Introduction
Nanostrukturerade ytor har nyligen rönt stor uppmärksamhet på grund av deras olika potentiella tillämpningar, inklusive mönstring, cellodling, rengöring och yta växling. Till exempel, superhydrofoba ytor inspirerade av nanostruktur av lotusblad och andra mottagliga ytor kan reagera på yttre stimuli 1-4.
Langmuir filmen är en av de mest studerade polymerbeläggningar. En Langmuir film bildas genom att släppa amfifila molekyler på en luft-vatten gränsytan 5-8. Filmen kan sedan överföras till en fast yta genom fysisk eller kemisk adsorption, och molekylkonforma på en fast yta kan styras med hjälp av vertikala och horisontella överföringsmetoder 9-12. Densiteten för den Langmuir filmen kan regleras exakt genom att komprimera luft-vattengränsytan. Nyligen har metoden också visat sig effektiv för tillverkning nanoscaled havsö-structures genom att utnyttja amfifila segmentsampolymerer. De nanostrukturer är antas bestå av en kärna av hydrofoba segment och ett skal av hydrofila segment 13-17. Dessutom är antalet av nanostrukturer på en yta regleras genom att styra området per molekyl (A m) av segmentsampolymeren vid gränsytan.
Vi har fokuserat på ett original, unikt byggnadsställning fria tissue engineering strategi, cell ark teknik, med hjälp av en temperaturberoende odlingsytan. Den utvecklade tekniken har tillämpats på regenerativa terapier för olika organ 18. Ett temperatursvarande odlingsytan tillverkades genom att ympa poly (N -isopropylacrylamide) (PIPAAm), en temperaturkänslig molekyl, på en yta från 19 till 27. PIPAAm och dess sampolymerer uppvisar en lägre kritiska lösningstemperaturen (LCST) i vattenhaltiga medier vid temperaturer nära 32 ° C. Odlingsytan uppvisade också en temperaturkänslig Alternati på mellan hydrofobicitet och hydrofilicitet. Vid 37 ° C, den PIPAAm-ympade ytan blev hydrofob, och cellerna lätt fästas och prolifererade på ytan såväl som på konventionellt vävnadsodlings polystyren. När temperaturen sänktes till 20 ° C, ytan blev hydrofil, och cellerna spontant lossnar från ytan. Därför kunde odlade konfluenta celler på ytan skördas som en intakt ark genom att ändra temperaturen. Dessa cellvidhäftnings och lösgör egenskaper också visas av en yta tillverkas genom Langmuir filmbeläggning för laboratorie demonstration 26, 27. En Langmuir film av segmentsampolymerer bestående av polystyren (P (St)) och PIPAAm (St-IPAAm) tillverkades. Langmuir-film med en specifik A m skulle kunna horisontellt överföras till en hydrofobt modifierad glassubstratet. Dessutom har celladhesion på och borttagning från den behandlade ytan som svar på temperatur utvärderas.
_content "> Här beskriver vi protokoll för tillverkning av en nanostrukturerad Langmuir-film sammansatt av värmekänslig amfifila blocksampolymerer på ett glassubstrat. Vår metod kan ge en effektiv tillverkningstekniken för organiska nanofilms inom olika områden av ytan vetenskap och kan underlätta mer effektiv kontroll av celladhesion på och spontant lossnar från en yta.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Syntes av Polystyrene- blocket -poly (N -isopropylacrylamide) genom tvåstegs Reversible Addition-fragmentering Chain Transfer (RAFT) radikalpolymerisation
- Upplösa styren (153,6 mmol), 4-cyano-4- (ethylsulfanylthiocarbonyl) sulfanylpentanoic syra (ECT; 0,2 mmol), och 4,4'-azobis (4-cyanovaleriansyra) (ACVA; 0,04 mmol) i 40 ml av en, 4-dioxan. Frysa lösningen i flytande kväve under vakuum i 15-20 min för att avlägsna de reaktiva species och gradvis tina vid RT. Kontrollera att lösningen är helt tinade och upprepa freeze-pump-tina avgascykeln tre gånger.
- Erhålla polystyren (PSt) (Mw: 13500) som ett makro RAFT agens genom polymerisation vid 70 ° C under 15 h i ett oljebad.
- Fällningen PSt makro RAFT medel med 800 ml eter och torka i vakuum.
- Upplösa IPAAm monomer (4,32 mmol), PSt makro RAFT medel (0,022 mmol) och ACVA (0,004 mmol) i 4 ml 1,4-dioxan.
- Avlägsnasyret i lösningen av frysning-pumpning-upptining avgasningscyklerna som nämns i steg 1,1.
- Utföra en polymerisation vid 70 ° C under 15 h i ett oljebad efter avgasning. Skaffa syntetiserade St-IPAAm molekyl (MW: 32.800) på samma sätt som PST makro RAFT agent.
2. Beredning av silaniserad hydrofoba modifierade glassubstrat
- Tvätta glassubstrat (24 mm x 50 mm) med ett överskott av aceton och etanol och sonikeras under 5 min för att avlägsna ytföroreningar.
- Torka substraten i en ugn vid 65 ° C under 30 min. Använd sedan syreplasma (400 W, 3 minuter) för att aktivera ytorna av substraten vid RT.
- Doppa substraten i toluen innehållande 1% hexyltrimethoxysilane över natten vid RT för att silaniseras substratet.
- Tvätta silaniserade substraten i toluen och sänk ned i aceton i 30 min för att avlägsna oreagerade medel.
- Härdnings substrat för två timmar vid 110 ° C för att noggrant immobilisera surface.
- Skär silaniserade substrat genom en glasskärare till 25 mm x 24 mm för att passa cellodlingsskålar (maträtt storlek: φ35 mm).
3. Beredning av Langmuir Filmer och Film överförda Surface
- Placera Langmuir filmen instrumentet i ett skåp för att förhindra ansamling av damm.
- Tvätta Langmuir tråg (storlek: 580 mm x 145 mm) och barriärer med destillerat vatten och etanol för att avlägsna föroreningar.
- Torka tråget och hinder genom att torka med en luddfri handduk. Fyll sedan tråget med cirka 110 ml destillerat vatten och ställ hinder på båda sidor av tråget. Notera att destillerat vatten bör tillsättas utan att spilla i följande steg 3,5-3,13.
- Hetta upp en platina Wilhelmy platta (omkrets: 39,24 mm) för övervakning av ytspänning med en gasbrännare tills plattan blir röd och sedan tvätta med destillerat vatten för att avlägsna föroreningar. Suspendera Wilhelmy plattan på en tråd fäst vidytan-tryckmätningsinstrument.
- Noll ytan-tryckmätnings instrument enligt tillverkarens protokoll. Komprimera luft-vattengränsytan på tråget av hindren på de båda sidorna av tråget tills gränssnittet når ungefär 50 cm 2 utan några droppar av polymer.
- Aspirera små föroreningar tills yttrycket är nästan 0 mN / m.
- Ompositionera de hinder på båda sidor, och tillsätt destillerat vatten för att kompensera för minskningen av destillerat vatten från steg 3,6.
- Lös 5 mg den syntetiserade St-IPAAm molekylen i 5 ml av en framkallningslösning av kloroform.
Notera: Diklormetan eller toluen kan också användas som lösningsmedel. - Försiktigt släppa 27 pl St-IPAAm upplöst i kloroform på tråget med hjälp av en mikrospruta eller mikropipett.
- Efter att ha väntat i 5 minuter för att möjliggöra fullständig avdunstning av kloroform, flytta båda hinder horisontellt för att komprimera St-IPAAm molecule vid gränsytan. Behåll komprimering av hinder på 0,5 mm / sek tills målområdet 50 cm 2 har uppnåtts.
Obs: En snabb komprimering orsakar defekter i Langmuir filmen. - Mät yttrycket (π) -A m isotermer med platina Wilhelmy skylt som är fastsatt på ytan-tryckmätningsinstrument under kompression enligt tillverkarens protokoll.
- Efter att ha nått målområdet storlek, upprätthålla ytan i fem minuter för att låta St-IPAAm molekyler för att slappna av, molekylerna når inte jämvikt omedelbart efter komprimering.
- Överföra Langmuir film till en hydrofobt modifierad glassubstrat med användning av en överföringsanordning för 5 min för att kraftigt adsorbera filmen. Fäst hydrofoba glassubstrat parallellt på enheten. Ansluta enheten till en anpassning scen och flytta vinkelrätt.
- Lyft substratet horisontellt med överföringsanordningen och torka i en dag i en desiccator.
4. odling av celler och optimera Cell Adhesion och avskildheten på Langmuir Film Överfört Surface
- För att framställa cellsuspensioner, kultur bovin arteria carotis endotelceller (BAECs) till en tredjedel konfluens vid 37 ° C i 5% CO2 och 95% luft på vävnadskulturpolystyren (TCPS) med Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) innehållande 10% fetalt bovint serum (FBS) och 100 U / ml penicillin.
- Efter konfluens har uppnåtts, behandla BAECs med 3 ml 0,25% trypsin-EDTA under 3 min vid 37 ° C i 5% CO2 och 95% luft.
- Avaktivera trypsin-EDTA genom tillsats av 10 ml av DMEM innehållande 10% FBS, och samla cellsuspension till en 50 ml koniskt rör.
- Centrifugera vid 120 x g under 5 min och aspirera supernatanten. Återsuspendera cellerna med 10 ml av DMEM.
- Placera St-IPAAm ytor under ultraviolett ljus på en ren bänk för sterilisering i 5 minuter.
- Seed den återvunna cells på St-IPAAm ytorna vid en koncentration av 1,0 x 10 4 celler / cm 2 som räknas av en engångs hemocytometer och observera cellerna på ytorna av ett mikroskop utrustat med en inkubator vid 37 ° C med 5% CO2 och 95% luft.
Obs! Sterilisera St-IPAAm ytor med ultraviolett ljus utrustad med en ren bänk. - Rekordtid-lapse bilder av vidhäftande BAECs för cirka 24,5 timmar vid 37 ° C med en faskontrastmikroskop med 10x förstoring. Efter BAEC vidhäftning, spela in avskiljandet av BAECs från St-IPAAm yta vid 20 ° C i ungefär 3,5 timmar.
5. Cell Sheet Fabrication på Langmuir Film-överförda Ytor
- Kultur BAECs används på samma sätt som beskrivs i avsnitt 4.
- Frö totalt 1,0 x 10 5 celler / cm 2 på St-IPAAm ytor och inkubera under 3 dagar vid 37 ° C i 5% CO2. Sammanflytande BAECs spontant lossnar vid 20 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Segmentsampolymerer bestående av polystyren och poly (N -isopropylacrylamide) (St-IPAAms) med specifika molekylvikter syntetiserades flotte radikalpolymerisation. ECT framställdes som en kedjeöverföringsmedel såsom beskrivits i Moad et al. 28. Två St-IPAAm molekyler av olika PIPAAm kedjelängder syntetiserades, och de erhållna segmentpolymerer karakteriserades genom en H-kärnmagnetisk resonans (NMR) och gelpermeationskromatografi (GPC). Molekylvikterna för St-IPAAms var 32.800 och 67.900, med en snäv molekylviktsfördelning (1,31 och 1,50). Monomeren omvandlingar av polystyren makro RAFT agent och PIPAAm befanns vara 17,4% och mer än 85,0%. Den syntetiserade St-IPAAms utsågs St-IPAAm170 och St-IPAAm480 respektive.
Langmuir filmer med olika områden per molekyl (A m) framställdes på ettluft-vattengränsytan, genom att tappa St-IPAAm molekyler lösta i kloroformlösning (Figur 1A). Efter att släppa St-IPAAm molekyler, var yttrycket av luft-vattengränsytan fast vid 0 mN / m och kontinuerligt ökat genom att stänga gränssnittet under kompression med barriärerna (Figur 1B). Eventuella brister i Langmuir filmer bildade på en luft-vattengränsytan kunde härledas från π-A m isoterm. Den beredda St-IPAAm Langmuir film överfördes till en hydrofobt modifierad glassubstrat (St-IPAAm yta) (Figur 1C). Filmen-överförda ytan utvärderades genom atomkraftsmikroskopi (AFM). Figur 2 visar AFM topografiska bilder (1 x 1 mikrometer) i St-IPAAm170 och St-IPAAm480 ytor. Nanostrukturer observerades på St-IPAAm ytor, medan sådana strukturer sällan observeras på nakna hydrofoba substratet. Storleken och formen på nanostrukturer var starkt dependent på en m och sammansättningen av St-IPAAm. AFM-topografiska bilder bekräftade att Langmuir-filmer kunde homogent överföras på det hydrofoba modifierade glassubstrat och att ytan morfologier kunde kontrolleras genom den molekylära sammansättningen och A m.
Stabiliteten i St-IPAAm Langmuir film utvärderades av en dämpad total reflektion Fourier-transform infraröd spektroskopet (ATR / FT-IR). Mängden PIPAAms på det hydrofoba glassubstrat kunde uppskattas genom en kalibreringslinje som erhållits från toppintensitetsförhållande av 1.000 cm -1 härledd från glas (Si-O) och 1650 cm-1 härledda från PIPAAm (C = O). Kalibreringskurvan beräknades från en serie av kända mängder av PIPAAm läggs den hydrofoba glas. Mängderna av PIPAAm St-IPAAm170 (10 nm 2 / molekyl) och St-IPAAm480 (40 nm 2 / molekyl) på substratet befanns vara 0,87 mikrogram/ cm 2 och 0,63 | ig / cm 2, respektive. Mängden PIPAAm på ytan efter tvättning med destillerat vatten var nästan desamma som de på ytorna utan tvättning. Dessa resultat indikerade att de tillverkade St-IPAAm ytor var stabil i en vattentillstånd.
Vi undersökte nästa vidhäftning och avlossning av bovin halspulsådern endotelceller (BAECs) på St-IPAAm ytor. Time-lapse fotografi av vidhäftande och lossnar BAECs på St-IPAAm480 yta på 40 nm 2 / molekyl visas i den animerade figur 1. Förenligt BAECs vid 37 ° C snabbt fristående från både St-IPAAm170 och St-IPAAm480 efter att minska temperaturen till 20 ° C. Antalet vidhäftande celler på St-IPAAm170 och St-IPAAm480 vid 37 ° C var 0,6 x 10 4 celler / cm2 och 0,9 x 10 4 celler / cm 2, vilket visar att antalet vidhäftande cells modulerades av sammansättningen av St-IPAAm yta. Cellskikt kan också utvinnas genom att lossa sammanflytande odlade BAECs från dessa St-IPAAm ytor. Den utvunna cellskiktet visualiserades som ett två-dimensionell cellstruktur (Figur 3). Cellerna nådde sammanflöde efter tre dagars odling på St-IPAAm170 och St-IPAAm480 ytor vid 37 ° C, och cellarket snabbt återhämtat sig efter att sänka temperaturen från 37 ° C till 20 ° C. Effekten av molekylvikten och A m av St-IPAAms på cellarket återhämtning sammanfattas i tabell 1. Viabiliteten hos cellskikt utvärderades genom trypanblått-färgning efter avskiljandet av BAECs arket. Celler behandlade med trypsin-EDTA på glassubstratet vid 37 ° C användes som en kontroll. Döda cellförhållanden på St-IPAAm170, St-IPAAm480 och hydrofoba glassubstrat som en kontroll beräknades till cirka 11,0%, 7,7%, och 11,7% respektive. Dessa resultat indikerade att cell viabilitet var knappast påverkas av temperaturminskning.
Figur 1:. Framställning av en termoresponsiv Langmuir film överförs yta (A) Den polystyrene- blocket -poly (N -isopropylacrylamide) (St-IPAAm) kloroformlösningen försiktigt droppades på en luft-vatten-gränsytan. Yttrycket mättes under kompression för att upptäcka eventuella defekter i Langmuir filmen. (B) Två hinder användes för att komprimera St-IPAAm molekyler på gränssnittet tills ett målområde av 50 cm 2 uppnåddes. (C) Efter kompression ades ett hydrofobt modifierad täckglassubstrat horisontellt placerad på gränssnittet med en inriktningssteget under 5 min. Substratet lyftes horisontellt och torkades i en dag. Denna siffra har ändrats något från offentliggörandet av Sakuma et al. 27
Figur 2:. Atomkraftsmikroskopi (AFM) topografiska bilder (1 x 1 mikrometer) av Langmuir film överförda ytor (St-IPAAm yta) Vänster panel: nanostrukturerade ytor av St-IPAAm170 med A m 10 nm 2 / molekyl. Högra panelen: nanostrukturerade ytor av St-IPAAm480 med en A m 40 nm 2 / molekyl. De AFM-bilder erhölls i gäng läge med en fosfat kisel fribärande med en fjäderkonstant av 3 N / m och resonansfrekvens av 70-90 kHz.
Tabell 1:. Bovin halspulsådern endotelceller (BAEC) ark återhämtning av en Langmuir film överförs yta med olika densiteter och PIPAAm kedjelängder "Good" representerar intakt cell ark återhämtning. "Knappast återvinnas" betyder att cellerna skulle kunna vara confluently odlas och de odlade cellerna uppvisade liten eller ingen lösgörande från ytan även efter en reduktion i temperatur. "Svag vidhäftning" betyder att cellerna inte var odlades till sammanflytning vid 37 ° C under 3 dagar. 
Figur 3: Makroskopisk bild av en återvunnen cell ark på en Langmuir film överförs yta med St-IPAAm480 och en A m 40 nm 
Animerad figur 1: . (Högerklicka för att ladda ner) Time-lapse fotografier av BAECs vidhäftning och lossnar på en Langmuir film överförs yta med St-IPAAm480 och Am av 40 nm 2 / molekyl. Bilderna togs vid 2-minuters intervall och de insamlade bilder lämnades som en film på 960x hastighet. Deskala bar i filmen är 50 pm. St-IPAAm170 St-IPAAm480 3 [nm 2 / molekyl] 10 [nm 2 / molekyl] 40 [nm 2 / molekyl] 3 [nm 2 / molekyl] 10 [nm 2 / molekyl] 40 [nm 2 / molekyl] svag vidhäftning Bra knappast utvinnas svag vidhäftning svag vidhäftning Bra
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ett temperatursvarande yta framställdes genom Langmuir-Schaefer-metoden och ytegenskaperna för celladhesion / lösgörande och cellarket återhämtning optimerades. Vid användning av denna metod för tillverkning av ytor, flera steg är kritiska. Den molekylära sammansättningen av St-IPAAm molekyler har en stor effekt på ytstrukturen och stabiliteten av ytan, och i förlängningen på celladhesion och avskildhet. Framför allt bör de St-IPAAm molekylerna har en snäv molekylviktsfördelning. I vår metod har två St-IPAAm molekyler med olika PIPAAm kedjelängder syntetiseras genom RAFT polymerisation, vilket möjliggör styrning av molekylvikt och molekylviktsfördelning.
Åtgärder bör vidtas för att förhindra kontaminering av luft-vattengränsytan under framställningen av St-IPAAm yta för att undvika fel i nanostrukturer. Innan släppa polymermolekyler på gränssnittet, contaminants bör sugas tills yttrycket når ca 0 mN / m. Kontaminering tenderar att ackumuleras runt kanterna på tråget och Wilhelmy plattan. Eftersom Wilhelmy plattan hade viss förorening på sin yta, var det glödgas. När pappers Wilhelmy platta används bör aspirationssteg vid gränsytan upprepas minst två gånger. Den π-A m isoterm kurva beror också på närvaron av föroreningar vid luft-vattengränsytan. Vi rekommenderar att kurvan för isotermerna erhållas mer än en gång innan tillverkningen av filmen. Eftersom kontaminering av den hydrofoba modifierade glassubstrat kan också förekomma, bör underlaget blåsas med frisk luft eller kvävgas för att avlägsna föroreningar.
Att konsekvent tillverka Langmuir film överförda ytor (St-IPAAm yta), är det viktigt att hydrofoba segment av en polymer, eftersom den hydrofoba växelverkan mellan Langmuir film och hydrofoba modifierade glas i är den drivande kraften av reaktionen. I denna studie, eftersom segmentsampolymeren var sammansatt av polystyren, som är starkt hydrofobt och hydrofilt PIPAAm vid rumstemperatur, den överförda filmen stabilt vidhäftad till substratet även under vatten eller cellodlingsbetingelser. Detta indikerar att hydrofoba segment spelar en viktig roll när det gäller tillverkning av en robust St-IPAAm yta.
För att styra cellvidhäftning och lossnar på en temperaturkänslig yta, både den molekylära kompositionen och exakt kontroll av densitet är viktiga. I detta Langmuir-Schaefer metod kan området per molekyl (A m) av polymer syntetiseras genom en given mängd tappade molekyler och målområdet av en luftvattengränsytan regleras genom komprimering. A m av att tappa St-IPAAm molekyler kan i teorin beräknas genom följande ekvation:
d / 53465 / 53465eq1.jpg "/>
där A är arean av gränsytan, Mw är molekylvikten för St-IPAAms, c är koncentrationen av kloroformlösningen, N är A Avogadros tal och V är volymen för polymerlösningen tappas. Nanoscale havet öarna strukturer observeras på St-IPAAm ytor efter tillverkning eftersom amfifila polymerer bildar självorganiserande strukturer på en luft-vatten-gränsytan, som beskrivs i tidigare studier 13-17. Storleken och mängden av nanoskala strukturer kontrollerades med en m och molekylvikten för St-IPAAms.
Celladhesion och lösgör utvärderades på PIPAAm-belagda ytor tillverkade genom olika metoder, inklusive elektronstrålebestrålning, yta initierad RAFT polymerisation och spinnbeläggning 19-27. Eftersom densitet, molekylvikt, och PIPAAm struktur påverkar cell vidhäftning och lossnar, precisa metoder för att tillverka PIPAAm belagda ytan är viktig. I detta Langmuir-Schaefer-metoden, kunde densitet, molekylvikt och yta nanostrukturer styras såsom beskrivits ovan. Celladhesion och avskildhet på St-IPAAm ytorna drastiskt påverkas av olika En m och St-IPAAm molekylär sammansättning och vissa förhållanden i St-IPAAm ytor för celladhesion och lossnar kan optimeras ytterligare. Dessa resultat indikerar att denna metod kan styra interaktionen mellan St-IPAAm yta och celler.
För reproducerbart återvinna intakt cellarket, är det viktigaste utformningen av en amfifil polymer. När endast hydrofila polymerer tillverkas på en yta av en Langmuir-Schaefer metod belagda polymerer lätt tvättas ut av destillerat vatten eller odlingsmedium. Detta resultat indikerade att den svaga hydrofoba polymeren inte bör användas för reproducerbar återhämtar cellarket i detta method eftersom polymeren modifierad yta var instabil i vattentillstånd. I vår metod, det hydrofila segmentet i en amfifil polymer möjliggör robust tillverkning på en yta utan att tvätta ut genom en vattenhaltig lösning. Dessutom, eftersom den Langmuir filmen parallellt överfördes till ett glassubstrat i denna studie, var nano skalas havs-ö-strukturer observeras på ytan. Även om strukturen av Langmuir film på basalsidan är väl känd för att vara annorlunda än på den apikala sidan, var strukturen fastställs genom en parallell överföring.
Cellterapi och regenerativ medicin har fokuserats på möjligheten att läka patienter som inte svarar på andra behandlingar. Vårt laboratorium har utvecklat en egen, unik byggnadsställning fria tissue engineering tillvägagångssätt med cellblad teknik tillverkas på en temperaturberoende odlingsytan med potentiella tillämpningar inom tissue engineering. Flera kliniska studier med cellskikt är already pågår och har visat goda resultat för flera typer av vävnader 29-31. Även BAECs användes som cellkälla för att tillverka cellskikt, andra cellkällor, inklusive stamceller kan användas för att tillverka ark av St-IPAAm yta genom att optimera kombinationer av A m och den molekylära sammansättningen av St-IPAAm molekyler. Denna icke-konventionell teknik kommer att bidra inte bara till den lätta produktionen av nanostrukturerade ytor men också för att de grundläggande cellodlings strategier för användning i regenerativ medicin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| N-isopropylacrylamide | Kohjin | No catalog number | |
| Azobis(4-cyanovaleric acid) | Wako Pure Chemicals | 016-19332 | |
| Styrene | Sigma-Aldrich | S4972 | |
| 1,3,5-trioxane | Sigma-Aldrich | T81108 | |
| 1,4-Dioxane | Wako Pure Chemicals | 045-24491 | |
| DMEM | Sigma | D6429 | |
| PBS | Nakarai | 11482-15 | |
| Streptomycin | GIBCO BRL | 15140-163 | |
| Penicillin | GIBCO BRL | 15140-122 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma | T4174 | |
| FBS | Japan Bioserum | JBS-11501 | |
| BAECs | Health Science Reserch Resources Bank | JCRB0099 | |
| Cover Glasses | Matsunami Glass Industry | C024501 | |
| AFM NanoScope V | Veeco | ||
| 1H NMR INOVA 400 | Varian, Palo Alto | ||
| ATR/FT-IR NICOLET 6700 | Thermo Scientific | ||
| GPC HLC-8320GPC | Tosoh | ||
| TSKgel Super AW2500, AW3000, AW4000 | Tosoh | ||
| Langmuir-Blodgett Deposition Troughs | KSV Instruments | KN 2002 | KSV NIWA Midium trough |
| Nikon ECLIPSE TE2000-U | Nikon |
References
- Bae, Y. H., Kwon, I. C., Pai, C. M., Kim, S. W. Controlled release of macromolecules from electrical and chemical stimuli-responsive hydrogels. Makromol. Chem., Macromol. Symp. 70-71 (1), 173-181 (1993).
- Fu, Q., et al. Reversible control of free energy and topography of nanostructured surfaces. J. Am. Chem. Soc. 126 (29), 8904-8905 (2004).
- Nykanen, A., et al. Phase behavior and temperature-responsive molecular filters based on self-assembly of polystyrene-block-poly(N-isopropylacrylamide)-block-polystyrene. Macromolecules. 40 (16), 5827-5834 (2007).
- Sun, T., et al. Reversible switching between superhydrophilicity and superhydrophobicity. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 43 (3), 357-360 (2004).
- Shuler, R. L., Zisman, W. A. A Study of the behavior of Polyoxyethylene at the air-water interface by wave damping and other methods. J. Phys. Chem. 74 (7), 1523-1534 (1970).
- Kawaguchi, M., Sauer, B. B., Yu, H. Polymeric monolayer dynamics at the air/water interface by surface light scattering. Macromolecules. 22 (4), 1735-1743 (1989).
- Saito, W., Kawaguchi, M., Kato, T., Imae, T. Spreading solvent and temperature effects on interfacial properties of Poly (N-isopropylacrylamide) films at the air-water interface. Langmuir. 7463 (11), 5947-5950 (1996).
- Jheng, K. T., Hsu, W. P. Molecular weight effect of PMMA on its miscibility with PS-b-PEO at the air/water interface. J. App. Polym. Sci. 125 (3), 1986-1992 (2012).
- Biesalski, M. A., Knaebel, A., Tu, R., Tirrell, M. Cell adhesion on a polymerized peptide-amphiphile monolayer. Biomaterials. 27 (8), 1259-1269 (2006).
- Da Silva, A. M. P. S. G., Lopes, S. I. C., Brogueira, P., Prazeres, T. J. V., Beija, M., Martinho, J. M. G. Thermo-responsiveness of poly(N,N-diethylacrylamide) polymers at the air-water interface: The effect of a hydrophobic block. Journal of colloid interface sci. 327 (1), 129-137 (2008).
- Wang, S. Q., Zhu, Y. X. Facile method to prepare smooth and homogeneous polymer brush surfaces of varied brush thickness and grafting density. Langmuir. 25 (23), 13448-13455 (2009).
- Estillore, N. C., Park, J. Y., Advincula, R. C. Langmuir−Schaefer (LS) macroinitiator film control on the grafting of a thermosensitive polymer brush via surface initiated-ATRP. Macromolecules. 43 (16), 6588-6598 (2010).
- Seo, Y. S., et al. Nanowire and mesh conformations of diblock copolymer blends at the air/water interface. Nano Lett. 4 (3), 483-486 (2004).
- Lu, Q., Bazuin, C. G. Solvent-assisted formation of nanostrand networks from supramolecular diblock copolymer/surfactant complexes at the air/water interface. Nano lett. 5 (7), 1309-1314 (2005).
- Nagano, S., Matsushita, Y., Ohnuma, Y., Shinma, S., Seki, T. Formation of a highly ordered dot array of surface micelles of a block copolymer via liquid crystal-hybridized self-assembly. Langmuir. 22 (12), 5233-5236 (2006).
- Perepichka, I. I., Borozenko, K., Badia, A., Bazuin, C. G. Pressure-induced order transition in nanodot-forming diblock. J. Am. Chem. Soc. 133 (493), 19702-19705 (2011).
- Wang, X. L., Ma, X. Y., Zang, D. Y. Aggregation behavior of polystyrene-b-poly(acrylicacid) at the air-water interface. Soft Matter. 9 (2), 443-453 (2013).
- Yamato, M., Okano, T.
- Rollason, G., Daviest, J. E., Sefton, M. V. Preliminary report on cell culture on a thermally reversible copolymer. Biomaterials. 14 (2), 153-155 (1993).
- Park, Y. S., Ito, Y., Imanishi, Y. Permeation control through porous membranes immobilized with thermosensitive polymer. Langmuir. 14 (4), 910-914 (1998).
- Kwon, O. H., Kikuchi, A., Yamato, M., Okano, T. Accelerated cell sheet recovery by co-grafting of PEG with PIPAAm onto porous cell culture membranes. Biomaterials. 24 (7), 1223-1232 (2003).
- Kikuchi, A., Okano, T. Nanostructured designs of biomedical materials: applications of cell sheet engineering to functional regenerative tissues and organs. J. Control. Release. 101 (1-3), 69-84 (2005).
- Fukumori, K., et al. Characterization of ultra-thin temperature-responsive polymer layer and its polymer thickness dependency on cell attachment/detachment properties. Macromol. biosci. 10 (10), 1117-1129 (2010).
- Takahashi, H., Nakayama, M., Yamato, M., Okano, T. Controlled chain length and graft density of thermoresponsive polymer brushes for optimizing cell sheet harvest. Biomacromolecules. 11 (8), 1991-1999 (2010).
- Nakayama, M., Yamada, N., Kumashiro, Y., Kanazawa, H., Yamato, M., Okano, T. Thermoresponsive poly(N-isopropylacrylamide)-based block copolymer coating for optimizing cell sheet fabrication. Macromol. Biosci. 12 (6), 751-760 (2012).
- Sakuma, M., et al. Control of cell adhesion and detachment on Langmuir-Schaefer surface composed of dodecyl-terminated thermo-responsive polymers. J. Biomater. Sci., Polym. Ed. 25 (5), 431-443 (2014).
- Sakuma, M., et al. Thermoresponsive nanostructured surfaces generated by the Langmuir-Schaefer method are suitable for cell sheet fabrication. Biomacromolecules. 15 (11), 4160-4167 (2014).
- Moad, G., Chong, Y. K., Postma, A., Rizzardo, E., Thang, S. H. Advances in RAFT polymerization: the synthesis of polymers with defined end-groups. Polymer. 46 (19), 8458-8468 (2005).
- Nishida, K., et al. Corneal Reconstruction with Tissue-Engineered Cell Sheets Composed of Autologous Oral Mucosal Epithelium. N. Engl. J. Med. 351 (12), 1187-1196 (2004).
- Ohki, T., et al. Prevention of esophageal stricture after endoscopic submucosal dissection using tissue-engineered cell sheets. Gastroenterology. 143 (3), 582-588 (2012).
- Sawa, Y., et al. Tissue engineered myoblast sheets improved cardiac function sufficiently to discontinue LVAS in a patient with DCM: report of a case. Surg. Today. 42 (2), 181-184 (2012).
