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Bioengineering

ऊतक इंजीनियरिंग के लिए Thermoresponsive Nanostructured सतहों की तैयारी

Published: March 1, 2016 doi: 10.3791/53465
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 2, 1, 2, 2, 2
1Department of Physics, Tokyo University of Science, 2Institute of Advanced Biomedical Engineering and Science, Tokyo Women's Medical University

Introduction

Nanostructured सतहों हाल ही में patterning, सेल संस्कृति, सफाई, और सतह स्विचिंग सहित अपनी विभिन्न संभावित अनुप्रयोगों के कारण पर्याप्त ध्यान आकर्षित किया है। उदाहरण के लिए, superhydrophobic कमल के पत्ते और अन्य संवेदनशील सतहों की nanostructure से प्रेरित सतहों बाहरी उत्तेजनाओं 1-4 करने के लिए प्रतिक्रिया करने में सक्षम हैं।

Langmuir फिल्म सबसे व्यापक रूप से अध्ययन बहुलक कोटिंग्स में से एक है। एक Langmuir फिल्म एक हवा-पानी इंटरफेस 5-8 पर amphiphilic अणुओं को छोड़ने के द्वारा बनाई है। फिल्म तो शारीरिक या रासायनिक सोखना द्वारा एक ठोस सतह पर स्थानांतरित किया जा सकता है, और एक ठोस सतह पर आणविक रचना क्षैतिज और ऊर्ध्वाधर हस्तांतरण के तरीकों का उपयोग कर 9-12 नियंत्रित किया जा सकता। Langmuir फिल्म का घनत्व ठीक हवा-पानी इंटरफेस compressing द्वारा विनियमित किया जा सकता है। हाल ही में, इस विधि को भी nanoscaled समुद्री द्वीप स्ट्रक्चरल fabricating के लिए कारगर साबित हो गया हैamphiphilic copolymers ब्लॉक का उपयोग करके तों। Nanostructures हाइड्रोफोबिक क्षेत्रों की एक कोर और हाइड्रोफिलिक खंडों 13-17 का एक खोल से मिलकर ग्रहण कर रहे हैं। इसके अलावा, एक सतह पर nanostructures की संख्या इंटरफेस में ब्लॉक copolymer के अणु प्रति क्षेत्र (ए एम) को नियंत्रित करने के द्वारा नियंत्रित किया जाता है।

हम एक मूल, अद्वितीय पाड़ मुक्त ऊतक इंजीनियरिंग दृष्टिकोण, सेल चादर इंजीनियरिंग पर ध्यान केंद्रित किया है एक तापमान संवेदनशील संस्कृति की सतह का उपयोग कर। विकसित प्रौद्योगिकी विभिन्न अंगों 18 के लिए पुनर्योजी उपचार के लिए लागू किया गया है। एक तापमान संवेदनशील संस्कृति की सतह एक सतह पर 19-27 पाली (एन -isopropylacrylamide) (PIPAAm), एक तापमान जिम्मेदार अणु, ग्राफ्टिंग द्वारा निर्मित किया गया था। PIPAAm और उसके copolymers प्रदर्शनी 32 डिग्री सेल्सियस के पास तापमान पर एक कम महत्वपूर्ण समाधान तापमान (LCST) जलीय मीडिया में। संस्कृति की सतह के तापमान में भी एक-उत्तरदायी alternati का प्रदर्शन hydrophobicity और hydrophilicity के बीच पर। 37 डिग्री सेल्सियस पर, PIPAAm-grafted सतह हाइड्रोफोबिक बन गया, और कोशिकाओं को आसानी से जुड़ी है और सतह पर साथ ही पारंपरिक टिशू कल्चर polystyrene पर proliferated। तापमान 20 डिग्री सेल्सियस के लिए उतारा गया है, सतह हाइड्रोफिलिक बन गया है, और कोशिकाओं अनायास सतह से अलग। इसलिए, सतह पर संवर्धित मिला हुआ कोशिकाओं के तापमान बदलकर एक अक्षुण्ण पत्रक के रूप में काटा जा सकता है। ये सेल आसंजन और टुकड़ी गुण भी एक सतह प्रयोगशाला प्रदर्शन 26, 27 के लिए Langmuir फिल्म कोटिंग द्वारा गढ़े द्वारा प्रदर्शित किए गए। Polystyrene (पी (एसटी)) और PIPAAm (St-IPAAm) से बना copolymers ब्लॉक के एक Langmuir फिल्म निर्मित किया गया था। एक विशिष्ट एक मीटर के साथ Langmuir फिल्म क्षैतिज एक hydrophobically संशोधित गिलास सब्सट्रेट करने के लिए हस्तांतरित किया जा सकता है। इसके अलावा, तापमान के जवाब में तैयार की सतह पर से कोशिका आसंजन और सेना की टुकड़ी का मूल्यांकन किया गया।

_content "> यहाँ, हम प्रोटोकॉल एक गिलास सब्सट्रेट पर थर्मामीटरों उत्तरदायी amphiphilic copolymers ब्लॉक से बना एक nanostructured Langmuir फिल्म के निर्माण के लिए का वर्णन है। हमारे विधि सतह विज्ञान के विभिन्न क्षेत्रों में जैविक nanofilms के लिए एक प्रभावी निर्माण तकनीक प्रदान कर सकता है और अधिक सुविधा हो सकती है पर कोशिका आसंजन के प्रभावी नियंत्रण और एक सतह से सहज टुकड़ी।

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Protocol

1. Polystyrene- ब्लॉक -poly (एन -isopropylacrylamide) दो कदम प्रतिवर्ती अलावा विखंडन श्रृंखला स्थानांतरण (बेड़ा) कट्टरपंथी polymerization द्वारा संश्लेषण

  1. styrene (153.6 mmol) भंग, 4-cyano-4- (ethylsulfanylthiocarbonyl) sulfanylpentanoic एसिड (ईसीटी; 0.2 mmol), और 4,4'-Azobis (4-cyanovaleric एसिड) (ACVA; 0.04 mmol) 1 से 40 मिलीलीटर में, 4-dioxane। प्रतिक्रियाशील प्रजातियों को हटाने और धीरे-धीरे आरटी पर पिघलना करने के लिए 15-20 मिनट के लिए वैक्यूम के तहत तरल नाइट्रोजन में समाधान रुक। सुनिश्चित करें कि समाधान पूरी तरह से thawed है बनाओ और इस फ्रीज पंप पिघलना degassing चक्र तीन बार दोहराएँ।
  2. एक तेल स्नान में 15 घंटे के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर polymerization द्वारा एक स्थूल बेड़ा एजेंट के रूप में: polystyrene (पीएसटी) (13,500 मेगावाट) प्राप्त करते हैं।
  3. वेग पीएसटी ईथर के 800 मिलीलीटर के साथ मैक्रो बेड़ा एजेंट और vacuo में सूखी।
  4. 1,4-dioxane के 4 मिलीलीटर में IPAAm मोनोमर (4.32 mmol), पीएसटी मैक्रो बेड़ा एजेंट (0.022 mmol), और ACVA (0.004 mmol) भंग।
  5. हटानाफ्रीज पंप पिघलना degassing चक्र से समाधान में ऑक्सीजन 1.1 चरण में उल्लेख किया है।
  6. degassing के बाद एक तेल स्नान में 15 घंटे के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर एक polymerization प्रदर्शन करना। प्राप्त संश्लेषित St-IPAAm अणु (मेगावाट: 32800) पीएसटी मैक्रो बेड़ा एजेंट के रूप में एक ही तरीके से।

2. silanized जल विरोधी संशोधित ग्लास substrates की तैयारी

  1. धो ग्लास substrates (24 मिमी x 50 मिमी) 5 मिनट के लिए एसीटोन और इथेनॉल और sonicate की एक अतिरिक्त के साथ सतह को दूर करने के लिए।
  2. 30 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर एक ओवन में substrates सूखी। फिर आरटी पर substrates की सतहों को सक्रिय करने के लिए ऑक्सीजन प्लाज्मा (400 डब्ल्यू, 3 मिनट) का उपयोग करें।
  3. आरटी पर रात भर में 1% hexyltrimethoxysilane युक्त सब्सट्रेट silanize को टोल्यूनि में substrates विसर्जित कर दिया।
  4. टोल्यूनि में silanized substrates धो लें और 30 मिनट के लिए एसीटोन में विसर्जित unreacted एजेंटों को दूर करने के लिए।
  5. 110 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए पानी रखना substrates अच्छी तरह से स्थिर करने के लिए रोंurface।
  6. 25 मिमी x 24 मिमी के लिए एक ग्लास कटर से silanized substrates कट सेल संस्कृति व्यंजन (डिश का आकार: φ35 मिमी) फिट करने के लिए।

3. Langmuir फिल्मों और फिल्म का तबादला सतह की तैयारी

  1. धूल के संचय को रोकने के लिए एक कैबिनेट में Langmuir फिल्म साधन रखें।
  2. (: 580 मिमी x 145 मिमी आकार) और आसुत जल और इथेनॉल को दूर करने के साथ बाधाओं को Langmuir गर्त धो लें।
  3. एक lintless तौलिया के साथ पोंछते द्वारा गर्त और बाधाओं सूखी। तब आसुत जल के लगभग 110 मिलीलीटर के साथ गर्त भरने, और गर्त के दोनों किनारों पर बाधाओं को निर्धारित किया है। ध्यान दें कि आसुत जल 3.5-3.13 निम्न चरणों में spilling के बिना जोड़ा जाना चाहिए।
  4. एक प्लैटिनम Wilhelmy प्लेट (परिधि: 39.24 मिमी) गर्मी एक गैस बर्नर के साथ सतह तनाव की निगरानी के लिए जब तक प्लेट लाल हो जाता है और उसके बाद आसुत पानी से धो लें दूषित पदार्थों को दूर करने के लिए। एक तार से जुड़ी पर Wilhelmy प्लेट निलंबितसतह दबाव माप उपकरण।
  5. निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार सतह दबाव माप साधन शून्य। गर्त के दोनों किनारों पर बाधाओं से गर्त पर हवा-पानी इंटरफेस सेक तक इंटरफेस बहुलक के किसी भी बूंदों के बिना लगभग 50 2 सेमी तक पहुँचता है।
  6. सतह दबाव जब तक महाप्राण छोटे contaminants लगभग 0 mN / मीटर है।
  7. दोनों पक्षों पर बाधाओं का स्थान है, और 3.6 कदम से आसुत जल की कमी की भरपाई के लिए आसुत जल जोड़ें।
  8. क्लोरोफॉर्म के विकास के समाधान के 5 मिलीलीटर में संश्लेषित St-IPAAm अणु की 5 मिलीग्राम भंग।
    नोट: क्लोराइड या टोल्यूनि भी विलायक के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।
  9. धीरे-सेंट IPAAm के 27 μl गर्त एक microsyringe या micropipette का उपयोग पर क्लोरोफॉर्म में भंग ड्रॉप।
  10. 5 मिनट के लिए प्रतीक्षा के बाद क्लोरोफॉर्म का पूरा वाष्पीकरण अनुमति देने के लिए, क्षैतिज St-IPAAm molecu सेक करने के लिए दोनों बाधाओं को स्थानांतरितइंटरफेस में ले। 50 2 सेमी तक पहुँच जाता है लक्षित क्षेत्र तक 0.5 मिमी / सेकंड में बाधाओं के संपीड़न की दर को बनाए रखें।
    नोट: एक तेजी से संपीड़न दर Langmuir फिल्म में दोष का कारण बनता है।
  11. प्लैटिनम Wilhelmy प्लेट निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार संपीड़न के दौरान सतह दबाव माप उपकरण से जुड़ी साथ सतह दबाव (π) ए एम isotherms उपाय।
  12. लक्षित क्षेत्र आकार तक पहुँचने के बाद, 5 मिनट के सेंट-IPAAm अणुओं आराम करने के लिए अनुमति देने के लिए सतह बनाए रखने; अणुओं संपीड़न के बाद तुरंत संतुलन तक पहुँच नहीं है।
  13. 5 मिनट के लिए एक हस्तांतरण उपकरण का उपयोग कर मजबूती के साथ फिल्म सोखना करने के लिए एक hydrophobically संशोधित गिलास सब्सट्रेट करने के लिए Langmuir फिल्म हस्तांतरण। डिवाइस पर समानांतर में हाइड्रोफोबिक ग्लास सब्सट्रेट को ठीक करें। एक संरेखण चरण के लिए डिवाइस से कनेक्ट करें और लंबरूप चलते हैं।
  14. एक desiccato में स्थानांतरण उपकरण और 1 दिन के लिए सूखे के साथ क्षैतिज सब्सट्रेट लिफ्टआर।

4. संवर्धन कोशिकाओं और Langmuir फिल्म तबादला भूतल पर कोशिका आसंजन और टुकड़ी का अनुकूलन

  1. सेल निलंबन, संस्कृति गोजातीय कैरोटिड धमनी endothelial कोशिकाओं (BAECs) एक तिहाई संगम के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ 2 और 95% हवा टिशू कल्चर polystyrene (TCPS) पर Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) 10% भ्रूण युक्त के साथ तैयार करने के लिए गोजातीय सीरम (FBS) और 100 यू / एमएल पेनिसिलिन।
  2. संगम के बाद तक पहुँच जाता है, BAECs 0.25% trypsin EDTA के 3 मिलीलीटर के साथ 3 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ 2 और 95% हवा में इलाज करते हैं।
  3. DMEM युक्त 10% FBS के 10 मिलीलीटर जोड़कर trypsin-EDTA निष्क्रिय है, और एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब सेल निलंबन लीजिए।
  4. 5 मिनट के लिए 120 XG पर अपकेंद्रित्र, और सतह पर तैरनेवाला aspirate। DMEM के 10 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को फिर से निलंबित।
  5. एक साफ बेंच पर 5 मिनट के लिए स्टरलाइज़ के लिए जगह पराबैंगनी प्रकाश के तहत St-IPAAm सतहों।
  6. बरामद सीई बीजसेंट-IPAAm पर lls 1.0 x 10 4 कोशिकाओं / 2 सेमी एक डिस्पोजेबल hemocytometer द्वारा गिना की एकाग्रता में सतहों और 5% सीओ 2 और 95% के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एक मशीन से लैस एक माइक्रोस्कोप से सतहों पर कक्षों का निरीक्षण वायु।
    ध्यान दें: एक साफ बेंच करने के लिए सुसज्जित पराबैंगनी प्रकाश द्वारा जीवाणुरहित St-IPAAm सतहों।
  7. लगभग 24.5 10X बढ़ाई के साथ एक चरण विपरीत माइक्रोस्कोप से 37 डिग्री सेल्सियस पर घंटे के लिए पक्षपाती BAECs के रिकार्ड समय चूक छवियों। BAEC आसंजन, लगभग 3.5 घंटे के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर St-IPAAm सतह से BAECs का रिकॉर्ड टुकड़ी के बाद।

Langmuir फिल्म का तबादला सतहों पर 5. सेल शीट निर्माण

  1. संस्कृति एक ही तरीके से इस्तेमाल किया BAECs धारा 4 में वर्णित है।
  2. पर St-IPAAm सतहों 1.0 x 10 5 कोशिकाओं / 2 सेमी की कुल बीज और 5% सीओ 2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 दिनों के लिए सेते हैं। मिला हुआ BAECs अनायास 20 डिग्री सेल्सियस पर अलग।

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Representative Results

Polystyrene और पाली (एन -isopropylacrylamide) (St-IPAAms) विशिष्ट आणविक वजन के साथ की रचना ब्लॉक copolymers बेड़ा कट्टरपंथी polymerization द्वारा संश्लेषित कर रहे थे। ईसीटी Moad एट अल। 28 में वर्णित के रूप में एक श्रृंखला हस्तांतरण एजेंट के रूप में तैयार किया गया था। अलग PIPAAm श्रृंखला लंबाई के दो St-IPAAm अणुओं संश्लेषित किया गया है, और प्राप्त ब्लॉक पॉलिमर 1 एच परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) और जेल पारगमन क्रोमैटोग्राफी (जीपीसी) की विशेषता थे। सेंट-IPAAms की आणविक वजन 32800 और 67900 थे, एक संकीर्ण आणविक वजन वितरण (1.31 और 1.50) के साथ। polystyrene मैक्रो बेड़ा एजेंट और PIPAAm की मोनोमर रूपांतरण 17.4% और 85.0% से भी अधिक पाए गए। संश्लेषित St-IPAAms St-IPAAm170 और सेंट-IPAAm480 क्रमशः नाम थे।

अणु प्रति विभिन्न क्षेत्रों (ए एम) के साथ एक Langmuir फिल्मों में गढ़े गए थेसेंट-IPAAm अणुओं क्लोरोफॉर्म समाधान (चित्रा 1 ए) में भंग छोड़ने के द्वारा हवा-पानी इंटरफेस। सेंट-IPAAm अणुओं को छोड़ने के बाद, हवा-पानी इंटरफेस की सतह पर दबाव 0 mN / मीटर तय की गई थी और लगातार बाधाओं (चित्रा 1 बी) के साथ संपीड़न के दौरान इंटरफेस बंद करने की वृद्धि हुई। एक हवा-पानी इंटरफेस पर गठित Langmuir फिल्मों में कोई दोष π-ए एम इज़ोटेर्म से अनुमान लगाया जा सकता है। तैयार St-IPAAm Langmuir फिल्म एक hydrophobically संशोधित गिलास सब्सट्रेट (St-IPAAm सतह) (चित्रा 1 सी) पर स्थानांतरित किया गया था। फिल्म का तबादला सतह परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी (AFM) द्वारा मूल्यांकन किया गया था। चित्रा 2 St-IPAAm170 और सेंट-IPAAm480 सतहों के AFM स्थलाकृतिक छवियों (1 एक्स 1 माइक्रोन) से पता चलता है। Nanostructures, पर सेंट-IPAAm सतहों मनाया गया, जबकि ऐसी संरचनाओं केवल शायद ही कभी नंगे हाइड्रोफोबिक सब्सट्रेट पर मनाया गया। आकार और nanostructures की आकृति जोरदार dependen थेएक मीटर पर टी और सेंट-IPAAm की संरचना है। AFM स्थलाकृतिक छवियों की पुष्टि की है कि Langmuir फिल्मों हाइड्रोफोबिक ही ढंग से संशोधित ग्लास सब्सट्रेट पर और कहा कि सतह morphologies आणविक संरचना और एक मीटर के द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है स्थानांतरित किया जा सकता है।

सेंट-IPAAm Langmuir फिल्म की स्थिरता एक तनु कुल प्रतिबिंब द्वारा मूल्यांकन किया गया था अवरक्त स्पेक्ट्रोस्कोप (एटीआर / फुट आईआर) फूरियर बदलना। हाइड्रोफोबिक गिलास सब्सट्रेट पर PIPAAms की राशि 1,000 सेमी के शिखर तीव्रता अनुपात -1 ग्लास (सी ओ) और 1650 सेमी -1 PIPAAm (सी = हे) से व्युत्पन्न से निकाली गई से प्राप्त एक अंशांकन लाइन से अनुमान लगाया जा सकता है। अंशांकन लाइन हाइड्रोफोबिक कांच पर PIPAAm कलाकारों के नाम से जाना जाता मात्रा की एक श्रृंखला से गणना की गई। सेंट-IPAAm170 (10 एनएम 2 / अणु) और सेंट-IPAAm480 (40 एनएम 2 / अणु) सब्सट्रेट पर की PIPAAm की मात्रा 0.87 माइक्रोग्राम हो पाए गए/ 2 सेमी और 0.63 माइक्रोग्राम / 2 सेमी, क्रमशः। आसुत जल से धोने के बाद सतह पर PIPAAm की राशि लगभग धोने के बिना सतहों पर उन के रूप में ही किया गया था। इन परिणामों से संकेत दिया कि गढ़े St-IPAAm सतहों एक पानी की हालत में स्थिर थे।

हम अगले आसंजन और सेंट-IPAAm सतहों गोजातीय कैरोटिड धमनी endothelial कोशिकाओं (BAECs) की टुकड़ी की जांच की। 40 एनएम 2 / अणु में सेंट-IPAAm480 सतह पर पक्षपाती और detaching BAECs के समय चूक फोटोग्राफी 37 डिग्री सेल्सियस पर एनिमेटेड चित्रा 1। पक्षपाती BAECs में दिखाया गया है तेजी से कम होने के बाद दोनों St-IPAAm170 और सेंट-IPAAm480 से अलग कर रहे थे 20 डिग्री सेल्सियस के तापमान। 37 डिग्री सेल्सियस पर St-IPAAm170 और सेंट-IPAAm480 पर पक्षपाती कोशिकाओं की संख्या में 0.6 x 10 4 कोशिकाओं / 2 सेमी और 0.9 x 10 4 कोशिकाओं / 2 सेमी था, क्रमशः, यह दर्शाता है कि पक्षपाती सेल की संख्यासेंट-IPAAm सतह की संरचना द्वारा संग्राहक गया था। सेल चादरें भी इन St-IPAAm सतहों से मिला हुआ सुसंस्कृत BAECs detaching द्वारा ठीक किया जा सकता है। बरामद सेल चादर एक दो आयामी संरचना सेल (चित्रा 3) के रूप में कल्पना की गई थी। सेंट-IPAAm170 और सेंट-IPAAm480 पर संस्कृति में तीन दिनों के बाद संगम तक पहुँच कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर सतहों, और सेल चादर तेजी से 20 डिग्री सेल्सियस से 37 डिग्री सेल्सियस के तापमान को कम करने के बाद बरामद किया गया था। आणविक वजन और सेल चादर वसूली पर St-IPAAms के एक मीटर के प्रभाव तालिका 1 में संक्षेप। सेल चादरों की व्यवहार्यता BAECs चादर की टुकड़ी के बाद trypan नीले रंग धुंधला द्वारा मूल्यांकन किया गया था। 37 डिग्री सेल्सियस पर कांच सब्सट्रेट पर trypsin EDTA के साथ इलाज किया कोशिकाओं एक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया। सेंट-IPAAm170, सेंट-IPAAm480 और एक नियंत्रण के रूप में हाइड्रोफोबिक गिलास सब्सट्रेट पर मृत सेल अनुपात लगभग 11.0%, 7.7%, और 11.7%, क्रमशः होने की गणना की गई। ये परिणाम है कि सीई संकेत दियाडालूँगा व्यवहार्यता शायद ही तापमान में कमी से प्रभावित था।

आकृति 1
चित्रा 1:। एक thermoresponsive Langmuir फिल्म का तबादला सतह की तैयारी (ए) polystyrene- ब्लॉक -poly (एन -isopropylacrylamide) (St-IPAAm) क्लोरोफॉर्म समाधान धीरे एक हवा-पानी इंटरफेस पर गिरा दिया गया था। सतह दबाव संपीड़न के दौरान मापा गया था Langmuir फिल्म में कोई दोष का पता लगाने के लिए। (ख) दो बाधाओं को 50 सेमी 2 पहुँच गया था का लक्ष्य क्षेत्र तक इंटरफेस पर St-IPAAm अणुओं सेक करने के लिए इस्तेमाल किया गया। (सी) संपीड़न के बाद, एक hydrophobically संशोधित कवर कांच सब्सट्रेट क्षैतिज इंटरफेस पर एक संरेखण चरण के साथ 5 मिनट के लिए रखा गया था। सब्सट्रेट क्षैतिज उठा लिया और 1 दिन के लिए सूख गया था। यह आंकड़ा थोड़ा Sak द्वारा प्रकाशन से संशोधित किया गया हैउमा एट अल। 27

चित्र 2
चित्रा 2:। Langmuir फिल्म का तबादला सतहों (St-IPAAm सतह) की परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी (AFM) स्थलाकृतिक छवियों (1 एक्स 1 माइक्रोन) वाम पैनल: 10 एनएम 2 / अणु के एक एक मीटर के साथ St-IPAAm170 की Nanostructured सतहों। सही पैनल: 40 एनएम 2 / अणु के एक एक मीटर के साथ St-IPAAm480 की Nanostructured सतहों। AFM छवियों मोड दोहन 3 एन / मीटर की लगातार वसंत और 70-90 किलोहर्ट्ज़ के गुंजयमान आवृत्ति के साथ एक फॉस्फेट डाल दिया गया सिलिकॉन ब्रैकट का उपयोग करने में प्राप्त किया गया।

चित्र तीन
चित्रा 3: सेंट-IPAAm480 के साथ एक Langmuir फिल्म का तबादला सतह पर एक सेल बरामद चादर और 40 एनएम के एक एक मीटर के macroscopic की छवि

फिल्म 1
एनिमेटेड चित्रा 1: । (राइट डाउनलोड करने के लिए क्लिक करें) सेंट-IPAAm480 और 40 एनएम 2 / अणु के एक AM साथ एक Langmuir फिल्म का तबादला सतह पर BAECs आसंजन और सेना की टुकड़ी के समय चूक तस्वीरें। छवियों 2 मिनट के अंतराल पर एकत्र किए गए थे और एकत्र चित्रों 960x गति से एक फिल्म के रूप में प्रदान किया गया।फिल्म में बड़े पैमाने बार 50 माइक्रोन है।

सेंट-IPAAm170 सेंट-IPAAm480
3 [एनएम 2 / अणु] 10 [एनएम 2 / अणु] 40 [एनएम 2 / अणु] 3 [एनएम 2 / अणु] 10 [एनएम 2 / अणु] 40 [एनएम 2 / अणु]
कमजोर आसंजन अच्छा शायद ही बरामद कमजोर आसंजन कमजोर आसंजन अच्छा

तालिका 1:। विभिन्न घनत्व और PIPAAm श्रृंखला लंबाई के साथ एक Langmuir फिल्म का तबादला सतह के गोजातीय कैरोटिड धमनी endothelial सेल (BAEC) शीट वसूली "अच्छा" बरकरार सीई का प्रतिनिधित्व करता हैडालूँगा चादर वसूली। "शायद ही बरामद" का अर्थ कोशिकाओं confluently संवर्धित किया जा सकता है और संवर्धित कोशिकाओं के तापमान में कमी के बाद भी सतह से कम या कोई टुकड़ी से पता चला है कि। "कमजोर आसंजन" इसका मतलब है कि कोशिकाओं को 3 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर संगम के लिए सुसंस्कृत नहीं थे।

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Discussion

एक तापमान संवेदनशील सतह Langmuir-शेफ़र विधि द्वारा निर्मित किया गया था, और सेल आसंजन / टुकड़ी और सेल चादर वसूली के लिए सतह के गुणों को अनुकूलित किया गया। सतहों के निर्माण के लिए इस विधि का उपयोग करते हैं, कई कदम महत्वपूर्ण हैं। सेंट-IPAAm अणुओं की आणविक संरचना सतह की संरचना पर एक बड़ा प्रभाव है और सतह की स्थिरता, और विस्तार के द्वारा, सेल आसंजन और सेना की टुकड़ी पर है। विशेष रूप से, सेंट-IPAAm अणुओं एक संकीर्ण आणविक वजन वितरण करना चाहिए था। हमारे विधि में, अलग-अलग PIPAAm श्रृंखला लंबाई के साथ दो St-IPAAm अणुओं बेड़ा polymerization द्वारा संश्लेषित थे, आणविक वजन और आणविक वजन वितरण के नियंत्रण की अनुमति है।

कदम nanostructures में दोष से बचने के लिए St-IPAAm सतह की तैयारी के दौरान हवा-पानी इंटरफेस के प्रदूषण को रोकने के लिए लिया जाना चाहिए। इससे पहले इंटरफेस पर बहुलक अणु छोड़ने, contaminanजब तक सतह दबाव लगभग 0 mN / मीटर तक पहुँचता है टीएस aspirated किया जाना चाहिए। संदूषण गर्त और Wilhelmy थाली के किनारों के आसपास जमा करने के लिए जाता है। क्योंकि Wilhelmy प्लेट इसकी सतह पर कुछ संदूषण था, यह annealed था। जब एक पेपर प्लेट Wilhelmy प्रयोग किया जाता है, इंटरफेस में आकांक्षा कदम दो बार कम से कम दोहराया जाना चाहिए। Π-ए एम इज़ोटेर्म की अवस्था भी हवा-पानी इंटरफेस में संदूषण की उपस्थिति पर निर्भर करता है। हमारा सुझाव है कि इस फिल्म के निर्माण से पहले की अवस्था isotherms के एक बार से अधिक प्राप्त किया जा। क्योंकि हाइड्रोफोबिक संशोधित ग्लास सब्सट्रेट के प्रदूषण को भी हो सकता है, सब्सट्रेट संक्रमण को दूर करने के लिए ताजा हवा या नाइट्रोजन गैस के साथ उड़ा दिया जाना चाहिए।

लगातार निर्माण के लिए Langmuir फिल्म का तबादला सतहों (St-IPAAm सतह), एक बहुलक के हाइड्रोफोबिक खंड महत्वपूर्ण है क्योंकि Langmuir फिल्म और हाइड्रोफोबिक संशोधित गिलास मैं के बीच बातचीत हाइड्रोफोबिक प्रतिक्रिया की असली ताकत है। इस अध्ययन में, क्योंकि ब्लॉक copolymer polystyrene, जो दृढ़ता से हाइड्रोफोबिक है, और कमरे के तापमान पर हाइड्रोफिलिक PIPAAm की रचना की थी, का तबादला फिल्म स्थिरतापूर्वक सब्सट्रेट करने के लिए भी पानी या सेल संस्कृति शर्तों के तहत पालन किया गया था। यह इंगित करता है कि हाइड्रोफोबिक खंडों एक मजबूत St-IPAAm सतह fabricating में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं।

एक तापमान संवेदनशील सतह पर सेल आसंजन और सेना की टुकड़ी को नियंत्रित करने के लिए, दोनों आणविक संरचना और घनत्व के सटीक नियंत्रण महत्वपूर्ण हैं। इस Langmuir-शेफ़र विधि में गिरा अणुओं की दी गई राशि और एक हवा पानी इंटरफेस का लक्ष्य क्षेत्र द्वारा संश्लेषित बहुलक का अणु प्रति क्षेत्र (ए एम) संपीड़न द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है। सेंट-IPAAm अणुओं छोड़ने का एक मीटर सिद्धांत में निम्न समीकरण द्वारा गणना की जा सकती है:

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जहां एक इंटरफेस, एम डब्ल्यू का क्षेत्र है सेंट-IPAAms की आणविक वजन है, सी क्लोरोफॉर्म समाधान की एकाग्रता है, एन ए Avogadro की संख्या है, और वी बहुलक समाधान की मात्रा को गिरा दिया है। नेनो समुद्री द्वीप संरचनाओं पिछले अध्ययनों 13-17 में वर्णित है, पर निर्माण के बाद St-IPAAm सतहों मनाया जाता है क्योंकि amphiphilic पॉलिमर के लिए फार्म एक हवा-पानी इंटरफेस पर आत्म आयोजन संरचनाओं। आकार और nanoscale संरचनाओं की राशि एक मीटर और सेंट-IPAAms की आणविक वजन द्वारा नियंत्रित किया गया था।

कोशिका आसंजन और सेना की टुकड़ी पर PIPAAm लेपित इलेक्ट्रॉन बीम विकिरण, सतह से शुरू की RAFT polymerization और स्पिन कोटिंग 19-27 सहित विभिन्न तरीकों, द्वारा गढ़े सतहों का मूल्यांकन किया गया। क्योंकि घनत्व, आणविक वजन, और PIPAAm संरचना सेल को प्रभावितएल आसंजन और टुकड़ी, PIPAAm लेपित सतह fabricating के लिए सटीक तकनीक महत्वपूर्ण हैं। इस Langmuir-शेफ़र विधि में, घनत्व, आणविक वजन और सतह nanostructures रूप में ऊपर वर्णित नियंत्रित किया जा सकता है। कोशिका आसंजन और सेंट-IPAAm सतहों टुकड़ी काफी विभिन्न ए एम और सेंट-IPAAm आणविक संरचना से प्रभावित थे, और सेंट-IPAAm की कुछ शर्तों कोशिका आसंजन और टुकड़ी के लिए सतहों आगे अनुकूलित किया जा सकता है। इन परिणामों से संकेत मिलता है कि इस विधि St-IPAAm सतह और कोशिकाओं के बीच बातचीत नियंत्रित कर सकते हैं।

reproducibly बरकरार सेल चादर ठीक करने के लिए, एक amphiphilic बहुलक के डिजाइन सबसे महत्वपूर्ण है। केवल हाइड्रोफिलिक पॉलिमर एक Langmuir-शेफ़र विधि द्वारा एक सतह पर निर्मित कर रहे हैं, जब लेपित पॉलिमर आसानी से आसुत जल या संस्कृति के माध्यम से बाहर धो रहे हैं। इस परिणाम से संकेत दिया है कि कमजोर हाइड्रोफोबिक बहुलक reproducibly इस मेथ में सेल चादर ठीक करने के लिए नहीं किया जाना चाहिएआयुध डिपो क्योंकि बहुलक संशोधित सतह एक पानी की हालत में अस्थिर था। हमारे विधि में, एक amphiphilic बहुलक में हाइड्रोफिलिक खंड एक जलीय घोल से बाहर धोने के बिना एक सतह पर मजबूत निर्माण में सक्षम बनाता है। इसके अलावा, क्योंकि Langmuir फिल्म parallelly इस अध्ययन में एक गिलास सब्सट्रेट करने के लिए स्थानांतरित किया गया था, नैनो स्केल समुद्री द्वीप संरचनाओं की सतह पर मनाया गया। हालांकि बेसल तरफ Langmuir फिल्म की संरचना अच्छी तरह से शिखर की ओर से अलग होने के लिए जाना जाता है, संरचना एक समानांतर स्थानांतरण द्वारा तय की गई थी।

सेल थेरेपी और पुनर्योजी चिकित्सा उपचार के रोगियों को जो अन्य उपचार के लिए अनुत्तरदायी हैं की संभावना पर ध्यान केंद्रित किया गया है। हमारी प्रयोगशाला सेल चादर इंजीनियरिंग ऊतक इंजीनियरिंग में संभावित अनुप्रयोगों के साथ एक तापमान संवेदनशील संस्कृति सतह पर गढ़े का उपयोग कर एक मूल, अद्वितीय पाड़ मुक्त ऊतक इंजीनियरिंग दृष्टिकोण विकसित किया है। सेल शीट के साथ कई क्लिनिकल परीक्षण alrea हैंवि चल रहा है और ऊतकों 29-31 के कई प्रकार के सफल परिणाम के लिए प्रदर्शन किया है। हालांकि BAECs सेल चादरें, अन्य सेल के सूत्रों, स्टेम कोशिकाओं सहित निर्माण करने के लिए सेल स्रोत के रूप में इस्तेमाल किया गया, एक मीटर के संयोजन और St-IPAAm अणुओं की आणविक संरचना का अनुकूलन के द्वारा एक St-IPAAm सतह पर चादर निर्माण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस गैर-परंपरागत तकनीक न केवल nanostructured सतहों का उत्पादन करने के लिए आसान है, लेकिन यह भी पुनर्योजी चिकित्सा में उपयोग के लिए मौलिक सेल संस्कृति रणनीतियों के लिए योगदान देगा।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
N-isopropylacrylamide Kohjin No catalog number
Azobis(4-cyanovaleric acid) Wako Pure Chemicals 016-19332
Styrene Sigma-Aldrich S4972
1,3,5-trioxane Sigma-Aldrich T81108
1,4-Dioxane Wako Pure Chemicals 045-24491
DMEM Sigma  D6429
PBS Nakarai 11482-15
Streptomycin GIBCO BRL 15140-163
Penicillin GIBCO BRL 15140-122
Trypsin-EDTA Sigma T4174
FBS Japan Bioserum JBS-11501
BAECs Health Science Reserch Resources Bank JCRB0099
Cover Glasses Matsunami Glass Industry C024501
AFM NanoScope V Veeco
1H NMR INOVA 400 Varian, Palo Alto
ATR/FT-IR NICOLET 6700 Thermo Scientific
GPC HLC-8320GPC Tosoh
TSKgel Super AW2500, AW3000, AW4000 Tosoh
Langmuir-Blodgett Deposition Troughs  KSV Instruments KN 2002 KSV NIWA Midium trough
Nikon ECLIPSE TE2000-U Nikon

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References

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जैव अभियांत्रिकी अंक 109 Langmuir फिल्म Langmuir-शेफ़र विधि प्रतिवर्ती इसके विखंडन हस्तांतरण कट्टरपंथी polymerization nanostructured सतह thermoresponsive सतह कोशिका आसंजन सेल टुकड़ी सेल चादर
ऊतक इंजीनियरिंग के लिए Thermoresponsive Nanostructured सतहों की तैयारी
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Sakuma, M., Kumashiro, Y., Nakayama, M., Tanaka, N., Haraguchi, Y., Umemura, K., Shimizu, T., Yamato, M., Okano, T. Preparation of Thermoresponsive Nanostructured Surfaces for Tissue Engineering. J. Vis. Exp. (109), e53465, doi:10.3791/53465 (2016).

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