Immunology and Infection

豚からのインフルエンザAウイルスの検出および単離のための鼻ワイプ

Published: December 4, 2015 doi: 10.3791/53313

Jacqueline M. Nolting¹, Christine M. Szablewski¹, Jody L. Edwards¹, Sarah W. Nelson¹, Andrew S. Bowman¹

¹Department of Veterinary Preventive Medicine, The Ohio State University

Abstract

インフルエンザウイルスは急速に豚集団に進化し、新しい株が絶えず出現しているので、豚におけるA型インフルエンザウイルスのためのサーベイランスは、ヒトおよび動物の健康にとって非常に重要です。豚インフルエンザの多様な系統によってそれら新型インフルエンザウイルス株の出現と維持に重要ホスト作るウイルスを感染させることができます。このような商業豚農場、農業フェア、および生きた動物市場などの多様な設定で豚をサンプリングすると、現在IAV株を循環させる包括的なビューを提供することが重要です。現在のゴールドスタンダード生前サンプリング技術（鼻腔スワブのすなわちコレクション）は、豚の物理的な拘束を必要とするため、労働集約的です。鼻ワイプは、動物の無拘束に最小限で豚の鼻を横切っての生地片をこすり伴います。鼻の手順は実行が簡単で、プロの獣医や動物の取り扱い訓練を受けた人材を必要としないワイプ。 W鼻腔スワブよりわずかに小さい敏感hileは、ウイルス検出と分離率は、鼻が低応力サンプリングの方法が必要な場合は、個々の豚をサンプリングするための実行可能な代替を払拭作るために十分です。進行プロトコルは、個々の豚からワイプ実行可能な鼻を収集するために必要な手順を説明します。

Introduction

インフルエンザAウイルス（IAV）は家禽、ブタ、およびヒトを含む多くの種において、呼吸器疾患を引き起こします。迅速なウイルスの進化が発生する可能性があり、新たなIAV株が頻繁に出現するセグメント化されたIAVゲノムの再集合のために。豚は、複数のホスト種からIAVsの再集合のための混合容器としての役割を果たすことができる種である^。1は、一般的にヒトから北米の豚（H1N1、H1N2、H3N2）が、複数のIAVの紹介の中で循環するIAVの三大サブタイプはまだありきこれらのサブタイプ内の大規模なIAVの多様性につながった。豚に感染IAVsの²急速な進化は、人間、鳥や豚のウイルスからの遺伝子セグメントを含むトリプル再集合IAV ³は、米国で豚の間で広まった1998年以来、明らかになっている^{。4つの内部}遺伝子そのトリプル再集合体のIAVのセグメントは現在、豚に感染IAVsの間で非常に普及している残る^。5

">世界的に、IAVは、典型的な臨床徴候は、発熱、食欲不振、倦怠感、咳、呼吸苦しい、くしゃみ、鼻汁や不十分な体重増加が含まれている豚の呼吸器疾患の重要な原因である。IAVはどこ繁殖農場をまくために特にコストがかかる可能性が原因IAV誘発される発熱と弱い生まれの子豚への障害が報告されている^。6,7を米国内では、IAVは、一般的に商業豚の群れとIAV感染豚の間で広範な抗原およびゲノム多様性と進化を続ける中で検出されたが、この制御を妨げていますウイルス^。8-11

トリプル再集合体北米の豚の系統とユーラシアの鳥のような豚系統からの遺伝子セグメントを含む豚系統のIAVは、世界中の大流行を引き起こしたときに、2009年に実現された豚に再集合に起因するパンデミックIAV株の出現についての公衆衛生上の懸念ヒトでは¹²パンデミックウイルス（A（H1N1）pdm09が）ので、持っています流行豚で再集合IAVは^13,14の株およびこれらの新たに再集合株のいくつかは、人間に戻って送信されてきた^。15再集合イベントやパンデミック可能性を秘めた新しいIAV株の出現豚不可欠でIAVウイルス循環の積極的な監視を行う頻度を、特に豚ヒト界面で。

豚ヒューマンインタフェースは、IAVの双方向の種間伝播のために重要です。ヒト - 豚商業豚生産で発生する伝送は、豚の人口に現在存在IAV多様性の大規模な量を担当しています。農業フェアは、米国の人々と豚のcominglingの最大設定であり、IAVの人獣共通伝送のための部位を知られている。2012年には^15〜21、バリアントH3N2 IAVの発生時に、例93％の出席を報告しました前疾患の発症日の農業フェア^。15ゲノム解析人間分離株と比較して展示豚からのウイルス分離株のは、人獣共通感染伝送を確認した。IAVに感染した²¹展覧会の豚は、多くの場合、直接診断テストの必要性を示す病気^、21〜23の臨床徴候を示さありません。

目に見えて病気豚のサンプリングだけでは成功した豚でIAVの有病率を特定せず、豚の中で新興IAVの新しい株を同定するために依拠することはできません。アクティブサーベイランスは、ブタにおけるIAVの新興株の検出のために絶対に必要であると豚と公衆衛生の両方のための彼らの脅威を評価します。ほとんどのIAVの監視活動は自発的であり、したがって、最小限の破壊方法が必要とされています。 IAV感染豚のための3つの主要な生前のサンプル収集の手順は以下のとおりです。鼻腔スワブ、口腔液、および鼻ワイプ。 IAVリストに合成繊維の挿入を検出するために、個々の豚をサンプリングするための現在の推奨事項は、好ましい方法として鼻孔に綿棒をひっくり返し鼻汁および上皮細胞を収集する^。24,25豚は、この手順を回避しようとする可能性があるため、訓練を受けた人材のチームが手動または動物の大きさに応じて、スネアと豚を抑える必要があります^。26の拘束プロセスがために手間がかかります人事、および豚のためにストレスのたまります。競技動物に追加されたストレスの認識が監視努力の所有者が耐性にすることができるように加えて、展覧会の豚は、多くの場合、公正に複数の競技に関与しています。

IAVで80〜100％の範囲のIAV検出の確率が群れに感染すると、口腔液は、豚の集団におけるIAVの分子検出のための綿棒を鼻にする一般的な代替となっている^。27,28さらに、口腔液は、より広い窓を提供することができます初期感染後の鼻腔スワブよりIAV検出。しかし、口腔液からIAV分離は、IAで得られたウイルス分離の試みの50％のみで問題がありましたV回復^。29

豚におけるIAV監視中に鼻腔スワブの代わりに鼻ワイプを使用すると、上記の制限を克服します。鼻ワイプは拘束スネアの使用を必要としないと手続きの動物や証人を強調することなく実行することができます。最小限の技術研修を監視サンプルを収集するために、豚の所有者を含む非獣医専門家を可能にする、鼻ワイプを収集するために必要とされています。鼻ワイプは、以前にインフルエンザの検出および単離ウイルス³⁰鼻腔スワブと比較した、サンプリングのこの非侵襲的方法の詳細なプロトコルは、以下に記載されています。

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Protocol

以下のデータの収集に使用されるすべての豚は、オハイオ州立大学施設内動物管理使用委員会の下で保護されていた（動物使用プロトコル番号2009A0134-R1）。

1.ウイルス輸送培地の調製とサンプル収集バイアル

精製水900 mlにブレインハートインフュージョンの37グラムを追加し、70℃に加熱し、完全に粉末を溶解する一方で攪拌棒および電磁攪拌機を完全に混合します。
15分間121℃で培養液をオートクレーブ。培養液は、室温になるまで作業台の上に冷却します。 4℃の冷蔵庫で一晩に必要な場合。
磁気撹拌棒、ペニシリンGナトリウム塩6.02 gで、室温で精製水50mlに硫酸ストレプトマイシン10gと混合し、溶解します。 100ミリリットルの全量を、追加の精製水を追加します。滅菌ボトルに0.22μmのポリエーテルスルホン膜を通して溶液をろ過。
無菌的に冷却されたブレインハートインフュージョンブロス中に濾過ペニシリン及びストレプトマイシン溶液を加え、徹底的に（手で撹拌棒やスワールフラスコ）を混ぜウイルス輸送培地を作るために。
無菌的には、ウイルス輸送培地のpHを試験します。必要に応じて、HClまたはNaOHを用いて7.4±0.2にpHを調整します。
張とハーモンによって記載されているように、RRT-PCRによりインフルエンザウイルスマトリックスタンパク質をテストすることによって、ウイルス輸送培地上の品質保証テストを実行します^。22
8 mlの容量の無菌の高密度ポリエチレンボトルにウイルス輸送培地5mlを分配します。フィールドでの使用のためにバイアルにラベルを付けます。
サンプル収集まで-20℃で標準クライオボックスにすぐに使用バイアルに保管してください。

豚の鼻ワイプの2コレクション

コレクションをサンプリングする直前にバイアルの適切な数を解凍。 1バイアルは、サンプリングされた豚ごとに必要とされるであろう。部屋で解凍温度は約30〜45分かかります。解凍したバイアルを使用するまで氷上パックに冷静さを保ちます。
ドン適切な個人保護具を使用する状況によって決定される（例えばカバーオール、ブートカバー、呼吸器、耳栓）など。
動物の面積を入力します。必要に応じて、小さな領域に豚を閉じ込めるませんが、何の拘束ありません。動物休止奮起しないでください。
使い捨て検査用手袋のペアに入れてください。豚、人、または無生物に触れて、手袋を汚染しないように注意してください。
（中×2。2で）5.08センチメートル×無菌5.08センチメートルを削除するには、手袋をはめた手を使用してそのラッパーから綿ガーゼパッド。滅菌ガーゼパッドは可能な限り使用する必要があります。個別包装のガーゼパッドは、パッケージごとに2つのガーゼパッドで包まれたものを使用するより便利です。
サンプリングのための可能な限りパッドのできるだけ多くを露出する一方の手の指先で綿ガーゼパッドを持ちます。
、豚の鼻を横切ってガーゼパッドを拭きとります可能な場合は、外部鼻孔を入力するには細心の注意。同じガーゼパッドに見える鼻汁（約1ml）を収集します。
同じ手を使用して、ウイルス輸送培地を含むバイアル中に配置することを容易にするためにそれ自体の上にガーゼパッドを折ります。
もう一方の手を使用して、バイアルのキャップを取り外し、バイアルに折り畳まれたガーゼパッドを配置します。バイアルをおさらいし、ガーゼパッドおよびウイルス輸送培地の混合を確実にするために、バイアルを振ります。
適切な容器に手袋と場所を削除します。各ブタの間に手袋を変更します。
バイアルの識別子を確認してください。レコード豚の識別番号、年齢、性別、臨床徴候、およびその他の注意事項は、調査員が必要と認めました。
すぐに収集した後、サンプルを冷やします。複数の凍結融解サイクルを防ぐために凍結する前にサンプルのアリコートすることを検討してください。できるだけ早く収集した後、実験室への輸送のためにドライアイスの上にサンプルを置きます。 -80でバイアルを保存テストが開始されるまでCを°。

A型インフルエンザウイルス核酸の検出3。

5分間37℃で乾燥したビーズ槽内のサンプルを解凍し、その後20〜30分間室温でベンチ上にサンプルを解凍終えます。ビーズには、いくつかのバイアルの同時添加は、浴を加熱する原因となります。バイアルを過熱しないよう注意すること。
RNA抽出のためにウイルス輸送培地100μlを削除します。
1. 多数のサンプルからRNAを抽出するためのハイスループット（96ウェルプレート形式）磁気ビーズプラットフォームを使用してください^。31
迅速な検出インフルエンザウイルスのリアルタイム逆転写PCRアッセイを使用してください^。31

鼻ワイプからのインフルエンザAウイルスの4.絶縁

3.1節で前述したように、サンプルを解凍
千（硫酸ゲンタマイシンで解凍したサンプルを扱います/ mlの）、アンホテリシンB（22.5 / mlの）、および硫酸カナマイシン（325 / mlの）。
前述のようにマディンDarbyイヌ腎臓（MDCK）上皮細胞に接種する^。32

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Representative Results

この方法の使用の成功は、RRT-PCRは、任意の環境破片がサンプリング中に拾ったからRNA抽出およびRRT-PCRの間の内部コントロールの使用に伴う、ショーのサンプルはPCR阻害物質が含まれていなかった、ということの結果が得られます。サンプル接種後、ウイルス分離ウェルは、サンプルから見える環境の破片があってはなりません。 PCRはウイルス核酸、必ずしも生存ウイルスを検出したため、PCRは、多くの場合、ウイルス分離よりも高いIAV陽性率をもたらす理解した上でRRT-PCRの結果とウイルス分離結果との間に合理的な合意があります。

結果は、鼻ワイプがIAVのための現在のゴールドスタンダードサンプリング技術であり、鼻スワブ、に有用な代替物であることを示しています。エドワーズらは、その研究では2013年に米国の農業フェアでブタから採取した鼻のワイプと鼻腔スワブの比較を行った、豚は、両方の鼻でサンプリングしましたスワブおよび鼻ワイプとサンプルがRRT-PCRおよびウイルス分離と並行してテストしました。エドワーズら。培養細胞で検出および単離IAVのRRT-PCRによると、ウイルス分離の両方の一致は553対に鼻腔スワブおよび鼻の比較サンプルを拭くことによって実証されたと報告した。これらの試験されたサンプルのうち^30、93.5パーセント（553分の517） RRT-PCR試験の結果（表1）、92.4％（553分の511）は、MDCK細胞（ 表2）にウイルス分離を使用して、一致した一致したの²¹鼻ワイプの推定RRT-PCR感度鼻腔スワブと比較しました92.9パーセントと鼻腔スワブに比べて鼻ワイプの推定IAV分離感度は82.9パーセントでした。エドワーズらは、以前にRRT-PCRおよびウイルス分離によって両方陽性であった鼻ワイプは、ウイルス分離（CT = 31.96）のためのRRT-PCRにより陽性であるが陰性であった鼻ワイプより低いCt値（24.32）を平均化することを指摘しました。 ²¹

表1：インフルエンザのRRT-PCR検出ウイルス29郡フェアで豚から集め鼻腔スワブおよび鼻ワイプから（エドワーズらから鼻の（2014）ユーティリティは、インフルエンザ展示豚集団におけるウイルスのサーベイランスのためのサンプルを拭いインフルエンザと。他の呼吸器ウイルス8（5）、574-579。

表2：エドワーズらから29郡フェアで豚から集め鼻腔スワブおよび鼻ワイプからインフルエンザの分離ウイルス（鼻の（2014）ユーティリティは、インフルエンザ展示豚集団におけるウイルスのサーベイランスのためのサンプルを拭いインフルエンザとその他の呼吸器ウイルス。 8（5）、574-579。）

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Discussion

ポリエステルが先端に付いた鼻腔スワブを用いて、ブタからサンプルを収集すると、IAVの監視を行う際に有用であることが判明しました。しかし、鼻腔スワブ手順を使用すると、拘束用スネアの必要な使用による監視の努力を妨げています。鼻ワイプは、サンプル収集中の人や豚のストレスを最小限にするために、現在の豚のサンプリング技術の洗練を表します。この方法は、のために開発され、展示豚の設定で検証してきたが、それは簡単に豚におけるIAVの生前の検出が必要である他の状況（ すなわち商業豚、生きている動物市場、生物医学研究、など）にも適用することができます

上述したように、このサンプリング技術の主要なドライバは出品豚の人口となっています。農業フェア中は、豚の所有者は、豚の全体的な組成に基づいて、金融賞を受賞し、悪評を得るために競争しています。事例証拠は、O、豚がうまく表示されない場合はことを示していますwnersは拘束し、サンプル採取時に豚のストレスレベルに属性があります。鼻ワイプは低い動物のストレスを必要とする設定でサンプリング個々の動物を含むサーベイランスのために有用です。技術が展示豚におけるIAVの監視活動の社会的受容を向上させたワイプ鼻の実行中にスネアリングを回避する能力と目に見えて悲惨な豚^。33鼻の低応力性質は方法は、商業豚農場のためのそれを都合よく適合させ拭いてください。さらに、鼻のメソッドは、それは、より少ない人員を必要とし、専門的な訓練を強制しないため、コストを削減することができ拭きます。

鼻腔スワブに加えて、商業豚における病原体検出の別の一般的に使用される形態は、そのペンに配置された綿ロープでかむために一緒に収容されている豚を可能にすることを含みます。彼らはロープから採取することができる口腔液を付着させる^。27,34,35口腔液収集のproduを動物の群から採取したサンプルに基づいており、病原体の有病率や透過研究のための制限がありますされているCES結果。さらに、口腔液からIAV分離が悪くなっている^。29経口液剤は、個々の豚のために使用されてきたが、ロープを飽和させるためにロープを掛けると豚のために必要な時間は、人員リソースの非効率的である^。36鼻ワイプを使用することが可能個々の動物の迅速な評価。両方の鼻ワイプからIAVを検出し、単離する能力は、口腔液の上に明確な利点を提供します。他のサンプリング方法のように、鼻の拭き取り用品は、ピークウイルス排出の間に最も効果的であり得ます。

鼻に関連するいくつかの制限が手順を実装する前に考慮すべきである方法を拭きがあります。ブタは彼らのsnoutsでルート好奇心の動物です。多くの場合、鼻の上に集められ、よりデブリがあるため、湿った、汚れた環境で、鼻腔スワブと比較して、そこにワイプされ、豚の鼻の外側に接点を拭いてください。鼻の間の接触は、基板を拭いて豚は鼻の鼻腔スワブよりも気道、しばしば環境破片（ すなわち寝具、飼料、肥料など）の意図しない堆積につながる状況の複数の外部表面に限定されていますワイプ。これらの環境汚染物質は、PCRを阻害するか、またはウイルス分離の試みの間に細胞毒性を引き起こす可能性があります。サンプリング場所や環境破片のレベルの清浄度は、鼻がプロトコルを拭くに進む前に評価する必要があります。鼻ワイプの環境汚染の発生もIAVは、試験した動物によって小屋ではなく、環境中に存在していたされていない可能性があり、この方法で検出したことを意味します。特定の動物に隔離IAV属性する機能は、監視活動や群れに基づく診断のための関心事ではないかもしれないが、これは実験室ベースのtrのために考慮すべき制限することができますansmission研究。

この方法を選択する前に対処する必要があるもう一つの問題は、鼻が多数のサンプルが必要になることワイプ増加保管および輸送スペースです。ワイプに使用バイアルは、鼻スワブストレージに使用される標準的な2ミリリットル低温貯蔵バイアルよりもはるかに大きく、長期保存とバックラボへの輸送のためにクーラーのスペースは約3〜4倍の冷凍庫のスペースを取ります。冷蔵、常温で長時間のためのサンプルを保存、または凍結融解サンプルを意志ウイルスの生存率の減少ですべての結果。余分なケアは、これらのサンプルを解凍するとき注意が必要です。ガーゼは、ウイルス輸送培地の多くを吸収するので、サンプルは乾燥ビーズ浴中で急速に過熱します。不注意解凍プロセス中にサンプルを過熱することは、ウイルスの生存率の減少をもたらすことができます。また、のためにワイプカンプからインビトロでIAV回復を減少綿棒にared、それは鼻が生存ウイルス回収のための高感度を必要とする状況では使用しないでワイプすることをお勧めします^。30

鼻によるブタのIAVサーベイランスの成功した使用方法は、サンプリングのより容易になることがワイプは、動物での監視活動、およびより少ないストレスの受け入れを増加させました。将来的には、公正や商業豚の群れの個々の豚の低ストレステストのためにエントリー時に豚をサンプリングするために有用であり得ます。この方法では、豚の他の呼吸器病原体の検出の使用のために調査することができました。豚は新規IAV株の出現に重要な役割を果たしているため、極めて重要であるブタにおけるIAVのための積極的監視を続けました。このように、この方法は、新規IAVsの射出株の検出および疫学調査を助けることができます。

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Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BBL Brain Heart Infusion	Becton, Dickinson and Company	211059
Penicillin G Sodium Salt	MP Biomedicals, LLC	021194537	1500 u/mg
Streptomycin Sulfate	AMRESCO LLC	0382
Gentamicin Solution	Mediatech, Inc.	30-005-CR	50 mg/ml
Amphotericin B Solution	Fisher	S 24 25	250 ug/ml
Kanamycin Sulfate	Teknova	K2105	5000 ug/ml
TPP Rapid Filtermax System	TPP Techno Plastic Products AG	99150
Nalgen Diagnostic Bottles	Thermo Scientific	342002-9025	HDPE with white PP closure
Dermacea Gauze Sponge, 8 ply	Covidien	441211	5.08 cm × 5.08 cm (2 in. × 2 in)
Nitrile Exam Gloves	Saftey Choice	19-170-010 (A-D)