Introduction
나노 구조화 된 표면은 최근에 의한 패터닝, 세포 배양, 세정, 표면 스위칭 포함한 다양한 응용 가능성으로 상당한 주목을 받고있다. 예를 들어, 연꽃 잎과 다른 반응 표면의 나노 구조에서 영감을 초 소수성 표면은 외부 자극 1-4에 반응 할 수있다.
랭 뮤어 막은 가장 널리 연구 폴리머 코팅이다. 랭 뮤어 막은 공기 - 물 계면에 5-8 양친 성 분자를 적하함으로써 형성된다. 필름은 물리적 또는 화학적 흡착에 의해 고체 표면에 전사 할 수 있으며, 고체 표면에 분자 형태는 수직 및 수평 전송 방법 9-12를 사용하여 제어 될 수있다. 랭 뮤어 막의 밀도는 정확하게 공기 - 물 계면을 압축에 의해 조절 될 수있다. 최근,이 방법은 관련된 과학 바다 섬 structur를 제조하는 효과가 입증되었습니다양친 성 블록 공중 합체를 이용하여 에스. 나노 구조는 소수성 세그먼트의 코어 및 친수성 세그먼트 13-17의 쉘 구성 간주됩니다. 또한, 표면에 나노 구조체들의 수는 인터페이스에서 블록 공중 합체의 분자 당 면적 (m)를 제어함으로써 조절된다.
우리는 온도에 응답하여 배양 표면을 이용하여 원래의 고유 지지체없는 조직 공학 방법, 세포 시트 공학에 초점을 맞추고있다. 개발 된 기술은 다양한 기관 (18)의 회생 치료에 적용되고있다. 온도 응답하여 배양 표면은 표면 상에 19 ~ 27 폴리 (N- 이소 프로필 아크릴 아미드의) (PIPAAm), 온도 반응 분자를 그 래프팅에 의해 제조 하였다. PIPAAm 및 공중 합체 전시 32 ° C에 가까운 온도에서 수성 매질에서 낮은 임계 용액 온도 (LCST). 배양은 표면 온도 응답 교류 직류을 나타내 소수성과 친수성 사이에. 37 ° C에서 PIPAAm 그래프트 표면은 친수성이되고, 세포는 쉽게 부착 표면 상뿐만 아니라, 종래의 조직 배양에서 증식 된 폴리스티렌. 온도를 20 ℃로 하강 될 때, 표면은 친수성이되고, 세포는 자발적으로 표면으로부터 분리. 따라서, 표면 상에 배양 세포 융합 온도를 변화시킴으로써 본래 시트로서 수확 될 수있다. 이러한 세포 접착 및 박리 특성도. 실험실 데모 26 27 랭 뮤어 필름 코팅하여 제조면에서 표시 한 폴리스티렌 (P (성)) 및 PIPAAm (세인트 IPAAm)로 이루어지는 블록 공중 합체의 랭 뮤어 필름을 제조 하였다. 특정의 m과 랭 뮤어 막을 가로 소수성 개질 된 유리 기판에 전사 할 수있다. 또한, 온도에 응답하여 상기 제조 된 표면으로부터 세포의 부착 및 박리를 평가 하였다.
_content "> 여기에서는 유리 기판 상에 열 응답하여 양친 성 블록 공중 합체로 이루어지는 나노 구조 랭 뮤어 필름의 제조에 대한 프로토콜을 설명한다. 우리의 방법은, 표면 과학의 다양한 분야에서, 유기 나노 필름에 효과적인 제조 방법을 제공 할 수 있고, 더 용이하게 할 수있다 에 대한 세포 부착을 효율적으로 제어하고 표면으로부터 자연 박리.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
폴리스티렌 - 블록 - 폴리 (N의 이소 프로필 아크릴 아미드) 2 단계 가역 추가-조각화 체인 전송 (RAFT) 라디칼 중합에 의해 1. 합성
- 스티렌 (153.6 밀리몰)을 용해시키고, 4- 시아 노 -4- (ethylsulfanylthiocarbonyl) sulfanylpentanoic 산 (ECT 0.2 mmol) 및 4,4'- 아조 비스 (4- 시아 노 발레르 산) (ACVA 0.04 mmol)을 1 mL의 40에서 1,4- 디 옥산. 반응 종을 제거하고 실온에서 서서히 해동 15-20 분 동안 진공 하에서 액체 질소 용액을 동결. 이 솔루션은 완전히 해동되어 있는지 확인이 동결 펌프 - 해동 탈주기를 세 번 반복한다.
- 오일 조에서 15 시간 동안 70 ° C에서 중합에 의해 매크로 RAFT 제로 : 폴리스티렌 (PST) (13,500 Mw)이옵니다.
- 침전물 PSt와 매크로 RAFT 에테르 800 mL를 제하고, 진공에서 건조.
- 1,4- 디 옥산 중 4 ㎖ 중의 IPAAm 단량체 (4.32 밀리몰) : PST 매크로 RAFT 에이전트 (0.022 mmol) 및 ACVA (0.004 밀리몰)을 녹인다.
- 풀다동결 - 펌프 - 해동 사이클에 의해 탈기 용액 중의 산소는 단계 1.1에 나와있다.
- 탈기 후, 오일 욕에서 15 시간 동안 70 ℃에서 중합 반응을 수행한다. 태평양 표준시 매크로 RAFT 에이전트와 동일한 방식으로 : 합성 세인트 IPAAm 분자 (32,800 Mw)이옵니다.
실란 소수성 수정 된 유리 기판 2. 준비
- 5 분 동안 아세톤, 에탄올 및 초음파 처리 과량의 워시 유리 기판 (24mm X 50mm)의 표면 오염물을 제거한다.
- 30 분 동안 65 ° C의 오븐에서 기판을 건조. 이어서 RT에서 기판의 표면을 활성화하기 위해 산소 플라즈마 (400 W, 3 분)를 사용한다.
- 기판 silanization합니다 위해 RT에서 밤새 1 % 헥실 트리 메 톡시 실란을 함유하는 톨루엔 기판을 담가.
- 톨루엔에 실란 화 기판을 세척하고 미 반응 에이전트를 제거하는 30 분 동안 아세톤에 몰입.
- 110 ° C에서 2 시간 동안 어닐링 기판을 철저들 고정하기urface.
- 세포 배양 접시 (: φ35 mm 접시 크기)에 맞게 25mm X 24mm에 유리 커터로 실란 화 된 기판을 잘라.
랭 뮤어 필름 및 필름 전송 표면 3. 준비
- 먼지의 축적을 방지하기 위해 캐비넷 랭 뮤어 막 악기를 놓는다.
- (: 580mm X 145mm 크기) 및 증류수와 오염 물질을 제거하기 위해 에탄올 장벽 랭 뮤어 통을 씻으십시오.
- lintless 타월로 닦아 저점과 장벽을 건조시킵니다. 그런 다음 증류수 약 110 ml의에 저점을 작성하고 통의 양쪽에 장벽을 설정합니다. 증류수가 3.5-3.13 다음 단계에 유출하지 않고 추가해야합니다.
- 플레이트는 적색으로 변할 때까지 가스 버너 표면 장력을 모니터링하고 오염물을 제거하기 위해 증류수로 세척 : 백금 빌헬 플레이트 (39.24 mm 경계)를 가열한다. 부착 와이어 빌헬 플레이트 일시표면 압력 측정 장비.
- 제조사의 프로토콜에 따라, 표면 압력 측정기구를 제로. 인터페이스 중합체 물기없이 약 50 ㎠로 될 때까지 골의 양측에 장벽 홈통에 공기 - 물 계면을 압축한다.
- 표면 압력까지 대기음 작은 오염 물질은 거의 0 MN / m이다.
- 양쪽에 장애물의 위치를 변경하고, 단계 3.6에서 증류수의 감소를 보상하기 위해 증류수를 추가합니다.
- 클로로포름 현상 용액 5ml에 합성 세인트 IPAAm 분자 5 ㎎을 녹인다.
참고 : 디클로로 메탄 또는 톨루엔과 같은 용매로서 사용될 수있다. - 조심스럽게 마이크로 실린 또는 마이크로 피펫을 사용하여 통에 클로로포름에 용해 세인트 IPAAm의 27 μl를 놓습니다.
- 5 분 동안 대기 한 후, 클로로포름의 완전한 증발을 허용 세인트 IPAAm의 molecu를 압축 수평으로 장벽을 이동계면 르. CM이 도달 할 때 (50)의 타겟 영역까지 0.5 mm / 초에서 장벽의 압축률을 유지한다.
주의 : 급속한 압축률 랭 뮤어 막 내의 결함을 야기한다. - 제조사의 프로토콜에 따라 압축하는 동안 표면 압력 측정기구에 부착 빌헬 백금 접시 표면 압 (π) -A m 등온선을 측정한다.
- 대상 지역의 크기에 도달 한 후, 세인트 IPAAm 분자 이완 할 수 있도록 5 분 동안 표면을 유지; 분자 압축 직후에 평형에 도달하지 않는다.
- 견고 필름 흡착 5 분 동안 전송 장치를 이용하여 소수성 개질 된 유리 기판에 랭 뮤어 막을 옮긴다. 단말기 병렬 소수성 유리 기판을 고정한다. 정렬 단계에 장치를 연결하고 수직으로 이동합니다.
- desiccato에서 1 일 동안 전송 장치 및 건조 수평 기판을 들어 올려아르 자형.
4. 세포를 배양하고, 랭 뮤어 필름 전송 된 표면에 세포 부착 및 박리 최적화
- 10 % 태아를 포함하는 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM)를 조직 배양 폴리스티렌 (FPC 기판)에 CO 2 및 95 % 공기, 5 %에서 37 ° C에서 삼분의 합류점에 세포 현탁 배양 소 경동맥 내피 세포 (BAECs)을 제조 소 혈청 (FBS) 및 100 U / ㎖ 페니실린.
- 합류점에 도달 한 후, CO 2 및 95 % 공기, 5 %에서 37 ° C에서 3 분 동안 0.25 % 트립신 EDTA 3 ㎖와 BAECs 치료.
- DMEM 10 % FBS를 함유하는 10 ㎖를 첨가함으로써 트립신 EDTA를 비활성화하고, 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 세포 현탁액을 수집한다.
- 5 분 120 XG에 원심 분리기 및 뜨는을 대기음. DMEM 10 mL로 세포를 다시하면 일시 중지합니다.
- 5 분 동안 살균 클린 벤치에 자외선 아래에있는 세인트 IPAAm 표면을 놓습니다.
- 회수 된 가전을 시드세인트 IPAAm에 LLS 일회용 혈구에 의해 계수 1.0 × 104 세포 / ㎠의 농도로 표면 및 5 % CO 2 및 95 %로 37 ℃ 배양기 구비 현미경으로 표면에 세포를 관찰 공기.
참고 : 클린 벤치에 장착 된 자외선에 의해 세인트 IPAAm 표면을 소독. - 10 배 확대와 위상 현미경에 의해 37 ° C에서 약 24.5 시간 동안 부착 BAECs의 녹음 시간 경과 이미지. BAEC 부착, 약 3.5 시간 동안 20 ° C에서 세인트 IPAAm 표면에서 BAECs의 기록 분리 후.
랭 뮤어 필름 전송 표면 5. 세포 시트 제작
- 동일한 방식으로 사용되는 배양 BAECs는 4 절에 설명.
- 세인트 IPAAm 표면에 1.0 × 105 세포 / ㎠의 총 시드 및 5 % CO 2에서 37 ℃에서 3 일간 배양한다. 합류 BAECs는 자발적으로 20 ° C에서 분리.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
폴리스티렌 특정 분자량의 폴리 (이소 프로필 아크릴 아미드의 N) (세인트 IPAAms)로 이루어지는 블록 공중 합체 RAFT 라디칼 중합에 의해 합성 하였다. Moad 외. (28)에 기재된 바와 같이 ECT는 연쇄 이동제로서 제조 하였다. 다른 PIPAAm 사슬 길이의 두 세인트 IPAAm 분자를 합성하고, 얻어진 블록 중합체 1 H 핵 자기 공명 (NMR) 및 겔 투과 크로마토 그래피 (GPC)에 의해 특징 하였다. 세인트 IPAAms의 분자량은 분자량 분포가 좁은 (1.31 및 1.50)으로 32,800 및 67,900이었다. 폴리스티렌 매크로 RAFT 에이전트와 PIPAAm의 단량체 전환은 17.4 % 이상 85.0 % 인 것으로 확인되었다. 합성 세인트 IPAAms는 각각 세인트 IPAAm170 및 세인트 IPAAm480 선정됐다.
분자 당 다양한 분야 (m)와 랭 뮤어 필름에서 제작 하였다클로로포름 용액 (그림 1A)에 용해 세인트 IPAAm 분자를 놓아 공기 - 물 인터페이스입니다. 세인트 IPAAm 분자를 적하 한 후, 공기 - 물 계면의 표면 압력이 0 MN / m로 고정하고, 연속 장애 (도 1b)를 압축하는 동안 인터페이스를 폐쇄함으로써 증가. 공기 - 물 인터페이스에 형성 랭 뮤어 필름의 결함은 π-A의 m 등온선에서 유추 할 수있다. 제조 세인트 IPAAm 랭 뮤어 막은 소수성 개질 된 유리 기판 (세인트 IPAAm면) (도 1C)에 옮겼다. 필름 전송 된 표면을 원자 힘 현미경 (AFM)으로 평가 하였다. (2) 세인트 IPAAm170 및 세인트 IPAAm480 표면의 AFM 지형 이미지 (1 × 1 ㎛)를 보여줍니다. 이러한 구조는 거의 노출 된 소수성 기판 상에 관찰되지 않았다 동안 나노 구조는, 세인트 IPAAm 표면에서 관찰되었다. 나노 구조의 크기 및 형상은 강력 하였다 dependenm에 t와 세인트 IPAAm의 구성. AFM 지형 이미지 랭 뮤어 막 균일 소수성 개질 된 유리 기판 상에 그 표면 모폴로지가 분자 조성 및 m에 의해 제어 될 수 있음을 전송할 수 있음을 확인 하였다.
세인트 IPAAm 랭 뮤어 필름의 안정성을 감쇠 전반사에 의해 평가 된 적외선 분광기 (ATR / FT-IR)를 푸리에 변환. 소수성 유리 기판 상 PIPAAms의 양은 1,000cm 피크 강도 비 -1 유리 (SI-O)과 1,650cm PIPAAm -1 (C = O)로부터 유래로부터 유도에서 얻은 검량선에 의해 추정 될 수있다. 교정 라인은 소수성 유리에 PIPAAm 캐스팅 확정 된 금액의 시리즈에서 계산 하였다. 세인트 IPAAm170 (10 nm의 2 / 분자)와 세인트 IPAAm480 기판 (40 nm의 2 / 분자)의 PIPAAm의 양은 0.87 μg의 것으로 밝혀졌다/ cm이 각각 0.63 μg의 / cm 2. 증류수로 세척 한 후, 표면에 PIPAAm의 양은 거의 세척없이 표면과 동일 하였다. 이 결과는 제조 세인트 IPAAm 표면이 물 상태 안정 것으로 나타났다.
우리는 옆에 부착와 세인트 IPAAm 표면에 소 경동맥 내피 세포 (BAECs)의 분리를 조사했다. 40 나노 2 / 분자의 세인트 IPAAm480 표면에 부착 및 분리 BAECs의 시간 경과 사진이 빠르게 감소 후 세인트 IPAAm170 및 세인트 IPAAm480 모두에서 분리 된 37 ° C에서 애니메이션 그림 1. 자기편 BAECs에 표시됩니다 20 ° C까지 온도. 37 ° C에서 세인트 IPAAm170 및 세인트 IPAAm480에 부착 세포의 수는 0.6 × 104 세포 / ㎠ 0.9 × 104 세포 / cm 2을 각각 나타내는 그 접착 세포 수들 세인트 IPAAm 표면의 구성에 의해 변조했다. 세포 시트는 이러한 세인트 IPAAm 표면에서 합류 배양 BAECs를 분리하여 복구 할 수 있습니다. 회수 된 세포 시트는 2 차원 셀 구조 (도 3)로 시각화 하였다. 세인트 IPAAm170 및 세인트 IPAAm480에 배양 3 일 후 합류에 도달 세포는 37 ° C에서 표면 및 세포 시트는 빠르게 20 ° C에 37 ° C의 온도를 감소 후 회수 하였다. 분자량 및 세포 시트의 회복 세인트 IPAAms의 m의 효과는 표 1에 요약되어있다. 세포 시트의 생존율 BAECs 시트를 박리 한 후 트립 판 블루 염색에 의해 평가 하였다. 37 ºC에서 유리 기판 상에 트립신 EDTA로 처리 된 세포는 대조군으로 사용 하였다. 세인트 IPAAm170, 세인트 IPAAm480 및 제어와 같은 소수성 유리 기판에 죽은 세포의 비율은 각각 11.0 %, 7.7 %, 11.7 %로 계산되었다. 이러한 결과는 세륨 지시LL 생존 거의 온도 저하에 의해 영향을하지 않았다.
그림 1 :. thermoresponsive 랭 뮤어 필름 전송 표면의 제조 (A) 폴리스타이렌 - 블록 - 폴리 (N의 이소 프로필 아크릴 아미드) (세인트 IPAAm) 클로로포름 용액 부드럽게 공기 - 물 인터페이스에 떨어졌다. 면압은 랭 뮤어 막에 결함을 검출하기 위해 압축 동안 측정 하였다. (B)는 두 개의 장벽이 도달 하였다 50cm의 타겟 영역까지 인터페이스 세인트 IPAAm 분자를 압축하는 데 사용 하였다. (C)의 압축 후에 소수성 개질 커버 유리 기판을 수평으로 5 분간 정렬 스테이지 계면에 배치 하였다. 기판을 수평으로 올려 1 일 동안 건조 하였다. 이 수치는 약간 Sak 적절 의한 출판물에서 수정되었습니다UMA 등. (27)
그림 2 :. 랭 뮤어 필름 전송 표면 (세인트 IPAAm면)의 원자 힘 현미경 (AFM) 지형 이미지 (1 × 1 ㎛) 왼쪽 패널 : 10 nm의 2 / 분자의 분 세인트 - IPAAm170의 나노 구조 표면. 오른쪽 패널 : 40 nm의 2 / 분자의 분 세인트 - IPAAm480의 나노 구조 표면. AFM 이미지는 스프링 (3) N / m의 상수 및 70-90 kHz의 공진 주파수의 인산 도핑 된 실리콘 캔틸레버를 사용 탭핑 모드를 얻었다.
표 1 :. 다양한 밀도와 PIPAAm 체인 길이와 랭 뮤어 필름 전송 표면의 소 경동맥 내피 세포 (BAEC) 시트 복구 "좋은"는 그대로 CE 마크를 나타냅니다LL 시트 복구. "단단하게 회복되지"세포 배양 confluently 수와 배양 된 세포도 온도의 감소 후에 표면으로부터 거의 또는 전혀 박리가 보였다 것을 의미한다. "약한 접착력"셀을 3 일 동안 37 ° C에서 배양하여 합류되지 않았 음을 의미한다. 
그림 3 : 세인트 IPAAm480와 랭 뮤어 필름 전송 표면에 회수 된 세포 시트 및 40 나노의 분의 육안 이미지 
애니메이션 그림 1 : . (오른쪽 다운로드 클릭) 세인트 IPAAm480 40 나노 2 / 분자의 암과 랭 뮤어 필름 전송 표면에 BAECs 부착 및 분리의 시간 경과 사진. 이미지는 2 분 간격으로 수집하고, 수집 된 이미지는 960x 속도 동영상으로 제공되었다. 그만큼영화의 스케일 바는 50 μm의입니다. 세인트 IPAAm170 세인트 IPAAm480 3 nm의 2 / 분자] 10 나노 2 / 분자] 40 nm의 2 / 분자] 3 nm의 2 / 분자] 10 나노 2 / 분자] 40 nm의 2 / 분자] 약한 접착력 좋은 거의 회복되지 약한 접착력 약한 접착력 좋은
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
온도 응답 표면은 랭 뮤어 - 쉐퍼 방법에 의해 제조하고, 세포 부착 / 분리 및 세포 시트 회수 표면 특성이 최적화되었다. 표면의 제조에 본 방법을 사용할 때, 몇 가지 단계가 중요하다. 세인트 IPAAm 분자의 분자 조성물은 세포 부착 및 박리에 표면 구조에 큰 영향 표면의 안정성, 확장자를 갖는다. 특히, 세인트 IPAAm 분자는 좁은 분자량 분포를 가져야한다. 제안 된 방법에서, 상이한 PIPAAm 쇄 길이를 갖는 두 세인트 IPAAm 분자는 분자량 및 분자량 분포를 제어 할 수 RAFT 중합에 의해 합성 하였다.
단계 나노 구조물의 결함을 방지 세인트 IPAAm 표면의 제조 동안 공기 - 물 계면의 오염을 방지하기 위해주의해야한다. 인터페이스에 폴리머 분자를 삭제, contaminan 전표면 압력은 대략 0 MN / m에 도달 할 때까지 TS를 흡입한다. 오염은 저점 빌헬 플레이트의 가장자리 주위에 축적되는 경향이있다. 빌헬 판의 표면에 약간의 오염이 있었기 때문에, 그것은 어닐링 하였다. 용지 빌헬 플레이트가 사용되는 경우, 계면에서 흡입 공정 회 이상 반복되어야한다. π-m 등온 곡선은 공기 - 물 계면에서의 오염 물질의 존재에 의존한다. 우리 등온선의 곡선 필름 제조 전에 한 번 이상 획득 될 것을 권장합니다. 소수성 개질 된 유리 기판의 오염이 발생할 수 있기 때문에, 기판의 오염을 제거하기 위해, 신선한 공기 또는 질소 가스를 취입한다.
일관 랭 뮤어 막 전사 표면 (세인트 IPAAm면)을 제조하기 위해, 중합체의 소수성 부분이 중요하기 때문에 랭 뮤어 필름 및 소수성 개질 된 유리 I 간의 소수성 상호 작용 반응의 구동력이야. 블록 공중 합체의 소수성이 강한 폴리스티렌, 실온에서 친수성 PIPAAm로 구성 되었기 때문에 본 연구에서는, 전사 필름은 안정에도 물 또는 세포 배양 조건 하에서 기판에 부착시켰다. 이것은 소수성 세그먼트 강력한 세인트 IPAAm 표면을 제조하는 데 중요한 역할을한다는 것을 나타낸다.
온도 응답 표면에 세포 부착 및 분리를 제어하는 분자 조성 및 밀도의 정확한 제어는 모두 중요하다. 이 랭 뮤어 - 쉐퍼 방법에서, 분자의 감소 정량 및 공기 - 물 계면의 대상 영역으로 합성 중합체 분자 당 면적 (m)의 압축에 의해 제어 될 수있다. 세인트 IPAAm 분자 적하의 m은 이론적으로 다음 식에 의해 계산 될 수있다 :
D / 53465 / 53465eq1.jpg "/>
여기서, 인터페이스, M w의 지역이며 세인트 IPAAms의 분자량이고, C는 클로로포름 용액의 농도이며, N은 아보가드로 수이며, V는 폴리머 용액의 부피가 감소된다. 양친 매성 고분자는 공기 - 물 인터페이스에서 자기 조직 구조를 형성하기 때문에 이전의 연구 13-17에 기술 된 바와 같이 나노 바다 섬 구조, 제조 후 세인트 IPAAm 표면에서 관찰된다. 나노 구조의 크기와 양 m 및 세인트 IPAAms의 분자량에 의해 조절되었다.
세포 부착 및 분리는 19-27 코팅 전자선 조사, 표면 개시 RAFT 중합에 스핀을 포함하는 다양한 방법에 의해 제조 PIPAAm 코팅 표면을 평가 하였다. 때문에 밀도, 분자량 및 PIPAAm 구조 CEL 영향L 부착 및 분리는 PIPAAm 코팅 된 표면을 제조하기위한 정확한 방법은 중요하다. 전술 한 바와 같이 본 랭 뮤어 - 쉐퍼 방법에서는, 밀도, 분자량 및 표면 나노 구조 제어 할 수있다. 세인트 IPAAm 표면에 세포 부착 및 분리는 크게 다양한 m와 세인트 IPAAm 분자 구성에 의해 영향을, 그리고 세인트 IPAAm의 몇 가지 조건이 더 최적화 할 수있는 세포 부착 및 분리에 대한 표면 하였다. 이러한 결과는이 방법이 세인트 IPAAm 표면과 세포 사이의 상호 작용을 제어 할 수 있음을 나타냅니다.
그대로 재현 세포 시트를 회수하기위한, 양쪽 성 폴리머의 설계에서 가장 중요하다. 단지 친수성 중합체 랭 뮤어 - 쉐퍼 법에 의해 표면 상에 제조 될 때, 코팅 된 폴리머가 쉽게 증류수 또는 배양 배지로 세척한다. 이 결과는 약한 소수성 중합체 재현성이 메트으로 세포 시트를 회수하는 데 사용되지 않아야 함을 지시OD 중합체 변성 물 표면 상태의 불안정하기 때문이다. 우리의 방법에있어서, 양친 성 고분자의 소수성 부분은 수용액에 의해 세척하지 않고 표면에 견고한 제조를 가능하게한다. 랭 뮤어 막은 평행이 연구에서, 유리 기판에 전사 된 후 또한, 나노 스케일 바다 - 섬 구조를 표면 상에 관찰되었다. 기저 측 랭 뮤어 막의 구조가 아니라 정점 측과 다른 것으로 알려져 있으나, 구조가 병렬로 전이하여 고정 하였다.
세포 치료제 및 재생 의학은 다른 처리에 응답하지 환자 치료의 가능성에 집중되어왔다. 우리의 실험은 조직 공학 응용 가능성으로 온도 응답 배양 표면에서 세포 시트 제작 기술을 이용하여 원래의 고유 지지체없는 조직 공학 방법을 개발했다. 세포 시트 여러 임상 시험 alrea 있습니다진행 DY와 조직 29-31 여러 종류의 성공적인 결과를 보여 주었다. BAECs가 줄기 세포를 포함한 세포 시트, 다른 셀 소스를 제조하는 세포 공급원으로 사용되었지만, m의 조합 세인트 IPAAm 분자의 분자 조성을 최적화함으로써 세인트 IPAAm 표면에 시트를 제조 할 수있다. 이 아닌 종래 기술은 나노 구조 표면 쉽게 생산뿐만 아니라, 재생 의료에 사용하기위한 기본적인 세포 배양 전략뿐만 기여할 것이다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| N-isopropylacrylamide | Kohjin | No catalog number | |
| Azobis(4-cyanovaleric acid) | Wako Pure Chemicals | 016-19332 | |
| Styrene | Sigma-Aldrich | S4972 | |
| 1,3,5-trioxane | Sigma-Aldrich | T81108 | |
| 1,4-Dioxane | Wako Pure Chemicals | 045-24491 | |
| DMEM | Sigma | D6429 | |
| PBS | Nakarai | 11482-15 | |
| Streptomycin | GIBCO BRL | 15140-163 | |
| Penicillin | GIBCO BRL | 15140-122 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma | T4174 | |
| FBS | Japan Bioserum | JBS-11501 | |
| BAECs | Health Science Reserch Resources Bank | JCRB0099 | |
| Cover Glasses | Matsunami Glass Industry | C024501 | |
| AFM NanoScope V | Veeco | ||
| 1H NMR INOVA 400 | Varian, Palo Alto | ||
| ATR/FT-IR NICOLET 6700 | Thermo Scientific | ||
| GPC HLC-8320GPC | Tosoh | ||
| TSKgel Super AW2500, AW3000, AW4000 | Tosoh | ||
| Langmuir-Blodgett Deposition Troughs | KSV Instruments | KN 2002 | KSV NIWA Midium trough |
| Nikon ECLIPSE TE2000-U | Nikon |
References
- Bae, Y. H., Kwon, I. C., Pai, C. M., Kim, S. W. Controlled release of macromolecules from electrical and chemical stimuli-responsive hydrogels. Makromol. Chem., Macromol. Symp. 70-71 (1), 173-181 (1993).
- Fu, Q., et al. Reversible control of free energy and topography of nanostructured surfaces. J. Am. Chem. Soc. 126 (29), 8904-8905 (2004).
- Nykanen, A., et al. Phase behavior and temperature-responsive molecular filters based on self-assembly of polystyrene-block-poly(N-isopropylacrylamide)-block-polystyrene. Macromolecules. 40 (16), 5827-5834 (2007).
- Sun, T., et al. Reversible switching between superhydrophilicity and superhydrophobicity. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 43 (3), 357-360 (2004).
- Shuler, R. L., Zisman, W. A. A Study of the behavior of Polyoxyethylene at the air-water interface by wave damping and other methods. J. Phys. Chem. 74 (7), 1523-1534 (1970).
- Kawaguchi, M., Sauer, B. B., Yu, H. Polymeric monolayer dynamics at the air/water interface by surface light scattering. Macromolecules. 22 (4), 1735-1743 (1989).
- Saito, W., Kawaguchi, M., Kato, T., Imae, T. Spreading solvent and temperature effects on interfacial properties of Poly (N-isopropylacrylamide) films at the air-water interface. Langmuir. 7463 (11), 5947-5950 (1996).
- Jheng, K. T., Hsu, W. P. Molecular weight effect of PMMA on its miscibility with PS-b-PEO at the air/water interface. J. App. Polym. Sci. 125 (3), 1986-1992 (2012).
- Biesalski, M. A., Knaebel, A., Tu, R., Tirrell, M. Cell adhesion on a polymerized peptide-amphiphile monolayer. Biomaterials. 27 (8), 1259-1269 (2006).
- Da Silva, A. M. P. S. G., Lopes, S. I. C., Brogueira, P., Prazeres, T. J. V., Beija, M., Martinho, J. M. G. Thermo-responsiveness of poly(N,N-diethylacrylamide) polymers at the air-water interface: The effect of a hydrophobic block. Journal of colloid interface sci. 327 (1), 129-137 (2008).
- Wang, S. Q., Zhu, Y. X. Facile method to prepare smooth and homogeneous polymer brush surfaces of varied brush thickness and grafting density. Langmuir. 25 (23), 13448-13455 (2009).
- Estillore, N. C., Park, J. Y., Advincula, R. C. Langmuir−Schaefer (LS) macroinitiator film control on the grafting of a thermosensitive polymer brush via surface initiated-ATRP. Macromolecules. 43 (16), 6588-6598 (2010).
- Seo, Y. S., et al. Nanowire and mesh conformations of diblock copolymer blends at the air/water interface. Nano Lett. 4 (3), 483-486 (2004).
- Lu, Q., Bazuin, C. G. Solvent-assisted formation of nanostrand networks from supramolecular diblock copolymer/surfactant complexes at the air/water interface. Nano lett. 5 (7), 1309-1314 (2005).
- Nagano, S., Matsushita, Y., Ohnuma, Y., Shinma, S., Seki, T. Formation of a highly ordered dot array of surface micelles of a block copolymer via liquid crystal-hybridized self-assembly. Langmuir. 22 (12), 5233-5236 (2006).
- Perepichka, I. I., Borozenko, K., Badia, A., Bazuin, C. G. Pressure-induced order transition in nanodot-forming diblock. J. Am. Chem. Soc. 133 (493), 19702-19705 (2011).
- Wang, X. L., Ma, X. Y., Zang, D. Y. Aggregation behavior of polystyrene-b-poly(acrylicacid) at the air-water interface. Soft Matter. 9 (2), 443-453 (2013).
- Yamato, M., Okano, T.
- Rollason, G., Daviest, J. E., Sefton, M. V. Preliminary report on cell culture on a thermally reversible copolymer. Biomaterials. 14 (2), 153-155 (1993).
- Park, Y. S., Ito, Y., Imanishi, Y. Permeation control through porous membranes immobilized with thermosensitive polymer. Langmuir. 14 (4), 910-914 (1998).
- Kwon, O. H., Kikuchi, A., Yamato, M., Okano, T. Accelerated cell sheet recovery by co-grafting of PEG with PIPAAm onto porous cell culture membranes. Biomaterials. 24 (7), 1223-1232 (2003).
- Kikuchi, A., Okano, T. Nanostructured designs of biomedical materials: applications of cell sheet engineering to functional regenerative tissues and organs. J. Control. Release. 101 (1-3), 69-84 (2005).
- Fukumori, K., et al. Characterization of ultra-thin temperature-responsive polymer layer and its polymer thickness dependency on cell attachment/detachment properties. Macromol. biosci. 10 (10), 1117-1129 (2010).
- Takahashi, H., Nakayama, M., Yamato, M., Okano, T. Controlled chain length and graft density of thermoresponsive polymer brushes for optimizing cell sheet harvest. Biomacromolecules. 11 (8), 1991-1999 (2010).
- Nakayama, M., Yamada, N., Kumashiro, Y., Kanazawa, H., Yamato, M., Okano, T. Thermoresponsive poly(N-isopropylacrylamide)-based block copolymer coating for optimizing cell sheet fabrication. Macromol. Biosci. 12 (6), 751-760 (2012).
- Sakuma, M., et al. Control of cell adhesion and detachment on Langmuir-Schaefer surface composed of dodecyl-terminated thermo-responsive polymers. J. Biomater. Sci., Polym. Ed. 25 (5), 431-443 (2014).
- Sakuma, M., et al. Thermoresponsive nanostructured surfaces generated by the Langmuir-Schaefer method are suitable for cell sheet fabrication. Biomacromolecules. 15 (11), 4160-4167 (2014).
- Moad, G., Chong, Y. K., Postma, A., Rizzardo, E., Thang, S. H. Advances in RAFT polymerization: the synthesis of polymers with defined end-groups. Polymer. 46 (19), 8458-8468 (2005).
- Nishida, K., et al. Corneal Reconstruction with Tissue-Engineered Cell Sheets Composed of Autologous Oral Mucosal Epithelium. N. Engl. J. Med. 351 (12), 1187-1196 (2004).
- Ohki, T., et al. Prevention of esophageal stricture after endoscopic submucosal dissection using tissue-engineered cell sheets. Gastroenterology. 143 (3), 582-588 (2012).
- Sawa, Y., et al. Tissue engineered myoblast sheets improved cardiac function sufficiently to discontinue LVAS in a patient with DCM: report of a case. Surg. Today. 42 (2), 181-184 (2012).
