Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

الأنف المسحات لمكافحة الأنفلونزا A الكشف عن الفيروسات وعزل من الخنازير

Published: December 4, 2015 doi: 10.3791/53313
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Veterinary Preventive Medicine, The Ohio State University

Abstract

مراقبة لفيروسات الأنفلونزا A في الخنازير أمر بالغ الأهمية لصحة الإنسان والحيوان بسبب فيروس الانفلونزا يتطور بسرعة في السكان الخنازير وسلالات جديدة آخذة في الظهور باستمرار. الخنازير قادرة على أن تصاب الأنساب متنوعة من فيروس إنفلونزا أي جعلها تستضيف مهم لظهور وصيانة أنفلونزا رواية A سلالات الفيروس. أخذ العينات الخنازير في إعدادات متنوعة مثل المزارع التجارية الخنازير، المعارض الزراعية، وأسواق الحيوانات الحية مهم لتوفير رؤية شاملة لتعميم حاليا سلالات IAV. وقبل الوفاة تقنية أخذ العينات الحالية معيار الذهب (أي جمع مسحات الأنف) هي العمل المكثفة لأنه يتطلب ضبط النفس الجسدي من الخنازير. مناديل الأنف تنطوي على فرك قطعة من القماش عبر خطم الخنزير بدون أدنى درجات ضبط النفس من الحيوان. الأنف مسح إجراء بسيط لأداء و لا يتطلب موظفين ذوي البيطرية المهنية أو التدريب التعامل مع الحيوانات. While قليلا أقل حساسية من مسحات الأنف، ومعدلات الكشف عن الفيروسات والعزلة كافية لجعل الأنف مناديل بديل قابل للتطبيق لأخذ عينات الخنازير الفردية عندما يطلب الضغط المنخفض طرق أخذ العينات. ويحدد البروتوكول إجراءات والخطوات اللازمة لجمع الأنف قابلة للحياة مسح من خنزير الفردية.

Introduction

فيروسات الانفلونزا (IAV) تسبب أمراض الجهاز التنفسي في كثير من الأنواع، بما في ذلك الطيور الداجنة والخنازير والبشر. بسبب إعادة التشكيل من مجزأة IAV الجينوم الفيروسي التطور السريع يمكن أن يحدث وسلالات IAV جديدة تظهر في كثير من الأحيان. الخنازير هي الأنواع التي يمكن أن تكون بمثابة وعاء خلط لإعادة التشكيل من IAVs من الأنواع المضيفة متعددة. 1 يوجد حاليا ثلاثة أنواع فرعية رئيسية من IAV المتداولة عادة بين الخنازير في أمريكا الشمالية (H1N1، H1N2، H3N2)، ولكن مقدمات IAV متعددة من البشر لها أدى إلى تنوع IAV واسعة النطاق داخل تلك الأنواع الفرعية. وقد 2 التطور السريع لIAVs تصيب الخنازير واضحا منذ عام 1998 عندما متفارز الثلاثي IAV التي تحتوي على أجزاء من جينات من الفيروسات البشرية والطيور والخنازير 3 أصبح واسع الانتشار بين الخنازير في الولايات المتحدة. 4 الجين الداخلي ولا تزال شرائح من أن متفارز IAV الثلاثي واسع الانتشار بين IAVs اصابة حاليا الخنازير. 5

"> جميع أنحاء العالم، IAV هو سبب كبير من أمراض الجهاز التنفسي في الخنازير التي تشمل العلامات السريرية النموذجية الحمى وفقدان الشهية والخمول، والسعال وصعوبة التنفس والعطس ورشح الأنف وعدم زيادة الوزن. IAV يمكن أن يكون مكلفا ولا سيما لزرع المزارع حيث الإنجابية وقد تم توثيق فشل بسبب الحمى التي يسببها IAV والخنازير ضعيفة المولد. 6،7 داخل الولايات المتحدة، تم الكشف عن IAV عادة في قطعان الخنازير التجارية والتنوع الجيني الأنتيجين واسعة والتطور المستمر بين IAV تصيب الخنازير أعاق السيطرة على هذه فيروس 8-11

شواغل الصحة العامة عن ظهور سلالة IAV الوبائية الناتجة عن الاندماج تلك في الخنازير تحققت في عام 2009 عندما IAV الخنازير النسب التي تحتوي على مقاطع جينية من الثلاثي متفارز أمريكا الشمالية النسب الخنازير ومثل أنفلونزا الطيور، نسب الخنازير الأوراسي تسبب وباء عالمي في البشر. 12 باء فيروس (A (H1N1) pdm09) منذ ذلك الحينreassorted مع الخنازير المتوطنة IAV سلالات 13،14 وبعض هذه السلالات reassorted حديثا قد أحيلت إلى البشر. 15 تواتر الأحداث بوادر ظهوره وظهور سلالات جديدة IAV مع القدرة على إحداث جائحة يجعل المراقبة النشطة للفيروسات IAV في الخنازير الضروري، وخاصة في واجهة الخنازير البشري.

واجهة-الخنازير البشري مهم للثنائي الاتجاه بين الأنواع انتقال IAV. من الانسان الى الخنازير انتقال تحدث في إنتاج الخنازير التجاري هو المسؤول عن كمية كبيرة من IAV التنوع الموجودة حاليا في عدد السكان الخنازير. المعارض الزراعية هي أكبر إعدادات comingling من الناس والخنازير في الولايات المتحدة، ومواقع لنقل الحيوانية من IAV. 15-21 وفي عام 2012 عرفت، خلال اندلاع البديل H3N2 IAV، ذكرت 93٪ من الحالات حضور خلال المعرض الزراعي في الأيام التي سبقت ظهور المرض. 15 تحليل الجينوممن العزلات الفيروسية من الخنازير معرض مقارنة مع العزلات بشرية مؤكدة انتقال الحيوانية. الخنازير المعرض 21 مصاب IAV في كثير من الأحيان لا تظهر العلامات السريرية للمرض، 21-23 تشير إلى الحاجة إلى اختبارات تشخيصية مباشرة.

أخذ عينات من الخنازير سوء واضح وحدها لا تحدد بنجاح انتشار IAV في الخنازير ولا يمكن الاعتماد على تحديد سلالات جديدة من IAV الناشئة بين الخنازير. المراقبة النشطة ضرورية للغاية للكشف عن سلالات الناشئة من IAV في الخنازير وتقييم تهديدهم لكل من الخنازير والصحة العامة. معظم أنشطة المراقبة IAV طوعية، وبالتالي هناك حاجة الأساليب التخريبية الحد الأدنى. إجراءات جمع العينات الثلاث الرئيسية السابقة للوفاة لIAV تصيب الخنازير هي: مسحات الأنف والسوائل عن طريق الفم، وتقضي على الأنف. التوصيات الحالية لأخذ عينات الخنازير الفردية للكشف عن قائمة IAV ادراج الاصطناعية الألياف يميل مسحات في فتحتي الأنف كما الأسلوب المفضللجمع الإفرازات الأنفية والخلايا الظهارية. 24،25 لأن الخنازير قد يحاول تجنب هذا الإجراء، قام فريق من الموظفين المدربين يجب كبح جماح الخنازير إما يدويا أو مع فخا تبعا لحجم الحيوان. 26 عملية ضبط النفس هي شاقة لل الموظفين، والمجهدة للخنازير. بالإضافة إلى ذلك، وغالبا ما تشارك المعرض الخنازير في مسابقات متعددة في معرض ذلك التصور مزيد من التوتر على حيوان المنافسة يمكن أن تجعل أصحاب مقاومة للجهود المراقبة.

مع احتمالات الكشف IAV تتراوح 80-100٪ في IAV قطعان المصابة، أصبحت السوائل الفموية شعبية بديلة لالأنف مسحات للكشف الجزيئي للIAV في السكان من الخنازير. 27،28 بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن توفر السوائل الفموية نافذة أوسع من كشف IAV من مسحات الأنف بعد الإصابة الأولية. ومع ذلك، فقد كان IAV بمعزل عن السوائل الفموية إشكالية مع 50٪ فقط من فيروس محاولات العزل مما أدى إلى IAV الانتعاش. 29

باستخدام مناديل الأنف بدلا من مسحات الأنف أثناء الترصد IAV في الخنازير يتغلب على القيود المذكورة أعلاه. مناديل الأنف لا تتطلب استخدام فخا الزجرية ويمكن أن يؤديها من دون مشددا على الحيوانات أو الشهود من هذا الإجراء. هناك حاجة إلى التدريب التقني الحد الأدنى لجمع مناديل الأنف، الذي يسمح للمهنيين غير للطب البيطري، بما في ذلك أصحاب الخنازير، لجمع عينات المراقبة. مناديل الأنفية وقد سبق بالمقارنة مع مسحات الأنف للكشف وعزل الإنفلونزا يوصف فيروس (30) وبروتوكول مفصلة لهذا الأسلوب غير الغازية لأخذ العينات أدناه.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

جميع الخنازير المستخدمة في جمع البيانات التالية ممن تشملهم بالحماية اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام جامعة ولاية أوهايو (استخدام الحيوانات بروتوكول عدد 2009A0134-R1).

1. إعداد الفيروسية نقل متوسطة وجمع العينات قوارير

  1. إضافة 37 غرام من الدماغ القلب التسريب إلى 900 مل من المياه النقية وتخلط جيدا مع بقضيب ومحرك مغناطيسي بينما التدفئة إلى 70 درجة مئوية إلى حل تماما المسحوق.
  2. الأوتوكلاف مرق على 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. باردة على أعلى مقاعد البدلاء حتى مرق تصل درجة حرارة الغرفة. بردت في 4 درجات مئوية خلال الليل إذا لزم الأمر.
  3. حل، عن طريق خلط مع شريط مغناطيسي، 6،02 غرام من البنسلين G ملح الصوديوم و 10 غرام من كبريتات الستربتومايسين إلى 50 مل من الماء النقي في درجة حرارة الغرفة. إضافة الماء النقى إضافية لتبرزي حجم الكلي إلى 100 مل. تصفية حل من خلال 0.22 ميكرون غشاء polyethersulfone في زجاجة معقمة.
  4. جو معقم و مطهر إضافة البنسلين تصفيتها وحل الستربتومايسين في تبريد الدماغ القلب تسريب مرق وتخلط جيدا (بقضيب أو دوامة القارورة باليد) لجعل وسيلة النقل الفيروسي.
  5. جو معقم و مطهر اختبار الرقم الهيدروجيني للمتوسطة النقل الفيروسي. إذا لزم الأمر، وضبط درجة الحموضة إلى 7.4 ± 0.2 باستخدام حمض الهيدروكلوريك أو هيدروكسيد الصوديوم.
  6. أداء الاختبار وضمان الجودة على المدى المتوسط ​​النقل الفيروسي عن طريق اختبار للأنفلونزا A البروتين مصفوفة الفيروس عن طريق RRT-PCR، كما وصفها تشانغ وهارمون 22
  7. الاستغناء عن 5 مل من متوسطة نقل الفيروس إلى معقمة زجاجات البولي إيثيلين عالي الكثافة بسعة 8 مل. تسمية قارورة لاستخدامها في هذا المجال.
  8. تخزين قوارير جاهزة للاستخدام في معيار البرد صناديق في -20 درجة مئوية حتى جمع العينات.

2. جمع الأنف المسحات من الخنازير

  1. ذوبان الجليد العدد المناسب من قوارير مباشرة قبل جمع العينات. وستكون هناك حاجة قنينة واحدة لكل خنزير عينات. ذوبان في الغرفةدرجة الحرارة يأخذ حوالي 30-45 دقيقة. حافظ على قارورة إذابة باردة على كمادات الثلج حتى الاستخدام.
  2. دون المعدات الشخصية الحماية المناسبة وفقا لما تمليه الحالة (مثل المآزر، ويغطي الحذاء، تنفس، سدادات الأذن، وغيرها).
  3. دخول المنطقة الحيوان. إذا لزم الأمر، حصر خنزير على منطقة صغيرة ولكن لا توجد كبح. لا رووس يستريح الحيوانات.
  4. وضع على زوج من القفازات الامتحان التخلص منها. الحرص على عدم تلويث قفازات من خلال لمس الخنازير، والأشخاص أو الجماد.
  5. استخدام قفاز لإزالة العقيمة 5.08 سم × 5.08 سم (2 بوصة. × 2 بوصة) وسادة من القطن الشاش من إزار. وينبغي أن تستخدم منصات شاش معقم كلما كان ذلك ممكنا. قطع من الشاش ملفوفة بشكل فردي أكثر ملائمة للاستخدام من تلك ملفوفة مع اثنين من قطع من الشاش في الحزمة.
  6. عقد وسادة من القطن الشاش مع أطراف أصابع يد واحدة فضح أكبر قدر من لوحة ممكن لأخذ العينات.
  7. مسح الشاش عبر خطم الخنزير، مع الأخذالحذر للدخول في فتحتي الأنف الخارجية إن أمكن. جمع الإفرازات الأنفية مرئية (حوالي 1 مل) مع نفس الشاش.
  8. باستخدام نفس اليد، طي الشاش على عاتقها تسهيل وضع في قارورة تحتوي على المتوسط ​​النقل الفيروسي.
  9. باستخدام ناحية أخرى، وإزالة الغطاء من القنينة ووضع الشاش مطوية في قارورة. خلاصة القارورة ويهز القارورة لضمان اختلاط الشاش والمتوسطة النقل الفيروسي.
  10. إزالة القفازات ومكان في وعاء مناسب. تغيير القفازات بين كل خنزير.
  11. التحقق من هوية قارورة. رقم السجل تحديد الخنزير، والعمر، والجنس، وعلامات سريرية، والملاحظات الأخرى التي تعتبر ضرورية من قبل المحققين.
  12. هدئ العينات مباشرة بعد جمع. النظر في جعل aliquots من العينة قبل التجميد لمنع متعددة تجميد أذاب دورات. في أقرب وقت ممكن بعد جمع، ووضع العينات في الثلج الجاف لنقلها إلى المختبر. تخزين قوارير في -80° C حتى يتم بدء الاختبار.

3. الكشف عن فيروس إنفلونزا أي الحمض النووي

  1. ذوبان الجليد العينات في 37 ° C الجاف حمام حبة لمدة 5 دقائق ثم إنهاء ذوبان العينات على أعلى مقاعد البدلاء في درجة حرارة الغرفة لمدة 20-30 دقيقة. وإضافة في وقت واحد من عدة قوارير لحبات تسبب الحمام للحرارة. ينبغي توخي الحذر حتى لا افراط قارورة.
  2. إزالة 100 ميكرولتر من المتوسطة النقل الفيروسي لاستخراج الحمض النووي الريبي.
    1. استخدام إنتاجية عالية (96 شكل لوحة جيدا) منصة حبة المغناطيسي لاستخراج الحمض النووي الريبي من عدد كبير من العينات. 31
  3. استخدام الوقت الحقيقي المقايسات عكس الناسخ PCR للكشف عن أنفلونزا السريع فيروس (31).

4. عزل فيروس الانفلونزا من الأنف المسحات

  1. ذوبان الجليد العينات كما هو موضح أعلاه في القسم 3.1
  2. علاج عينات إذابة مع جنتاميسين سلفات (1000ميكروغرام / مل)، الأمفوتريسين B (22.5 ميكروغرام / مل)، وكبريتات كانامايسين (325 ميكروغرام / مل).
  3. تطعيم إلى مدين، داربي الكلى الناب (MDCK) الخلايا الظهارية كما هو موضح سابقا. 32

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الاستخدام الناجح لهذه الطريقة تعطي RRT-PCR النتائج التي، ترافق مع استخدام الرقابة الداخلية خلال استخراج الحمض النووي الريبي وRRT-PCR، وتظهر عينات لا تحتوي على مثبطات PCR من أي حطام البيئي التقطت خلال أخذ العينات. بعد عينة التلقيح، وينبغي أن يكون الفيروس الآبار العزلة خالية من الحطام البيئي مرئية من العينة. وهناك اتفاق معقول بين النتائج RRT-PCR والنتائج عزل الفيروس على أساس أن PCR غالبا ما تعطي معدل إيجابي IAV أعلى من عزل الفيروس لPCR بالكشف عن الحمض النووي الفيروسي، وليس الفيروس قابلة للحياة بالضرورة.

وتبين النتائج أن تقضي على الأنف هي بديل المفيد الانف مسحات، والتي هي تقنية أخذ العينات معيار الذهب الحالية لIAV. ادواردز وآخرون بعمل مقارنة مناديل خطم ومسحات الأنف التي تم جمعها من الخنازير في المعارض الزراعية في الولايات المتحدة خلال عام 2013. وفي تلك الدراسة، وأخذت عينات من الخنازير مع كل من الأنف وكانت مسحات الأنف ومناديل وعينات اختبار بالتوازي مع RRT-PCR وعزل الفيروس. ادواردز وآخرون. أفادت وقد تجلى التوافق لكلا كشف وعزل IAV التي كتبها RRT-PCR وعزل الفيروس في الخلايا المستزرعة من المقارنة بين 553 يقترن مسحة الأنف والأنف مسح العينات. 30 من هذه العينات المختبرة، 93.5٪ (517/553) نتائج الاختبار RRT-PCR كانوا في اتفاق (الجدول 1) و92،4٪ (511/553) كانت في العقد باستخدام عزل الفيروس في خلايا MDCK (الجدول 2). 21 حساسية RRT-PCR لمناديل الأنف يقدر بالمقارنة مع مسحات أنفية كان كانت 92.9٪ وحساسية العزلة IAV التقديرية للمناديل الأنفية مقارنة مع مسحات الأنف 82.9٪. ادواردز وآخرون، أشار في وقت سابق ان تقضي على الأنفية التي كانت إيجابية سواء من جانب RRT-PCR وعزل الفيروس وبلغ متوسط ​​انخفاض قيمة ط م (24.32) من مناديل الأنفية التي كانت إيجابية من قبل RRT-PCR ولكن سلبية لعزل الفيروس (ط = 31.96). 21

"jove_content" FO: المحافظة على together.within صفحة = "دائما"> الجدول 1

الجدول 1: كشف RRT-PCR من فيروس إنفلونزا أي من مسحات الأنف ومناديل خطم التي تم جمعها من الخنازير في 29 المعارض مقاطعة (من ادواردز وآخرون (2014) أداة من خطم مسح عينات للأنفلونزا A مراقبة الفيروس في السكان الخنازير معرض الأنفلونزا و. باقي الجهاز التنفسي الفيروسات 8 (5)، 574-579.

الجدول 2

الجدول 2: عزل فيروس الانفلونزا من مسحات الأنف ومناديل خطم التي تم جمعها من الخنازير في 29 المعارض مقاطعة (من ادواردز وآخرون (2014) أداة من خطم مسح عينات للأنفلونزا A مراقبة الفيروس في السكان الخنازير معرض الأنفلونزا والفيروسات التنفسية الأخرى. 8 (5)، 574-579).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

جمع عينات من الخنازير باستخدام مسحات أنفية ذات الرؤوس البوليستر وقد ثبت مفيدة في إجراء المراقبة IAV. ومع ذلك، فإن استخدام الإجراء مسحة الأنف يعيق جهود المراقبة بسبب استخدام المطلوبة فخا لضبط النفس. مناديل الأنف تمثل صقل التقنيات الحالية أخذ العينات الخنازير لتقليل الضغط على الناس وخنازير أثناء جمع العينات. في حين تم تطوير طريقة لوالتحقق من صحة الإعدادات في المعرض الخنازير، ويمكن تطبيقها بسهولة على حالات أخرى حيث كشف ما قبل الوفاة من IAV في الخنازير ضروري (أي الخنازير التجاري، أسواق الحيوانات الحية، البحوث الطبية الحيوية، الخ)

كما ذكر أعلاه، كان المحرك الرئيسي لهذا الأسلوب أخذ العينات السكان معرض الخنازير. خلال المعارض الزراعية، وأصحاب الخنازير تتنافس لكسب مكافآت مالية وسمعة سيئة على أساس التشكيل العام للخنزير. تشير الأدلة القولية أنه إذا لم تظهر خنزير جيدا، سwners قد يعزو ذلك إلى مستوى الإجهاد الخنزير أثناء ضبط النفس وجمع العينات. مناديل الأنفية هي مفيدة لجهود المراقبة التي تنطوي على الحيوانات الفردية أخذ العينات في الإعدادات التي تتطلب إجهاد الحيوان منخفضة. القدرة على تجنب الإصطياد والخنازير المؤلمة بشكل واضح أثناء تنفيذ مسح الأنف تقنية تحسنت القبول العام من جهود المراقبة IAV في المعرض الخنازير. 33 لطبيعة التوتر منخفضة من الأنف مسح الطريقة أيضا يجعل من مناسبة تماما لمزارع الخنازير التجارية. وعلاوة على ذلك، والأنف مسح طريقة يمكن أن تساعد في خفض التكاليف لأنها تتطلب عددا أقل من الأفراد، ولا ولاية التدريب المتخصص.

بالإضافة إلى الانف مسحات، وآخر شكل تستخدم عادة للكشف عن مسببات المرض في الخنازير التجاري ينطوي على السماح الخنازير التي يسكنون معا لمضغه على حبل القطن التي تم وضعها في القلم بهم. تم إيداعه السوائل الفموية التي يمكن جمعها من الحبل. 27،34،35 عن طريق الفم السائل الم Ù جمعالنتائج المجال الاقتصادي الموحد التي تعتمد على العينات التي تم جمعها من مجموعة من الحيوانات وله حدود لانتشار مسببات المرض أو انتقال الدراسات. بالإضافة إلى ذلك، كان IAV بمعزل عن السوائل الفموية الفقراء. وقد استخدمت 29 السوائل عن طريق الفم لالخنازير الفردية ولكن الوقت اللازم لتعليق الحبال وللخنازير لتشبع الحبال يمكن أن يكون غير فعال للموارد الموظفين. 36 عن طريق مناديل الأنف يسمح لل التقييم السريع للحيوانات الفردية. القدرة على حد سواء كشف وعزل IAV من مناديل الأنف توفر ميزة واضحة على السوائل عن طريق الفم. مثل أساليب أخذ العينات الأخرى، قد تكون مناديل الأنف الأكثر فعالية خلال إفراز الفيروس الذروة.

هناك بعض القيود المرتبطة الأنف يمسح الطريقة التي ينبغي النظر فيها قبل تنفيذ الإجراء. الخنازير حيوانات غريبة أن استئصال مع الخطوم بهم. في كثير من الأحيان هناك المزيد من الحطام جمعها على الأنف مسح، بالمقارنة مع مسحات الأنف، بسبب رطبة، والبيئة القذرةيمسح الاتصالات على السطح الخارجي للأنف خنزير. الاتصال بين الأنف مسح الركيزة ويقتصر الخنزير على سطح أكثر الخارجي من الجهاز التنفسي من مسحات الأنف، وهو الوضع الذي غالبا ما يؤدي إلى ترسب غير مقصود من الحطام البيئي (أي الفراش، والأعلاف، والأسمدة، الخ) على الأنف مناديل مبلله. ويمكن لهذه الملوثات البيئية تمنع PCR أو يسبب السمية الخلوية أثناء محاولات العزلة الفيروسية. قد تحتاج على نظافة المكان وأخذ العينات ومستويات الحطام البيئي التي سيتم تقييمها قبل الشروع في الأنف مسح البروتوكولات. حدوث التلوث البيئي من مناديل الأنف يعني أيضا أن IAV الكشف مع ربما لم تسلط هذه الطريقة من قبل الحيوان اختبار، وإنما كان موجودا في البيئة. في حين أن القدرة على عزو IAV عزل لحيوان معين قد لا يكون مصدر قلق للأنشطة المراقبة أو التشخيص القطيع مقرها، وهذا قد يكون وجود قيود للنظر في آر مختبر مقرهادراسات ansmission.

وثمة مسألة أخرى لا بد من معالجتها قبل اختيار هذا الأسلوب هو زيادة التخزين والنقل الفضائي أن أعدادا كبيرة من الأنف مسح وعينات يتطلب. قارورة تستخدم لمناديل هي أكبر بكثير من مستوى قوارير تخزين 2 مل المبردة المستخدمة لتخزين مسحة الأنف وسوف يستغرق حوالي 3-4 مرات أكثر الفضاء الثلاجة لمدة التخزين على المدى الطويل والفضاء برودة للنقل إلى المختبر. تخزين العينات لفترات طويلة من الوقت في درجة حرارة الغرفة، تحت التبريد، أو عينات ذوبان تجميد سوف كل نتيجة إلى انخفاض قابلية الفيروس. تحتاج المزيد من الحيطة الواجب اتخاذها عند ذوبان هذه العينات. لأن الشاش يمتص الكثير من متوسطة النقل الفيروسي، وعينات من الحرارة الزائدة بسرعة في حمام حبة الجاف. المحموم عن غير قصد عينات أثناء عملية الذوبان يمكن أن يؤدي أيضا إلى انخفاض في قابلية الفيروس. أيضا، بسبب انخفاض الانتعاش IAV في المختبر من مناديل شركاتعرب كورب لمسحات، فمن المستحسن أن الأنف مناديل ألا تستخدم في الحالات التي تتطلب حساسية عالية للانتعاش الفيروس قابلة للحياة. 30

الاستخدام الناجح لمراقبة IAV في الخنازير عن طريق الأنف مسح طريقة يمكن أن يؤدي إلى مزيد من سهولة أخذ العينات، وزيادة القبول من جهود المراقبة، وأقل من الضغط على الحيوانات. في المستقبل، قد يكون من المفيد لأخذ عينات الخنازير عند الدخول إلى المعرض أو للاختبار منخفضة التوتر الخنازير الفردية في قطعان الخنازير التجارية. هذه الطريقة يمكن أن يتم التحقيق للكشف عن مسببات الأمراض استخدام الجهاز التنفسي الأخرى في الخنازير. لأن الخنازير تلعب دورا حاسما في ظهور سلالات جديدة IAV، واصلت المراقبة النشطة للIAV الخنازير أمر بالغ الأهمية. على هذا النحو، يمكن هذه الطريقة تساعد في التحقيق كشف وبائية سلالات الناشئة من IAVs الرواية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BBL Brain Heart Infusion Becton, Dickinson and Company 211059
Penicillin G Sodium Salt MP Biomedicals, LLC 021194537 1500 u/mg
Streptomycin Sulfate AMRESCO LLC 0382
Gentamicin Solution Mediatech, Inc. 30-005-CR 50 mg/ml
Amphotericin B Solution Fisher S 24 25 250 ug/ml
Kanamycin Sulfate Teknova K2105 5000 ug/ml
TPP Rapid Filtermax System TPP Techno Plastic Products AG  99150
Nalgen Diagnostic Bottles Thermo Scientific 342002-9025 HDPE with white PP closure
Dermacea Gauze Sponge, 8 ply Covidien 441211 5.08 cm × 5.08 cm (2 in. × 2 in) 
Nitrile Exam Gloves Saftey Choice 19-170-010 (A-D)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ma, W., Kahn, R. E., Richt, J. A. The pig as a mixing vessel for influenza viruses: Human and veterinary implications. J. Mol. Genet. Med. 3 (1), 158-166 (2008).
  2. Nelson, M. I., Vincent, A. L. Reverse zoonosis of influenza to swine: new perspectives on the human-animal interface. Trends Microbiol. 23, (2015).
  3. Zhou, N. N., et al. Genetic reassortment of avian, swine, and human influenza A viruses in American pigs. J. Virol. 73 (10), 8851-8856 (1999).
  4. Webby, R. J., et al. Evolution of swine H3N2 influenza viruses in the United States. J. Virol. 74 (18), 8243-8251 (2000).
  5. Vincent, A., et al. Review of influenza A virus in swine worldwide: a call for increased surveillance and research. Zoonoses Public Health. 61 (1), 4-17 (2014).
  6. Karasin, A. I., Olsen, C. W., Anderson, G. A. Genetic characterization of an H1N2 influenza virus isolated from a pig in Indiana. J. Clin. Microbiol. 38 (6), 2453-2456 (2000).
  7. Zhou, N. N., et al. Emergence of H3N2 reassortant influenza A viruses in North American pigs. Vet. Microbiol. 74 (1-2), 47-58 (2000).
  8. Corzo, C. A., et al. Active Surveillance for Influenza A Virus among Swine, Midwestern United States, 2009-2011. Emerg. Infect. Dis. 19 (6), 954-960 (2013).
  9. Lorusso, A., et al. Genetic and antigenic characterization of H1 influenza viruses from United States swine from 2008. J. Gen. Virol. 92 (Pt 4), 919-930 (2011).
  10. Loving, C. L., et al. Efficacy in pigs of inactivated and live attenuated influenza virus vaccines against infection and transmission of an emerging H3N2 similar to the 2011-2012 H3N2v. J. Virol. 87 (17), 9895-9903 (2013).
  11. Vincent, A. L., et al. Efficacy of inactivated swine influenza virus vaccines against the 2009 A/H1N1 influenza virus in pigs. Vaccine. 28 (15), 2782-2787 (2010).
  12. Smith, G. J., et al. Origins and evolutionary genomics of the 2009 swine-origin H1N1 influenza A epidemic. Nature. 459 (7250), 1122-1125 (2009).
  13. Vijaykrishna, D., et al. Reassortment of Pandemic H1N1/2009 Influenza A Virus in Swine. Science. 328 (5985), 1529 (2010).
  14. Ducatez, M. F., et al. Multiple Reassortment between Pandemic (H1N1) 2009 and Endemic Influenza Viruses in Pigs, United States. Emerg. Infect. Dis. 17 (9), 1624-1629 (2011).
  15. Jhung, M. A., et al. Outbreak of variant influenza A(H3N2) virus in the United States. Clin. Infect. Dis. 57 (12), 1703-1712 (2013).
  16. Vincent, A. L., et al. Characterization of an influenza A virus isolated from pigs during an outbreak of respiratory disease in swine and people during a county fair in the United States. Vet. Microbiol. 137 (1-2), 51-59 (2009).
  17. Killian, M. L., et al. Simultaneous Infection of Pigs and People with Triple-Reassortant Swine Influenza Virus H1N1 at a U.S. County Fair. Zoonoses Public Health. 60 (3), 196-201 (2013).
  18. Wong, K. K., et al. Outbreak of influenza A (H3N2) variant virus infection among attendees of an agricultural fair, Pennsylvania, USA, 2011. Emerg. Infect. Dis. 18 (12), 1937-1944 (2011).
  19. Bowman, A. S., et al. Molecular evidence for interspecies transmission of H3N2pM/H3N2v influenza A viruses at an Ohio agricultural fair, July 2012. Emerg. Microbes. Infect. 1 (10), e33 (2012).
  20. Wells, D. L., et al. Swine influenza virus infections. Transmission from ill pigs to humans at a Wisconsin agricultural fair and subsequent probable person-to-person transmission. JAMA. 265 (4), 478-481 (1991).
  21. Bowman, A. S., et al. Swine-to-human transmission of influenza A(H3N2) virus at agricultural fairs, Ohio, USA, 2012. Emerg. Infect. Dis. 20 (9), 1472-1480 (2012).
  22. Bowman, A. S., Nolting, J. M., Nelson, S. W., Slemons, R. D. Subclinical influenza virus A infections in pigs exhibited at agricultural fairs, Ohio, USA, 2009-2011. Emerg. Infect. Dis. 18 (12), 1945-1950 (2012).
  23. Gray, G. C., et al. Influenza A(H1N1)pdm09 Virus among Healthy Show Pigs, United States. Emerg. Infect. Dis. 18 (9), 1519-1521 (2012).
  24. Van Reeth, K., Brown, I. H., Olsen, C. W. Ch. 40, Influenza virus. Diseases of Swine. Zimmerman, J. J. , Wiley-Blackwell. 557-571 (2012).
  25. Culhane, M. R., Detmer, S. E. Ch. 21, Sample types, collection, and transport for influenza A viruses of swine. Methods in Molecular Biology. Spackman, E. Animal Influenza Virus, Methods in Molecular Biology; 1161. 259-263 (2014).
  26. Sheldon, C. C., Sonsthagen, T., Topel, J. A. Animal Restraint for Veterinary Professionals. , Mosby. (2006).
  27. Detmer, S. E., Patnayak, D. P., Jiang, Y., Gramer, M. R., Goyal, S. M. Detection of Influenza A virus in porcine oral fluid samples. J. Vet. Diagn. Invest. 23 (2), 241-247 (2011).
  28. Goodell, C. K., et al. Probability of detecting influenza A virus subtypes H1N1 and H3N2 in individual pig nasal swabs and pen-based oral fluid specimens over time. Vet. Microbiol. 166 (3-4), 3-4 (2013).
  29. Romagosa, A., Gramer, M., Joo, H. S., Torremorell, M. Sensitivity of oral fluids for detecting influenza A virus in populations of vaccinated and non-vaccinated pigs. Influenza Other Respir. Viruses. 6 (2), 110-118 (2012).
  30. Edwards, J. L., et al. Utility of snout wipe samples for influenza A virus surveillance in exhibition swine populations. Influenza Other Respir. Viruses. 8 (5), 574-579 (2014).
  31. Zhang, J., Harmon, K. M. Ch. 23, RNA extraction from swine samples and detection of influenza A virus in swine by real-time RT-PCR. Animal Influenza Virus. Spackman, E. , Methods in Molecular Biology; 1161. 277-293 (2014).
  32. Zhang, J., Gauger, P. C. Ch. 22, Isolation of swine influenza virus in cell cultures and embryonated chicken eggs. Animal Influenza Virus. Spackman, E. , Methods in Molecular Biology; 1161. 265-276 (2014).
  33. Bowman, A. S., et al. The Inability to Screen Exhibition Swine for Influenza A Virus Using Body Temperature. Zoonoses Public Health. , (2015).
  34. Prickett, J. R., Kim, W., Simer, R., Yoon, K. J., Zimmerman, J. Oral-fluid samples for surveillance of commercial growing pigs for porcine reproductive and respiratory syndrome virus and porcine circovirus type 2 infections. J. Swine Health Prod. 16 (2), 86-91 (2008).
  35. Prickett, J., et al. Detection of Porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection in porcine oral fluid samples: a longitudinal study under experimental conditions. J. Vet. Diagn. Invest. 20 (2), 156-163 (2008).
  36. Pepin, B., Liu, F. F., Main, R., Ramirez, A., Zimmerman, J. Collection of oral fluid from individually housed sows. J. Swine Health Prod. 23 (1), 35-37 (2015).

Tags

علم المناعة، العدد 106، وتقنيات وإجراءات التشخيص والأنفلونزا فيروس A، الخنازير، الخنازير، والمراقبة، الخطم، والكشف عن العوامل المسببة للأمراض
الأنف المسحات لمكافحة الأنفلونزا A الكشف عن الفيروسات وعزل من الخنازير
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nolting, J. M., Szablewski, C. M.,… More

Nolting, J. M., Szablewski, C. M., Edwards, J. L., Nelson, S. W., Bowman, A. S. Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine. J. Vis. Exp. (106), e53313, doi:10.3791/53313 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter