のCKと空気と比較して、液体中の酸​​素濃度が低いです。これらは、いくつかのケースでは、結果に影響を与える可能性がある重要な要因です。したがって、このアッセイで得られた結果を支持することが推奨される酸化ストレス耐性の他の方法を使用して再現性を確認しました。

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Protocol

試薬の調製

  1. C.のためのメディアの準備エレガンスの成長（ここでは、野生型動物とflcn-1（ok975）変異動物）。
    1. トリスHCl、トリス塩基、Bactopetoneの31グラム、塩化ナトリウムを20gとコレステロールの0.08グラムの2.4グラムの5.5グラムを含有する修飾Youngren唯一バクトペプトン（MYOB）ドライミックスを準備します。振とうしながらよく混ぜます。
      注：この混合物は、MYOB培地10 Lを調製するのに十分です。
      注：通常の増殖培地（NGM）プレートはMYOB板27の代わりに使用することができます。しかし、同じタイプのプレートは、系統間の独立した反復間有効な比較のために使用されるべきです。このプロトコルでは、我々は唯一のMYOBのプレートを使用していました。
    2. MYOB乾燥混合物の6グラム、寒天の17グラムを追加することで、MYOB媒体の1 Lを調製し、122℃で45分間、H 2 O、オートクレーブで1 Lに構成しています。プレートを注ぎ、室温で2日間乾燥させてください。
    3. 無菌技術を用いて、cultu 100mlの接種E.とLBブロス培地の再大腸菌 OP50細菌と37℃でO / Nを成長させます。
    4. E.と種子MYOBプレート大腸菌 OP50細菌。それは48時間室温で成長できるようにします。
  2. RNAiを用いて遺伝子のダウンレギュレーションのための準備
    1. MYOBのRNAi送りプレートを準備します。ステップ1.1.1と1.1.2のように進みます。オートクレーブ処理後、培地を約55℃まで冷却し、1ミリリットルM 1のイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（IPTG）および1ミリリットルの100mMアンピシリンを追加することができます。
    2. ストリークE.大腸菌 HT115制御EVまたはプレート寒天アンピシリン上flcn-1特異的RNAi（50μg/ mlの）/テトラサイクリン（15μgの/ ml）のいずれかを発現するプラスミドで形質転換された細菌。 37℃で培養O / Nを成長させます。
    3. コロニーを選択し、Eを接種制御EVまたはflcn-1特異的RNAiのいずれかを発現し、37＆＃でLB /アンピシリン（50μg/ ml）中、O / Nでの培養を成長させるプラスミドで形質転換した大腸菌 HT115細菌176; C。
    4. E.によるシード·プレート大腸菌 HT115 EV細菌やHT115 flcn-1のRNAi細菌。
      注：使用前にRTでプレートを48時間にしてください。給電によるのRNAiノックダウンが有効になっている場合は、DS-RNA 28の送達の他の方法を使用します。
  3. パラコート（PQ）を使用して酸化ストレスを誘導します。
    1. 7 H 2 O·KH 2 PO 4、のNa 2 HPO 4、5gのNaClをし、MgSO 4 0.25gの6gの3gを混合することによってM9バッファーを調製します蒸留水で1リットルに起動します。 RTで122℃、店舗ボトルで45分間オートクレーブソリューション。
    2. アッセイの日に、M9 / PQを含む溶液を準備します。このプロトコルは、100 mMのPQを使用します（M9バッファーの4ミリリットルに溶解PQの0.1028グラムを、ウェル当たりM9 / PQの40μlの全96ウェルプレートを埋めます）。
      注意：PQが危険と毒性の高い化合物です。適切なガイドラインに従って処理します。
      注：最初に新しいのを実行しています電車や新たな条件、それは7-10時間以内に動物を殺すために使用するのに最適な濃度を決定するためにPQの濃度を増加さに生存をアッセイすることをお勧めします。

年齢同期L4人口の調製

  1. E.を接種した新鮮なMYOBプレートに20妊娠大人の雌雄同体を転送大腸菌 OP50細菌。アッセイの間に必要な虫の数に基づいて、いくつかのプレートを準備します。
  2. 彼らは6時間産卵することを可能にした後、白金線虫を用いて、母親を削除選びます。産卵数を評価するために顕微鏡下でプレートを確認してください。
  3. 卵が孵化し、48時間、20℃で成長させます。この時点で、動物が後期L4 /若年成人の段階にあります。同じステージの動物を選択し、PQ液含有ウェルに移します。
    注：48時間のインキュベーションが唯一の野生型動物と同様に成長する突然変異体に適用されるので、それが発達監視することが重要ですそれはそうでなければ、他のタイムラインを使用する必要があり、野生型の現像速度に準拠を保証するために、新たにテストされた変異体の割合。
  4. あるいは、同期技術​​を使用しています。次亜塩素酸溶液を用いて、L1幼虫ワームの同期人口を（;光から分離するためにアルミホイルで瓶を包む水25ml、5.25％の次亜塩素酸ナトリウムの125ミリリットル、4 M NaOHを50ミリリットル）を生成します。強烈な漂白がアッセイ中に動物の行動に影響を与える可能性があるので、このアッセイのために、それは、推奨されません。
    注意：ガイドラインに従って次亜塩素酸溶液を処理します。
    注：ダウン、目的の遺伝子を調節する特異的RNAi細菌を播種したRNAiプレートに母親の転送を除いて、セクション2で説明したように雌雄同体を同期させるためにRNAiを使用する場合。 RNAiのでノックダウンが弱い場合には、複数の世代のための給紙を推奨します。

3.酸化ストレス抵抗性アッセイを<実行/ P>

  1. 96ウェルプレートの各ウェルに100 mMのPQ溶液をピペット40μL（新しく調製）。すべての条件（処理、突然変異体など ）を複製するように、少なくとも12のウェルを使用してください。白金線虫ピックを使用して、十分に開始時刻と終了時刻を示すあらゆるに5-8 L4幼虫動物を転送します。
  2. 別の条件を開始すると、開始時刻と終了時刻を確認します。ワームを転送し、開始時刻から時間後に死亡した動物の得点間のインキュベーション時間で2​​0℃でプレートを置きます。
  3. 解剖顕微鏡を使用して、生存時間ごとにカウント。ゆっくりカウントを開始する前に、プレートを振ります。死んだ動物として、あっても高強度の光をスポットした後、移動しないワームを示しています。また、生きている動物の数を示しています。
    注：高倍率でワーム形状、尾と頭の動きを見ると、生きているから死んだ虫を決定するのに役立ちます。
  4. ほとんどのワームは死んでいるまで、この手順を時間ごとに繰り返します。
<Pクラス= "jove_title"> 4。毎回ポイントでの生存割合の決意

  1. すべてのウェルに移した動物の数を追加することによって、条件あたりの動物の数を計算します。破損または転送時に殺される動物を無視します。
  2. すべての時点について、条件ごとに死んだ動物の合計数（12ウェル中の死んだ動物の合計）を計算します。すべての時点について、死亡率（死亡した動物の数の動物の総数で割り、100を掛けた）及び生存率（100パーセントマイナス死）を計算します。
  3. このアッセイを、少なくとも3つの独立した回を繰り返します。

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Representative Results

比較すると、野生型C.エレガンスはflcn-1（ok975）変異動物を

ここでは、野生型Cの抵抗を決定するために、100 mMのPQを使用しました酸化ストレス、熱、および無酸素23に抵抗することが示されているflcn-1（ok975）動物と比較してエレガンス 。処理の4時間後、野生型の48.3パーセントはflcn-1で77.8パーセント生存率（ok975）動物と比較して生存しました。予想されるように、flcn-1（ok975）変異動物は、野生型（ 図2および表1）と比較して、100mMのPQに対してより耐性でした。

制御EVまたはflcn-1のRNAi細菌を与えた野生型動物を比較します

RNAiを用いflcn-1のダウンレギュレーション、前節で提示結果と同様に、100 mMのPQに対する耐性を増加させました。この結果は、RNAiを模倣機能喪失型Mを用いて、遺伝子機能のダウンレギュレーションを示しています utation（ 図2および表1）。

図1
Cで96ウェルプレート中の酸化ストレス耐性決意の方法の図1の回路図、図エレガンス 。

MYOBプレート上で増殖させた大腸菌 OP50細菌を与えた同期L4 /若い成体動物は、100mMのPQを含む96ウェルマイクロタイタープレートのウェルに移し、虫の多くは死んなるまで生存時間ごとに測定されます。のRNAiノックダウンの場合には、同じ手順を同期動物はIPTGを補ったプレート上で増殖させることを除いて続き、そしてE.が供給されます発現時に標的遺伝子をノックダウンしますプラスミドを有する大腸菌 HT115細菌。

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C.における酸化ストレスにFLCN-1が増加抵抗の図2.損失エレガンス 。 -動物対照で処理またはflcn-1 RNAiを重量の100 mMのPQ（A）重量とflcn-1（ok975）変異動物と（B）から（A、B）の生存率。

100mMのPQ％の生存率
1時間株のRNAi パーセント生存率（±SD） P値多数の実験ワームの合計数
重量 82.38±1.31 0.0002 3 210
flcn-1（ok975） 99.03±1.67 3 224
重量;コントロール 91.70±0.55 0.0462 3 202
重量; flcn-1（RNAiの） 95.93±2.48 3 207
2時間株のRNAi パーセント生存率（±SD） P値多数の実験ワームの合計数
重量 72.13±7.13 0.005 3 210
flcn-1（ok975） 96.33±2.28 3 224
重量;コントロール 80.27±5.34 0.0261 3 202
重量; flcn-1（RNAiの） 91.23±1.42 3 207
3時間株のRNAi パーセント生存率（±SD） P値多数の実験ワームの合計数
重量 55.37±4.72 0.0004 3 210
flcn-1（ok975） 87.00±1.36 3 224
重量;コントロール 70.77±3.50 0.0027 3 202
重量; flcn-1（RNAiの） 87.63±2.67 3 207
4時間株のRNAi パーセント生存率（±SD） P値多数の実験ワームの合計数
重量 48.30±6.39 0.002 3 210
flcn-1（ok975） 77.80±3.12 3 224
重量;コントロール 63.77±0.66 0.0122 3 202
重量; flcn-1（RNAiの） 80.57±6.68 3 207
5時間株のRNAi パーセント生存率（±SD） P値多数の実験ワームの合計数
重量 41.60±8.33 0.0062 3
flcn-1（ok975） 67.43±1.42 3 224
重量;コントロール 60.53±2.58 0.0313 3 202
重量; flcn-1（RNAiの） 71.53±5.24 3 207
6時間株のRNAi パーセント生存率（±SD） P値多数の実験ワームの合計数
重量 34.86±5.88 0.0021 3 210
flcn-1（ok975） 60.34±2.05 3 224
重量;コントロール 44.43±3.93 0.0042 3 202
重量; flcn-1（RNAiの） 62.13±3.44 3 207

表1の結果の概要と図2から、酸化ストレス抵抗性の統計分析。

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Discussion

C.エレガンスは、それが容易に培養することができるので、 生体内での遺伝的に酸化ストレス耐性を研究するための魅力的なモデル生物であり、急速に遺伝的に同一の子孫の多くをもたらします。酸化ストレス抵抗性を測定するための複数の方法は、以前に記載されており、それらは、PQ、ロテノン、H 2 O 2、及びジュグロン25,26,29-32などの種々のROS光源と培養プレートの補充に基づいています。ここでは、100 mMのPQを用いて96ウェルプレート中の液体中の酸​​化ストレス耐性を測定するプロトコルを説明します。同様のアッセイは、グリアら 33によって行われました。このアッセイは、他のROS源を用いて、液体中の酸​​化ストレスを研究するために適合させることができます。例えば、我々としても23数個のH 2 O 2濃度にflcn-1が増加する抵抗の損失を示しました。

このアッセイは、技術的な可能性がありLY運動性欠陥や、ドーパミントランスポーターのDAT-1 34に変異を保有する菌株として水泳誘発性麻痺の表現型を表示するいくつかの株のために挑戦。それは必ずしも減少し、酸化ストレス抵抗性ではなく、運動の欠陥を意味するものではありませんので、この場合は、移動できないことが混乱しています。また、死亡した動物のカウントが慎重に完了する必要があると研究者らは、Cに注意を払わなければなりませんこのような尾の動き、と頭の動き、あるいは遅い体の動きなどの行動の詳細をエレガンス 。 PQの濃度が高すぎると、動物の死亡速度は非常に高速である場合には、一方が遅く死亡率を得るためにPQの濃度を低下させることを検討してください。他の人がこのようなDAF-2変異動物37のように非常に耐性がありながら、いくつかの動物は、このようなAAK-2変異動物26,33,35,36として酸化ストレスに非常に敏感です。この場合、異なる共同で生存をアッセイPQのncentrationsを考慮すべきです。

RNAi実験のために、陰性の結果は、RNAi治療の非効率性に起因する可能性があります。この場合には、mRNAレベルの測定は、遺伝子ノックダウンに成功したかどうかを決定することが重要です。

このプロトコルは、さらに、C.の水泳行動を追跡する検出器を使用して酸化ストレス耐性のハイスループットスクリーニングに適合させることができます液体38,39でエレガンス 。これは、潜在的にCの耐久性の監視を可能にしますエレガンスと酸化ストレスの下で曲げ体の頻度などの遊泳行動。身体の動きの速い速度は、ストレス下での高いワームの適合性を示している可能性があります。

下等真核生物におけるストレス耐性を酸化的につながる経路が高度に進化にわたって保存されており、酸化ストレス関連疾患およびヒトの老化にリンクされています。 MitohormesisとバランスのとれたGENERATIOROSのnが寿命を延長し、健康スパンを向上させるために不可欠です。しかし、過剰なROSは、細胞、組織/器官、および生物に対して非常に損傷を与えます。変更された場合、最適なROSのバランスを提供することを、経路を見つけることはこのように不可欠であり、酸化ストレスに対する耐性を調節する薬物についてのスクリーニングは、共通分母を持つ複数の疾患の治療法の開発を助けることができる：酸化ストレス。 C.これらのスクリーニングを行いますエレガンスは、酸化ストレスにリンクされているヒト疾患の理解と治療のための大きな可能性と価値を持って有利な、高速で安価で、かつ信頼性の高い方法です。

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Acknowledgments

我々は、Cの線虫遺伝学センターを認めますエレガンス株 。資金援助は、テリー·フォックス·研究所から提供されました。また、RolandeとマルセルGosselin大学院学生の身分とマギル統合がん研究研修プログラムのがん研究FRN53888でCIHR / FRSQ訓練助成金からEPに付与されたサポートを認めます。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar bacteriological grade Multicell 800-010-LG
Bacteriological peptone Oxoid LP0037
Sodium chloride biotechnology grade Bioshop 7647-14-5
Cholesterol Sigma C8503-25G
UltraPure tris hydrochloride Invitrogen 15506-017
Tris aminomethane Bio Basic Canada Inc 77-86-1
IPTG Santa Cruz Biotechnology sc-202185A
Ampicillin Bioshop 69-52-3
Yeast extract Bio Basic Inc. 8013-01-2
Methyl viologen dichloride hydrate Aldrich chemistry 856177-1G
Petri dish 60 x15 mm Fisher FB0875713A
Pipet 10 ml Fisher 1367520
Potassium phosphate monobasic G-Biosciences RC-084
Magnesium sulfate heptahydrate Sigma M-5921
Sodium phosphate dibasic Bioshop 7558-79-4
Discovery v8 stereo zeiss microscope
96 well clear microtiter plate
flcn-1 RNAi source Ahringer Library

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細胞生物学、問題99、酸化ストレス、パラコート、
の酸化ストレス抵抗を測定<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em&gt; 96ウェルのマイクロタイタープレート中
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Possik, E., Pause, A. Measuring… More

Possik, E., Pause, A. Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates. J. Vis. Exp. (99), e52746, doi:10.3791/52746 (2015).

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