Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

التصور من الوخز على الحركة وتوصيف دور Published: April 8, 2016 doi: 10.3791/53816
Automatic Translation
1, 2
1Department of Plant Science, University of California, Davis, 2Agricultural Research Service, San Joaquin Valley Agricultural Sciences Center, United States Department of Agriculture

Summary

في هذه الدراسة، كان يعمل في غرفة تدفق نانو ميكروفلويديك لتصور وظيفيا تميز الحركة ارتعاش Xylella fastidiosa، وهي البكتيريا التي تسبب مرض بيرس في الكرمة.

Abstract

Xylella fastidiosa هو نوع من البكتيريا سالبة الجرام غير سوطي التي تسبب عددا من الأمراض الهامة اقتصاديا من النباتات. تقدم الحركة الوخز اكس. fastidiosa وسيلة للحركة لمسافات طويلة داخل المصنع والاستعمار، إذ تسهم نحو المرضية في اكس. fastidiosa. إن الحركة ارتعاش اكس. يتم تشغيل fastidiosa من النوع الرابع الشعرة. وينظم النوع الرابع الشعرة من Xylella fastidiosa التي كتبها pilG، منظم الكيميائي في بيل-حزب الشعب الجمهوري البروتينات ترميز الاوبرون التي تشارك مع مسارات نقل الإشارة. لتوضيح أدوار pilG في الحركة ارتعاش اكس. وقد وضعت fastidiosa، وpilG -deficient متحولة XF ΔpilG وسلالة مكملة لها XfΔpilG- C التي تحتوي على pilG مواطن. واستخدمت غرف ميكروفلويديك متكاملة مع نظام تسجيل صورة مرور الزمن لمراقبة الوخز الحركة في XfΔpILG، XfΔpilG- C ونوع السلالة في البرية. باستخدام هذا النظام تسجيل، فإنه يسمح الملاحظات على المدى الطويل المكانية والزمانية لتجميع والهجرة من الخلايا الفردية والسكان من البكتيريا عبر حركية الوخز. اكس. أظهر fastidiosa النوع البري ومكملة XfΔpilG- C سلالة خصائص الوخز حركية نموذجية الملاحظة المباشرة في غرف تدفق الموائع الدقيقة، في حين عرضت متحولة XfΔpliG النمط الظاهري نقص الوخز. وتوضح هذه الدراسة أن pilG يساهم في الحركة ارتعاش اكس. fastidiosa. ويستخدم غرفة تدفق الموائع الدقيقة كوسيلة لمراقبة الوخز حركية.

Introduction

Xylella fastidiosa هو غير سوطي، البكتيريا المسببة للأمراض سلبية الغرام التي تسبب عددا من الأمراض المحاصيل ذات الأهمية الاقتصادية، بما في ذلك مرض بيرس في الكرمة (كرمة العنب الاوروبي L.) 1،2، 3. هذه البكتيريا يقتصر على الخشب التي تضطلع المياه أوعية. إصابة الكرمة يتسبب في انسداد الأوعية الخشب والنتائج في الإجهاد المائي ونقص التغذية 3. الاستعمار الناجح يعتمد على قدرة بكتيريا للانتقال من موقع الأولي العدوى إلى بقية النبات 3. الوخز حركية وسيلة لحركة البكتيرية مستقلة سوطي من خلال الإرشاد، والمرفق، وتراجع من نوع القطبي الرابع البيلي 4 التي اتسمت في اكس. fastidiosa 5،6،7.

وقد لوحظ أن الحركة الوخز بواسطة ملاقط الليزر ومجهر القوة الذرية (AFM) 8،9،10. باستخدام هذه التقنيات، رmotilities السحر ولدت من النوع الرابع شعرة من N. السيلان و P. تميزت الزنجارية التي كتبها فلوريدا uorescently وضع العلامات البيلي والاستيلاء على تحركاتهم مجهريا. على الرغم من أن كلتا الطريقتين قد فصلت قوة لاصقة من البكتيريا الفردية، وإجراءات معقدة وتستغرق وقتا طويلا 9،10. استخدمت الدوائر uidic فلوريدا الصغيرة لمراقبة الهجرة لمسافات طويلة من الخلايا الفردية، وكذلك مجاميع صغيرة من الخلايا البكتيرية 5،6. وقد صممت هذه الغرف باعتبارها نانو قناة microfabricated في لوحة متكاملة مع الوقت الفاصل بين نظام تسجيل صورة 11،12،13،14. فلوريدا مايكرو الأجهزة غرفة uidic توفر مزايا عدة لدراسة السلوك الحركي وخلية خلية التفاعلات من البكتيريا: (ط) أنه يوفر منصة متكاملة مع قدرات قناة متعددة؛ (ب) فإنه يمكن دراسة الاقتراحات وتجمعات من الخلايا وحيدة في ملامح نانو النطاق من البكتيريا. (ج) لأنها تتيح م مباشرicroscopic تسجيل صورة من الخلايا البكتيرية وتحليل الوقت الفاصل، (د) ويوفر الملاحظات المكانية والزمانية على المدى الطويل من سكان الفردية و / أو من البكتيريا في بيئة الصغرى؛ (ت) معدل التدفق من مستنبت في قناة يمكن التحكم بدقة ومطلوب (السادس) فقط حجم صغير جدا (1 مل) من مستنبت لكل تجربة.

في الآونة الأخيرة، وقد تم توظيف الجزئي فلوريدا uidic آه فلوريدا نظام للتحقيق في سلوك الخلايا البكتيرية في إطار مختلف microenvironments 14،15،16. والإلتصاق والمرفق سطح E. القولونية 15، X. fastidiosa 16، وAcidovorax citrulli 14 إلى الواجهات الزجاجية وتقييمها باستخدام الصغير فلوريدا غرف uidic. وقد تم تحليل تشكيل تجميع وفاي الحيوي ل م بوساطة النوع الرابع الشعرة من Acidovorax citrulli 14. وعلاوة على ذلك، فإن الحركة من أ. لاحظ citrulli تحت آه فلوريدا جتظاهر onditions أن البيلي النوع الرابع قد تلعب أدوارا هامة في الاستعمار وانتشار A. citrulli في الأوعية الخشب تحت النسغ آه فلوريدا الظروف. وmotilities الوخز الزائفة الزنجارية وX. وقد لوحظت خلايا fastidiosa بنجاح ضد تيار السائل في غرفة تدفق microfabricated 5،6،17. نقص النوع الرابع شعرة pilB وpilQ المسوخ من X. تم العثور على fastidiosa إلى تغيير عميق في سرعة الوخز الحركة في ظل الظروف آه فلوريدا في الأجهزة uidic فلوريدا الصغيرة 5،6،18. وأشارت الدراسات التي أجريت على التصاق البكتيريا والحركة في الأجهزة uidic فلوريدا الصغرى أن الدوائر uidic الصغير فلوريدا هي مناسبة خاصة لتحليل حركية الوخز والهجرة من البكتيريا بوساطة البيلي في المختبر. تفسر هذه النتائج آلية الهجرة بوساطة الوخز مما يسهل التعلق خلية خلية، وتجميع والاستعمار فيالمضيف، تؤدي في النهاية إلى الإصابة النظامية.

بيل-حزب الشعب الجمهوري الاوبرون من X. fastidiosa يحتوي pilG، بيلي، pilJ، حبوب منع الحمل، chpB وchpC التي مسارات إشارة ترميز التنبيغ 20. والمستقبلات الكيميائية عبر الغشاء ربط المحفزات الكيميائية في نطاق محيط بالجبلة وتفعيل شلال يشير في جزء حشوية قدرتهم على السيطرة في نهاية المطاف البكتيرية حركية الوخز. في الاوبرون بيل-حزب الشعب الجمهوري من X. fastidiosa، وهو بروتين PilG الفوسفات المكوك هو نديد لCHEY. في E. القولونية و P. الزنجارية، CHEY هو منظم استجابة في أنظمة الكيميائي التي تتفاعل مع بروتينات سياط محرك 19 و 21. على الرغم من أن مساهمات الاوبرون بيل-حزب الشعب الجمهوري نحو الفوعة في اكس. تم فحص fastidiosa مؤخرا 20، ودور pilG في الاوبرون الكيميائي في استجابة لإشارات البيئية وتنظيم / المحرك النوع الرابع الشعرة من X. fastidiosa هو UNCلير. لتوضيح فكرة الكيميائي منظم pilG في نشاط الحركة ارتعاش اكس. fastidiosa، يتم استخدام غرفة uidic فلوريدا متناهية الصغر لتقييم الحركة ارتعاش اكس. fastidiosa. يتميز pilG من اكس fastidiosa بمقارنة الظواهر من المسخ حذف XF ΔpliG، سلالة مكملة XfΔpliG -C والنوع البري في المختبر. تسلط هذه النتائج الضوء على دور pilG في الحركة ارتعاش اكس. fastidiosa.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. الطرفية هامش البكتيرية مستعمرة

  1. تنمو اكس. fastidiosa (XF) تيميكولا النوع البري 22، pilG حذف متحولة XF ΔpliG (باستخدام سبق وصفها استراتيجية حذف 23)، ولها مكملة XfΔpliG -C (باستخدام سبق وصفها القائم على كروموسوم استراتيجية تكامل الجيني 24) على PD2 لوحات المتوسطة أجار 25 عند 28 درجة مئوية لمدة 5-7 أيام.
  2. السيلوفان الأوتوكلاف (1 × 1 سم 2) في الماء عند 121 درجة مئوية (249 درجة فهرنهايت) لمدة 15 دقيقة. التقاط قطعة واحدة من السيلوفان، واستنزاف المياه من خلال لمس زاوية واحدة من السيلوفان على طبق بيتري فارغة، وضع بعناية السيلوفان أكثر من 15٪ من سطح أجار والهواء الجاف.
  3. التقاط فرد اكس. المستعمرات fastidiosa مع المسواك تقريب وخلايا بقعة عقيمة جو معقم و مطهر على ورقة تعقيمها من السيلوفان مضافين على 15٪ من سطح أجار في لوحات أجار. احتضان لوحةالصورة عند 28 درجة مئوية لمدة 2-3 أيام.
  4. دراسة مورفولوجية حافة المستعمرات باستخدام مجهر تشريح مع عدسة الهدف 2X و10X عدسة العين. تصوير هامش المحيطي حول المستعمرات.

2. المجهري وميكروفلويديك غرف تدفق

  1. صنع أجهزة ميكروفلويديك باستخدام إجراءات الصورة معدني مشابهة لتلك التي سبق وصفها 5،18. تصميم أربعة قنوات موازية مع برامج التصميم بمساعدة الكمبيوتر على سيد رقاقة السيليكون باستخدام أساليب الطباعة الحجرية القياسية 26.
  2. إنشاء غرف ميكروفلويديك من سيد رقاقة السيليكون مع ثنائي ميثيل بولي سيلوكسان (PDMS). صب PDMS unpolymerized على سيد رقاقة السيليكون وعلاجه عند 60 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. تقشر النسخة المتماثلة PDMS من سيد رقاقة وتقليم النسخة المتماثلة PDMS بشفرة إلى 22 ملم × 40 ملم ونفس الحجم من الزجاج ساترة.
  3. فضح النسخة المتماثلة PDMS، ساترة الزجاج (22 × 40 مم 2)، وmicroscشريحة مكتب مستشار رئيس الوزراء (51 × 76 مم 2) لالبلازما الجوية في 30 واط لمدة 2 دقيقة 27. شطيرة الجسم PDMS بين ساترة الزجاج وميكروسكوب لبناء غرفة uidic فلوريدا الصغيرة.
  4. حفر حفرة (مم 5.5) من خلال PDMS في نهاية كل من قناة نمط. قطع أنابيب السيليكون والمطاط إلى 12-20 سم. إدراج واحدة من نهاية أنبوب السيليكون والمطاط (5.1 ملم خارج القطر، 2.1 ملم داخل القطر، 0.8 مم الجدار) في نهاية كل فتح القنوات من النسخة المتماثلة PDMS، وختم ذلك مع PDMS unpolymerized في 60 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  5. ربط آخر من نهاية الأنبوب إلى نهاية الشائكة من الروابط LUER البلاستيكية. التفاف غرف ميكروفلويديك تجميعها مع رقائق الألومنيوم والأوتوكلاف لهم لمدة 20 دقيقة.
  6. جمع البكتيريا خلايا اكس. fastidiosa النوع البري، متحولة XF ΔpliG، ومكملة XfΔpliG -C عبر كشط، وذلك باستخدام بتلقيح المتاح حلقات من لوحات PD2 المتوسطة. ضبط كثافة الخليةإلى الكثافة البصرية من 0.05 في 600 نانومتر في PD2 مرق كما هو موضح سابقا 23. جمع حل الخلية البكتيرية إلى حقنة Gastight 1 مل.
  7. تركيب جهاز ميكروفلويديك على مرحلة المجهر المقلوب. توصيل أنبوب مدخل إلى حقنة Gastight 5 مل تحتوي على PD2 مرق. تناسب Gastight حقنة 5 مل مع مضخات الحقنة.
  8. توصيل أنبوب منفذ إلى خزان النفايات. الحفاظ على معدل التدفق المتوسط ​​من 0.2 دقيقة ميكرولتر -1 لمدة 30 دقيقة لتحقيق الاستقرار في النظام.
  9. ربط أنابيب الجانب مدخل إلى 1 مل Gastight حقنة تحتوي على محلول الخلية البكتيرية. مسح حل الخلية البكتيرية من خلال أنابيب مطاطية حتى يتم الوصول إلى القناة. الحفاظ على معدل التدفق المتوسط ​​من 0.2 دقيقة ميكرولتر -1 لمدة 30 دقيقة أخرى من أجل مطاردة خلايا غير منضم من الغرفة قبل التقاط الصورة.
  10. جبل مصراع المجهر تحت الجزء المعدلة مجال المجهر للسيطرة على ضوء. ربط مصراع للتعاون مصراعنظام ntrol وربط نظام التحكم مصراع الكاميرا لجهاز الكمبيوتر.
  11. جبل الكاميرا الرقمية إلى منفذ الفيديو المجهر وتوصيله إلى جهاز الكمبيوتر. تشغيل برنامج تسجيل مرور الزمن، حدد وظيفة "مصراع" من القائمة، والتعرف تلقائيا على مصراع الكاميرا المثبتة كما الافتراضي في البرنامج لتأسيس اتصالات لمصراع مع البرنامج.
  12. حدد وظيفة "كاميرا رقمية" من القائمة من برنامج تسجيل مرور الزمن إلى التعرف تلقائيا على الكاميرا الرقمية وجهاز الالتقاط الافتراضي في البرنامج وإقامة الاتصالات مع الكاميرا الرقمية مع البرنامج.
  13. تحديد موقع الخلايا البكتيرية في واحدة من القنوات باستخدام 20X البصريات على النقيض من المرحلة، ثم التبديل إلى 40X عدسة الهدف قبل التقاط الصورة.
  14. تشغيل برنامج تسجيل مرور الزمن، حدد وظيفة "الحصول على الصور" باستخدام المعلمات الافتراضية من القائمة للحصول على صور من المجهر.بعد ذلك، فتح وظيفة "اكتساب الوقت الفاصل"، وتعيين الفاصل الزمني إلى 30 ثانية 5،18،28 لمدة 6-24 ساعة اعتمادا على التجربة اللازمة لمراقبة الوخز الحركة من X. fastidiosa 5،18،28. انقر على زر "موافق" لبدء تسجيل مرور الزمن. انقر على "وظيفة المكدس" من القائمة، حدد "حفظ باسم" إلى كومة من الصور في مجلد الوجهة على جهاز الكمبيوتر بعد الانتهاء من التسجيل.
  15. لقنوات متعددة، والتقاط الصور الوقت الفاصل بين من القناة الأولى كل 30 ثانية لمدة 6 ساعة. نقل عدسة الهدف من المجهر إلى القناة التالية لتحديد موقع الخلايا المستهدفة. تكرار الدالة مرور الزمن كما هو موضح أعلاه لالتقاط الصور في كل من أربع قنوات بالتتابع إذا تم تعيين التجربة حتى الاستفادة من أربع قنوات. مواصلة التقاط الصور الوقت الفاصل بين لطالما ثلاثة أيام متتالية. أجريت جميع التجارب في درجة حرارة الغرفة (23 ± 2 درجة مئوية).
  16. تجميع الصور الوقت الفاصل إلىملف الفيديو باستخدام الوقت الفاصل بين برنامج تسجيل التصوير. تشغيل الوقت الفاصل بين تسجيل البرامج، انقر فوق "وظيفة كومة" من القائمة، ثم اختر "وظيفة كومة مفتوحة" لفتح الملفات مكدسة من الكمبيوتر.
  17. بدء تشغيل وظيفة "جعل الفيلم" من وحدة كومة، واختيار جميع الصور واختيار "افي" تنسيق الإخراج. انقر فوق "حفظ باسم" لتخزين ملف الفيديو في مجلد الوجهة على الكمبيوتر.
  18. اختيار الأفلام التي تم تجميعها من المجلد الوجهة على الكمبيوتر واللعب بها. ثم، ومراقبة الحركة من الخلايا واحد من خلال التصور الناتجة من النشاط الوخز حركية من خلايا البكتيريا الموجودة في ملفات الفيديو التي تم إنشاؤها.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وجود هامش مستعمرة الطرفية يدل على النوع الرابع بوساطة شعرة الوخز حركية، لوحظ في مستعمرات اكس. النوع البري fastidiosa ومكملة سلالة XF ΔpliG -C (الشكل 1). متحولة XfΔpliG، ومع ذلك، لم تظهر هامشية حول المحيط الخارجي للمستعمرات (الشكل 1). كشفت الوقت الفاصل بين التصوير من الخلايا البكتيرية في غرف تدفق نانو ميكروفلويديك أن لوحظ الوخز الحركة في كل من النوع البري اكس. fastidiosa ومكملة XfΔpliG -C (التكميلي V1، V3)، في حين أن خلايا متحولة XfΔpilG لم تظهر الوخز الحركة في كافة مراحل التجربة (التكميلي V2). خلايا متحولة XfΔpilG شكلت مجاميع فضفاضة صغيرة نسبيا في PD2 مرق (التكميلي V2). في المقابل، خلايا اكس. النوع البري fastidiosa ومكملة XfΔpilG- C د eveloped المجاميع الكبيرة في PD2 مرق (الشكل 2، (التكميلي V1، V3).

الشكل 1
الشكل 1: إن هامش الطرفية من مستعمرة بكتيرية خصائص هامش مستعمرة اكس. fastidiosa من النوع البري، متحولة XF ΔpilG، ومكملة XfΔpilG- C نمت على PD2 أجار مغطاة بغطاء معقم من السيلوفان. باستثناء متحولة XfΔpilG، أظهرت جميع المستعمرات على هامش الطرفية، مشيرا إلى النوع الرابع بوساطة شعرة الوخز حركية. تم التقاط الصور بعد 5 أيام من النمو في مستنبت. التكبير شريط، 0.5 مم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

_upload / 53816 / 53816fig2.jpg "/>
الشكل 2: الحركة ارتعاش اكس. خلايا fastidiosa في غرفة تدفق نانو ميكروفلويديك وسجلت الحركة الوخز جميع الخلايا سلالة اختبارها خلال 6 أيام من المراقبة. أجريت التقييمات من ثلاث شرائح الفيديو مستقلة. شريط التكبير، 20 ميكرون.
ملاحظة: الحركة ارتعاش اكس. وتتميز الخلايا fastidiosa من حركة خلية واحدة عبر الواجهات الزجاجية من خلال الإرشاد، والمرفق، وتراجع من القطبية البيلي النوع الرابع. وقد لوحظ في خلية واحدة في الهجرة تفضيلي ضد تيار السائل في غرفة تدفق microfabricated. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

6 / 53816supfig1.jpg "/>
التكميلي الشكل 1: أربع قنوات غرفة تدفق ميكروفلويديك. كل قناة مع وسائل الإعلام في وسائل الإعلام خارج الموصلات في كل نهاية. الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الفيلم التكميلي 1
التكميلي الفيلم 1: الوخز حركية. (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل). الوخز البرية من نوع اكس fastidiosa في غرفة تدفق الموائع الدقيقة.

الفيلم التكميلي 2
الفيلم التكميلي 2: twitchin اختلالز الحركة. (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل). على الحركة من XF متحولة. لاحظ XfΔpilG في غرفة التدفق amicrofluidic.

الفيلم التكميلي 3
الفيلم التكميلي 3: المستعادة حركية الوخز. (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل). الوخز الحركة من XF سلالة التكميلي. لاحظ XfΔpilG-C في غرفة تدفق الموائع الدقيقة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في هذه الدراسة، ونحن ميزت سلوك حركة اكس. fastidiosa PilG متحولة XF ΔpilG ومتكاملة سلالات XfΔpilG- C في المصممة حديثا متعددة متوازية نانو قناة الصغرى غرف uidic فلوريدا. لا تستطيع الدوائر uidic المصممة حديثا الصغير فلوريدا قد تصل إلى أربع قاعات متوازية مع 100 ميكرومتر نانو القناة في عرض مقارنة لتصاميم سابقة مع واحد فقط 50 ميكرون قناة واسعة 18. تحسن أوسع قناة نانو تسهل إدخال الخلايا البكتيرية مع المتدفقة من وسائل الإعلام. وبالإضافة إلى ذلك، هذه القاعة على microfluidics هو 1) بسيطة لبناء وتجميع. 2) غير مكلفة نسبيا. و3) ينطبق بسهولة إلى اختلاف متطلبات التجريبية. ونتيجة لذلك، وهذا تصميم غرفة يسمح للمراقبة على المدى الطويل من حركات الخلايا البكتيرية تحت أصناف المكروية التجريبية.

استقرار آه فلوريدا التيارات throuغ قناة uidic الصغير فلوريدا هي خطوة حاسمة لخلق التدفق الجزئي فلوريدا المكروية uidic سليمة لمراقبة من حركة الخلايا البكتيرية في ظل مجموعة متنوعة من البيئات التجريبية. وبيغ غرف uidic فلوريدا الصغيرة وتوصيل الأنابيب مع وسائل الإعلام قبل إدخال الخلايا البكتيرية هي أيضا خطوة هامة لتحقيق الاستقرار في التدفق في الغرفة. ومع ذلك، فإن سرعة عالية لتدفق طرد الخلايا البكتيرية من الغرفة دون الاحتفاظ الخلايا في مجرى الغرفة. سرعة المناسبة من وسائل الإعلام التي تتدفق من خلال القنوات uidic فلوريدا الصغيرة تحتاج إلى تعديل باستخدام مضخة الحقنة. خلال التجارب في هذه الدراسة، تم تعيين المتدفقة واستقرت بواسطة مضخة في 0،2-1 ميكرولتر دقيقة -1 لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل إدخال الخلايا البكتيرية في القناة. مرة واحدة أدخلت الخلايا في القنوات uidic فلوريدا الصغيرة والمتوسطة آه فلوريدا واستمر في 0.2 ميكرولتر مفي -1 لمدة 30 إلى 60 دقيقة لتحقيق الاستقرار في النظام وإزالة الخلايا nonattached. من المهم جدا لتحقيق الاستقرار في تدفق وللحفاظ على خلفية واضحة من أجل مراقبة حركة الخلايا البكتيرية. تم القبض على الصور كل 30 ثانية ليخدع فاي جمهورية مقدونيا النشاط الوخز حركية من خلايا أدخلت الحفاظ على سرعة تدفق ثابتة عند 0.2 ميكرولتر دقيقة -1. إذا تتطلب التجارب على مجموعة من الخلايا البكتيرية في الغرفة، والخلايا يمكن أن يخرجوا تدريجيا عن طريق زيادة معدلات آه فلوريدا وسائل الإعلام ،2-110 ميكرولتر دقيقة -1 عن طريق ضبط سرعة ضخ حقنة.

تم تقييم أنشطة الخلية البكتيرية في غرف uidic فلوريدا الصغيرة من خلال مجهر مقلوب باستخدام 40X البصريات على النقيض من المرحلة والوقت الفاصل بين الصور المسجلة مع الكاميرا الرقمية، والتي كان يسيطر عليها برامج التصوير. سرعة تدفق والفاصل الزمني لالتقاط الصور يمكن تعديلها وفقا لذلك مع experimمتطلبات ental. ومع ذلك، في معظم الحالات، وتدفق السرعة لضبط معدل التدفق المتوسط ​​إلى 0.2 دقيقة ميكرولتر -1 مع سجلت الصور الوقت الفاصل بين كل 30 ثانية للحصول على الخلايا البكتيرية بوساطة شعرة. وفي حالات أخرى، إذا زاد معدل فلوريدا المتوسط ​​آه إلى 0.1 دقيقة ميكرولتر -1 أثناء التجريب، وسوف يتم تسجيل سلوك الخلايا البكتيرية عن طريق التقاط الصور كل 10 إلى 15 ثانية وفقا لذلك. التقطت الصور الوقت الفاصل بين كل 30 ثانية لمدة 6-24 ساعة وحفظها باعتباره مصدر الصور والملفات لكل سلالة اختبارها. وبعد ذلك التزم الفيديو من الصور الملتقطة 6-8 ساعة من كل سلالة، التي تظهر الظواهر التباين في الوخز motilities بين نوع متحولة والبرية / تكملة سلالات (التكميلي V1، V2، V3).

وتشمل أهمية الأجهزة غرفة نانو الصغير فلوريدا uidic على macroscale موازية لوحة الدوائر آه فلوريدا الفحص المباشر للحركات وتجمعات من الغناءخلايا جنيه من البكتيريا. بالإضافة إلى التكلفة المنخفضة 5 وانخفاض متطلبات كاشف وحجم العينة، ومزايا الصغير فلوريدا غرف uidic هي سهولة بناء المكروية آه فلوريدا للثقافة البكتيرية ومراقبة دقيقة على معدل فل فلوريدا المرن آه. تسمح قنوات موازية متعددة مراقبة السلالات البكتيرية التفاضلية في إعداد التجربة واحد والذي يوفر البيانات متوافقة لتحليلها. حركية الوخز مستقلة سوطي من البكتيريا مع بيلي القطبية هو مناسبة خاصة للتحليل في هذه القاعة uidic FL-نانو الصغير. ومع ذلك، هذه القاعة uidic فلوريدا الصغيرة هي أقل مناسبة لحركة البكتيرية التي تعتمد على سوطي، التي تنقل البكتيريا عادة ما تكون سريعة جدا والمعارض اتجاهات عشوائية. هذا القيد في بعض الأحيان يمكن أن يتعرض للخطر عن طريق ضبط معدل التدفق المتوسط ​​إلى 0.05 دقيقة ميكرولتر -1 وتغيير الوقت الفاصل بين معدل التقاط الصور في كل 1-2 ثانية لمدة 1 ساعة لanalyزي حركات البكتيريا بوساطة سوطي في البيئة نانو النطاق.

الأجهزة غرفة الموائع الدقيقة المستخدمة هنا دليلا البصري المباشر للتقييم وظيفي للPilG مسؤولة عن سلوك الحركة في المختبر. بالإضافة إلى ذلك، يكشف عن هذه الدراسة أيضا أن الخلية إلى تجميع الخلية من خلال حركية الوخز أمر ضروري لتشكيل بيوفيلم، مما يشير إلى والمرضية في اكس. fastidiosa. التصور من البكتيريا الوخز الحركة من قبل أجهزة ميكروفلويديك يوفر نهجا جديدا لدراسة وظيفة الجينات التي تنطوي على السلوك في البكتيريا التي لا تقاس بسهولة عن طريق طرق الفحص الأخرى. ويمكن تطبيق هذا النهج لأنظمة بكتيرية أخرى. توفر أجهزة غرفة ميكروفلويديك نظام تدفق لوصف السلوك الفسيولوجي من الخلايا البكتيرية المرتبطة إرفاق ملفات خلية خلية، تجمعات الخلايا، وأنماط الحركة وتشكيل بيوفيلم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب تعلن أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Acknowledgments

وأيد هذه الدراسة من قبل الولايات المتحدة وزارة الزراعة، دائرة البحوث الزراعية. وذكر الأسماء التجارية أو المنتجات التجارية في هذا المنشور فقط لغرض توفير معلومات محددة، ولا تعني توصية أو تأييد من قبل وزارة الزراعة في الولايات المتحدة. وزارة الزراعة الأميركية تساوي مزود الفرصة وصاحب العمل.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Biology materials
X. fastidiosa (Xf) Temecula wild type Costa, H. S., et al., 2004 22
pilG deletion mutant XfΔpliG Shi, X. Y., et al., 2007 26
pilG complementary strain XfΔpliG-C  Davis, M. J., et al. 1998 23
Physical materials and equipment
Disposable inoculating loops VWR international, Radnor, PA #22-363-607 quantitative procedures such as bacterial collection
Polydimethylsiloxane (PDMS) Dow Corning Corporation #0002709226 Sylgard 184 silicone Elastomeric Kits
AmScope MD2000 digital camera AmScope, Irvine, CA SE305R-AZ-E Image, video recording and measurement 
Tubes line Edgewood, NY #T4300 Connected to the syringe and microfluidic chamber
Plastic luer connectors Edgewood, NY Connected to the syringe and microfluidic chamber
Syringe pumps Pico Plus, Harvard Apparatus, MA #702209 The flow rate can be adjusted while the pump is running.
Syringes Gastight, Hemilton Company, Reno, NV #1005 Provide the flowing broth
Inverted Olympus IMT-2 microscope Olympus IMT-2 FLuoro PHase Image observation and recording
SPOT-RT digital camera Diagnostic Instruments, Inc., MI RT230 Image, video recording and measurement
Microscope Shutter The UNIBLITZ, US #LS2T2 Control camera’s exposure time
Microscope Shutter Control system The UNIBLITZ, US VCM-D1 VCM-D1 Single Channel CE/UL/CSA Approved Shutter Driver
MetaMorph Image software Universal Imaging Corp., PA Real-time super-resolution image processing 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Purcell, A. H., Hopkins, D. L. Fastidious xylem-limited bacterial plant pathogens. Annu. Rev. Phytopathol. 34, 131-151 (1996).
  2. Purcell, A. H. Xylella fastidiosa, a regional problem or global threat. J. Plant Pathology. 79, 99-105 (1997).
  3. Hopkins, D. L. Xylella fastidiosa: Xylem-limited bacterial pathogen of plants. Annu. Rev. Phytopathol. 27, 271-290 (1989).
  4. Mattick, J. S. Type IV pili and twitching motility. Annu. Rev. Microbiol. 56, 289-314 (2002).
  5. Meng, Y., et al. Upstream migration of Xylella fastidiosa via pilus-driven twitching motility. J. Bacteriol. 187, 5560-5567 (2005).
  6. Li, Y., et al. Type I and type IV pili of Xylella fastidiosa affect twitching motility, biofilm formation and cell-cell aggregation. Microbiology. 153, 719-726 (2007).
  7. Simpson, A. J. G., et al. The genome sequence of the plant pathogen Xylella fastidiosa. Nature. 406, 151-157 (2000).
  8. Maier, B., Potter, L., So, M., Long, C. D., Seifert, H. S., Sheetz, M. P. Single pilus motor forces exceed 100 pN. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, 16012-16017 (2002).
  9. Touhami, A., Jericho, M. H., Boyd, J. M., Beveridge, T. J. Nanoscale characterization and determination of adhesion forces of Pseudomonas aeruginosa pili by using atomic force microscopy. J. Bacteriol. 188, 370-377 (2006).
  10. Skerker, J. M., Berg, H. C. Direct observation of extension and retraction of type IV pili. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98, 6901-6904 (2001).
  11. Brown, D. C., Larson, R. S. Improvements to parallel plate flow chambers to reduce reagent and cellular requirements. BMC Immunol. 2, 9 (2001).
  12. Thomas, W. E., Nilsson, L. M., Forero, M., Sokurenko, E. V., Vogel, V. Shear-dependent 'stick-and-roll' adhesion of type 1 fimbriated Escherichia coli. Mol. Microbiol. 53, 1545-1557 (2004).
  13. Thomas, W. E., Trintchina, E., Forero, M., Vogel, V., Sokurenko, E. V. Bacterial adhesion to target cells enhanced by shear force. Cell. 109, 913-923 (2002).
  14. Bahar, O., Fuente, D. L., Burdman, S. Assessing adhesion, biofilm formation and motility of Acidovorax citrulli using microfluidic flow chambers. FEMS Microbiol. Lett. 312, 33-39 (2010).
  15. Thomas, W. E. Using a laminar flow system to explain shear-enhanced bacterial adhesion. Proceedings of ICMM2005, Third International Conference on Microchannels and Mini-channels. Toronto, Ontario, Canada, , 751-759 (2005).
  16. Fuente, D. L., et al. Assessing adhesion forces of type I and type IV pili of Xylella fastidiosa bacteria by use of a microfluidic flow chamber. Appl. Environ. Microbiol. 73, 2690-2696 (2007).
  17. DeLange, P. A., Collins, T. L., Pierce, G. E., Robinson, J. B. PilJ localizes to cell poles and is required for type IV pilus extension in Pseudomonas aeruginosa. Curr Microbiol. 55, 389-395 (2007).
  18. Fuente, D. L., Burr, T. J., Hoch, H. C. Mutations in type I and type IV pilus biosynthetic genes affect twitching motility rates in Xylella fastidiosa. J. Bacteriol. 189, 7507-7510 (2007).
  19. Ferandez, A., Hawkins, A. C., Summerfield, D. T., Harwood, C. S. Cluster II che genes from Pseudomonas aeruginosa are required for an optimal chemotactic response. J. Bacteriol. 184, 4374-4383 (2002).
  20. Cursino, L., et al. Identification of an Operon, Pil-Chp, That Controls Twitching Motility and Virulence in Xylella fastidiosa. Mol. Plant Microbe Interact. 10, 1198-1206 (2011).
  21. Hazelbauer, G. L., Falke, J. J., Parkinson, J. S. Bacterial chemoreceptors: High-performance signaling in networked arrays. Trends Biochem. Sci. 33, 9-19 (2008).
  22. Costa, H. S., et al. Plant hosts of Xylella fastidiosa in and near southern California vineyards. Plant Dis. 88, 1255-1261 (2004).
  23. Shi, X. Y., Dumenyo, C. K., Hernandez-Martinez, R., Azad, H., Cooksey, D. A. Characterization of regulatory pathways in Xylella fastidiosa: genes and phenotypes controlled by algU. Appl. Environ. Microbiol. 73, 6748-6756 (2007).
  24. Matsumoto, A., Young, G. M., Igo, M. M. Chromosome-Based Genetic Complementation System for Xylella fastidiosa. Appl. Environ. Microbiol. 75, 1679-1687 (2009).
  25. Davis, M. J., Purcell, A. H., Thomson, S. V. Isolation Media for the Pierce's Disease Bacterium. Phytopathology. 70, 425-429 (1980).
  26. Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Soft lithography. Annu. Rev. Mater. Sci. 28, 153-184 (1998).
  27. Chaudhury, M. K., Whitesides, G. M. Direct measurement of interfacial interactions between semispherical lenses and flat sheets of poly-(dimethylsiloxane) and their chemical derivatives. Langmuir. 7, 1013-1025 (1991).
  28. Cruz, L. F., Parker, J. K., Cobine, P. A., De La Fuente, L. Calcium-enhanced twitching motility in Xylella fastidiosa is linked to a single PilY1 homolog. Appl. Environ. Microbiol. 80, 7176-7196 (2014).

Tags

علم المناعة، العدد 110،
التصور من الوخز على الحركة وتوصيف دور<em&gt; PilG</em&gt; في<em&gt; Xylella fastidiosa</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shi, X., Lin, H. Visualization of… More

Shi, X., Lin, H. Visualization of Twitching Motility and Characterization of the Role of the PilG in Xylella fastidiosa. J. Vis. Exp. (110), e53816, doi:10.3791/53816 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter