Introduction
Nanostrukturerte overflater har nylig tiltrukket betydelig oppmerksomhet på grunn av sine ulike mulige bruksområder, blant annet mønster, cellekultur, rengjøring og overflate veksling. For eksempel superhydrophobic overflater inspirert av nanostrukturen av lotus blad og andre følsomme overflater er i stand til å reagere på ytre stimuli 1-4.
Langmuir film er en av de mest studerte polymerbelegg. En Langmuir film er dannet av amfifile molekyler å slippe ut en luft-vann-grenseflaten 5-8. Filmen kan deretter overføres på en fast overflate ved fysisk eller kjemisk adsorpsjon, og molekylær konformasjon på en fast overflate kan kontrolleres ved hjelp av vertikale og horisontale overføringsmetoder 9-12. Tettheten av Langmuir filmen kan reguleres nøyaktig ved å komprimere luft-vann-grenseflaten. Nylig har denne metoden også vist seg effektiv for fabrikasjon nanoscaled sjø-øya Struktureringes ved å utnytte amfifile blokk-kopolymerer. Nanostrukturer antas å bestå av en kjerne av hydrofobe segmenter og et skall av hydrofile segmenter 13-17. I tillegg er antallet av nanostrukturer på en overflate reguleres ved å regulere arealet pr molekyl (A m) av blokk-kopolymeren på grensesnittet.
Vi har fokusert på et originalt, unikt stillas fritt tissue engineering tilnærming, celle ark engineering, ved hjelp av en temperatur-responsive kultur overflaten. Den utviklede teknologien har blitt brukt til regenerativ behandling for ulike organer 18. En temperaturfølsomme kulturoverflaten ble fremstilt ved poding av poly- (N -isopropylacrylamide) (PIPAAm), en temperatur-følsom molekyl, på en overflate 19-27. PIPAAm og dens kopolymerer oppviser en lavere kritisk oppløsningstemperatur (LCST) i vandig medium ved temperaturer i nærheten av 32 ° C. Kulturen overflate oppviste også en temperatur-følsom alternati på mellom hydrofobisitet og hydrofilisitet. Ved 37 ° C, ble den PIPAAm-podet overflaten hydrofob, og cellene lett festes og spredte på overflaten så vel som på konvensjonell vevskulturpolystyren. Når temperaturen ble senket til 20 ° C, ble overflaten hydrofil, og cellene spontant løsnet fra overflaten. Derfor kan dyrkede konfluente celler på overflaten bli høstet som en intakt ark ved å endre temperaturen. Disse celleadhesjonsprosesser og avløsning egenskaper ble også vist av en overflate fabrikkert av Langmuir film belegg for laboratorium demonstrasjon 26, 27. En Langmuir film av blokk-kopolymerer bestående av polystyren (P (St)) og PIPAAm (St-IPAAm) ble fabrikkert. Langmuir film med en spesifikk A m kan være horisontalt overført til en hydrofobisk modifisert glass-substrat. I tillegg ble celleadhesjon av og løsgjøring fra den preparerte overflaten som reaksjon på temperatur evaluert.
_content "> Her beskriver vi protokoller for fremstilling av et nanostrukturerte Langmuir film sammensatt av termofølsomt amfifile blokk-kopolymerer på et glass-substrat. Vår metode kan gi en effektiv fremstillingsteknikk for organiske nanofilms i ulike felt av overflatevitenskap og kan bidra til mer effektiv kontroll av celle-adhesjon på spontan og løsgjøring fra en overflate.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Syntese av polystyren blokk -poly (N -isopropylacrylamide) ved to-trinns Vendbar Tilsetting-fragmentering Chain Transfer (RAFT) Radical Polymerisering
- Oppløs styren (153,6 mmol), 4-cyano-4- (ethylsulfanylthiocarbonyl) sulfanylpentanoic syre (ECT; 0,2 mmol), og 4,4'-Azobis (4-cyanvaleriansyre) (ACVA, 0,04 mmol) i 40 ml av 1, 4-dioksan. Fryse oppløsningen i flytende nitrogen under vakuum i 15-20 minutter for å fjerne de reaktive arter og gradvis tine ved RT. Pass på at løsningen er helt tint og gjenta dette fryse-pumpe-tine avgassing syklusen tre ganger.
- Skaff polystyren (PSt) (Mw: 13500) som en makro RAFT middel ved polymerisering ved 70 ° C i 15 timer i et oljebad.
- Bunnfallet PSt makro RAFT middel med 800 ml eter, og tørk i vakuum.
- Oppløs IPAAm monomer (4,32 mmol), PSt makro RAFT middel (0,022 mmol), og ACVA (0,004 mmol) i 4 ml 1,4-dioksan.
- Fjerneoksygen i oppløsningen ved fryse-pumpe-tine-sykluser avgassing som nevnt i trinn 1.1.
- Utføre en polymerisering ved 70 ° C i 15 timer i et oljebad etter avgassing. Skaff syntetisert St-IPAAm molekyl (Mw: 32800) på samme måte som den PSt makro RAFT agent.
2. Utarbeidelse av silanert Hydrofob Modified glass underlag
- Vask glass-substrater (24 mm x 50 mm) med et overskudd av aceton og etanol og sonikere i 5 minutter for å fjerne overflateforurensninger.
- Tørk de substrater i en ovn ved 65 ° C i 30 minutter. Deretter bruker oksygenplasma (400 W, 3 min) for å aktivere overflaten av substrater ved RT.
- Fordyp substrater i toluen inneholdende 1% heksyltrimetoksysilan over natten ved RT silanize underlaget.
- Vask de silanerte substrater i toluen og dyppe i aceton i 30 minutter for å fjerne uomsatte midler.
- Anneal substrater i 2 timer ved 110 ° C for å grundig immobilisere surface.
- Skjær silaniserte substrater av et glass cutter til 25 mm x 24 mm for å passe cellekultur retter (rett størrelse: φ35 mm).
3. Utarbeidelse av Langmuir Films og Film-overført Surface
- Plasser Langmuir film instrument i et kabinett for å forhindre akkumulering av støv.
- Vask Langmuir trau (størrelse: 580 mm x 145 mm) og barrierer med destillert vann og etanol for å fjerne forurensninger.
- Tørk trau og barrierer ved å tørke med en lintless håndkle. Deretter fyller rennen med omtrent 110 ml destillert vann, og sett barrierer på begge sider av trauet. Merk at destillert vann bør legges uten å søle i følgende trinn 3,5 til 3,13.
- Varm en platina Wilhelmy plate (perimeter: 39,24 mm) for å overvåke overflatespenningen med en gassbrenner til platen blir rød og vaskes deretter med destillert vann for å fjerne forurensninger. Heng Wilhelmy plate på en ledning festet tilden overflate-trykk-måleinstrument.
- Null overflate-trykkmåleinstrumentet i henhold til produsentens protokoll. Komprimere luft-vann-grenseflaten på trauet ved barrierene på begge sidene av trau inntil grenseflaten når omtrent 50 cm 2 uten noen dråper av polymer.
- Sug små forurensninger til overflaten trykket er nesten 0 mN / m.
- Reposisjonere barrierene på begge sider, og tilsett destillert vann for å kompensere for reduksjon av destillert vann fra trinn 3.6.
- Oppløs 5 mg av det syntetiserte St-IPAAm molekylet i 5 ml av en utvikling oppløsning av kloroform.
Merk: diklormetan eller toluen kan også anvendes som løsningsmiddel. - Forsiktig slippe 27 mL av St-IPAAm oppløst i kloroform på bunnen ved hjelp av en mikro eller mikropipette.
- Etter å ha ventet i 5 min for å tillate fullstendig fordamping av kloroform, flytte begge barrierene horisontalt for å komprimere St-IPAAm molecule ved grenseflaten. Oppretthold komprimering av barrierene på 0,5 mm / sek til målområdet på 50 cm 2 er nådd.
Merk: En rask kompresjonsforhold fører til defekter i Langmuir film. - Mål flatetrykket (π) -A m isotermer med platina Wilhelmy plate festet til overflaten trykk-måleinstrument under komprimeringen i henhold til produsentens protokoll.
- Etter å ha nådd størrelse målområdet, vedlikeholde overflaten i 5 min for å la de St-IPAAm molekyler til å slappe av; molekylene ikke nå likevekt umiddelbart etter komprimering.
- Overføre Langmuir filmen til et hydrofobisk modifisert glass-substrat ved hjelp av et overføringsapparat i 5 min for å adsorbere robust filmen. Fest hydrofobe glass underlaget parallelt på enheten. Koble enheten til en justering scenen og flytte loddrett.
- Løft underlaget horisontalt med overføring apparater og tørr for en dag i en desiccator.
4. Dyrking Cells og optimalisere celle adhesjon og Detachment på Langmuir Film Overført Surface
- For å fremstille cellesuspensjoner, kultur bovint carotid arterie endotelceller (BAECs) til en tredjedel konfluens ved 37 ° C i 5% CO2 og 95% luft på vevskulturpolystyren (TCPS) med Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) inneholdende 10% føtalt bovint serum (FBS) og 100 U / ml penicillin.
- Etter at konfluens er nådd, behandle BAECs med 3 ml 0,25% trypsin-EDTA i 3 minutter ved 37 ° C i 5% CO2 og 95% luft.
- Deaktivere trypsin-EDTA ved tilsetning av 10 ml DMEM inneholdende 10% FBS, og samle cellesuspensjonen i et 50 ml konisk rør.
- Sentrifuger ved 120 xg i 5 minutter, og aspirer supernatanten. Re-suspendere cellene med 10 ml av DMEM.
- Plasser St-IPAAm overflater under ultrafiolett lys på en ren benk for sterilisering i 5 min.
- Seed den gjen cells på St-IPAAm overflater ved en konsentrasjon på 1,0 x 10 4 celler / cm2 telles ved en engangs hemocytometer og observere cellene på overflatene av et mikroskop utstyrt med en inkubator ved 37 ° C med 5% CO2 og 95% luft.
Merk: Steriliser St-IPAAm overflater av ultrafiolett lys utstyrt til en ren benk. - Record time-lapse bilder av heft BAECs for om lag 24,5 timer ved 37 ° C med et fasekontrastmikroskop med 10X forstørrelse. Etter BAEC vedheft, rekord avløsning av BAECs fra St-IPAAm overflaten ved 20 ° C i ca 3,5 time.
5. Cell Sheet Fabrication på Langmuir Film-overførte Overflater
- Kultur BAECs brukes på samme måte som beskrevet i punkt 4.
- Seed en total på 1,0 x 10 5 celler / cm2 på St-IPAAm overflater og inkuber i 3 dager ved 37 ° C i 5% CO2. Confluent BAECs spontant enebolig ved 20 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Blokk-kopolymerer som består av polystyren og poly (N -isopropylacrylamide) (St-IPAAms) med spesifikke molekylvekter ble syntetisert ved RAFT radikal polymerisasjon. ECT ble fremstilt som et kjedeoverføringsmiddel som beskrevet i Moad et al., 28. To St-IPAAm molekyler med forskjellige kjedelengder PIPAAm ble syntetisert, og de oppnådde blokkpolymerer ble karakterisert ved 1H-kjernemagnetisk resonans (NMR) og gelpermeasjonskromatografi (GPC). Molekylvektene til St-IPAAms var 32800 og 67900, med en snever molekylvektfordeling (1,31 og 1,50). De monomere omdannelser av polystyren makro RAFT middel og PIPAAm ble funnet å være 17,4%, og mer enn 85,0%. Den syntetiserte St-IPAAms ble kåret til St-IPAAm170 og St-IPAAm480, henholdsvis.
Langmuir filmer med ulike områder per molekyl (A m) ble fabrikkert ved enluft-vann-grenseflaten ved å slippe St-IPAAm molekyler oppløst i kloroform-løsning (figur 1A). Etter slippe St-IPAAm molekyler, ble overflatetrykket av grensesnittet luft-vann satt til 0 mN / m og kontinuerlig økes ved å lukke grensesnittet under komprimeringen med bommene (figur 1B). Eventuelle feil i Langmuir filmer dannet på en luft-vann-grensesnittet kan utledes fra π-A m isotermen. Den forberedt St-IPAAm Langmuir film ble overført til en hydrofobisk modifisert glass substrat (St-IPAAm overflate) (figur 1C). Filmen-overført overflaten ble evaluert av atomic force mikroskopi (AFM). Figur 2 viser AFM topografiske bilder (1 x 1 mikrometer) av de St-IPAAm170 og St-IPAAm480 overflater. Nanostrukturer ble observert på St-IPAAm flater, mens slike strukturer ble bare sjelden observert på den nakne hydrofobe underlaget. Størrelsen og formen på nanostrukturer var sterkt dependent på A m og sammensetningen av St-IPAAm. AFM topografiske bilde bekreftet at Langmuir filmene kan være homogent overføres til den hydrofobe modifiserte glass-substrat, og at overflate morfologier kan bli kontrollert av den molekylære sammensetning og A m.
Stabiliteten av de St-IPAAm Langmuir film ble bedømt ved hjelp av en svekket samlet refleksjons Fourier-transform infrarød spektroskopi (ATR / FT-IR). Mengden av PIPAAms på det hydrofobe glassubstratet kan anslås ved en kalibreringslinje oppnådd fra toppintensitet forhold på 1,000 cm-1 avledet fra glass (Si-O) og 1650 cm-1 avledet fra PIPAAm (C = O). Kalibreringslinjen ble beregnet fra en serie av kjente mengder av PIPAAm støpt på den hydrofobe glasset. Mengdene av PIPAAm St. IPAAm170 (10 nm 2 / molekyl) og St-IPAAm480 (40 nm 2 / molekyl) på substratet ble funnet å være 0,87 ug/ cm2 og 0,63 mikrogram / cm 2, henholdsvis. Mengden av PIPAAm på overflaten etter vask med destillert vann var nesten det samme som de på overflatene uten vasking. Disse resultatene indikerte at fremstille St-IPAAm overflater var stabile i en vann tilstand.
Vi neste undersøkte vedheft og avløsning av storfe halspulsåren endotelceller (BAECs) på St-IPAAm overflater. Time-lapse fotografering av heft og løsne BAECs på St-IPAAm480 overflaten på 40 nm 2 / molekyl er vist i den animerte figur 1. Heft BAECs ved 37 ° C ble raskt løsrevet fra både St-IPAAm170 og St-IPAAm480 etter avtagende temperaturen til 20 ° C. Antallet av adherente celler på St-IPAAm170 og St-IPAAm480 ved 37 ° C var 0,6 x 10 4 celler / cm 2 og 0,9 x 10 4 celler / cm 2, henholdsvis, noe som indikerer at antallet adherente celles er modulert av sammensetningen av St-IPAAm overflate. Celle ark kan også utvinnes ved å koble konfluente dyrkede BAECs fra disse St-IPAAm overflater. Det gjenvunne cellefolien ble visualisert som et todimensjonalt cellestruktur (figur 3). Cellene nådde sammenløpet etter tre dager i kultur på St-IPAAm170 og St-IPAAm480 overflater ved 37 ° C, og den cellefolien ble hurtig gjenvunnet etter reduksjon av temperaturen fra 37 ° C til 20 ° C. Effekten av molekylvekt og A m St. IPAAms på cellefolien utvinning er oppsummert i tabell 1. Levedyktigheten av celleplater ble bestemt ved trypan blå farving etter adskillelse av BAECs ark. Celler ble behandlet med trypsin-EDTA på glassubstratet ved 37 ° C ble anvendt som en kontroll. Døde celler forholdstall på St-IPAAm170, St-IPAAm480 og hydrofobe glass underlaget som en kontroll ble beregnet til å være ca 11,0%, 7,7% og 11,7%, henholdsvis. Disse resultatene indikerte at cell levedyktighet ble neppe påvirket av temperaturreduksjon.
Fig. 1: Fremstilling av en thermoresponsive Langmuir film overført overflate (A) polystyren-blokk -poly (N -isopropylacrylamide) (St-IPAAm) kloroformoppløsning ble forsiktig dryppet på en luft-vann-grenseflaten. Overflatetrykket ble målt under komprimering for å oppdage eventuelle feil i Langmuir film. (B) To barrierer ble brukt til å komprimere de St-IPAAm molekyler på grenseflaten til et målområde på 50 cm2 ble nådd. (C) Etter komprimering, ble en hydrofobt modifisert deksel glassubstrat horisontalt plassert på grenseflaten med en innrettingstrinn i 5 min. Substratet ble løftet horisontalt og tørket i 1 dag. Dette tallet har blitt litt endret fra og med publiseringen av Sakuma et al. 27
Figur 2:. Atomic force mikroskopi (AFM) topografiske bilder (1 x 1 mikrometer) av Langmuir film overført overflater (St-IPAAm overflaten) Venstre panel: nanostrukturerte overflater av St-IPAAm170 med en A m på 10 nm 2 / molekyl. Høyre panel: nanostrukturerte overflater av St-IPAAm480 med en A m på 40 nm 2 / molekyl. AFM bildene ble tatt i å tappe modus ved hjelp av en fosfat-dopet silisium cantilever med en fjærkonstant 3 N / m og resonansfrekvens på 70-90 kHz.
Tabell 1:. Bovine halspulsåren endotelceller (BAEC) ark utvinning av en Langmuir film-overført overflaten med ulike tettheter og PIPAAm kjedelengder "Good" representerer intakt cell ark utvinning. "Neppe utvinnes" betyr at cellene kan være confluently dyrket og de dyrkede celler viste liten eller ingen løsrivelse fra overflaten selv etter at en reduksjon i temperatur. "Svak klebing" betyr at cellene var dyrket til konfluens ved 37 ° C i 3 dager. 
Figur 3: Makroskopisk bilde av en celle utvunnet ark på en Langmuir film overført overflate med St-IPAAm480 og en A m på 40 nm 
Animert Figur 1: . (Høyreklikk for å laste ned) Time-Lapse fotografier av BAECs vedheft og avløsning på en Langmuir film-overført overflate med St-IPAAm480 og en Am på 40 nm 2 / molekyl. Bildene ble tatt på 2-minutters intervaller, og de innsamlede bildene ble gitt som en film på 960 ganger hastighet. Deskala bar i filmen er 50 mikrometer. St-IPAAm170 St-IPAAm480 3 [nm 2 / molekyl] 10 [nm 2 / molekyl] 40 [nm 2 / molekyl] 3 [nm 2 / molekyl] 10 [nm 2 / molekyl] 40 [nm 2 / molekyl] svak vedheft God neppe utvinnes svak vedheft svak vedheft God
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En temperaturfølsomme overflate ble fremstilt ved Langmuir-Schaefer metode, og overflateegenskapene for celleadhesjon / løsgjøring og gjenvinning av cellefolien var optimalisert. Ved bruk av denne fremgangsmåten for fabrikasjon av overflater, flere trinn er kritisk. Den molekylære sammensetning av de St-IPAAm molekyler har en stor effekt på overflatestrukturen og stabiliteten av overflaten, og ved utvidelse, ved celleadhesjon og løsgjøring. Spesielt bør de St-IPAAm molekyler har en snever molekylvektfordeling. I vår fremgangsmåte, ble to St-IPAAm molekyler med forskjellige kjedelengder PIPAAm syntetisert ved RAFT polymeriseringen, slik at kontroll av molekylvekt og molekylvektfordeling.
Skritt som bør tas for å hindre forurensning av luft-vann-grensesnittet under utarbeidelsen av St-IPAAm overflate for å unngå feil i nanostrukturer. Før slippe polymermolekyler på grenseflaten, contaminants skal suges inntil overflaten trykket når omtrent 0 mN / m. Forurensning en tendens til å samle seg rundt kantene av rennen og Wilhelmy plate. Fordi Wilhelmy plate hadde en viss forurensning på sin overflate, ble det glødet. Når en papir Wilhelmy plate blir brukt, bør aspirasjon skritt i skjærings gjentas minst to ganger. Den π-A m isotermen kurve er også avhengig av tilstedeværelsen av forurensning i luft-vann-grenseflaten. Det anbefales at kurven av isotermene fås mer enn én gang før fremstillingen av filmen. Fordi forurensning av det hydrofobe modifiserte glass-substrat kan også forekomme, bør substratet bli blåst med frisk luft eller nitrogengass for å fjerne forurensninger.
For å fremstille Langmuir gående tabletter, overført flater (St-IPAAm overflate), er viktig for den hydrofobe segment av en polymer fordi den hydrofobe interaksjon mellom Langmuir film og hydrofobisk modifisert glass i er den drivende kraft for reaksjonen. I denne studien, fordi blokk-kopolymeren var sammensatt av polystyren, som er sterkt hydrofob og hydrofil PIPAAm ved værelsestemperatur, den overførte filmen var stabilt festet til substratet selv under vann eller cellekulturbetingelser. Dette indikerer at hydrofobe segmenter spiller en viktig rolle ved fremstilling av en robust St-IPAAm overflate.
For å kontrollere celle adhesjon og løsgjøring på en temperatur-følsom overflate, både den molekylære sammensetningen og den nøyaktige kontroll av tetthet er viktige. I denne Langmuir-Schaefer metoden, kan det areal per molekyl (A m) av polymer syntetisert ved en gitt mengde falt molekyler og målområdet av en luft-vann-grenseflaten kontrolleres ved sammenpressing. A m slippe St-IPAAm molekyler kan i teorien beregnes av følgende ligning:
d / 53465 / 53465eq1.jpg "/>
hvor A er arealet av grenseflaten, Mw er molekylvekten av St-IPAAms, c er konsentrasjonen av kloroformoppløsningen, er N A Avogadros tall, og V er volumet av den polymeroppløsning droppet. Nanoskala sjø-øy strukturer er observert på St-IPAAm overflater etter fremstilling på grunn amfifile polymerer dannes selvorganiserende strukturer på en luft-vann-grenseflaten, slik som beskrevet i tidligere studier 13-17. Størrelsen og mengden av nanoskala strukturer ble kontrollert ved A m og molekylvekten av St-IPAAms.
Celle adhesjon og avløsning ble evaluert på PIPAAm-belagte overflater fabrikkert av ulike metoder, inkludert elektronbestråling, overflate initiert RAFT polymerisering og spin belegg 19-27. Fordi tetthet, molekylvekt og struktur PIPAAm påvirke cell vedheft og løsrivelse, presise teknikker for fabrikasjon PIPAAm lakkert overflate er viktig. I denne Langmuir-Schaefer metode, kunne tetthet, molekylvekt og flatenanostrukturer reguleres som beskrevet ovenfor. Celle adhesjon og avløsning på St-IPAAm overflater ble drastisk påvirket av diverse A m og St-IPAAm molekylære sammensetningen, og noen forhold av St-IPAAm overflater for celle adhesjon og avløsning kan bli ytterligere optimalisert. Disse resultatene indikerer at denne fremgangsmåte kan kontrollere interaksjonen mellom de St-IPAAm overflate og celler.
For reproduserbar måte å utvinne intakt cellefoliebane, er utformingen av en amfifil polymer viktigst. Når bare hydrofile polymerer er fremstilt på en overflate ved en Langmuir-Schaefer metode, er belagt polymerer lett vaskes ut med destillert vann eller dyrkningsmediet. Dette resultat indikerte at den svake hydrofobe polymer ikke bør brukes til på reproduserbar måte å gjenvinne cellefolien i dette method fordi polymeren med modifisert overflate var ustabilt i et vann tilstand. I vår fremgangsmåte, den hydrofile segment i en amfifil polymer muliggjør robust fabrikasjon på en overflate uten å vaske ut av en vandig oppløsning. I tillegg, siden den Langmuir filmen ble parallelt overført til et glass-substrat i denne studien ble nano skalert sjø-øy strukturer observeres på overflaten. Selv om strukturen av Langmuir film på basal side er godt kjent for å være forskjellig fra det på den apikale side, ble strukturen løst ved en parallell overføring.
Celleterapi og regenerativ medisin har vært fokusert på muligheten for helbredelse pasienter som er svarer til andre behandlinger. Vårt laboratorium har utviklet en original og unik stillas fritt tissue engineering tilnærming ved hjelp av celle ark ingeniør fabrikkert på en temperatur-responsive kultur overflaten med potensielle bruksområder i tissue engineering. Flere kliniske studier med celle ark er already i gang, og har vist vellykket utfall for flere typer vev 29-31. Selv om BAECs ble benyttet som cellekilde for å fremstille celleplater, andre cellekilder, inkludert stamceller, kan brukes til å fremstille ark på et St-IPAAm overflate ved å optimalisere kombinasjoner av A m og den molekylære sammensetning av St-IPAAm molekyler. Denne ikke-konvensjonell teknologi bidrar ikke bare til den enkle fremstilling av nanostrukturerte overflater, men også i grunnleggende cellekultur strategier for anvendelse i regenerativ medisin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| N-isopropylacrylamide | Kohjin | No catalog number | |
| Azobis(4-cyanovaleric acid) | Wako Pure Chemicals | 016-19332 | |
| Styrene | Sigma-Aldrich | S4972 | |
| 1,3,5-trioxane | Sigma-Aldrich | T81108 | |
| 1,4-Dioxane | Wako Pure Chemicals | 045-24491 | |
| DMEM | Sigma | D6429 | |
| PBS | Nakarai | 11482-15 | |
| Streptomycin | GIBCO BRL | 15140-163 | |
| Penicillin | GIBCO BRL | 15140-122 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma | T4174 | |
| FBS | Japan Bioserum | JBS-11501 | |
| BAECs | Health Science Reserch Resources Bank | JCRB0099 | |
| Cover Glasses | Matsunami Glass Industry | C024501 | |
| AFM NanoScope V | Veeco | ||
| 1H NMR INOVA 400 | Varian, Palo Alto | ||
| ATR/FT-IR NICOLET 6700 | Thermo Scientific | ||
| GPC HLC-8320GPC | Tosoh | ||
| TSKgel Super AW2500, AW3000, AW4000 | Tosoh | ||
| Langmuir-Blodgett Deposition Troughs | KSV Instruments | KN 2002 | KSV NIWA Midium trough |
| Nikon ECLIPSE TE2000-U | Nikon |
References
- Bae, Y. H., Kwon, I. C., Pai, C. M., Kim, S. W. Controlled release of macromolecules from electrical and chemical stimuli-responsive hydrogels. Makromol. Chem., Macromol. Symp. 70-71 (1), 173-181 (1993).
- Fu, Q., et al. Reversible control of free energy and topography of nanostructured surfaces. J. Am. Chem. Soc. 126 (29), 8904-8905 (2004).
- Nykanen, A., et al. Phase behavior and temperature-responsive molecular filters based on self-assembly of polystyrene-block-poly(N-isopropylacrylamide)-block-polystyrene. Macromolecules. 40 (16), 5827-5834 (2007).
- Sun, T., et al. Reversible switching between superhydrophilicity and superhydrophobicity. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 43 (3), 357-360 (2004).
- Shuler, R. L., Zisman, W. A. A Study of the behavior of Polyoxyethylene at the air-water interface by wave damping and other methods. J. Phys. Chem. 74 (7), 1523-1534 (1970).
- Kawaguchi, M., Sauer, B. B., Yu, H. Polymeric monolayer dynamics at the air/water interface by surface light scattering. Macromolecules. 22 (4), 1735-1743 (1989).
- Saito, W., Kawaguchi, M., Kato, T., Imae, T. Spreading solvent and temperature effects on interfacial properties of Poly (N-isopropylacrylamide) films at the air-water interface. Langmuir. 7463 (11), 5947-5950 (1996).
- Jheng, K. T., Hsu, W. P. Molecular weight effect of PMMA on its miscibility with PS-b-PEO at the air/water interface. J. App. Polym. Sci. 125 (3), 1986-1992 (2012).
- Biesalski, M. A., Knaebel, A., Tu, R., Tirrell, M. Cell adhesion on a polymerized peptide-amphiphile monolayer. Biomaterials. 27 (8), 1259-1269 (2006).
- Da Silva, A. M. P. S. G., Lopes, S. I. C., Brogueira, P., Prazeres, T. J. V., Beija, M., Martinho, J. M. G. Thermo-responsiveness of poly(N,N-diethylacrylamide) polymers at the air-water interface: The effect of a hydrophobic block. Journal of colloid interface sci. 327 (1), 129-137 (2008).
- Wang, S. Q., Zhu, Y. X. Facile method to prepare smooth and homogeneous polymer brush surfaces of varied brush thickness and grafting density. Langmuir. 25 (23), 13448-13455 (2009).
- Estillore, N. C., Park, J. Y., Advincula, R. C. Langmuir−Schaefer (LS) macroinitiator film control on the grafting of a thermosensitive polymer brush via surface initiated-ATRP. Macromolecules. 43 (16), 6588-6598 (2010).
- Seo, Y. S., et al. Nanowire and mesh conformations of diblock copolymer blends at the air/water interface. Nano Lett. 4 (3), 483-486 (2004).
- Lu, Q., Bazuin, C. G. Solvent-assisted formation of nanostrand networks from supramolecular diblock copolymer/surfactant complexes at the air/water interface. Nano lett. 5 (7), 1309-1314 (2005).
- Nagano, S., Matsushita, Y., Ohnuma, Y., Shinma, S., Seki, T. Formation of a highly ordered dot array of surface micelles of a block copolymer via liquid crystal-hybridized self-assembly. Langmuir. 22 (12), 5233-5236 (2006).
- Perepichka, I. I., Borozenko, K., Badia, A., Bazuin, C. G. Pressure-induced order transition in nanodot-forming diblock. J. Am. Chem. Soc. 133 (493), 19702-19705 (2011).
- Wang, X. L., Ma, X. Y., Zang, D. Y. Aggregation behavior of polystyrene-b-poly(acrylicacid) at the air-water interface. Soft Matter. 9 (2), 443-453 (2013).
- Yamato, M., Okano, T.
- Rollason, G., Daviest, J. E., Sefton, M. V. Preliminary report on cell culture on a thermally reversible copolymer. Biomaterials. 14 (2), 153-155 (1993).
- Park, Y. S., Ito, Y., Imanishi, Y. Permeation control through porous membranes immobilized with thermosensitive polymer. Langmuir. 14 (4), 910-914 (1998).
- Kwon, O. H., Kikuchi, A., Yamato, M., Okano, T. Accelerated cell sheet recovery by co-grafting of PEG with PIPAAm onto porous cell culture membranes. Biomaterials. 24 (7), 1223-1232 (2003).
- Kikuchi, A., Okano, T. Nanostructured designs of biomedical materials: applications of cell sheet engineering to functional regenerative tissues and organs. J. Control. Release. 101 (1-3), 69-84 (2005).
- Fukumori, K., et al. Characterization of ultra-thin temperature-responsive polymer layer and its polymer thickness dependency on cell attachment/detachment properties. Macromol. biosci. 10 (10), 1117-1129 (2010).
- Takahashi, H., Nakayama, M., Yamato, M., Okano, T. Controlled chain length and graft density of thermoresponsive polymer brushes for optimizing cell sheet harvest. Biomacromolecules. 11 (8), 1991-1999 (2010).
- Nakayama, M., Yamada, N., Kumashiro, Y., Kanazawa, H., Yamato, M., Okano, T. Thermoresponsive poly(N-isopropylacrylamide)-based block copolymer coating for optimizing cell sheet fabrication. Macromol. Biosci. 12 (6), 751-760 (2012).
- Sakuma, M., et al. Control of cell adhesion and detachment on Langmuir-Schaefer surface composed of dodecyl-terminated thermo-responsive polymers. J. Biomater. Sci., Polym. Ed. 25 (5), 431-443 (2014).
- Sakuma, M., et al. Thermoresponsive nanostructured surfaces generated by the Langmuir-Schaefer method are suitable for cell sheet fabrication. Biomacromolecules. 15 (11), 4160-4167 (2014).
- Moad, G., Chong, Y. K., Postma, A., Rizzardo, E., Thang, S. H. Advances in RAFT polymerization: the synthesis of polymers with defined end-groups. Polymer. 46 (19), 8458-8468 (2005).
- Nishida, K., et al. Corneal Reconstruction with Tissue-Engineered Cell Sheets Composed of Autologous Oral Mucosal Epithelium. N. Engl. J. Med. 351 (12), 1187-1196 (2004).
- Ohki, T., et al. Prevention of esophageal stricture after endoscopic submucosal dissection using tissue-engineered cell sheets. Gastroenterology. 143 (3), 582-588 (2012).
- Sawa, Y., et al. Tissue engineered myoblast sheets improved cardiac function sufficiently to discontinue LVAS in a patient with DCM: report of a case. Surg. Today. 42 (2), 181-184 (2012).
