Abstract
Sorveglianza di virus dell'influenza A in suina è fondamentale per la salute umana e animale perché virus evolve rapidamente nella popolazione suina e nuovi ceppi sono continuamente emergendo. Swine sono in grado di essere infettati da diversi lignaggi di virus influenzale che li ospita importanti per la formazione e il mantenimento di nuova influenza A ceppi di virus. Campionamento suini in contesti diversi, quali aziende agricole suini, fiere agricole e mercati di animali vivi è importante fornire una visione completa di ceppi attualmente in circolazione IAV. La corrente ante mortem tecnica di campionamento gold-standard (ossia la raccolta di tamponi nasali) è laborioso perché richiede contenzione fisica dei suini. Salviette nasale coinvolgere strofinando un pezzo di tessuto attraverso il muso del maiale con minima o nessuna moderazione dell'animale. Il nasale wipe procedura è semplice da eseguire e non richiede personale con veterinaria professionale o formazione trattamento degli animali. Wentre leggermente meno sensibile di tamponi nasali, tassi di rilevazione di virus e l'isolamento sono sufficienti per fare nasale pulisce una valida alternativa per il campionamento singoli suini quando sono richiesti bassi di stress metodi di campionamento. Il protocollo procedura delinea i passi necessari per raccogliere un nasale valida wipe da un maiale individuo.
Introduction
I virus influenzali A (IAV) causano malattie respiratorie in molte specie, tra cui uccelli domestici, suina, e gli esseri umani. A causa riassortimento del genoma segmentato IAV rapida evoluzione virale possono verificarsi e nuovi ceppi IAV emergere frequentemente. Maiali sono una specie che può servire come un vaso di miscelazione per riassortimento di IAV da più specie ospiti. 1 Al momento non ci sono tre principali sottotipi di IAV comunemente circolano tra nordamericano suina (H1N1, H1N2, H3N2), ma più introduzioni IAV da esseri umani hanno ha portato alla vasta diversità IAV all'interno di tali sottotipi. 2 rapida evoluzione della IAV infettare suina è evidente dal 1998, quando un reassortant tripla IAV contenente segmenti di geni provenienti da virus umani, aviari e suini 3 si diffuse tra i maiali negli Stati Uniti. 4 Il gene interna segmenti di quel triplice reassortant IAV rimangono altamente diffusa tra IAV attualmente infettare suina. 5
"> In tutto il mondo, IAV è una causa importante di malattia respiratoria dei suini in cui i segni clinici tipici comprendono febbre, anoressia, letargia, tosse, respiro affannoso, starnuti, scolo nasale e scarso aumento di peso. IAV può essere particolarmente onerosa seminare aziende agricole in cui riproduttiva fallimento a causa di IAV febbre indotta e suinetti deboli di origine sono stati documentati. 6,7 Negli Stati Uniti, IAV è comunemente individuato in allevamenti suini commerciali e l'ampia diversità antigenica e genomica e continua evoluzione tra IAV suina infettare ha ostacolato il controllo di questa virus. 8-11Salute pubblica teme la comparsa di un ceppo IAV pandemia derivante dal riassortimento nei suini sono stati realizzati nel 2009, quando un IAV suina lignaggio contenente segmenti di geni della stirpe suina nordamericana triplo riassortanti e il lignaggio suina aviaria-come eurasiatico ha causato una pandemia a livello mondiale negli esseri umani. 12 La virus pandemico (A (H1N1) pdm09) ha dalriassortito con suina endemica IAV ceppi 13,14 e alcuni di questi ceppi di nuova riassortito sono stati trasmessi di nuovo agli esseri umani. 15 La frequenza di eventi riassortimento e comparsa di nuovi ceppi IAV con potenziale pandemico rende sorveglianza attiva di far circolare i virus nei suini IAV imperativo, soprattutto all'interfaccia suina umana.
L'interfaccia suina-umano è importante per interspecie bidirezionale trasmissione di IAV. Human-to-suina trasmissione che si verificano nella produzione suina commerciale è responsabile di una grande quantità di diversità IAV attualmente presenti nella popolazione suina. Fiere agricole sono le impostazioni per la comingling di persone e suina negli Stati Uniti più grandi e sono noti siti per la trasmissione zoonotica di IAV. 15-21 Nel 2012, durante l'epidemia di una variante H3N2 IAV, il 93% dei casi segnalati partecipazione a una fiera agricola, nei giorni precedenti l'inizio della malattia. 15 Analisi genomicadi isolati virali da suini espositivi rispetto al isolati umani confermato trasmissione zoonotici. 21 Exhibition suina infetta da IAV spesso non presentavano segni clinici di malattia, 21-23 che indicano la necessità di test diagnostici diretti.
Il campionamento dei suini visibilmente malati da solo non identificare con successo IAV prevalenza nei suini e non può essere invocata per individuare nuovi ceppi di IAV emergenti tra maiali. La sorveglianza attiva è assolutamente necessario per il rilevamento di ceppi emergenti di IAV in suini e per valutare la loro minaccia sia per la suina e della salute pubblica. La maggior parte delle attività di sorveglianza IAV sono volontarie e, pertanto, sono necessari metodi minimamente dirompenti. Le tre principali procedure di raccolta del campione ante mortem per IAV infettare suina sono: tamponi nasali, fluidi orali, e salviette nasali. Le attuali raccomandazioni per il campionamento dei suini individuale per rilevare lista IAV l'inserimento di fibre sintetiche ribaltati tamponi nelle narici come il metodo preferitoraccogliere le secrezioni nasali e le cellule epiteliali. 24,25 Poiché suini possono cercare di evitare questa procedura, una squadra di personale addestrato deve trattenere suini manualmente o con un laccio seconda della taglia dell'animale. 26 Il processo di ritenuta è laborioso per il personale e stressante per i maiali. Inoltre, mostra suini sono spesso coinvolti in molteplici competizioni in una fiera così la percezione di stress aggiunto su un animale di concorrenza può offrire proprietari resistenti agli sforzi di sorveglianza.
Con probabilità di rilevazione IAV che vanno dal 80-100% in IAV allevamenti infetti, fluidi orali sono diventati una alternativa popolare per nasale tamponi per la diagnosi molecolare di IAV nelle popolazioni di suini. 27,28 Inoltre, fluidi orali possono fornire una finestra più ampia di rilevamento IAV di tamponi nasali dopo l'infezione iniziale. Tuttavia, IAV isolamento da fluidi orali è stato problematico con solo il 50% dei virus tentativi di isolamento con conseguente IAV recupero. 29
Utilizzando salviette nasali in luogo di tamponi nasali durante IAV sorveglianza nei suini supera i limiti di cui sopra. Salviette nasali non richiedono l'uso di un laccio di ritegno e possono essere eseguite senza stress agli animali o testimoni della procedura. Formazione tecnica minima è necessaria per raccogliere salviette nasali, che consente ai professionisti non veterinari, compresi i proprietari dei suini, per raccogliere i campioni di sorveglianza. Salviette nasali sono stati precedentemente confrontati con tamponi nasali per la rilevazione e l'isolamento di virus influenzale A 30 e il protocollo dettagliato per questo metodo non invasivo di campionamento è descritto di seguito.
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Protocol
Tutti i suini utilizzati per la raccolta dei seguenti dati sono stati protetti ai sensi della Istituzionale Animal Care and Use Committee Ohio State University (uso animale numero di protocollo 2009A0134-R1).
1. Preparazione di trasporto virale media e provate Fiale Collection
- Aggiungere 37 g di Brain Heart Infusion a 900 ml di acqua purificata e mescolare accuratamente con un ancoretta e agitatore magnetico mentre il riscaldamento a 70 ° C per sciogliere completamente la polvere.
- Autoclavare il brodo a 121 ° C per 15 min. Raffreddare sul banco fino brodo raggiunge la temperatura ambiente. Mettete in frigorifero a 4 ° C durante la notte se necessario.
- Sciogliere, mescolando con ancoretta magnetica, 6,02 g di sale sodico Penicillina G e 10 g di solfato di streptomicina in 50 ml di acqua depurata a temperatura ambiente. Aggiungere acqua purificata supplementare per portare il volume totale di 100 ml. Filtrare la soluzione attraverso una membrana polietersulfone 0,22 micron in una bottiglia sterile.
- Asetticamente aggiungere la penicillina filtrato e la soluzione di streptomicina nella raffreddato Brain Heart Infusion Broth e mescolare bene (o ancoretta pallone ricciolo mano) per rendere il mezzo di trasporto virale.
- Asetticamente testare il pH del mezzo di trasporto virale; se necessario, regolare il pH a 7,4 ± 0,2 con HCl o NaOH.
- Eseguire test di garanzia della qualità del mezzo di trasporto virale da test per l'influenza A proteina di matrice del virus da rRT-PCR, come descritto da Zhang e Harmon. 22
- Dispensare 5 ml di mezzo di trasporto virale in bottiglie di polietilene ad alta densità sterili con capacità da 8 ml. Etichetta le fiale per uso nel settore.
- Conservare le fiale pronti per l'uso in crio-scatole standard a -20 ° C fino a quando la raccolta del campione.
2. Raccolta di nasale Salviette da Swine
- Scongelare il numero appropriato di flaconcini immediatamente prima del prelievo; Sarà necessario un flaconcino per suino campionato. Scongelamento in cameratemperatura richiede circa 30-45 minuti. Tenere le fiale scongelate raffreddare su impacchi di ghiaccio fino al momento dell'uso.
- Don adeguati dispositivi di protezione personale come dettate dalla situazione (ad esempio, tuta, calzari, respiratore, tappi per le orecchie, ecc).
- Entra nell'area animale. Se necessario, limitare il maiale ad una piccola area ma senza frenare. Non svegliare riposo animali.
- Indossare un paio di guanti monouso di esame. Fare attenzione a non contaminare i guanti da maiali toccando, persone o oggetti inanimati.
- Usare una mano guantata per rimuovere una sterile 5,08 cm × 5,08 cm (2 in. × 2 in.) Tampone di garza di cotone dal suo involucro. Garze sterili devono essere usati quando possibile. Garze confezionati singolarmente sono più comodi da usare rispetto a quelli avvolto con due tamponi di garza per collo.
- Tenere il tampone di garza di cotone con la punta delle dita di una mano esporre come gran parte del pad come possibile per il campionamento.
- Pulire il tampone di garza attraverso il muso del maiale, presaattenzione per entrare nelle narici esterne, se possibile. Raccogliere visibili secrezioni nasali (circa 1 ml) con lo stesso tampone di garza.
- Utilizzando la stessa mano, piegare la garza su se stesso per facilitare il posizionamento nel flaconcino contenente mezzo di trasporto virale.
- Utilizzando invece, rimuovere il tappo dal flacone e posizionare la garza piegata nel flaconcino. Richiudere la fiala e agitare il flaconcino per garantire la miscelazione del garza e mezzo di trasporto virale.
- Togliere i guanti e posto in un contenitore adeguato. Cambiare i guanti tra ogni suino.
- Verificare l'identificativo fiala. Numero record di identificazione maiale, età, sesso, segni clinici, e altre note ritenute necessarie da investigatore.
- Raffreddare i campioni immediatamente dopo il prelievo. Considerare la possibilità aliquote del campione prima del congelamento per evitare più cicli di congelamento-scongelamento. Non appena possibile dopo la raccolta, posizionare i campioni in ghiaccio secco per il trasporto al laboratorio. Conservare le fiale a -80° C fino all'avvio test.
3. Rilevamento di virus influenzale A Nucleic Acid
- Scongelare i campioni a 37 ° C bagno branello secco per 5 min e quindi completare scongelamento i campioni sul banco a temperatura ambiente per 20-30 min. L'aggiunta contemporanea di più flaconi alle perline causerà la vasca al calore; si deve prestare attenzione per non surriscaldare i flaconi.
- Togliere 100 ml di mezzo di trasporto virale per l'estrazione dell'RNA.
- Utilizzare un high-throughput (96 formato pozzetti) piattaforma perla magnetica per l'estrazione di RNA da un gran numero di campioni. 31
- Utilizzare in tempo reale analisi della trascrittasi inversa PCR per il rilevamento rapido di influenza virus. 31
4. L'isolamento del virus influenzale A da nasali Salviettine
- Scongelare i campioni come descritto in precedenza nella sezione 3.1
- Trattare i campioni scongelati con gentamicina solfato (1.000mcg / ml), amfotericina B (22,5 mg / ml), e kanamicina solfato (325 mcg / ml).
- Seminare in Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) le cellule epiteliali, come descritto in precedenza. 32
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Representative Results
Uso di successo di questo metodo produce rRT-PCR risulta che, accompagnato con l'uso di un controllo interno durante l'estrazione di RNA e rRT-PCR, mostrano campioni non contenevano inibitori della PCR da eventuali detriti ambientali prelevati durante il campionamento. Dopo il campione inoculazione, virus sacche di isolamento dovrebbe essere libero di detriti visibile ambientale dal campione. Vi è ragionevole concordanza tra i risultati rRT-PCR e risultati di isolamento del virus con la consapevolezza che la PCR spesso produce un tasso positivo più elevato IAV di isolamento del virus perché PCR rileva acido nucleico virale, non necessariamente praticabile virus.
I risultati mostrano che salviettine nasali sono un'utile alternativa nasale tamponi, che sono la tecnica di campionamento attuale gold standard per IAV. Edwards et al. Eseguito un confronto di salviette muso e tamponi nasali che sono stati raccolti da suini a fiere agricole negli Stati Uniti nel corso del 2013. In questo studio, i maiali sono stati campionati con entrambi nasaletamponi e salviette nasali e dei campioni sono stati test in parallelo con rRT-PCR e isolamento del virus. Edwards et al. ha riferito la concordanza sia per il rilevamento e l'isolamento di IAV da rRT-PCR e l'isolamento del virus in cellule in coltura è stato dimostrato dal confronto tra il 553 abbinato tampone nasale e nasale pulire campioni. Di questi 30 campioni analizzati, il 93,5% (517/553) dei risultati della prova rRT-PCR erano in accordo (Tabella 1) e 92,4% (511/553) erano in accordo con isolamento del virus in cellule MDCK (Tabella 2). 21 La sensibilità rRT-PCR stimato per salviettine nasali rispetto ai tamponi nasali era 92,9% e la stima della sensibilità isolamento IAV per salviettine nasali rispetto a tamponi nasali era 82,9%. Edwards et al., Precedentemente osservato che salviettine nasali che erano positivi sia da rRT-PCR e isolamento del virus in media un valore inferiore Ct (24,32) di salviettine nasali che è positivo per rRT-PCR ma negativo per l'isolamento del virus (Ct = 31.96). 21
Tabella 1: rRT-PCR rilevamento del virus influenzale A da tamponi nasali e salviette muso raccolti da suini a 29 fiere di paese (da Edwards et al (2014) Utilità di muso pulire campioni per l'influenza A la sorveglianza del virus nella popolazione suina espositivi influenza e.. Altro respiratorio Virus 8 (5), 574-579.
Tabella 2: isolamento del virus influenzale A da tamponi nasali e salviette muso raccolti da suini a 29 fiere di paese (da Edwards et al (2014) Utilità di muso pulire campioni per l'influenza A la sorveglianza del virus nella popolazione suina espositivi influenza e altri virus respiratori.. 8 (5), 574-579.)
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Discussion
La raccolta di campioni da suini utilizzando tamponi nasali di poliestere con la punta si è dimostrato utile nel condurre sorveglianza IAV; Tuttavia, l'uso della procedura di tampone nasale ostacola gli sforzi di sorveglianza dovuti all'uso richiesto di un laccio per contenzione. Salviette nasale rappresentano un affinamento delle attuali tecniche di campionamento suina per minimizzare lo stress sulle persone e maiali durante la raccolta del campione. Mentre il metodo è stato messo a punto e validato in contesti mostra suina, può essere facilmente applicato ad altre situazioni in cui è necessaria la rilevazione ante mortem di IAV nei suini (ad esempio suini commerciale, i mercati di animali vivi, la ricerca biomedica, ecc)
Come notato sopra, il fattore principale di questa tecnica di campionamento è la popolazione mostra suina. Durante fiere agricole, proprietari di suini a gara per guadagnare premi finanziari e notorietà in base alla composizione complessiva del maiale. Prove aneddotiche indicano che se un maiale non mostra bene, owners possono attribuire al livello di stress del maiale durante moderazione e la raccolta del campione. Salviette nasali sono utili per gli sforzi di sorveglianza che coinvolgono singoli animali di campionamento in ambienti che richiedono basso stress degli animali. La capacità di evitare snaring e maiali visibilmente angoscianti durante l'esecuzione nasale tecnica pulire ha migliorato l'accettazione pubblica delle attività di sorveglianza IAV in mostra suina. 33 La natura a basso stress della nasale pulire metodo rende anche adatto per allevamenti suini commerciali. Inoltre, la nasale pulire metodo può aiutare a ridurre i costi perché richiede meno personale e non si occupa di formazione specializzata.
Oltre a tamponi nasali, un'altra forma comunemente usata di rilevamento del patogeno in suina commerciale significa permettere maiali che sono alloggiati insieme a masticare su una corda di cotone che è stato inserito nel loro recinto. Depositano fluidi orali, che possono essere raccolti dalla corda. 27,34,35 orale liquido raccolta produrisultati CES che si basano su campioni raccolti da un gruppo di animali e ha dei limiti per gli studi di prevalenza o di trasmissione dei patogeni. Inoltre, IAV isolamento da fluidi orali è stata scarsa. 29 fluidi orali sono stati utilizzati per i suini individuale, ma il tempo richiesto per appendere le corde e per i suini per saturare le corde possono essere inefficiente delle risorse di personale. 36 Uso salviettine nasali consente la rapida valutazione dei singoli animali. La capacità di rilevare ed isolare sia IAV da salviette nasali fornisce un netto vantaggio rispetto fluidi orali. Come altri metodi di campionamento, salviette nasali possono essere più efficaci in alta spargimento virale.
Ci sono alcune limitazioni associate al nasale wipe metodo che dovrebbe essere considerato prima di attuare la procedura. I maiali sono animali curiosi che radicano con i loro musi. Spesso c'è più detriti raccolti su un wipe nasale, rispetto ai tamponi nasali, a causa del ambiente umido sporcola salvietta contatti sul esterno del muso di maiale. Il contatto tra il substrato e nasale pulire il maiale è limitato ad una superficie più esterna del tratto respiratorio di tamponi nasali, una situazione che si traduce spesso in deposizione accidentale di detriti ambientale (cioè lettiera, alimenti, concime, ecc) sul nasale salviette. Questi contaminanti ambientali in grado di inibire la PCR o causare tossicità cellulare durante i tentativi di isolamento virale. La pulizia del luogo di campionamento ei livelli di detriti ambientali può avere bisogno di essere valutato prima di procedere con nasale pulire protocolli. Il verificarsi di contaminazione ambientale di salviette nasali significa anche che IAV rilevato con questo metodo non può essere versato dall'animale testato, ma era presente nell'ambiente. Mentre la capacità di attribuire un IAV isolare un particolare animale non può essere una preoccupazione per le attività di sorveglianza e diagnostica gregge base, questo può essere un limite da considerare per il laboratorio basato trstudi asmissione.
Un altro problema che deve essere affrontato prima di scegliere questo metodo è la conservazione e il trasporto maggiore spazio che un gran numero di campioni nasale pulire richiederanno. I flaconcini utilizzati per salviette sono molto più grandi delle fiale da 2 ml di stoccaggio criogenico standard utilizzati per lo stoccaggio tampone nasale e richiederanno circa tre a quattro volte più spazio di congelatore per la conservazione a lungo termine e lo spazio di raffreddamento per il trasporto al laboratorio. La conservazione dei campioni per lunghi periodi di tempo a temperatura ambiente, in frigorifero, o congelamento-scongelamento i campioni saranno tutti risultato una diminuzione della redditività virus. La cura supplementare deve essere presa quando scongelamento questi campioni. Poiché la garza assorbe gran parte del mezzo di trasporto virale, campioni si surriscaldano rapidamente in un bagno tallone secca. Inavvertitamente surriscaldamento i campioni durante il processo di scongelamento può anche tradursi in una diminuzione della redditività virus. Inoltre, a causa della ridotta recupero IAV in vitro da salviette bozzettoared di tamponi, si raccomanda che nasale non salviette essere utilizzato in situazioni che richiedono alta sensibilità per il recupero virus vitali. 30
Successo nell'uso di IAV sorveglianza nei suini da parte nasale pulire metodo può portare ad una maggiore facilità di campionamento, maggiore accettazione degli sforzi di sorveglianza, e meno stress sugli animali. In futuro, può essere utile per il campionamento maiali su ingresso a una fiera o per il test a bassa tensione di singoli suini in allevamenti suini commerciali. Questo metodo potrebbe essere indagato per l'uso rilevare altri agenti patogeni respiratori nei suini. Perché suina hanno un ruolo fondamentale nella nascita di ceppi nuovi IAV, continua sorveglianza attiva per IAV nei suini è critica. Come tale, questo metodo può aiutare nella rilevazione e di indagine epidemiologica di ceppi emergenti di nuovi IAV.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BBL Brain Heart Infusion | Becton, Dickinson and Company | 211059 | |
| Penicillin G Sodium Salt | MP Biomedicals, LLC | 021194537 | 1500 u/mg |
| Streptomycin Sulfate | AMRESCO LLC | 0382 | |
| Gentamicin Solution | Mediatech, Inc. | 30-005-CR | 50 mg/ml |
| Amphotericin B Solution | Fisher | S 24 25 | 250 ug/ml |
| Kanamycin Sulfate | Teknova | K2105 | 5000 ug/ml |
| TPP Rapid Filtermax System | TPP Techno Plastic Products AG | 99150 | |
| Nalgen Diagnostic Bottles | Thermo Scientific | 342002-9025 | HDPE with white PP closure |
| Dermacea Gauze Sponge, 8 ply | Covidien | 441211 | 5.08 cm × 5.08 cm (2 in. × 2 in) |
| Nitrile Exam Gloves | Saftey Choice | 19-170-010 (A-D) |
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