Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

ויזואליזציה של תנועתיות מפרכסים אפיון תפקידו של Published: April 8, 2016 doi: 10.3791/53816
Automatic Translation
1, 2
1Department of Plant Science, University of California, Davis, 2Agricultural Research Service, San Joaquin Valley Agricultural Sciences Center, United States Department of Agriculture

Summary

במחקר זה, תא זרימת ננו-microfluidic הועסק לדמיין והן מבחינה תפקודית לאפיין את תנועתיות והמרטיטה של Xylella fastidiosa, חיידק הגורם למחלה של פירס גפן.

Abstract

Fastidiosa Xylella הוא חיידק שאינו והולקה בשוט גראם שלילי הגורם למספר מחלות חשיבות הכלכלית של צמחים. תנועתיות מתעוות מספקות X. fastidiosa אמצעי לתנועת תוך צמח למרחקים ארוכים והתנחלות, תורם כלפי פתוגניות ב X. fastidiosa. תנועתיות והמרטיטה של X. fastidiosa מופעל על ידי פילי מסוג IV. סוג IV פילים של fastidiosa Xylella מוסדרים pilG, רגולטור chemotaxis בחלבוני קידוד אופרון Pil-CHP כי הם מעורבים עם מסלולי העברת אותות. כדי להבהיר את התפקידים של pilG ב תנועתיות והמרטיטה של X. fastidiosa, pilG -deficient מוטציה XF ΔpilG ומתח המשלים XfΔpilG- C המכיל יליד pilG פותחו. תאי microfluidic משולבים עם מערכת הקלטת הזמן לשגות תמונה שמשו לראות את התנועה מרטטת XfΔpאילג, XfΔpilG- C ומתח סוג הבר שלה. באמצעות מערכת הקלטה זו, הוא מתיר תצפיות במרחב ובזמן ארוך טווח של צבירה, הגירה של תאים בודדים ואוכלוסיות של חיידקים באמצעות תנועתיות מתעוות. X. סוג בר fastidiosa ו XfΔpilG- C זן משלימים הראה המאפיינים תנועתיות מתעוות טיפוסי לצפות ישירות בתאי זרימה microfluidic, בעוד מוטציה XfΔpliG הציג את הפנוטיפ לקוי מתעוות. מחקר זה מוכיח כי pilG תורמת תנועתיות והמרטיטה של X. fastidiosa. תא הזרימה microfluidic משמש כאמצעי להתבוננות תנועתיות מתעוות.

Introduction

Fastidiosa Xylella הוא חיידק שאינו והולקה בשוט גראם שלילי, פתוגניים הגורם למספר מחלות יבול חשיבות הכלכלית, כולל המחלות של פירס גפן (ותטיס vinifera ל) 1,2, 3. חיידק זה מוגבל עצת ניצוח המים כלי. זיהום של גפן גורם סתימה של צינורות עצה ותוצאות לחץ מים חסרים תזונתי 3. הקולוניזציה מוצלח תלוי ביכולת של החיידק לעבור מהאתר הראשוני של הידבקות לשאר הצמח 3. מתעוות תנועתיות הוא אמצעי תנועת חיידקים עצמאי-flagellar באמצעות הרחבה, מצורף, ההכחשה של פילי IV הסוג קוטבי 4 כי כבר מאופיין ב X. fastidiosa 5,6,7.

תנועתיות מתעוות נצפתה על ידי פינצטה לייזר ו במיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) 8,9,10. שימוש בשיטות אלה, tmotilities הכישוף שנוצר על ידי pilus IV סוג של נ gonorrhoeae ו פ aeruginosa התאפיין פילי תיוג uorescently fl לכידות תנועותיהם מיקרוסקופיות. למרות שני השיטות שפרטו הכח הדבק של חיידקים בודדים, הנהלים הם מסובכים וגוזל זמן 9,10. תאי uidic מיקרו fl שימשו להתבונן הגירה למרחקים ארוכים של תאים בודדים, כמו גם אגרגטים קטנים של תאים חיידקיים 5,6. תאים אלו עוצבו כמו ערוצי microfabricated-ננו צלחת משולבת עם 11,12,13,14 מערכת הקלטת הזמן לשגות תמונה. מייקרו fl מכשירים הקאמריים uidic מציעים כמה יתרונות ללימוד התנהגות תנועת תאי תאי האינטראקציות של חיידקים: (i) הוא מספקת פלטפורמה משולבת עם יכולות ערוץ מרובות; (Ii) זה יכול לבחון את תנועות ו מצבורים של תאים בודדים של תכונות בקנה מידה ננו של חיידקים; (Iii) הוא מאפשר מטר ישירהקלטה תמונה icroscopic של תאים חיידקיים וניתוח זמן לשגות, (iv) שהיא מספקת תצפיות במרחב ובזמן לטווח ארוך של הפרט / או אוכלוסיות של חיידקים בסביבה-מיקרו; (V) את קצב הזרימה של מדיום תרבות ערוץ ניתן לשלוט באופן מדויק ו (vi) רק נפח קטן מאוד (1 מיליליטר) של מדיום התרבות נדרש עבור כל ניסוי.

לאחרונה, מיקרו fl uidic fl ow מערכת הועסק לחקור את ההתנהגויות של תאים חיידקיים תחת microenvironments שונים 14,15,16. הדביק ואת מצורף המשטח של E. 15 coli, X. fastidiosa 16, ו Acidovorax citrulli 14 משטחי זכוכית הוערכו באמצעות תאי מיקרו fl uidic. ההצטברות וביו בקולנוע היווצרות בתיווך פילי סוג IV של citrulli Acidovorax נותחו 14. יתר על כן, ההצעה של א citrulli שרואים בזמן fl ow גonditions הוכיח כי פילי הסוג IV עשויים לשחק תפקידים חשובים קולוניזציה ולהפיץ של א citrulli ב צינורות העצה תחת SAP fl ow תנאים. Motilities והמרטיט של Pseudomonas aeruginosa ו X. תאי fastidiosa נצפו בהצלחה נגד זרם נוזל בתוך תא זרימת microfabricated 5,6,17. IV pilus סוג לוקה מוטציות pilB ו pilQ של X. fastidiosa נמצא עמוקות לשנות את המהירות של מתעוות תנועתיות בתנאי הזרימה בהתקני uidic fl מיקרו 5,6,18. המחקרים שנערכו על הידבקות חיידקים תנועתיות בהתקנים מיקרו fl uidic ציינו כי fl מיקרו תאי uidic מתאימים במיוחד לניתוח תנועתיות לפרכס נדידת חיידקים בתיווך פילי במבחנה. תוצאות אלו מסבירות את מנגנון ההעברה בתיווך מתעוות המאפשר מצורף תאי תאים, צבירת קולוניזציה בתוךהמארח, בסופו של דבר להוביל לזיהום סיסטמי.

פיל-CHP אופרון של X. fastidiosa מכיל pilG, פילים, pilJ, גלולה, chpB ו chpC מקודדי אות התמר מסלולי 20. וכימיים הטרנסממברני להיקשר לגירויים כימיים בתחום periplasmic ולהפעיל מפל איתות חלק cytoplasmic שלהם בסופו של דבר לשלוט תנועתיות מתעוות חיידקים. בשנת אופרון Pil-CHP של X. fastidiosa, PilG חלבון phospho-הסעות הוא homologue כדי סטרייצ'י. בתוך א ' coli ו פ aeruginosa, סטרייצ'י הוא הרגולטור בתגובה במערכות chemotaxis כי אינטראקציה עם החלבונים המנועים שוטונים 19, 21. למרות התרומות של אופרון Pil-CHP כלפי ארסיות X. fastidiosa נבחנו לאחרונה 20, תפקיד pilG ב אופרון chemotaxis בתגובה לאותות סביבתיים פילי IV סוג מוסדר / מנוע של X. fastidiosa הוא UNCליר. כדי להבהיר את התובנה של chemotaxis הרגולטור pilG בפעילות של תנועתיות ומרטיט של X. fastidiosa, תא מיקרו fl uidic משמש כדי להעריך את תנועתיות ומרטיט של X. fastidiosa. PilG של fastidiosa X. מאופיין על ידי השוואת פנוטיפים של מוטציה המחיקה XF ΔpliG, -C XfΔpliG זן משלימה סוג בר שלו במבחנה. התוצאות ממחישות את תפקידו של pilG ב תנועתיות והמרטיטה של X. fastidiosa.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. פרינג ההיקפיים של מושבת חיידקים

  1. לגדול X. fastidiosa (XF) טמקולה סוג בר 22, מוטצית מחיקת pilG XF ΔpliG (באמצעות אסטרטגית מחיקה שתוארה לעיל 23), ו -C XfΔpliG המשלה (באמצעות שתואר לעיל אסטרטגיה שלמה גנטי מבוסס כרומוזום 24) על צלחות אגרו בינוני PD2 25 על 28 מעלות צלזיוס למשך 5-7 ימים.
  2. צלופן החיטוי (1 x 1 ס"מ 2) במים ב 121 ° C (249 ° F) במשך 15 דקות. תרימי חתיכה אחת של צלופן, לנקז את המים על ידי נגיעה בפינה אחת של צלופן על צלחת פטרי ריקות, בזהירות להניח את הצלופן מעל 15% של השטח אגר ואוויר יבש.
  3. תרים X. פרט מושבות fastidiosa עם סטרילי קיסמים מעוגלים ותא נקודה בסביבה נקיה מחיידקים על גבי גיליון מעוקר של צלופן המעולף על 15% של שטח אגר הצלחות אגרו. דגירה את הצלחתs ב- C ° 28 במשך 2-3 ימים.
  4. בדוק את מורפולוגיה קץ המושבות באמצעות מיקרוסקופ לנתח עם עדשת 2X אובייקטיבית עדשה 10X עינית. צלם את השוליים היקפי סביב מושבות.

2. צ'יימברס זרימה מיקרוסקופים Microfluidic

  1. לפברק מכשירי microfluidic באמצעות נהלי צילום ליתוגרפיות דומים לאלה שתוארו קודם לכן 5,18. תכנון ארבעה ערוצים מקבילים עם תוכנת תכנון בעזרת מחשב על פרוסות סיליקון מאסטר בשיטות ליתוגרפיות תקן 26.
  2. צור לתאי microfluidic מאדון פרוס סיליקון עם polydimethylsiloxane (PDMS). יוצקים PDMS unpolymerized כלפי מאמן פרוסות סיליקון ולרפא אותו ב -60 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. לקלף את העתק PDMS מן האדון רקיק וקוצצים את העתק PDMS עם להב לתוך 22 מ"מ x 40 מ"מ בגודל זהה של coverslip זכוכית.
  3. לחשוף את העתק PDMS, coverslip זכוכית (22 x 40 מ"מ 2), וכן microscשקופית אופ (51 x 76 מ"מ 2) לפלזמה האוויר של 30 וואט למשך 2 דקות 27. סנדוויץ הגוף PDMS בין coverslip זכוכית מיקרוסקופ זכוכית לבנות תא uidic fl מיקרו.
  4. לקדוח חור (5.5 מ"מ קוטר) דרך PDMS בכל קצה של ערוץ בדוגמת. חותכים את צינורות סיליקון גומי לתוך ארוך 12-20 ס"מ. הכנס קצה אחד של צינור גומי סיליקון (5.1 מ"מ קוטר חיצוני, 2.1 מ"מ קוטר פנימי, 0.8 קיר מ"מ) לתוך בכל קצה הפתיחה של הערוצים של העתק PDMS, וסוגרים אותו עם PDMS unpolymerized ב 60 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
  5. חבר קצה אחר של הצינור עד הסוף הדוקרני של מחברי luer פלסטיק. עוטפים את תאי microfluidic התאספו עם רדיד אלומיניום ו החיטוי אותם במשך 20 דקות.
  6. איסוף תאי חיידקים של X. סוג בר fastidiosa, מוטציה XF ΔpliG, ו XfΔpliG -C משלימים באמצעות גירוד, באמצעות inoculating הפנויה לולאות מצלחות בינוני PD2. התאם צפיפות התאיםכדי צפיפות אופטית של 0.05 ב 600 ננומטר במרק PD2 כפי שתואר קודם לכן 23. לאסוף את הפתרון תא החיידק לתוך מזרק 1 מ"ל gastight.
  7. הר המכשיר microfluidic על הבמה מיקרוסקופ הפוכה. חברו צינור היניקה אל מזרק 5 מ"ל gastight המכיל מרק PD2. התאימו את מזרק 5 מ"ל gastight עם משאבות מזרק.
  8. חברו את צינור מוצא למאגר הפסולת. יש לשמור על קצב זרימה בינונית של 0.2 דקות μl -1 למשך 30 דקות כדי לייצב את המערכת.
  9. חבר צינורות-כניסת צד מזרק 1 מ"ל gastight המכיל את פתרון תא החיידק. שטוף את פתרון תא החיידק דרך צינורות הגומי עד הערוץ הוא הגיע. יש לשמור על קצב זרימה בינוני של 0.2 דקות μl -1 עבור 30 דקות אחרות כדי לשטוף תאים מאוגדים מהאולם לפני לכידת תמונה.
  10. הר תריס מיקרוסקופ תחת במשרה מותאמת השדה של המיקרוסקופ לשלוט האור. חבר את התריס כדי שיתוף התריסמערכת ntrol ולחבר את מערכת בקרת תריס למחשב.
  11. הר מצלמה דיגיטלית ליציאת וידאו של המיקרוסקופ ולחבר אותו למחשב. הפעל את תוכנת הצריבה זמן לשגות, בחר את הפונקציה "תריס" מהתפריט, ולהכיר את התריס מותקן באופן אוטומטי כברירת מחדל בתוכנה כדי ליצור חיבורים אל התריס עם התוכנה.
  12. בחר את פונקציית "מצלמה דיגיטלית" מהתפריט של תוכנת הצריבה לשגות הזמן להכיר את המצלמה הדיגיטלית באופן אוטומטי כהתקן לכידת ברירת המחדל בתוכנה ליצור תקשורת עם מצלמה דיגיטלית עם התוכנה.
  13. אתר תאים חיידקיים באחד הערוצים באמצעות 20X אופטיקה שלב בניגוד, ואז לעבור העדשה אובייקטיבי 40X לפני לכידת תמונה.
  14. הפעל את תוכנת הצריבה זמן לשגות, בחר את הפונקציה "רכישת התמונה" באמצעות פרמטרים של ברירת מחדל מהתפריט לרכוש את התמונות מן מיקרוסקופ.לאחר מכן, לפתוח את פונקצית "רוכש זמן לשגות" ולהגדיר את מרווח הזמן עד 30 שניות 5,18,28 של משך 6-24 שעות תלוי ניסוי צריך לראות את התנועה מתעוות של X. fastidiosa 5,18,28. לחץ על "אישור" כדי להתחיל את ההקלטה זמן לשגות. לחץ "סטאק פונקציה" מהתפריט, בחר "שמירה בשם" לערום את התמונות בתיקיית היעד במחשב לאחר שסיים את ההקלטה.
  15. עבור מספר רב של ערוצים, ללכוד תמונות זמן לשגות מהערוץ הראשון כל 30 שניות במשך 6 שעות. הזז את העדשה האובייקטיבית של המיקרוסקופ לערוץ הבא כדי לאתר את תאי היעד. חזור על הפונקציה זמן לשגות כמתואר לעיל כדי ללכוד תמונות בכל אחד ברצף ארבעה ערוצים אם הניסוי מוגדר לנצל ארבעה ערוצים. המשך לכידת תמונה זמן לשגות עבור כל עוד שלושה ימים רצופים. כל הניסויים בוצעו בטמפרטורת החדר (23 ± 2 ° C).
  16. לקמפל את זמן לשגות תמונות לתוךקובץ וידאו באמצעות תוכנת הדמיה הקלטה זמן לשגות. הפעל תוכנת צריבת הזמן לשגות, לחץ על "פונקצית סטאק" מהתפריט, ובחר "פונקציה גרם פתוחה" כדי לפתוח את הקבצים המוערמים מהמחשב.
  17. הפעל את "הסרט הפוך" פונקציה ממודול מחסנית, בחירת כל התמונות ובחירת פורמט "AVI" פלט. לחץ על "שמירה בשם" כדי לשמור את קובץ הווידאו בתיקיית היעד במחשב.
  18. בחר סרטים מלוקט מתוך תיקיית היעד במחשב ולשחק בהם. לאחר מכן, לבחון את תנועתיות של תאים בודדים באמצעות ויזואליזציה וכתוצאה מהפעילות מתעוות תנועתיות של תאי חיידקים קבצי וידאו שנוצר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הנוכחות של מיעוט המושבה היקפי מעיד על תנועתיות מתעוות סוג IV בתיווך pilus, נצפתה במושבות של X. סוג בר fastidiosa ומתח XF ΔpliG -C משלים (איור 1). Mutant XfΔpliG, לעומת זאת, לא להפגין שוליים סביב בפריפריה של מושבות (איור 1). זמן לשגות הדמיה של תאים חיידקיים בתאי תזרים ננו-microfluidic גילה כי תנועתיות מתעוות נצפתה בשני X. סוג בר fastidiosa ואת (V1 משלימה, V3) XfΔpliG -C משלימים, ואילו תאים מוטנטים XfΔpilG ולא הציג מתעוות תנועתיות לאורך הניסוי (V2 משלימה). תאים של מוטצית XfΔpilG יצרו אגרגטים רופפים קטנים יחסית במרק PD2 (V2 משלימה). לעומת זאת, תאים של X. סוג בר fastidiosa ו XfΔpilG- ג ד משלימה אגרגטים גדולים eveloped במרק PD2 (איור 2, (V1 משלימה, V3).

איור 1
איור 1:. השולים ההיקפיים של מושבת חיידקי מאפיינים שולים מושבה של X. fastidiosa מן הסוג בר, מוטצית XF ΔpilG, ו XfΔpilG- C משלים גדל על אגר PD2 מכוסה בסדין מעוקר של צלופן. למעט מוטצית XfΔpilG, כל המושבות הציגו שולים היקפיים, המציין תנועתיות מתעוות הסוג IV בתיווך pilus. התמונות צולמו לאחר 5 ימים של צמיחה על המדיום לתרבות. גדלה ברה, 0.5 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

_upload / 53,816 / 53816fig2.jpg "/>
איור 2: תנועתיות והמרטיטה של X. fastidiosa תאי תא זרימת ננו-microfluidic. תנועתיות עוויתות של כל תאי הזן הנבדקים נרשמו במהלך 6 ימים של התבוננות. ההערכות בוצעו משלושה קטעי וידאו עצמאיים. גדלה ברה, 20 מיקרומטר.
הערה: תנועתיות והמרטיטה של X. fastidiosa תאים מאופיין תנועת תא בודד על פני משטחי זכוכית באמצעות הרחבה, מצורף, הכחשה של פילי IV סוג הקוטב. התא הבודד נצפה ההגירה מועדפת נגד זרם נוזל בתוך תא זרימה microfabricated. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

6 / 53816supfig1.jpg "/>
משלימה איור 1: תא הזרימה microfluidic ארבעה ערוצים. כל ערוץ עם התקשורת והמדיה החוצה מחברים בכל קצה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

סרט משלימה 1
משלימה סרט 1: נרעדה תנועתיות. (קליק ימני להוריד). מתעוות של fastidiosa X. wild-type בתא זרימה microfluidic.

סרט משלימה 2
סרט משלימה 2: twitchin הפגוםתנועתיות גרם. (קליק ימני להוריד). מוטציה תנועתיות של XF. XfΔpilG שנצפה תא הזרימה amicrofluidic.

סרט משלים 3
סרט משלימה 3: שוחזר תנועתיות מתעוות. (קליק ימני להוריד). היא נרעדה תנועתיות של זן משלימים XF. XfΔpilG-C שנצפתה תא זרימה microfluidic.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

במחקר זה, אנו שאפיינו את התנהגות התנועה של X. fastidiosa PilG מוטציה XF ΔpilG וללחצים XfΔpilG- C משלים שלה החדש תוכנן מרובים מיקרו במקביל ננו-ערוץ fl תאי uidic. קלי FL מייקרו החדש תוכנן תאי uidic יכולים להכיל עד ארבעה תאים במקביל 100 מיקרומטר ערוצי ננו רוחב לעומת עיצובים קודם לכן עם ערוץ רחב אחת בלבד 50 מיקרומטר 18. הערוץ-ננו רחב יותר המשופר מקלת כניסתה של תאים חיידקיים עם הזורם של התקשורת. בנוסף, תא מיקרופלואידיקה זה הוא 1) פשוט לבנות ולהרכיב; 2) לא יקר יחסית; ו -3) בקלות החלים על דרישות משתנות של ניסוי. כתוצאה מכך, עיצוב תא זה מתיר התצפית ארוך הטווח של התנועות של תאי חיידקיים תחת זני microenvironment הניסיון.

ייצוב fl ow של הזרמים throuGH ערוץ מייקרו fl uidic הוא השלב הקריטי ליצירת microenvironment שלם זורם-מייקרו fl uidic עבור התצפית של תנועתיות של תאי חיידקיים תחת מגוון רחב של סביבות ניסיון. שטיפה של תאי מיקרו fl uidic צינורות חיבור עם התקשורת לפני כניסתה של תאים חיידקיים היא גם צעד חשוב לייצב את זרימת בתא. עם זאת, המהירות הגבוהה של הזרימה תהיה לרוקן תאי חיידקיים מתוך החדר מבלי להשאיר בידה תאים כמובן של החדר. המהירות הנכונה של התקשורת זורם בצינורות מיקרו fl uidic צריך להיות מותאם באמצעות משאבת מזרק. במהלך הניסויים במחקר זה, זורם קובע על מנת לייצב את המשאבה על 0.2 עד 1 μl דקות -1 לפחות 30 דקות לפני החדרת התאים חיידקיים לתוך התעלה. ברגע שהתאים הוכנסו לתוך ערוצים מיקרו fl uidic, המדיום fl ow נשמר 0.2 μl מב -1 למשך 30 עד 60 דקות כדי לייצב את המערכת וסרה תא nonattached. חשוב מאוד כדי לייצב את הזרימה כדי לשמור על רקע ברור על מנת לבחון את ההצעה של תאים חיידקיים. תמונות נתפסו כל 30 שניות כדי להונות פירמת פעילות מתעוות תנועתיות של התאים הציגו שמירה על מהירות זרימה קבועה על 0.2 דקות μl -1. אם הניסויים דורשים גביית תאים חיידקיים בבית הבליעה, התאים ניתן סמוקות החוצה על ידי הגדלת בהדרגה שיעורי הזרימה של מדיה 0.2 כדי 110 דק μl -1 ידי התאמת מהירות משאבת מזרק.

פעילות תא החיידק בתאי uidic fl מיקרו הוערכה באמצעות מיקרוסקופ הפוכה באמצעות 40X אופטיקה שלב בניגוד ותמונות זמן לשגות מוקלט עם מצלמה דיגיטלית, אשר נשלטה על ידי תוכנת ההדמיה. מהירות הזרימה ואת מרווח הזמן עבור לכידת תמונה יכולות להיות בהתאם עם experimדרישות ental. עם זאת, ברוב המקרים, לזרום מהירות עבור קצב זרימה בינוני מוגדר 0.2 μl דקות -1 עם זמן לשגות תמונות תיעד כל 30 שניות עבור תאים חיידקיים בתיווך pilus. במקרים אחרים, אם שיעור זרימת המדיום הוא עלה ל 0.1 דקות μl -1 במהלך ניסויים, את ההתנהגות של תאי חיידקיים תתועד על ידי לכידת תמונות כל 10 עד 15 שניות בהתאם. תמונות הזמן לשגות נלקחו כל 30 שניות משך 6-24 שעות והצילו כמו קבצי תמונות מקור עבור כל זן נבדק. הסרטונים אז קוימו מהתמונות שנלקחו 6-8 שעות מכל זן, אשר הראו פנוטיפים הניגוד מתעוות motilities בין סוג מוטציה ופרוע / משלימים זנים (V1 משלימה, V2, V3).

המשמעות של המכשירים הקאמריים uidic fl ננו-מייקרו מעל תאי לוחות מקבילים macroscale fl ow כוללת את החקירה הישירה של תנועות ואת המצבורים של השריםתאים של חיידקים le. בנוסף בעלות נמוכה 5 ודרישות נפח מגיב מדגם נמוך, את היתרונות של תאי uidic fl מיקרו הם קלות הבנייה של המיקרו-סביבה fl ow לתרבות חיידקים שליטה מדויקת על קצב הזרימה fl uid. הערוצים במקביל המרובים לאפשר הצפייה זני חיידקים דיפרנציאליים הגדרת ניסוי יחידה המספקת נתונים תואמים לניתוח. תנועתיות מתעוות עצמאית-flagellar של חיידקים עם פילי הקוטב מתאים במיוחד עבור ניתוח בתא uidic fl ננו-מיקרו זה. עם זאת, תא uidic fl מייקרו זה פחות מתאים לתנועת חיידקים תלוי flagellar, שבו התנועה של חיידקים היא בדרך כלל מהירה מדי ותערוכות בכיוונים אקראיים. הגבלה לפעמים זה יכול להיות בסכנה על ידי התאמת קצב הזרימה בינוני עד 0.05 μl דקות -1 ושינוי שיעור לכידת תמונה זמן לשגות בכל 1 עד 2 שניות במשך שעה 1 כדי analyZE בקשותיהן של חיידקים בתיווך flagellar בסביבה בקנה מידה ננו.

מכשירים קאמריים Microfluidic המופיע בו לספק ראיות חזותיות ישירות להערכה תפקודית של PilG האחראי להתנהגות תנועה במבחנה. בנוסף, מחקר זה גם מגלה כי תא להצטברות תא דרך תנועתיות מתעוות חיוני להיווצרות ביופילם, איתות פתוגניות ב X. fastidiosa. ויזואליזציה של חיידקים מתעוות תנועתיות ידי מכשירים microfluidic מספק גישה חדשה ללמוד לתפקד גנים מעורבים בהתנהגות בחיידקים אשר אינה נמדדת בקלות על ידי שיטות assay אחרים. גישה זו יכולה להיות מיושמת על מערכות חיידקים אחרות. המכשירים בתא microfluidic לספק מערכת זרימה לאפיון ההתנהגות הפיזיולוגית של תאי חיידקיים הקשורים מצורף תאי תאים, מצבורי תא, בדפוסי תנועת היווצרות ביופילם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

מחקר זה מומן על ידי מחלקת החקלאות של ארצות הברית, שירות המחקר החקלאי. שמות מסחריים או מוצרים מסחריים בפרסום זה מוזכרים אך ורק לצורך מתן מידע ספציפי ואינו משתמע המלצה או תמיכה על ידי משרד החקלאות ארצות הברית. USDA היא ספקית שוויון הזדמנויות מעסיקה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Biology materials
X. fastidiosa (Xf) Temecula wild type Costa, H. S., et al., 2004 22
pilG deletion mutant XfΔpliG Shi, X. Y., et al., 2007 26
pilG complementary strain XfΔpliG-C  Davis, M. J., et al. 1998 23
Physical materials and equipment
Disposable inoculating loops VWR international, Radnor, PA #22-363-607 quantitative procedures such as bacterial collection
Polydimethylsiloxane (PDMS) Dow Corning Corporation #0002709226 Sylgard 184 silicone Elastomeric Kits
AmScope MD2000 digital camera AmScope, Irvine, CA SE305R-AZ-E Image, video recording and measurement 
Tubes line Edgewood, NY #T4300 Connected to the syringe and microfluidic chamber
Plastic luer connectors Edgewood, NY Connected to the syringe and microfluidic chamber
Syringe pumps Pico Plus, Harvard Apparatus, MA #702209 The flow rate can be adjusted while the pump is running.
Syringes Gastight, Hemilton Company, Reno, NV #1005 Provide the flowing broth
Inverted Olympus IMT-2 microscope Olympus IMT-2 FLuoro PHase Image observation and recording
SPOT-RT digital camera Diagnostic Instruments, Inc., MI RT230 Image, video recording and measurement
Microscope Shutter The UNIBLITZ, US #LS2T2 Control camera’s exposure time
Microscope Shutter Control system The UNIBLITZ, US VCM-D1 VCM-D1 Single Channel CE/UL/CSA Approved Shutter Driver
MetaMorph Image software Universal Imaging Corp., PA Real-time super-resolution image processing 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Purcell, A. H., Hopkins, D. L. Fastidious xylem-limited bacterial plant pathogens. Annu. Rev. Phytopathol. 34, 131-151 (1996).
  2. Purcell, A. H. Xylella fastidiosa, a regional problem or global threat. J. Plant Pathology. 79, 99-105 (1997).
  3. Hopkins, D. L. Xylella fastidiosa: Xylem-limited bacterial pathogen of plants. Annu. Rev. Phytopathol. 27, 271-290 (1989).
  4. Mattick, J. S. Type IV pili and twitching motility. Annu. Rev. Microbiol. 56, 289-314 (2002).
  5. Meng, Y., et al. Upstream migration of Xylella fastidiosa via pilus-driven twitching motility. J. Bacteriol. 187, 5560-5567 (2005).
  6. Li, Y., et al. Type I and type IV pili of Xylella fastidiosa affect twitching motility, biofilm formation and cell-cell aggregation. Microbiology. 153, 719-726 (2007).
  7. Simpson, A. J. G., et al. The genome sequence of the plant pathogen Xylella fastidiosa. Nature. 406, 151-157 (2000).
  8. Maier, B., Potter, L., So, M., Long, C. D., Seifert, H. S., Sheetz, M. P. Single pilus motor forces exceed 100 pN. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, 16012-16017 (2002).
  9. Touhami, A., Jericho, M. H., Boyd, J. M., Beveridge, T. J. Nanoscale characterization and determination of adhesion forces of Pseudomonas aeruginosa pili by using atomic force microscopy. J. Bacteriol. 188, 370-377 (2006).
  10. Skerker, J. M., Berg, H. C. Direct observation of extension and retraction of type IV pili. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98, 6901-6904 (2001).
  11. Brown, D. C., Larson, R. S. Improvements to parallel plate flow chambers to reduce reagent and cellular requirements. BMC Immunol. 2, 9 (2001).
  12. Thomas, W. E., Nilsson, L. M., Forero, M., Sokurenko, E. V., Vogel, V. Shear-dependent 'stick-and-roll' adhesion of type 1 fimbriated Escherichia coli. Mol. Microbiol. 53, 1545-1557 (2004).
  13. Thomas, W. E., Trintchina, E., Forero, M., Vogel, V., Sokurenko, E. V. Bacterial adhesion to target cells enhanced by shear force. Cell. 109, 913-923 (2002).
  14. Bahar, O., Fuente, D. L., Burdman, S. Assessing adhesion, biofilm formation and motility of Acidovorax citrulli using microfluidic flow chambers. FEMS Microbiol. Lett. 312, 33-39 (2010).
  15. Thomas, W. E. Using a laminar flow system to explain shear-enhanced bacterial adhesion. Proceedings of ICMM2005, Third International Conference on Microchannels and Mini-channels. Toronto, Ontario, Canada, , 751-759 (2005).
  16. Fuente, D. L., et al. Assessing adhesion forces of type I and type IV pili of Xylella fastidiosa bacteria by use of a microfluidic flow chamber. Appl. Environ. Microbiol. 73, 2690-2696 (2007).
  17. DeLange, P. A., Collins, T. L., Pierce, G. E., Robinson, J. B. PilJ localizes to cell poles and is required for type IV pilus extension in Pseudomonas aeruginosa. Curr Microbiol. 55, 389-395 (2007).
  18. Fuente, D. L., Burr, T. J., Hoch, H. C. Mutations in type I and type IV pilus biosynthetic genes affect twitching motility rates in Xylella fastidiosa. J. Bacteriol. 189, 7507-7510 (2007).
  19. Ferandez, A., Hawkins, A. C., Summerfield, D. T., Harwood, C. S. Cluster II che genes from Pseudomonas aeruginosa are required for an optimal chemotactic response. J. Bacteriol. 184, 4374-4383 (2002).
  20. Cursino, L., et al. Identification of an Operon, Pil-Chp, That Controls Twitching Motility and Virulence in Xylella fastidiosa. Mol. Plant Microbe Interact. 10, 1198-1206 (2011).
  21. Hazelbauer, G. L., Falke, J. J., Parkinson, J. S. Bacterial chemoreceptors: High-performance signaling in networked arrays. Trends Biochem. Sci. 33, 9-19 (2008).
  22. Costa, H. S., et al. Plant hosts of Xylella fastidiosa in and near southern California vineyards. Plant Dis. 88, 1255-1261 (2004).
  23. Shi, X. Y., Dumenyo, C. K., Hernandez-Martinez, R., Azad, H., Cooksey, D. A. Characterization of regulatory pathways in Xylella fastidiosa: genes and phenotypes controlled by algU. Appl. Environ. Microbiol. 73, 6748-6756 (2007).
  24. Matsumoto, A., Young, G. M., Igo, M. M. Chromosome-Based Genetic Complementation System for Xylella fastidiosa. Appl. Environ. Microbiol. 75, 1679-1687 (2009).
  25. Davis, M. J., Purcell, A. H., Thomson, S. V. Isolation Media for the Pierce's Disease Bacterium. Phytopathology. 70, 425-429 (1980).
  26. Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Soft lithography. Annu. Rev. Mater. Sci. 28, 153-184 (1998).
  27. Chaudhury, M. K., Whitesides, G. M. Direct measurement of interfacial interactions between semispherical lenses and flat sheets of poly-(dimethylsiloxane) and their chemical derivatives. Langmuir. 7, 1013-1025 (1991).
  28. Cruz, L. F., Parker, J. K., Cobine, P. A., De La Fuente, L. Calcium-enhanced twitching motility in Xylella fastidiosa is linked to a single PilY1 homolog. Appl. Environ. Microbiol. 80, 7176-7196 (2014).

Tags

אימונולוגיה גיליון 110, עווית תנועתיות pilus סוג IV, Microfluidic תא זרימה
ויזואליזציה של תנועתיות מפרכסים אפיון תפקידו של<em&gt; PilG</em&gt; ב<em&gt; Fastidiosa Xylella</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shi, X., Lin, H. Visualization of… More

Shi, X., Lin, H. Visualization of Twitching Motility and Characterization of the Role of the PilG in Xylella fastidiosa. J. Vis. Exp. (110), e53816, doi:10.3791/53816 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter