Introduction
Nanostrukturierte Oberflächen haben in jüngster Zeit erhebliche Aufmerksamkeit aufgrund ihrer verschiedenen Anwendungsmöglichkeiten, einschließlich Strukturierung, Zellkultur, Reinigung und Oberflächenumschaltung. Zum Beispiel superhydrophoben Oberflächen , die durch die Nanostruktur des Lotusblattes inspiriert und andere ansprechende Oberflächen sind in der Lage 1-4 auf äußere Reize reagieren.
Die Langmuir-Film ist eine der am häufigsten untersuchten Polymerbeschichtungen. Ein Langmuir - Film wird durch Eintropfen amphiphilen Molekülen auf einem Luft-Wasser - Grenzfläche 5-8 gebildet. Der Film kann dann durch physikalische oder chemische Adsorption und die molekulare Konformation auf einer festen Oberfläche auf einer festen Oberfläche übertragen werden kann unter Verwendung von vertikalen und horizontalen Übertragungsmethoden 9-12 gesteuert werden. Die Dichte des Langmuir-Film kann präzise durch Komprimieren der Luft-Wasser-Grenzfläche zu regeln. In jüngster Zeit hat dieses Verfahren auch zur Herstellung von nanoskaligen sea-island Structur bewährtes durch amphiphile Blockcopolymere verwendet. Die Nanostrukturen angenommen eines Kerns aus hydrophoben Segmenten bestehen und eine Schale aus hydrophilen Segmente 13-17. Darüber hinaus wird die Anzahl von Nanostrukturen auf einer Oberfläche durch Steuern der Fläche pro Molekül (A m) des Blockcopolymers an der Grenzfläche geregelt.
Wir haben auf einem ursprünglichen, einzigartigen, gerüstfreie Gewebe-Engineering-Ansatz, Zellrasen Technik fokussiert, eine temperaturempfindliche Kulturoberfläche verwenden. Die entwickelte Technologie wurde für verschiedene Organe 18 auf regenerative Therapien angewandt. Eine temperaturempfindliche Kulturoberfläche wurde durch Pfropfen von Poly (N Isopropylacrylamid) (PIPAAm), eine temperaturempfindliche Molekül, auf eine Oberfläche 19-27 hergestellt. PIPAAm und seine Copolymere weisen eine untere kritische Lösungstemperatur (LCST) in wässrigem Medium bei Temperaturen nahe 32 ° C. Die Kulturfläche zeigte auch eine temperaturempfindliche Alterna auf zwischen Hydrophobie und Hydrophilie. Bei 37 ° C, die PIPAAm gepfropfte Oberfläche wurde hydrophob, und die Zellen leicht angebracht und proliferierten auf der Oberfläche als auch auf konventionelle Gewebskultur-Polystyrol. Wenn die Temperatur auf 20 ° C gesenkt wurde, wurde die Oberfläche hydrophil, und die Zellen von der Oberfläche spontan löst. Daher kultiviert konfluenten Zellen auf der Oberfläche konnte durch Änderung der Temperatur als intaktes Blatt geerntet werden. Diese Zell - Adhäsion und Ablösung Eigenschaften wurden auch von einer Oberfläche hergestellt durch Langmuir Filmbeschichtung für Labordemonstration 26 angezeigt, 27. Ein Langmuir - Film von Blockcopolymeren , bestehend aus Polystyrol (P (St)) und PIPAAm (St-IPAAm) wurde hergestellt. Die Langmuir - Film mit einem spezifischen A m könnte horizontal zu einer hydrophob modifizierten Glassubstrat übertragen werden. Zusätzlich Zelladhäsion auf und Ablösung von der vorbereiteten Oberfläche in Reaktion auf Temperatur wurden bewertet.
_content "> Hier beschreiben wir Protokolle für die Herstellung eines Films aus thermo-responsive amphiphile Blockcopolymere auf einem Glassubstrat besteht Langmuir nanostrukturiert. Unser Verfahren in verschiedenen Bereichen der Oberflächenwissenschaft eine effektive Herstellungstechnik für organische Nanofilme bereitstellen kann und erleichtern eine wirksame Kontrolle der Zelladhäsion auf und spontane Ablösung von einer Oberfläche.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Synthese von Polystyrol- Block -Poly (N Isopropylacrylamid) durch die zwei-Stufen - Reversible Addition-Fragmentation Chain Transfer (RAFT) radikalische Polymerisation
- Auflösen Styrol (153,6 mmol), 4-cyano-4- (ethylsulfanylthiocarbonyl) sulfanylpentanoic Säure (ECT; 0,2 mmol) und 4,4'-Azobis (4-cyanovaleriansäure) (ACVA; 0,04 mmol) in 40 ml 1, 4-Dioxan. Frieren Sie die Lösung in flüssigem Stickstoff unter Vakuum für 15-20 min, die reaktiven Spezies zu entfernen und allmählich auftauen bei RT. Stellen Sie sicher, dass die Lösung vollständig aufgetaut ist und wiederholen Sie diese Gefrier-Pump-Auftau-Entgasung Zyklus dreimal.
- Erhalten, die Polystyrol (PSt) (Mw: 13.500) als Makro RAFT Mittel durch Polymerisation bei 70 ° C für 15 Stunden in einem Ölbad.
- Precipitate PSt Makro RAFT Mittel mit 800 ml Ether und im Vakuum getrocknet.
- Auflösen IPAAm Monomer (4,32 mmol), PSt Makro RAFT Mittel (0,022 mmol) und ACVA (0,004 mmol) in 4 ml 1,4-Dioxan.
- Entfernender Sauerstoff in der Lösung durch die Gefrier-Pump-Auftau-Zyklen Entgasung wie in Schritt 1.1 erwähnt.
- Durchführen einer Polymerisation bei 70 ° C für 15 Stunden in einem Ölbad nach dem Entgasen. Erhalten Sie synthetisierten St-IPAAm Molekül (Mw: 32,800) auf die gleiche Weise wie bei der PSt Makro RAFT Mittel.
2. Herstellung von Silanized Hydrophobe Modified Glassubstrate
- Waschglassubstrate (24 mm x 50 mm) mit einem Überschuß an Aceton und Ethanol und mit Ultraschall 5 min Oberflächenverunreinigungen zu entfernen.
- Trocknen der Substrate in einem Ofen bei 65 ° C für 30 min. Dann Sauerstoffplasma verwenden (400 W, 3 min), um die Oberflächen der Substrate bei RT zu aktivieren.
- Tauchen der Substrate in Toluol, das 1% Hexyltrimethoxysilan über Nacht bei RT, das Substrat zu silanisieren.
- Waschen Sie die silanisierte Substrate in Toluol und tauchen für 30 min in Aceton nicht umgesetztes Mittel zu entfernen.
- Anneal Substrate für 2 Stunden bei 110 ° C, um gründlich die s immobilisierenDein Gesicht.
- Schneiden Sie die silanisierte Substrate durch ein Glasschneider bis 25 mm x 24 mm, die Zellkulturschalen (Schale Größe: φ35 mm) passen.
3. Herstellung von Langmuir-Filme und Film-Oberfläche übertragen
- Legen Sie das Langmuir-Film Instrument in einem Schrank die Ansammlung von Staub zu verhindern.
- Waschen Sie die Langmuir-Trog (Größe: 580 mm x 145 mm) und Barrieren mit destilliertem Wasser und Ethanol zu entfernen Verunreinigungen.
- Trocknen Sie die Wanne und Barrieren, die durch mit einem fusselfreien Tuch abwischen. Dann füllen die Wanne mit etwa 110 ml destilliertem Wasser, und stellen Sie die Hindernisse auf beiden Seiten der Mulde. Man beachte, dass destilliertes Wasser sollte ohne Verschütten in den folgenden Schritten von 3,5 bis 3,13 zugegeben werden.
- Erhitzen Sie eine Platin Wilhelmy-Platte (Umfang: 39,24 mm) zur Überwachung der Oberflächenspannung mit einem Gasbrenner, bis die Platte rot wird und dann mit destilliertem Wasser waschen Verunreinigungen zu entfernen. Hängen Sie die Wilhelmy-Platte auf einem Draht befestigtdie Oberflächendruck-Messinstrument.
- Null, um die Oberflächendruck-Messgerät nach dem Protokoll des Herstellers. Komprimieren der Luft-Wasser - Grenzfläche auf dem Trog durch die Barrieren an den beiden Seiten der Rinne , bis die Schnittstelle ohne Tropfen Polymer etwa 50 cm 2 erreicht.
- Aspirat kleine Verunreinigungen, bis der Oberflächendruck ist nahezu 0 mN / m.
- Positionieren Sie die Hindernisse auf beiden Seiten, und destilliertes Wasser für die Abnahme von destilliertem Wasser aus Schritt 3.6 zu kompensieren.
- Man löst 5 mg des synthetisierten St-IPAAm Molekül in 5 ml einer Entwicklungslösung aus Chloroform.
Hinweis: Dichlormethan oder Toluol, können auch als Lösungsmittel verwendet werden. - fallen sanft 27 & mgr; l von St-IPAAm in Chloroform auf den Trog gelöst, um eine Mikrospritze oder Mikropipette.
- Nach einer Wartezeit für 5 Minuten eine vollständige Verdampfung von Chloroform zu ermöglichen, beide Barrieren bewegen horizontal, um die St-IPAAm Moleku zu komprimierenle an der Grenzfläche. Aufrechterhaltung Komprimierungsrate der Barrieren bei 0,5 mm / sec , bis der Zielfläche von 50 cm 2 erreicht ist.
Hinweis: Eine schnelle Kompressionsrate Defekte in der Langmuir-Film verursacht. - Messen der Oberflächendruck (π) -A m Isothermen mit dem Platin Wilhelmy - Platte an der Oberfläche Druck-Messinstrument während der Kompression nach dem Protokoll des Herstellers.
- Nachdem das Zielgebiet Größe erreichen, halten die Oberfläche für 5 min die St-IPAAm Moleküle zu ermöglichen, sich zu entspannen; die Moleküle Gleichgewicht nicht unmittelbar nach der Kompression erreichen.
- Übertragen Sie die Langmuir-Film auf eine hydrophob modifizierte Glassubstrat mit einer Transfervorrichtung für 5 Minuten unter Verwendung zu robust den Film adsorbieren. Befestigen Sie das hydrophobe Glassubstrat parallel auf dem Gerät. Schließen Sie das Gerät an eine Ausrichtungsstufe und senkrecht bewegen.
- Heben Sie das Substrat horizontal mit der Transfervorrichtung und trocken für 1 Tag in einem desiccator.
4. Kultivierung von Zellen und Optimierung von Zelladhäsion und Detachment auf dem Langmuir Film übertragen Oberflächen
- Zur Herstellung von Zellsuspensionen, die Kultur bovine Arteria carotis Endothelzellen (BAECs) zu einem Drittel Konfluenz bei 37 ° C in 5% CO 2 und 95% Luft auf Gewebekultur - Polystyrol (TCPS) mit Dulbecco modifiziertem Eagle Medium (DMEM) , das 10% fötales Rinderserum (FBS) und 100 U / ml Penicillin.
- Nach Erreichen der Konfluenz, behandeln BAECs mit 3 ml 0,25% Trypsin-EDTA 3 min bei 37 ° C in 5% CO 2 und 95% Luft.
- Deaktivieren des Trypsin-EDTA durch Zugabe von 10 ml DMEM-10% FBS enthält, und sammeln zu einer 50 ml konischen Röhrchen die Zellsuspension.
- Zentrifuge bei 120 xg für 5 min, und den Überstand aspirieren. Re-suspend die Zellen mit 10 ml DMEM.
- Legen Sie die St-IPAAm Oberflächen unter UV-Licht auf eine saubere Bank für 5 min zu sterilisieren.
- Samen des wiedergewonnenen cells auf der St-IPAAm Flächen in einer Konzentration von 1,0 x 10 4 Zellen / cm 2 durch eine Einweg - Hämozytometer gezählt und die Zellen auf den Oberflächen mit einem Mikroskop mit einem Inkubator bei 37 ° C mit 5% CO 2 und 95% ausgestattet beobachten Luft.
Hinweis: Sterilisieren Sie die St-IPAAm Oberflächen durch UV-Licht auf eine saubere Bank ausgestattet. - Nehmen Sie Zeitrafferbilder von adhärenten BAECs für etwa 24,5 Stunden bei 37 ° C mit einem Phasenkontrast-Mikroskop mit 10-facher Vergrößerung. Nach BAEC- Haftung, Rekord Ablösung der BAECs von der St-IPAAm Oberfläche bei 20 ° C für etwa 3,5 Stunden.
5. Zellrasen Herstellung auf den Langmuir Film-Oberflächen übertragen
- Kultur BAECs in der gleichen Weise verwendet, in Abschnitt 4 beschrieben.
- Seed insgesamt 1,0 x 10 5 Zellen / cm 2 auf St-IPAAm Oberflächen und Inkubation für 3 Tage bei 37 ° C in 5% CO 2. Confluent BAECs spontan bei 20 ° C abgelöst.
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Representative Results
Blockcopolymere , bestehend aus Polystyrol und Poly (N Isopropylacrylamid) (St-IPAAms) mit spezifischen Molekulargewichten wurden durch RAFT Radikalpolymerisation synthetisiert. ECT wurde als Kettenübertragungsmittel hergestellt , wie es in Moad et al. 28. Zwei St-IPAAm Molekülen verschiedener PIPAAm Kettenlängen synthetisiert wurden, und die erhaltenen Blockpolymere wurden durch 1 H - kernmagnetische Resonanz (NMR) und Gelpermeationschromatographie (GPC) charakterisiert. Die Molekulargewichte von St-IPAAms waren 32.800 und 67.900, mit einer engen Molekulargewichtsverteilung (1,31 und 1,50). Die Monomerumsätzen aus Polystyrol Makro RAFT Mittel und PIPAAm wurden als 17,4% und mehr als 85,0% gefunden. Die synthetisierten St-IPAAms wurden St-IPAAm170 und St-IPAAm480 benannt sind.
Langmuir - Filme mit verschiedenen Bereichen pro Molekül (A m) wurden in einem hergestelltLuft-Wasser - Grenzfläche durch Eintropfen St-IPAAm Moleküle , gelöst in Chloroform - Lösung (1A). St-IPAAm Moleküle Nach dem Zutropfen der Oberflächendruck des Luft-Wasser - Grenzfläche wurde bei 0 mN / m festgelegt und kontinuierlich durch das Schließen der Schnittstelle während der Kompression mit den Barrieren (1B) erhöht. Etwaige Mängel in Langmuir - Filmen auf einem Luft-Wasser - Grenzfläche gebildet könnte von der π-A m Isotherme abgeleitet werden. Die hergestellte St-IPAAm Langmuir - Film wurde auf eine hydrophob modifizierte Glassubstrat (St-IPAAm Oberfläche) (1C) übertragen. Die Film übertragen Oberfläche wurde durch Atomkraftmikroskopie (AFM) ausgewertet. Abbildung 2 zeigt AFM topographische Bilder (1 x 1 & mgr; m) der St-IPAAm170 und St-IPAAm480 Oberflächen. Nanostrukturen wurden auf den St-IPAAm Oberflächen beobachtet, während solche Strukturen wurden nur selten auf dem nackten hydrophoben Substrat beobachtet. Die Größe und Form der Nanostrukturen waren stark dependent auf A m und die Zusammensetzung von St-IPAAm. AFM topographische Bilder bestätigt , dass die Langmuir - Filme homogen auf die hydrophob modifizierten Glassubstrat übertragen werden kann , und dass die Oberflächenmorphologien durch die molekulare Zusammensetzung und ein m gesteuert werden.
Die Stabilität des St-IPAAm Langmuir-Film durch eine abgeschwächte Totalreflexion Fourier-Transformations-Infrarot-Spektroskop (ATR / FT-IR) wurde bewertet. Die Menge an PIPAAms auf dem hydrophoben Glassubstrat kann aus Peak - Intensitätsverhältnis von 1000 cm -1 aus Glas (Si-O) und 1.650 cm -1 von PIPAAm (C = O) abgeleitet ist, erhalten durch eine Kalibrierungslinie abgeschätzt werden. Die Kalibrierungslinie wurde aus einer Reihe von bekannten Mengen PIPAAm Guss auf der hydrophoben Glas berechnet. Die Mengen an PIPAAm von St-IPAAm170 (10 nm 2 / Molekül) und St-IPAAm480 (40 nm 2 / Molekül) auf dem Substrat wurden gefunden 0,87 ug sein/ cm 2 und 0,63 & mgr; g / cm 2. Die Menge an PIPAAm auf der Oberfläche nach Waschen mit destilliertem Wasser war fast die gleiche wie die auf den Oberflächen ohne Waschen. Diese Ergebnisse zeigten, dass die hergestellten St-IPAAm Oberflächen in einem Wasser Zustand stabil waren.
Nächstes untersuchten wir die Haftung und Ablösung von Rinder-Carotis-Endothelzellen (BAECs) an den St-IPAAm Oberflächen. Zeitrafferaufnahmen von adhärenten und Abnehmen BAECs auf der St-IPAAm480 Oberfläche bei 40 nm 2 / Molekül wird in das animierte Abbildung 1 dargestellt. Adherent BAECs bei 37 ° C wurden von beiden St-IPAAm170 und St-IPAAm480 schnell abgelöst , nachdem die Abnahme Temperatur auf 20 ° C. Die Anzahl der adhärenten Zellen auf St-St-IPAAm170 und IPAAm480 bei 37 ° C betrug 0,6 x 10 4 Zellen / cm 2 und 0,9 x 10 4 Zellen / cm 2, die jeweils anzeigen, daß die Anzahl der adhärenten Zells wurde durch die Zusammensetzung der Oberfläche St-IPAAm moduliert. Zellschichten könnten auch durch Ablösen konfluenten kultivierten BAECs von diesen St-IPAAm Flächen zurückgewonnen werden. Das zurückgewonnene Zellschicht wurde als ein zweidimensionales Zellenstruktur (3) sichtbar gemacht . Zellen Konfluenz erreicht nach drei Tagen in Kultur auf St-St-IPAAm170 und IPAAm480 Flächen bei 37 ° C, und die Zellschicht schnell zurückgewonnen wurde auf 20 ° C, die Temperatur von 37 ° C nach reduziert. Die Wirkung des Molekulargewichts und A m von St-IPAAms auf Blattrückgewinnungszelle ist in Tabelle 1 zusammengefasst. Die Lebensfähigkeit der Zellschichten wurde durch Trypan - Blau - Färbung nach der Ablösung von BAECs Blatt ausgewertet. Zellen mit Trypsin-EDTA auf dem Glassubstrat bei 37 ºC behandelt wurden, als Kontrolle verwendet. Tote Zellen-Verhältnisse auf St-IPAAm170, St-IPAAm480 und das hydrophobe Glassubstrat als Kontrolle wurden berechnet etwa 11,0%, 7,7% betragen, und 11,7%, respectively. Diese Ergebnisse zeigten, dass cell Lebensfähigkeit wurde kaum durch Temperaturabsenkung betroffen.
Abb . 1: Herstellung eines thermoresponsive Langmuir Film übertragen Oberfläche (A) Die Polystyrol- Block -Poly (N Isopropylacrylamid) (St-IPAAm) Chloroform - Lösung wurde fallen gelassen sanft auf einem Luft-Wasser - Grenzfläche. Der Oberflächendruck wurde während der Kompression gemessen irgendwelche Defekte in der Langmuir-Film zu erkennen. (B) Es wurden zwei Barrieren verwendet , um die St-IPAAm - Moleküle auf der Oberfläche bis zu einer Zielfläche von 50 cm zu komprimieren wurde 2 erreicht. (C) Nach der Kompression ein hydrophob modifiziertes Abdeckungsglassubstrat horizontal wurde 5 min an der Grenzfläche mit einer Ausrichtungsstufe angeordnet. Das Substrat wurde angehoben horizontal und für 1 Tag getrocknet. Diese Zahl wurde von der Veröffentlichung von Sak leicht modifiziertuma et al. 27
Abbildung 2:. Rasterkraftmikroskopie (AFM) topographische Bilder (1 x 1 m) von Langmuir Film übertragen Oberflächen (St-IPAAm Oberfläche) Linker Bereich: Nanostrukturierte Oberflächen von St-IPAAm170 mit einem A m von 10 nm 2 / Molekül. Rechts: Nanostrukturierte Oberflächen von St-IPAAm480 mit einem A m von 40 nm 2 / Molekül. Die AFM-Bilder wurden in Tapping-Modus unter Verwendung eines Phosphat-dotierten Silizium-Cantilever mit einer Federkonstante von 3 N / m und Resonanzfrequenz von 70-90 kHz erhalten.
Tabelle 1:. Bovine Arteria carotis Endothelzellen (BAEC-) Blatt Wiederherstellung eines Langmuir Film übertragen Oberfläche mit verschiedenen Dichten und PIPAAm Kettenlängen "Gut" steht für intakte cell Blatt Erholung. "Kaum gewonnen" bedeutet, dass die Zellen konfluent kultiviert werden, und die kultivierten Zellen zeigten wenig oder keine Ablösung von der Oberfläche auch nach einer Verringerung der Temperatur. "Weak Haftung" bedeutet, dass Zellen, die nicht kultiviert wurden für 3 Tage bei 37 ° C bis zur Konfluenz. 
Abbildung 3: Die makroskopische Bild eines zurückgewonnenen Zellschicht auf einem Langmuir Film übertragen Oberfläche mit St-IPAAm480 und einem A m von 40 nm 
Animierte Abbildung 1: . (Rechtsklick zum Herunterladen) Zeitraffer-Aufnahmen von BAECs Haftung und Ablösung auf einem Langmuir Film übertragen Oberfläche mit St-IPAAm480 und einem Am von 40 nm 2 / Molekül. Die Bilder wurden in 2-Minuten-Intervallen gesammelt und die gesammelten Bilder wurden als Film bei 960x Geschwindigkeit zur Verfügung gestellt. DasMaßstabsleiste im Film ist 50 & mgr; m. St-IPAAm170 St-IPAAm480 3 [nm 2 / Molekül] 10 [nm 2 / Molekül] 40 [nm 2 / Molekül] 3 [nm 2 / Molekül] 10 [nm 2 / Molekül] 40 [nm 2 / Molekül] schwache Adhäsion Gut Kaum erholt schwache Adhäsion schwache Adhäsion Gut
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Discussion
Eine temperaturempfindliche Oberfläche wurde durch das Langmuir-Schäfer-Methode hergestellt, und die Oberflächeneigenschaften für die Zelladhäsion / Ablösung und Zellrasen Rückgewinnung optimiert. Wenn für die Herstellung von Oberflächen unter Verwendung dieses Verfahrens sind mehrere Schritte kritisch. Die molekulare Zusammensetzung der St-IPAAm Moleküle hat eine große Wirkung auf die Oberflächenstruktur und die Stabilität der Oberfläche und durch die Erweiterung, auf die Zelladhäsion und Ablösung. Insbesondere sollten die St-IPAAm Moleküle eine enge Molekulargewichtsverteilung. In unserem Verfahren werden zwei St-IPAAm Moleküle mit unterschiedlichen PIPAAm Kettenlängen wurden durch RAFT-Polymerisation synthetisiert, so dass die Steuerung des Molekulargewichts und der Molekulargewichtsverteilung.
Es sollten Schritte ergriffen werden, eine Verunreinigung der Luft-Wasser-Grenzfläche während der Herstellung der St-IPAAm Oberfläche zu verhindern Defekte in den Nanostrukturen zu vermeiden. Vor dem Abwurf Polymermoleküle auf die Schnittstelle, contaminants sollten abgesaugt werden, bis der Oberflächendruck etwa 0 mN / m erreicht. Verunreinigung neigt um die Ränder des Troges und Wilhelmy-Platte zu akkumulieren. Weil der Wilhelmy-Platte eine Kontamination an ihrer Oberfläche hatte, wurde sie geglüht. Wenn ein Papier Wilhelmy-Platte verwendet wird, sollte das Absaugen an der Grenzfläche zumindest zweimal wiederholt werden. Die π-A m isotherm Kurve hängt auch von der Anwesenheit von Verunreinigungen an der Luft-Wasser - Grenzfläche. Wir empfehlen, dass der Verlauf der Isothermen mehr als einmal vor der Herstellung des Films erhalten werden. Weil Verunreinigung des hydrophob modifizierten Glassubstrat auch auftreten kann, sollte das Substrat mit Frischluft oder Stickstoffgas eingeblasen werden Verunreinigungen zu entfernen.
Konsequent Langmuir film übertragen Oberflächen (St-IPAAm Oberfläche), das hydrophobe Segment eines Polymers herzustellen ist wichtig, weil die hydrophobe Wechselwirkung zwischen dem Langmuir-Film und hydrophob modifizierte Glas i s die treibende Kraft der Reaktion. In dieser Studie, da das Block-Copolymer aus Polystyrol zusammengesetzt war, das stark hydrophob ist und hydrophile PIPAAm bei Raumtemperatur wurde die übertragenen Film auf das Substrat auch unter Wasser oder Zellkulturbedingungen stabil eingehalten. Dies zeigt an, dass hydrophobe Segmente eine wichtige Rolle spielen eine robuste St-IPAAm Oberfläche bei der Herstellung.
Zur Steuerung der Zelladhäsion und Ablösung auf einer temperaturempfindlichen Oberfläche, sowohl die molekulare Zusammensetzung und die genaue Steuerung der Dichte sind wichtig. In diesem Langmuir-Schäfer - Methode, die Fläche pro Molekül (A m) des Polymers , das durch eine gegebene Menge an sank Moleküle und die Zielfläche eines Luft-Wasser - Grenzfläche synthetisierte kann durch Kompression gesteuert werden. Die A m von St-IPAAm Moleküle fallen in der Theorie kann durch die folgende Gleichung berechnet werden:
d / 53465 / 53465eq1.jpg "/>
wobei A die Fläche der Grenzfläche, M w das Molekulargewicht des St-IPAAms ist, c ist die Konzentration der Chloroformlösung, N A die Avogadro-Zahl, und V ist das Volumen der Polymerlösung getropft. Nanoskalige Meer-Insel - Strukturen auf St-IPAAm Oberflächen nach der Herstellung beobachtet , da amphiphile Polymere selbstorganisierenden Strukturen auf einem Luft-Wasser - Grenzfläche bilden, wie 13-17 in früheren Studien beschrieben. Die Größe und Menge von nanoskaligen Strukturen wurde von A m und das Molekulargewicht von St-IPAAms gesteuert.
Zelladhäsion und Ablösung wurden durch verschiedene Verfahren auf PIPAAm beschichteten Oberflächen hergestellt ausgewertet, einschließlich Elektronenstrahlbestrahlung, oberflächeninitiierte RAFT - Polymerisation und Schleuderbeschichtung 19-27. Da Dichte, Molekulargewicht und PIPAAm Struktur beeinflussen cell Haftung und Ablösung, präzise Techniken zur PIPAAm beschichtete Oberfläche Herstellung sind wichtig. In diesem Langmuir-Schäfer-Methode, Dichte, Molekulargewicht und Oberflächennanostrukturen gesteuert werden, wie oben beschrieben. Zelladhäsion und Ablösung an den St-IPAAm Oberflächen wurden durch verschiedene A m und St-IPAAm molekulare Zusammensetzung und einige Bedingungen von St-IPAAm Oberflächen für die Zellhaftung und Ablösung konnte weiter optimiert drastisch beeinflusst. Diese Ergebnisse zeigen, dass dieses Verfahren die Interaktion zwischen dem St-IPAAm Oberfläche und Zellen steuern kann.
Zur reproduzierbaren intakte Zellschicht erholt sich, die Gestaltung eines amphiphilen Polymers ist am wichtigsten. Wenn nur hydrophile Polymere, die auf einer Oberfläche von einem Langmuir-Schäfer-Verfahren beschichteten Polymere hergestellt werden leicht durch destilliertes Wasser oder Kulturmedium ausgewaschen. Dieses Ergebnis zeigte, dass die schwache hydrophobe Polymer sollte nicht zur reproduzierbaren Gewinnung von Zellschicht in diesem Meth verwendet werdenod weil das Polymer mit modifizierter Oberfläche instabil war in einem Wasser Zustand. In unserem Verfahren kann das hydrophile Segment in einem amphiphilen Polymer robust Herstellung auf einer Oberfläche, ohne von einer wässrigen Lösung auswäscht. Da zusätzlich die Langmuir-Film parallel zu einem Glassubstrat in dieser Studie nanoskaligen Meer-Insel-Strukturen überführt wurden auf der Oberfläche beobachtet. Obwohl die Struktur von Langmuir-Film auf der basalen Seite auch von der auf der apikalen Seite zu sein, unterschiedliche bekannt ist, wurde die Struktur durch eine parallele Übertragung fixiert.
Die Zelltherapie und der regenerativen Medizin haben sich auf die Möglichkeit der Heilung Patienten, die auf andere Behandlungen nicht ansprechen konzentriert. Unser Labor hat eine originelle, einzigartige gerüstfreie Gewebe-Engineering-Ansatz unter Verwendung von Zellschicht Technik auf einer Temperatur ansprechenden Kulturoberfläche mit möglichen Anwendungen im Tissue Engineering hergestellt entwickelt. Mehrere klinische Studien mit Zellschichten sind already im Gange und haben erfolgreiche Ergebnisse für verschiedene Arten von Gewebe 29-31 demonstriert. Obwohl BAECs als Zellquelle verwendet wurden Zellschichten, anderen Zellquellen herzustellen, einschließlich Stammzellen, verwendet werden Blätter auf einem St-IPAAm Oberfläche herzustellen , indem die Kombinationen von A m und die molekulare Zusammensetzung von St-IPAAm Moleküle zu optimieren. Diese nicht-konventionellen Technologie wird dazu beitragen, nicht nur auf die einfache Herstellung von nanostrukturierten Oberflächen, sondern auch auf grundlegende Zellkultur-Strategien für den Einsatz in der regenerativen Medizin.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| N-isopropylacrylamide | Kohjin | No catalog number | |
| Azobis(4-cyanovaleric acid) | Wako Pure Chemicals | 016-19332 | |
| Styrene | Sigma-Aldrich | S4972 | |
| 1,3,5-trioxane | Sigma-Aldrich | T81108 | |
| 1,4-Dioxane | Wako Pure Chemicals | 045-24491 | |
| DMEM | Sigma | D6429 | |
| PBS | Nakarai | 11482-15 | |
| Streptomycin | GIBCO BRL | 15140-163 | |
| Penicillin | GIBCO BRL | 15140-122 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma | T4174 | |
| FBS | Japan Bioserum | JBS-11501 | |
| BAECs | Health Science Reserch Resources Bank | JCRB0099 | |
| Cover Glasses | Matsunami Glass Industry | C024501 | |
| AFM NanoScope V | Veeco | ||
| 1H NMR INOVA 400 | Varian, Palo Alto | ||
| ATR/FT-IR NICOLET 6700 | Thermo Scientific | ||
| GPC HLC-8320GPC | Tosoh | ||
| TSKgel Super AW2500, AW3000, AW4000 | Tosoh | ||
| Langmuir-Blodgett Deposition Troughs | KSV Instruments | KN 2002 | KSV NIWA Midium trough |
| Nikon ECLIPSE TE2000-U | Nikon |
References
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