Introduction
Nanogestructureerde oppervlakken hebben onlangs trok veel aandacht vanwege hun verschillende mogelijke toepassingen, inclusief patronen, celkweek, het schoonmaken en het oppervlak switching. Bijvoorbeeld superhydrofobe oppervlakken geïnspireerd door de nanostructuur van de lotusblad en andere reagerende oppervlakken kunnen reageren op externe stimuli 1-4.
De Langmuir film is een van de meest bestudeerde polymeercoating. Een Langmuir film wordt gevormd door het droppen van amfifiele moleculen op een lucht-water-interface 5-8. De film kan vervolgens op een vast oppervlak worden overgedragen door fysische of chemische adsorptie, en de moleculaire conformatie op een stevige ondergrond kan worden gecontroleerd met behulp van verticale en horizontale overdracht methoden 9-12. De dichtheid van de Langmuir film kan nauwkeurig worden geregeld door het comprimeren van de lucht-water grensvlak. Onlangs heeft deze methode ook effectief gebleken voor het vervaardigen van nanometerschaal zee-eiland structures door gebruik amfifiele blokcopolymeren. De nanostructuren worden verondersteld te bestaan uit een kern van hydrofobe segmenten en een schil van hydrofiele segmenten 13-17. Bovendien is het aantal nanostructuren op een oppervlak geregeld door regeling van de oppervlakte per molecuul (A m) van het blokcopolymeer bij het grensvlak.
We hebben ons gericht op een originele, unieke scaffold-free tissue engineering aanpak, cellaag techniek, met behulp van een op temperatuur reagerende cultuur oppervlak. De ontwikkelde technologie is toegepast op regeneratieve therapieën voor verschillende organen 18. Een temperatuur reagerende kweekoppervlak werd vervaardigd door enten poly (N -isopropylacrylamide) (PIPAAm), een temperatuur reagerende molecuul op een oppervlak 19-27. PIPAAm en zijn copolymeren vertonen een lagere kritische oplossing temperatuur (LCST) in waterige media bij temperaturen rond de 32 ° C. De cultuur oppervlak vertoonde ook een temperatuur reagerende wisselspanning is tussen hydrofobiciteit en hydrofiliciteit. Bij 37 ° C, werd de PIPAAm-geënte oppervlak hydrofoob en cellen gemakkelijk bevestigd en verspreid over het oppervlak alsook conventionele weefselkweek polystyreen. Wanneer de temperatuur werd verlaagd tot 20 ° C, werd het oppervlak hydrofiel, en cellen spontaan los van het oppervlak. Daarom kon gekweekte confluente cellen op het oppervlak worden geoogst als een intacte blad door de temperatuur te veranderen. Deze cel adhesie en onthechting eigenschappen werden ook weergegeven door een oppervlak vervaardigd door Langmuir film coating voor laboratorium demonstratie 26, 27. Een Langmuir film van blokcopolymeren bestaande uit polystyreen (P (St)) en PIPAAm (St-IPAAm) werd vervaardigd. De Langmuir film met een Bk meter kan horizontaal worden overgedragen aan een hydrofoob gemodificeerde glassubstraat. Bovendien celadhesie aan en onthechting van het voorbereide oppervlak in reactie op temperatuur geëvalueerd.
_content "> We beschrijven protocollen voor de productie van een nanogestructureerde Langmuir film samengesteld uit warmte reagerende amfifiele blokcopolymeren op een glazen substraat. Onze werkwijze kan een effectieve fabricatietechniek voor organische nanofilms op verschillende gebieden van oppervlaktekunde en kunnen meer vergemakkelijken effectieve controle van celadhesie en op spontane loslating van het oppervlak.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Synthese van polystyreen blok poly (N -isopropylacrylamide) door twee stappen Reversible Addition-fragmentatie Chain Transfer (VLOT) radicale polymerisatie
- Ontbinden styreen (153,6 mmol), 4-cyaan-4- (ethylsulfanylthiocarbonyl) sulfanylpentanoic zuur (ECT; 0,2 mmol) en 4,4'-azobis (4-cyanovaleriaanzuur) (ACVA; 0,04 mmol) in 40 ml 1, 4-dioxaan. Bevries de oplossing in vloeibare stikstof onder vacuüm gedurende 15-20 min de reactieve species te verwijderen en geleidelijk ontdooien bij kamertemperatuur. Zorg ervoor dat de oplossing volledig is ontdooid en herhaal deze vries-pomp-ontdooi ontgassingscyclus drie keer.
- Haal de polystyreen (PSt) (Mw: 13.500) als macro RAFT middel door polymerisatie bij 70 ° C gedurende 15 uur in een oliebad.
- Precipitaat PSt macro RAFT middel met 800 ml ether en droog in vacuo.
- Ontbinden IPAAm monomeer (4,32 mmol), PSt macro RAFT middel (0,022 mmol) en ACVA (0,004 mmol) in 4 ml 1,4-dioxaan.
- Verwijderende zuurstof in de oplossing van de vries-pomp-ontdooi ontgassingscycli zoals vermeld in stap 1,1.
- Voer een polymerisatie bij 70 ° C gedurende 15 uur in een oliebad na ontgassen. Verkrijgen gesynthetiseerd St-IPAAm molecule (Mw: 32.800) op dezelfde wijze als de PSt macro RAFT middel.
2. Voorbereiding van Silanized hydrofobe Modified glassubstraten
- Wassen glassubstraten (24 mm x 50 mm) met een overmaat van aceton en ethanol en ultrasone trillingen gedurende 5 min verontreinigingen te verwijderen.
- Droog de substraten in een oven bij 65 ° C gedurende 30 minuten. Gebruik vervolgens zuurstofplasma (400 W, 3 min) aan de oppervlakken van de substraten bij KT geactiveerd.
- Dompel de substraten in tolueen die 1% hexyltrimethoxysilaan nacht bij RT om het substraat silaniseren.
- Was de gesilaniseerde substraten in tolueen en onder te dompelen in aceton gedurende 30 min om niet-gereageerd agenten te verwijderen.
- Ontlaten substraten gedurende 2 uur bij 110 ° C grondig immobiliseren de sjouw gezicht.
- Snij de gesilaniseerde substraten door een glassnijder tot 25 mm x 24 mm aan de celkweek gerechten (schotel size: φ35 mm) passen.
3. Voorbereiding van Langmuir Films en-Film overgebracht Surface
- Plaats de Langmuir film instrument in een kast om de ophoping van stof te voorkomen.
- Was de Langmuir trog (grootte: 580 mm x 145 mm) en barrières met gedestilleerd water en ethanol om verontreinigingen te verwijderen.
- Droog de goot en barrières door af te vegen met een handdoek zonder pluizen. Vul dan het dieptepunt met ongeveer 110 ml gedestilleerd water, en zet de barrières aan beide zijden van de trog. Merk op dat gedestilleerd water moet worden toegevoegd zonder morsen in de volgende stappen 3,5-3,13.
- Verhit een platina Wilhelmy plaat (perimeter: 39,24 mm) voor het bewaken van de oppervlaktespanning met een gasbrander totdat de plaat wordt rood en daarna wassen met gedestilleerd water om verontreinigingen te verwijderen. Hang de Wilhelmy plaat op een draad verbonden aande oppervlakte-druk-meetinstrument.
- Het oppervlak nul-druk-meetinstrument overeenkomstig protocol van de fabrikant. Druk de lucht-water interface op de bak door de barrières aan beide zijden van de goot tot de interface er ongeveer 50 cm 2 zonder druppels polymeer.
- Zuig kleine verontreinigingen tot het oppervlak druk is bijna 0 mN / m.
- Verplaats de barrières aan beide kanten, en voeg gedestilleerd water om te compenseren voor de daling van gedistilleerd water uit stap 3.6.
- Los 5 mg van het gesynthetiseerde St-IPAAm molecuul in 5 ml van een oplossing ontwikkeling chloroform.
Opmerking: Dichloormethaan of tolueen kunnen ook worden toegepast als het oplosmiddel. - Voorzichtig laten vallen 27 ul van St-IPAAm opgelost in chloroform op de trog met een micro-of micropipet.
- Na wachten op 5 min naar volledige verdamping van chloroform toe, bewegen beide barrières horizontaal naar St-IPAAm molecu comprimerenle aan het grensvlak. Handhaaf compressieverhouding van de barrières bij 0,5 mm / sec tot het doelgebied van 50 cm 2 komt.
Opmerking: Een snelle compressieverhouding veroorzaakt gebreken in de Langmuir film. - Meet de oppervlaktedruk (π) -A m isothermen met platina Wilhelmy plaat tijdens de compressie volgens het protocol van de fabrikant aan het oppervlak-druk-meetinstrument.
- Na het doelgebied grootte bereiken, houden het oppervlak gedurende 5 minuten om de St-IPAAm moleculen te ontspannen; de moleculen niet evenwicht onmiddellijk bereiken na compressie.
- Breng de Langmuir film op een hydrofoob gemodificeerd glassubstraat met een overdrachtsinrichting voor 5 min krachtig adsorberen de film. Bevestig de hydrofobe glassubstraat parallel aan het apparaat. Sluit het apparaat aan een uitlijning podium en loodrecht bewegen.
- Til het substraat horizontaal met de overdracht apparatuur en droog gedurende 1 dag in een desiccator.
4. het kweken van cellen en het optimaliseren van de Cel Adhesie en Detachement op de Langmuir Film Overgedragen Surface
- Om celsuspensies, cultuur runder halsslagader endotheelcellen (BAECs) met weefselkweek polystyreen (TCPS) bereiden eenderde confluentie bij 37 ° C in 5% CO2 en 95% lucht met Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) dat 10% foetaal runderserum (FBS) en 100 U / ml penicilline.
- Nadat confluentie is bereikt, behandel BAECs met 3 ml 0,25% trypsine-EDTA gedurende 3 min bij 37 ° C in 5% CO2 en 95% lucht.
- Deactiveren trypsine-EDTA door toevoeging van 10 ml van het DMEM bevattende 10% FBS, en het verzamelen van de celsuspensie in een 50 ml conische buis.
- Centrifugeer bij 120 xg gedurende 5 minuten, en zuig de supernatant. Resuspendeer de cellen met 10 ml van het DMEM.
- Plaats de St-IPAAm oppervlakken onder ultraviolet licht op een schone werkbank voor het steriliseren gedurende 5 min.
- Zaad van de herstelde cells de St-IPAAm oppervlakken bij een concentratie van 1,0 x 10 4 cellen / cm2 geteld door een wegwerp hemocytometer en observeer de cellen op het oppervlak van een microscoop uitgerust met een incubator bij 37 ° C met 5% CO2 en 95% lucht.
Let op: Steriliseer de St-IPAAm oppervlakken door ultraviolet licht uitgerust om een schone werkbank. - Record time-lapse beelden van hechtende BAECs ongeveer 24,5 uur bij 37 ° C door een fase-contrast microscoop met 10x vergroting. Na BAEC hechting, opnemen detachement van de BAECs van de Sint-IPAAm oppervlak bij 20 ° C gedurende ongeveer 3,5 uur.
5. cellaag Fabrication op de Langmuir Film-overgebracht Surfaces
- Cultuur BAECs op dezelfde wijze beschreven in Sectie 4.
- Seed totaal 1,0 x 10 5 cellen / cm2 op St-IPAAm oppervlakken en incubeer gedurende 3 dagen bij 37 ° C in 5% CO2. Confluente BAECs spontaan los bij 20 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Blok-copolymeren bestaande uit polystyreen en poly (N -isopropylacrylamide) (St-IPAAms) met specifieke moleculaire gewichten werden gesynthetiseerd door RAFT radicaalpolymerisatie. ECT bereid als een ketenoverdrachtsmiddel, zoals beschreven in Moad et al. 28. Twee St-IPAAm moleculen van verschillende PIPAAm ketenlengtes gesynthetiseerd en het verkregen blokpolymeren werden gekarakteriseerd door 1H nucleaire magnetische resonantie (NMR) en gelpermeatiechromatografie (GPC). De molecuulgewichten van St-IPAAms waren 32.800 en 67.900, met een nauwe molecuulgewichtsverdeling (1,31 en 1,50). Het monomeer omzettingen van polystyreen macro VLOT middel en PIPAAm bleken 17,4% en meer dan 85,0% bedragen. De gesynthetiseerde St-IPAAms werden genoemd St-IPAAm170 en St-IPAAm480, respectievelijk.
Langmuir films met verschillende gebieden per molecuul (A m) werden gefabriceerd op eenlucht-water-interface door het droppen van St-IPAAm moleculen opgelost in chloroform-oplossing (figuur 1A). Nadat ze St-IPAAm moleculen, werd de oppervlaktedruk van het lucht-water grensvlak vastgesteld op 0 mN / m en continu verhoogd door het sluiten van de interface tijdens compressie de barrières (Figuur 1B). Eventuele gebreken in Langmuir films gevormd op een lucht-water-interface kan worden afgeleid uit het π-A m isotherm. De bereide St-IPAAm Langmuir film werd overgebracht naar een hydrofoob gemodificeerde glazen substraat (St-IPAAm oppervlak) (figuur 1C). De film overgebracht oppervlak werd geëvalueerd door atomaire kracht microscopie (AFM). Figuur 2 toont AFM topografische beelden (1 x 1 um) van de St-IPAAm170 en St-IPAAm480 oppervlakken. Nanostructuren werden waargenomen op de St-IPAAm oppervlakken, terwijl dergelijke structuren slechts zelden waargenomen op de kale hydrofobe substraat. De grootte en vorm van de nanostructuren waren sterk dependent op A m en de samenstelling van St-IPAAm. AFM topografische beelden bevestigd dat de Langmuir films homogeen kan worden overgebracht op de hydrofoob gemodificeerde glassubstraat en de oppervlaktemorfologie kan worden geregeld door de moleculaire samenstelling en A m.
De stabiliteit van de St-IPAAm Langmuir film werd geëvalueerd door een verzwakte totale reflectie Fourier-transformatie infrarood spectroscoop (ATR / FT-IR). De hoeveelheid PIPAAms op de hydrofobe glassubstraat kan worden geschat door een ijklijn verkregen uit piekintensiteitsverhouding van 1000 cm -1 afgeleid van glas (Si-O) en 1650 cm -1 afgeleid van PIPAAm (C = O). De kalibratie lijn werd berekend uit een reeks van bekende hoeveelheden PIPAAm cast op het hydrofobe glas. De bedragen van PIPAAm van St-IPAAm170 (10 nm 2 / molecuul) en St-IPAAm480 (40 nm 2 / molecuul) op het substraat bleken 0,87 ug/ cm2 en 0,63 gg / cm 2, respectievelijk. De hoeveelheid PIPAAm op het oppervlak na wassen met gedestilleerd water was bijna hetzelfde als die op de oppervlakken zonder te wassen. Deze resultaten geven aan dat de gefabriceerde St-IPAAm oppervlakken waren stabiel in het water staat.
We vervolgens onderzocht de hechting en onthechting van runderen halsslagader endotheelcellen (BAECs) op de St-IPAAm oppervlakken. Time-lapse fotografie van hechtende en losmaken BAECs op de St-IPAAm480 oppervlak op 40 nm 2 / molecuul wordt getoond in de Animated figuur 1. Hechtende BAECs bij 37 ° C werden snel losgemaakt van zowel de St-IPAAm170 en St-IPAAm480 na het verminderen van de temperatuur tot 20 ° C. Het aantal hechtende cellen op St-IPAAm170 en St-IPAAm480 bij 37 ° C was 0,6 x 10 4 cellen / cm2 en 0,9 x 10 4 cellen / cm2, wat aangeeft dat het aantal hechtende cellens werd gemoduleerd door de samenstelling van de St-IPAAm oppervlak. Cell vellen kan ook worden teruggewonnen door het losmaken van confluent gekweekt BAECs van deze hotels in St-IPAAm oppervlakken. Het gewonnen cellaag werd gevisualiseerd als een tweedimensionale celstructuur (figuur 3). Cellen confluentie bereikten na drie dagen kweek op St-IPAAm170 en St-IPAAm480 oppervlakken bij 37 ° C en de cellaag werd snel hersteld na verlaging van de temperatuur van 37 ° C tot 20 ° C. Het effect van het molecuulgewicht en een meter van St-IPAAms on cellaag herstel samengevat in tabel 1. De levensvatbaarheid van celvellen werd geëvalueerd door trypan blauw kleuring na onthechting van BAECs blad. Cellen behandeld met trypsine-EDTA op het glassubstraat bij 37 ° C werden gebruikt als controle. Dode cel ratio's op St-IPAAm170, St-IPAAm480 en het hydrofobe glassubstraat als een controle werden berekend tot ongeveer 11,0%, 7,7% en 11,7% bedragen, respectievelijk. Deze resultaten gaven aan dat cell levensvatbaarheid werd nauwelijks beïnvloed door temperatuurverlaging.
Figuur 1. Bereiding van een warmteresponsieve Langmuir-film overgebracht oppervlak (A) De polystyreen-blok-poly (N -isopropylacrylamide) (St-IPAAm) chloroformoplossing werd voorzichtig neergezet op een lucht-water grensvlak. Het oppervlak druk werd gemeten tijdens compressie om eventuele gebreken in de Langmuir film op te sporen. (B) twee drempels gebruikt om de St-IPAAm moleculen op het grensvlak comprimeren tot een doelgebied van 50 cm2 werd bereikt. (C) Na compressie is een hydrofoob gemodificeerd dekglaasje substraat horizontaal geplaatst op het raakvlak met een uitlijning podium voor 5 min. Het substraat is horizontaal opgeheven en gedroogd gedurende 1 dag. Dit cijfer is enigszins gewijzigd ten opzichte van de publicatie van Sakuma et al. 27
Figuur 2:. Atomic Force Microscopy (AFM) topografische beelden (1 x 1 pm) van Langmuir-film overgebracht oppervlakken (St-IPAAm oppervlak) Linker paneel: nanogestructureerde oppervlakken van St-IPAAm170 met een meter van 10 nm 2 / molecuul. Rechter paneel: Nanogestructureerde oppervlakken van St-IPAAm480 met een A m van 40 nm 2 / molecuul. De AFM afbeeldingen werden verkregen in de modus tikken met een fosfaat-gedoteerd silicium cantilever met een veerconstante van 3 N / m en resonantiefrequentie van 70-90 kHz.
Tabel 1:. Bovine halsslagader endotheelcellen (BAEC) vel herstel van een Langmuir-film overgebracht oppervlak met verschillende dichtheden en PIPAAm ketenlengten "Good" vertegenwoordigt intact cell vel herstel. "Nauwelijks hersteld" betekent dat de cellen confluently gekweekt kunnen worden en de gekweekte cellen vertoonden weinig of geen losraken van het oppervlak zelfs na een temperatuurverlaging. "Zwak adhesie" betekent dat de cellen niet tot confluentie gekweekt bij 37 ° C gedurende 3 dagen. 
Figuur 3: Macroscopische beeld van een teruggewonnen cel vel op een Langmuir-film overgebracht oppervlak met St-IPAAm480 en een A m van 40 nm 
Animated Figuur 1: . (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden) Time-lapse foto's van BAECs hechting en onthechting op een Langmuir-film overgebracht oppervlak met St-IPAAm480 en een Am van 40 nm 2 / molecuul. De beelden werden verzameld op 2-min-intervallen en de verzamelde foto's werden verstrekt als een film in 960x snelheid. Deschaal bar in de film is 50 pm. St-IPAAm170 St-IPAAm480 3 [nm 2 / molecuul] 10 [nm 2 / molecuul] 40 [nm 2 / molecuul] 3 [nm 2 / molecuul] 10 [nm 2 / molecuul] 40 [nm 2 / molecuul] zwakke hechting Goed nauwelijks hersteld zwakke hechting zwakke hechting Goed
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een temperatuur reagerende oppervlak werd vervaardigd door de Langmuir-Schaefer-methode, en de oppervlakte-eigenschappen voor celadhesie / onthechting en cellaag herstel werden geoptimaliseerd. Bij gebruik van deze werkwijze voor de vervaardiging van oppervlakken, verschillende stappen zijn kritisch. De moleculaire samenstelling van de St-IPAAm moleculen heeft een groot effect op de oppervlaktestructuur en de stabiliteit van het oppervlak, en daarmee ook op celadhesie en onthechting. Met name dient de St-IPAAm moleculen een nauwe molecuulgewichtsverdeling hebben. In onze methode werden twee St-IPAAm moleculen met verschillende ketenlengten PIPAAm gesynthetiseerd door RAFT polymerisatie, waardoor regeling van het molecuulgewicht en de molecuulgewichtsverdeling.
Stappen moeten worden genomen om verontreiniging van de lucht-water-interface tijdens de bereiding van de St-IPAAm oppervlak te voorkomen gebreken in de nanostructuren te vermijden. Voor het laten vallen van polymeer moleculen aan de interface, contaminants moet worden opgezogen tot het oppervlak druk ongeveer 0 mN / m bereikt. Verontreiniging accumuleert rond de randen van de goot en Wilhelmy plaat. Omdat de Wilhelmy plaat had enkele besmetting op het oppervlak, werd gegloeid. Wanneer het papier Wilhelmy plaat wordt gebruikt, dient aspiratie stap op het grensvlak tweemaal herhaald tenminste. De π-A isotherm m bocht hangt ook af van de aanwezigheid van verontreinigingen in de lucht-water grensvlak. Wij bevelen aan dat de curve van de isothermen meer dan één keer worden verkregen voor de fabricage van de film. Omdat besmetting van de hydrofobe gemodificeerde glazen substraat ook kan optreden, moet het substraat geblazen met verse lucht of stikstofgas verontreiniging te verwijderen.
Consequent fabriceren Langmuir-film overgebracht oppervlakken (St-IPAAm oppervlak), de hydrofobe segment van een polymeer is belangrijk omdat de hydrofobe interactie tussen de Langmuir film en hydrofoob gemodificeerde glas i is de drijvende kracht van de reactie. In deze studie, omdat het blokcopolymeer bestond uit polystyreen, die sterk hydrofoob en hydrofiel PIPAAm bij kamertemperatuur, het werd stabiel overgedragen film gehecht aan het substraat zelfs onder water of celkweekomstandigheden. Dit geeft aan dat hydrofobe segmenten spelen een belangrijke rol bij het vervaardigen van robuuste St-IPAAm oppervlak.
Celadhesie en losmaking op een temperatuur reagerende oppervlak controle, de moleculaire samenstelling en precieze controle van de dichtheid van belang. In deze Langmuir-Schaefer methode kan de oppervlakte per molecuul (A m) polymeer gesynthetiseerd door een gegeven hoeveelheid daalde moleculen en het doelgebied van een lucht-water grensvlak worden geregeld door compressie. De A m dropping St-IPAAm moleculen kan in theorie worden berekend door de volgende vergelijking:
d / 53465 / 53465eq1.jpg "/>
waarbij A het oppervlak van het grensvlak, Mw het molecuulgewicht van St-IPAAms, c de concentratie van de chloroformoplossing, N een getal van Avogadro is, en V het volume van het polymeer gedruppeld. Nanoschaal zee-eiland structuren waargenomen op St-IPAAm oppervlakken na constructie omdat amfifiele polymeren zelforganiserende structuren een lucht-water grensvlak, zoals in eerdere studies 13-17. De grootte en hoeveelheid van structuren op nanoschaal werd gecontroleerd door A m en het molecuulgewicht van St-IPAAms.
Celadhesie en onthechting werden geëvalueerd op PIPAAm beklede oppervlakken vervaardigd door verschillende methoden, waaronder bestraling met een elektronenbundel, oppervlakte RAFT geïnitieerde polymerisatie en spincoaten 19-27. Omdat dichtheid, molecuulgewicht en PIPAAm structuur beïnvloeden cell hechting en onthechting, nauwkeurige technieken voor het fabriceren van PIPAAm-gecoate oppervlak zijn belangrijk. In deze Langmuir-Schaefer methode zouden dichtheid, molecuulgewicht en oppervlakte nanostructuren worden gecontroleerd zoals hierboven beschreven. Cel adhesie en onthechting aan de St-IPAAm oppervlakken werden drastisch beïnvloed door diverse A m en St-IPAAm moleculaire samenstelling, en een aantal voorwaarden van de St-IPAAm oppervlakken voor celadhesie en onthechting verder kan worden geoptimaliseerd. Deze resultaten geven aan dat deze werkwijze de wisselwerking tussen de St-IPAAm oppervlak en cellen kunnen beheersen.
Voor reproduceerbaar winnen van intacte cellaag, de vormgeving van een amfifiel polymeer belangrijkste. Wanneer er slechts hydrofiele polymeren worden vervaardigd op een oppervlak door een Langmuir-Schaefer methode worden gecoat polymeren gemakkelijk uit gewassen door gedestilleerd water of het kweekmedium. Dit resultaat gaf aan dat de zwakke hydrofobe polymeer niet worden gebruikt reproduceerbaar cellaag herstellen in deze method omdat het polymeer gemodificeerde oppervlak instabiel was in een water staat. Bij onze werkwijze, het hydrofiele segment in een amfifiel polymeer maakt robuuste fabricage op een oppervlak zonder uitwassen met een waterige oplossing. Bovendien, omdat de Langmuir film evenwijdig werd overgebracht naar een glazen substraat in deze studie werden nano-schaal zee-eiland structuren waargenomen op het oppervlak. Hoewel de structuur van Langmuir film op de basale zijde bekend is dan die op de apicale kant, werd de structuur bevestigd door een parallelle overdracht.
Celtherapie en regeneratieve geneeskunde zijn gericht op de mogelijkheid van genezing patiënten die niet reageren op andere behandelingen. Ons laboratorium heeft een originele, unieke scaffold-free tissue engineering aanpak ontwikkeld met behulp van cellaag techniek gefabriceerd op een temperatuur reagerende cultuur oppervlak met potentiële toepassingen in tissue engineering. Verschillende klinische studies met cel platen zijn already aan de gang en hebben succesvolle resultaten aangetoond voor verschillende soorten weefsels 29-31. Hoewel BAECs als celbron werden gebruikt celvellen, andere mobiele bronnen, waaronder stamcellen fabriceren, kan worden gebruikt om vellen op een St-IPAAm oppervlak fabriceren door het optimaliseren van de combinaties van A m en de moleculaire samenstelling van St-IPAAm moleculen. Deze niet-conventionele technologie zal niet alleen bijdragen tot de gemakkelijke productie van nanogestructureerde oppervlakken, maar ook de fundamentele celkweek strategieën voor gebruik in regeneratieve geneeskunde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| N-isopropylacrylamide | Kohjin | No catalog number | |
| Azobis(4-cyanovaleric acid) | Wako Pure Chemicals | 016-19332 | |
| Styrene | Sigma-Aldrich | S4972 | |
| 1,3,5-trioxane | Sigma-Aldrich | T81108 | |
| 1,4-Dioxane | Wako Pure Chemicals | 045-24491 | |
| DMEM | Sigma | D6429 | |
| PBS | Nakarai | 11482-15 | |
| Streptomycin | GIBCO BRL | 15140-163 | |
| Penicillin | GIBCO BRL | 15140-122 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma | T4174 | |
| FBS | Japan Bioserum | JBS-11501 | |
| BAECs | Health Science Reserch Resources Bank | JCRB0099 | |
| Cover Glasses | Matsunami Glass Industry | C024501 | |
| AFM NanoScope V | Veeco | ||
| 1H NMR INOVA 400 | Varian, Palo Alto | ||
| ATR/FT-IR NICOLET 6700 | Thermo Scientific | ||
| GPC HLC-8320GPC | Tosoh | ||
| TSKgel Super AW2500, AW3000, AW4000 | Tosoh | ||
| Langmuir-Blodgett Deposition Troughs | KSV Instruments | KN 2002 | KSV NIWA Midium trough |
| Nikon ECLIPSE TE2000-U | Nikon |
References
- Bae, Y. H., Kwon, I. C., Pai, C. M., Kim, S. W. Controlled release of macromolecules from electrical and chemical stimuli-responsive hydrogels. Makromol. Chem., Macromol. Symp. 70-71 (1), 173-181 (1993).
- Fu, Q., et al. Reversible control of free energy and topography of nanostructured surfaces. J. Am. Chem. Soc. 126 (29), 8904-8905 (2004).
- Nykanen, A., et al. Phase behavior and temperature-responsive molecular filters based on self-assembly of polystyrene-block-poly(N-isopropylacrylamide)-block-polystyrene. Macromolecules. 40 (16), 5827-5834 (2007).
- Sun, T., et al. Reversible switching between superhydrophilicity and superhydrophobicity. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 43 (3), 357-360 (2004).
- Shuler, R. L., Zisman, W. A. A Study of the behavior of Polyoxyethylene at the air-water interface by wave damping and other methods. J. Phys. Chem. 74 (7), 1523-1534 (1970).
- Kawaguchi, M., Sauer, B. B., Yu, H. Polymeric monolayer dynamics at the air/water interface by surface light scattering. Macromolecules. 22 (4), 1735-1743 (1989).
- Saito, W., Kawaguchi, M., Kato, T., Imae, T. Spreading solvent and temperature effects on interfacial properties of Poly (N-isopropylacrylamide) films at the air-water interface. Langmuir. 7463 (11), 5947-5950 (1996).
- Jheng, K. T., Hsu, W. P. Molecular weight effect of PMMA on its miscibility with PS-b-PEO at the air/water interface. J. App. Polym. Sci. 125 (3), 1986-1992 (2012).
- Biesalski, M. A., Knaebel, A., Tu, R., Tirrell, M. Cell adhesion on a polymerized peptide-amphiphile monolayer. Biomaterials. 27 (8), 1259-1269 (2006).
- Da Silva, A. M. P. S. G., Lopes, S. I. C., Brogueira, P., Prazeres, T. J. V., Beija, M., Martinho, J. M. G. Thermo-responsiveness of poly(N,N-diethylacrylamide) polymers at the air-water interface: The effect of a hydrophobic block. Journal of colloid interface sci. 327 (1), 129-137 (2008).
- Wang, S. Q., Zhu, Y. X. Facile method to prepare smooth and homogeneous polymer brush surfaces of varied brush thickness and grafting density. Langmuir. 25 (23), 13448-13455 (2009).
- Estillore, N. C., Park, J. Y., Advincula, R. C. Langmuir−Schaefer (LS) macroinitiator film control on the grafting of a thermosensitive polymer brush via surface initiated-ATRP. Macromolecules. 43 (16), 6588-6598 (2010).
- Seo, Y. S., et al. Nanowire and mesh conformations of diblock copolymer blends at the air/water interface. Nano Lett. 4 (3), 483-486 (2004).
- Lu, Q., Bazuin, C. G. Solvent-assisted formation of nanostrand networks from supramolecular diblock copolymer/surfactant complexes at the air/water interface. Nano lett. 5 (7), 1309-1314 (2005).
- Nagano, S., Matsushita, Y., Ohnuma, Y., Shinma, S., Seki, T. Formation of a highly ordered dot array of surface micelles of a block copolymer via liquid crystal-hybridized self-assembly. Langmuir. 22 (12), 5233-5236 (2006).
- Perepichka, I. I., Borozenko, K., Badia, A., Bazuin, C. G. Pressure-induced order transition in nanodot-forming diblock. J. Am. Chem. Soc. 133 (493), 19702-19705 (2011).
- Wang, X. L., Ma, X. Y., Zang, D. Y. Aggregation behavior of polystyrene-b-poly(acrylicacid) at the air-water interface. Soft Matter. 9 (2), 443-453 (2013).
- Yamato, M., Okano, T.
- Rollason, G., Daviest, J. E., Sefton, M. V. Preliminary report on cell culture on a thermally reversible copolymer. Biomaterials. 14 (2), 153-155 (1993).
- Park, Y. S., Ito, Y., Imanishi, Y. Permeation control through porous membranes immobilized with thermosensitive polymer. Langmuir. 14 (4), 910-914 (1998).
- Kwon, O. H., Kikuchi, A., Yamato, M., Okano, T. Accelerated cell sheet recovery by co-grafting of PEG with PIPAAm onto porous cell culture membranes. Biomaterials. 24 (7), 1223-1232 (2003).
- Kikuchi, A., Okano, T. Nanostructured designs of biomedical materials: applications of cell sheet engineering to functional regenerative tissues and organs. J. Control. Release. 101 (1-3), 69-84 (2005).
- Fukumori, K., et al. Characterization of ultra-thin temperature-responsive polymer layer and its polymer thickness dependency on cell attachment/detachment properties. Macromol. biosci. 10 (10), 1117-1129 (2010).
- Takahashi, H., Nakayama, M., Yamato, M., Okano, T. Controlled chain length and graft density of thermoresponsive polymer brushes for optimizing cell sheet harvest. Biomacromolecules. 11 (8), 1991-1999 (2010).
- Nakayama, M., Yamada, N., Kumashiro, Y., Kanazawa, H., Yamato, M., Okano, T. Thermoresponsive poly(N-isopropylacrylamide)-based block copolymer coating for optimizing cell sheet fabrication. Macromol. Biosci. 12 (6), 751-760 (2012).
- Sakuma, M., et al. Control of cell adhesion and detachment on Langmuir-Schaefer surface composed of dodecyl-terminated thermo-responsive polymers. J. Biomater. Sci., Polym. Ed. 25 (5), 431-443 (2014).
- Sakuma, M., et al. Thermoresponsive nanostructured surfaces generated by the Langmuir-Schaefer method are suitable for cell sheet fabrication. Biomacromolecules. 15 (11), 4160-4167 (2014).
- Moad, G., Chong, Y. K., Postma, A., Rizzardo, E., Thang, S. H. Advances in RAFT polymerization: the synthesis of polymers with defined end-groups. Polymer. 46 (19), 8458-8468 (2005).
- Nishida, K., et al. Corneal Reconstruction with Tissue-Engineered Cell Sheets Composed of Autologous Oral Mucosal Epithelium. N. Engl. J. Med. 351 (12), 1187-1196 (2004).
- Ohki, T., et al. Prevention of esophageal stricture after endoscopic submucosal dissection using tissue-engineered cell sheets. Gastroenterology. 143 (3), 582-588 (2012).
- Sawa, Y., et al. Tissue engineered myoblast sheets improved cardiac function sufficiently to discontinue LVAS in a patient with DCM: report of a case. Surg. Today. 42 (2), 181-184 (2012).
