Summary
Neste estudo, uma câmara de fluxo nano-microfluídico foi utilizado para visualizar e funcionalmente caracterizar a motilidade espasmos da Xylella fastidiosa, bactéria que causa a doença de Pierce em videira.
Abstract
Xylella fastidiosa é uma bactéria não-flagelado Gram negativo que causa uma série de doenças economicamente importantes de plantas. A motilidade espasmos fornece X. fastidiosa um meio para o movimento de longa distância intra-planta ea colonização, contribuindo para patogenicidade em X. fastidiosa. A motilidade espasmos de X. fastidiosa é operado por pili tipo IV. Pili de tipo IV de Xylella fastidiosa são regulados por pilG, um regulador de quimiotaxia em proteínas do operão de codificação Pil-CHP que estão envolvidos com vias de transdução de sinal. Para elucidar os papéis de pilG na motilidade espasmos de X. fastidiosa, uma pilG -deficient mutante Xf ΔpilG e sua estirpe complementar XfΔpilG- C contendo pilG nativa foram desenvolvidos. A câmara microfluídicos integrados com um sistema de gravação de imagens de lapso de tempo foi usado para observar espasmos motilidade em XfΔpIlg, XfΔpilG- C e sua linhagem selvagem. Usando este sistema de gravação, que permite observações espaciais e temporais de longa duração de agregação, a migração de células individuais e as populações de bactérias através de motilidade espasmos X.. fastidiosa tipo selvagem e complementar estirpe XfΔpilG- C mostrou características típicas espasmos motilidade diretamente observados nas câmaras de fluxo microfluídicos, enquanto mutante XfΔpliG exibiu o fenótipo deficiente se contraindo. Este estudo demonstra que pilG contribui para a motilidade espasmos dos X. fastidiosa. A câmara de fluxo microfluidico é utilizado como um meio para a observação de contracções motilidade.
Introduction
Xylella fastidiosa é uma bactéria patogénica gram-negativas não flagelados, que faz com que um certo número de doenças de culturas economicamente importantes, incluindo a doença de Pierce em videira (Vitis vinifera L.) 1,2, 3. Esta bactéria é limitada ao xilema de condução de água embarcações. Infecção da videira faz com que o bloqueio dos vasos do xilema e resulta em estresse hídrico e deficiências nutricionais 3. Colonização bem sucedida depende da capacidade da bactéria para se mover a partir do local inicial da infecção para o resto da planta 3. Espasmos motilidade é um meio de movimento bacteriana independente de flagelar através da extensão, apego e retração do pili tipo IV polar 4 que tem sido caracterizado X. fastidiosa 5,6,7.
A motilidade espasmos tem sido observado por pinças laser e microscopia de força atômica (AFM) 8,9,10. Utilizando estas técnicas, tmotilidades witching gerado pelo pilus de tipo IV de N. gonorrhoeae e P. aeruginosa foram caracterizados por fl pili rotulagem uorescently e capturando os seus movimentos microscopicamente. Embora ambos os métodos tenham detalhado a força adesiva de bactérias individuais, os procedimentos são complicados e demorados 9,10. As câmaras uidic fl micro foram usados para observar a migração de longa distância de células individuais, bem como pequenos agregados de células bacterianas 5,6. Estas câmaras foram concebidas como um-nano-canal microfabricated em uma placa integrada com um lapso de tempo 11,12,13,14 sistema de gravação de imagem. Micro fl dispositivos câmara uidic oferecem várias vantagens para estudar o comportamento movimento e célula-célula interações de bactérias: (i) fornece uma plataforma integrada com múltiplas capacidades de canal; (Ii) que pode examinar os movimentos e agregações de células individuais nas características de nano-escala de bactérias; (Iii) que permite m diretaicroscopic gravação de imagem de células bacterianas e análises de lapso de tempo, (iv) ele fornece observações espaciais e temporais de longo prazo de populações individuais e / ou de bactérias em um micro-ambiente; (V) a taxa de fluxo de meio de cultura em um canal pode ser controlada com precisão e (VI), apenas um muito pequeno volume (1 ml) de meio de cultura é necessário para cada experiência.
Recentemente, o micro fl uidic fluxo do sistema foi utilizado para investigar o comportamento de células bacterianas sob diferentes microambientes 14,15,16. A adesividade e o anexo de superfície do E. coli 15, X. fastidiosa 16 e Acidovorax citrulli 14 em superfícies de vidro foram avaliados através de câmaras uidic micro fl. A formação de agregação e biofilme mediada por tipo pili IV do Acidovorax citrulli foram analisados 14. Além disso, o movimento de A. citrulli observado sob fl uxo cs condições demonstraram que o pili de tipo IV podem desempenhar papéis importantes na colonização e a propagação de A. citrulli nos vasos do xilema sob seiva fluxo condições. Os motilidades espasmos de Pseudomonas aeruginosa e X. fastidiosa células foram observadas com sucesso contra uma corrente de fluido numa câmara de fluxo microfabricado 5,6,17. Pilus de tipo IV deficiente PilB e pilQ mutantes de X. fastidiosa foram encontrados para alterar profundamente a velocidade da contraindo motilidade nas condições fl uxo em micro dispositivos uidic fl 5,6,18. Os estudos realizados sobre a adesão bacteriana e motilidade em dispositivos uidic fl micro indicaram que as câmaras uidic micro fl são particularmente adequadas para analisar a motilidade contrair-se e a migração das bactérias mediada por pili in vitro. Estes resultados explicam o mecanismo de migração mediada por espasmos que facilita a ligação célula-célula, a agregação e a colonização dentroo anfitrião, eventualmente, levar a infecção sistémica.
Pil-Chp operon de X. fastidiosa contém pilG, Pili, pilJ, Comprimido, CHPB e CHPC que a transdução do sinal de codificação vias 20. Os quimiorreceptores transmembranares ligar estímulos químicos no domínio periplasmático e activar uma cascata de sinalização na sua porção citoplasmática para controlar, em última análise da motilidade espasmos bacteriana. No operão Pil-cogeração de X. fastidiosa, uma PilG proteína fosfo-shuttle é um homólogo de CheY. Em E. coli e P. aeruginosa, CheY é o regulador de resposta de quimiotaxia em sistemas que interagem com as proteínas do motor flagelos 19, 21. Embora as contribuições do operon Pil-Chp em direção a virulência em X. fastidiosa foram examinados 20 recentemente, o papel de pilG no operão quimiotaxia em resposta aos sinais ambientais e regulada pili de tipo IV / motor de X. fastidiosa é UNClear. Para elucidar a visão do regulador de quimiotaxia pilG na actividade da motilidade espasmos de X. fastidiosa, uma câmara de micro uidic FL é utilizado para avaliar a motilidade espasmos dos X. fastidiosa. O pilG de X. fastidiosa é caracterizada pela comparação dos fenótipos de um mutante de deleção Xf ΔpliG, a estirpe complementar XfΔpliG -C e seu tipo selvagem in vitro. Os resultados destacam o papel de pilG na motilidade espasmos de X. fastidiosa.
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Protocol
1. O Fringe periférica de origem bacteriana Colony
- Crescer X. fastidiosa (Xf) Temecula 22 de tipo selvagem, mutante de deleção pilG Xf ΔpliG (usando estratégia de deleção anteriormente descritos 23), e a sua complementar XfΔpliG -C (usando previamente descrito estratégia de complementação genética baseada no cromossoma 24) na PD2 de agar com meio placas 25 a 28 ° C durante 5-7 dias.
- Celofane autoclave (1 x 1 cm2) em água a 121 ° C (249 ° F) durante 15 min. Pegue um pedaço de celofane, drenar a água tocando em um canto do celofane em uma placa de Petri vazia, com cuidado colocar o celofane mais de 15% da superfície de agar e ar seco.
- Pegar indivíduo X. colónias fastidiosa com estéril palitos arredondadas e células no local assepticamente em uma folha esterilizada de celofane sobreposto ao 15% da superfície do agar nas placas de ágar. Incubar a placas a 28 ° C durante 2-3 dias.
- Examinar a morfologia da borda das colónias utilizando um microscópio de dissecação com uma lente objectiva 2X e uma lente ocular 10X. Fotografar a orla periférica em torno de colónias.
2. Microscopia e microfluídicos Fluxo Chambers
- Fabricar dispositivos microfluídicos utilizando procedimentos de foto-litográfica semelhantes aos descritos anteriormente 5,18. Projetar quatro canais paralelos com software de desenho assistido por computador sobre silício mestre usando métodos de litografia padrão 26.
- Criar as câmaras microfluídicos de mestre de wafer de silício com polidimetilsiloxano (PDMS). Pour PDMS não polimerizados sobre a bolacha de silício mestre e curá-la a 60 ° C durante 1 h. Descole a réplica de PDMS do mestre wafer e aparar a réplica PDMS com uma lâmina em um 22 mm x 40 mm como o mesmo tamanho de uma lamela de vidro.
- Expor a réplica de PDMS, uma lamela de vidro (22 x 40 mm2), e um microscslides ope (51 x 76 mm2) ao plasma de ar a 30 W por 2 min 27. Sanduíche do corpo PDMS entre a lamela de vidro eo vidro de microscópio para construir a câmara uidic fl micro.
- Perfurar um furo (5,5 mm de diâmetro) através do PDMS em cada extremidade do canal modelado. Corte o tubo de borracha de silicone em 12-20 cm de comprimento. Inserir uma extremidade da tubagem de borracha de silicone (5,1 mm de diâmetro externo, 2,1 mm de diâmetro interno, parede de 0,8 mm) em cada extremidade dos canais da réplica de PDMS de abertura, e selá-lo com PDMS não polimerizados a 60 ° C durante 1 h.
- Ligue a outra extremidade do tubo até o fim farpado de conectores luer de plástico. Enrole as câmaras de microfluidos montadas com a folha de alumínio e autoclave los durante 20 min.
- Recolha células de bactérias de X. fastidiosa tipo selvagem, mutante Xf ΔpliG, e complementar XfΔpliG -C através de raspagem, usando inoculação descartáveis laços de placas de meio PD2. Ajustar a densidade celularpara uma densidade óptica de 0,05 a 600 nm em PD2 caldo como descrito anteriormente 23. Recolhe-se o solução da célula bacteriana numa seringa de 1 ml estanque ao gás.
- Montar o dispositivo microfluídico em um palco microscópio invertido. Ligue um tubo de entrada para a seringa estanque ao gás 5 ml contendo PD2 caldo. Montar a 5 ml estanque ao gás seringa com as bombas de seringa.
- Ligue o tubo de saída a um reservatório de resíduos. Manter uma taxa de fluxo de meio de 0,2 mL min -1 durante 30 minutos para estabilizar o sistema.
- Conectar tubos laterais de entrada a uma seringa de 1 ml estanque ao gás que contém a solução da célula bacteriana. Lavar a solução de células bacterianas através do tubo de borracha até que o canal seja atingido. Manter uma taxa de fluxo de meio de 0,2 mL min -1 durante mais 30 minutos, a fim de lavar as células não ligadas da câmara antes da captura da imagem.
- Montar o obturador microscópio sob a parte ajustada ao campo do microscópio para controlar a luz. Ligue o obturador para a co obturadorntrol sistema e ligar o sistema de controlo do obturador para o computador.
- Montar uma câmera digital à porta de vídeo do microscópio e conecte-o ao computador. Executar o software de gravação de lapso de tempo, selecione a função "obturador" do menu, e reconhecer automaticamente o obturador instalado como padrão no software para estabelecer conexões com o obturador com o software.
- Seleccione a função "camera digital" a partir do menu do software de gravação de lapso de tempo para reconhecer automaticamente a câmera digital como o dispositivo de captura padrão no software e estabelecer a comunicação com a câmera digital com o software.
- Localizar as células bacterianas em um dos canais usando 20X de contraste de fase óptica e, em seguida mudar para a lente da objectiva de 40X, antes da captura da imagem.
- Executar o software de gravação de lapso de tempo, selecione a função "aquisição de imagem" usando parâmetros padrão a partir do menu para adquirir as imagens do microscópio.Em seguida, abra a função "Adquirir time-lapse" e defina o intervalo de tempo para 30 seg 5,18,28, com duração de 6-24 horas, dependendo experiência necessária para observar se contraindo motilidade dos X. fastidiosa 5,18,28. Clique em "OK" para iniciar a gravação de lapso de tempo. Clique em "função de pilha" a partir do menu, selecione "salvar como" para empilhar as imagens na pasta de destino no computador depois de terminar a gravação.
- Para múltiplos canais, capturar imagens de lapso de tempo a partir do primeiro canal a cada 30 seg durante 6 horas. Mover a lente objectiva do microscópio para o próximo canal para localizar as células alvo. Repita a função de lapso de tempo, como descrito acima para capturar imagens em cada um dos quatro canais sequencialmente se experimento está configurado para utilizar quatro canais. Continue a captura de imagens de lapso de tempo para até três dias consecutivos. Todas as experiências foram realizadas à temperatura ambiente (23 ± 2 ° C).
- Compilar as imagens de lapso de tempo em umarquivo de vídeo usando o software de imagem de gravação de lapso de tempo. Executar o software de gravação de lapso de tempo, clique em "função Stack" no menu e selecione "função de pilha aberta" para abrir os arquivos empilhados a partir do computador.
- Inicie a função de "fazer cinema" do módulo de pilha, a seleção de todas as imagens e escolher o formato de saída "AVI". Clique em "Salvar como" para armazenar o arquivo de vídeo na pasta de destino no computador.
- Seleccione os filmes compilados a partir da pasta de destino no computador e reproduzi-los. Em seguida, observe a motilidade das células individuais através da visualização resultante da atividade espasmos motilidade de células de bactérias nos arquivos de vídeo gerados.
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Representative Results
A presença de uma colónia franja periférica indicativo de tipo IV mediada pelo pilus motilidade espasmos, foi observada nas colónias de X. fastidiosa tipo selvagem e complementar estirpe Xf ΔpliG -C (Figura 1). Mutante XfΔpliG, no entanto, não exibiram uma franja ao redor da periferia de colónias (Figura 1). Imagens de lapso de tempo de células bacterianas em câmaras de fluxo nano-microfluídico revelou que contraindo motilidade foi observada em ambas tipo selvagem X. fastidiosa ea complementar XfΔpliG -C (Supplemental V1, V3), enquanto que as células mutantes XfΔpilG não apresentou espasmos motilidade durante todo o experimento (Supplemental V2). As células de mutante XfΔpilG formada relativamente pequenos agregados soltos em caldo PD2 (Suplementar V2). Em contraste, células de X. fastidiosa tipo selvagem e complementar XfΔpilG- C d eveloped agregados maiores em caldo PD2 (Figura 2, (Suplementar V1, V3).
Figura 1:. A franja periférica da colónia bacteriana Colony características de margem de X. fastidiosa de tipo selvagem, mutante Xf ΔpilG, e complementar XfΔpilG- C cultivadas em PD2 agar coberto com um lençol esterilizado de celofane. Com a exceção de XfΔpilG mutante, todas as colônias exibiu uma franja periférica, indicando tipo IV mediada por pilus motilidade espasmos. Fotos foram tiradas depois de 5 dias de crescimento em meio de cultura. Ampliação bar, 0,5 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 2: A motilidade espasmos de X. células fastidiosa em câmara de fluxo nano-microfluídico. A motilidade espasmos de todas as células estirpe testada foi gravado durante 6 dias de observação. As avaliações foram realizadas a partir de três segmentos de vídeo independentes. bar ampliação, de 20 um.
Nota: A motilidade espasmos de X. células fastidiosa é caracterizado por um movimento de célula única em superfícies de vidro através da extensão, apego e retração do pili polar tipo IV. Observou-se a única célula na migração preferencialmente contra uma corrente de fluido em uma câmara de fluxo microfabricated. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Suplementar Figura 1: Uma câmara de fluxo microfluidico de quatro canais. Cada canal com a mídia em e meios de comunicação fora conectores em cada extremidade. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Filme Suplementar 1: Espasmos motilidade. (Clique direito a download). Twitching do tipo selvagem X. fastidiosa em uma câmara de fluxo microfluídico.
Filme Suplementar 2: Twitchin prejudicadag motilidade. (Clique direito a download). Motilidade de Xf mutante. XfΔpilG observado na câmara de fluxo amicrofluidic.
Suplementar Filme 3: Recuperado motilidade espasmos. (Clique direito a download). Espasmos motilidade do Xf estirpe complementar. XfΔpilG-C observada em uma câmara de fluxo microfluídico.
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Discussion
Neste estudo, caracteriza o comportamento de movimento de X. fastidiosa PilG mutante Xf ΔpilG e suas complementares estirpes XfΔpilG- C em recém-projetado de múltipla nano-canal paralelo micro câmaras fl uidic. As câmaras uidic recém-projetado micro fl pode ter até quatro câmaras paralelas com 100 um nano-canal de largura em comparação com modelos anteriores, com apenas uma única de 50 m de largura do canal 18. A melhoria mais ampla nano-canal facilita a introdução de células bacterianas com o fluxo da mídia. Além disso, esta câmara de microfluídica é 1) simples de construir e montar; 2) relativamente barato; e 3) facilmente aplicável a diferentes requisitos experimentais. Como resultado, este desenho da câmara permite a observação a longo prazo dos movimentos das células bacterianas com variedades microambiente experimental.
Estabilizar o fluxo das correntes ThrouGH o canal uidic micro FL é o passo crítico para a criação de um fluxo de micro-fl microambiente uidic intacta para a observação da motilidade das células bacterianas sob uma variedade de condições experimentais. A lavagem das câmaras uidic fl micro e tubagem de ligação com os meios de comunicação antes da introdução das células bacterianas é também um passo importante para estabilizar o fluxo na câmara. No entanto, a elevada velocidade do fluxo irá limpar as células bacterianas para fora da câmara sem células retendo ao longo da câmara. A velocidade adequada dos meios que fluem através dos canais uidic fl micro necessita de ser ajustada utilizando uma bomba de seringa. Durante as experiências no presente estudo, o fluxo foi ajustado e estabilizado pela bomba em 0,2 a 1 mL min-1 durante pelo menos 30 min antes da introdução das células bacterianas no interior do canal. Uma vez que as células foram introduzidas nos canais uidic fl micro, a forma de fluxo foi mantido a 0,2 ul mem -1 durante 30 a 60 minutos para estabilizar o sistema e remover as células nonattached. É muito importante para estabilizar o fluxo de e para manter o fundo claro, a fim de observar o movimento das células bacterianas. As imagens foram capturadas a cada 30 seg para confirmar a atividade espasmos motilidade das células introduzidas mantendo uma velocidade de fluxo constante em 0,2 min mL -1. Se as experiências a necessidade de recolher as células bacterianas na câmara, as células podem ser lavadas para fora, aumentando gradualmente as taxas de fl uxo de meios 0,2-110 mL min -1, ajustando a velocidade da bomba de seringa.
As atividades de células bacterianas nas câmaras uidic fl micro foram avaliados através do microscópio invertido usando 40X óptica de contraste de fase e imagens de lapso de tempo gravados com uma câmera digital, que foi controlado pelo software de imagem. A velocidade de fluxo e o intervalo de tempo para a captura de imagem pode ser ajustado em conformidade com experimrequisitos ental. No entanto, na maioria dos casos, a velocidade de fluxo para uma taxa de fluxo de meio é ajustado para 0,2 ul min -1 imagens com lapso de tempo a cada 30 seg durante as células bacterianas mediada pelo pilus. Em outros casos, se o ritmo do fluxo médio é aumentada para 0,1 ul min -1 no decurso da experimentação, o comportamento das células bacterianas será gravada por captura de imagens a cada 10 a 15 seg em conformidade. As imagens de lapso de tempo foram tomados a cada 30 seg, com duração de 6-24 horas e guardado como um imagens de origem arquivos para cada estirpe testada. Os vídeos foram então cumpridas a partir das imagens tiradas de 6-8 horas de cada estirpe, que mostraram fenótipos de contraste em contraindo motilidades entre o tipo mutante e selvagem / complementar cepas (Supplemental V1, V2, V3).
O significado das fl dispositivos câmara uidic nano-micro mais de macroescala de placas paralelas câmaras de fluxo inclui o exame direto dos movimentos e agregações de cantarcélulas le de bactérias. Além de baixo custo 5 e baixos requisitos de reagentes e volume da amostra, as vantagens de câmaras uidic micro fl são a facilidade de construção de um microambiente ow fl para a cultura bacteriana e controle preciso sobre a taxa de fl fl uid ow. Os vários canais paralelos permitir a observação de estirpes bacterianas diferenciais numa única configuração da experiência que fornece dados compatíveis para análise. A motilidade espasmos independente de flagelar das bactérias com a pili polar é particularmente adequado para análise nesta câmara uidic fl nano-micro. No entanto, esta câmara de micro uidic FL é menos adequado para o movimento bacteriana dependente de flagelar, em que o movimento de bactérias é geralmente demasiado rápido e apresenta direcções aleatórias. Esta limitação, por vezes, pode ser comprometida por ajustamento da taxa de fluxo de forma a 0,05 min -1 ul e alterando a taxa de captura de imagem com lapso de tempo a cada 1 a 2 segundos durante 1 h para Analyze os movimentos das bactérias mediada por flagelar no ambiente em escala nano.
Dispositivos de câmara microfluídicos aqui utilizadas fornecem evidência visual direto para avaliação funcional do PilG responsável pelo comportamento de movimento in vitro. Além disso, este estudo também mostra que a agregação de células de células através da motilidade espasmos é essencial para a formação de biofilme, de sinalização e patogenicidade em X. fastidiosa. Visualização de bactérias se contraindo motilidade por dispositivos microfluídicos fornece uma nova abordagem para estudar a função de genes envolvendo comportamento em bactérias que não é facilmente medido por outros métodos de ensaio. Esta abordagem pode ser aplicada a outros sistemas bacterianos. Os dispositivos de microfluidos da câmara de fornecer um sistema de circulação para caracterizar o comportamento fisiológico de células bacterianas associadas com anexos célula-célula, agregações celulares, os padrões de movimento e formação de biofilmes.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Este estudo foi apoiado pelo United States Department of Agriculture, Agricultural Research Service. nomes comerciais ou produtos comerciais nesta publicação são mencionados somente para a finalidade de fornecer informações específicas e não implica qualquer recomendação ou conselho pelo Departamento de Agricultura dos Estados Unidos. O USDA é um fornecedor de oportunidades iguais e empregador.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biology materials | |||
| X. fastidiosa (Xf) Temecula wild type | Costa, H. S., et al., 2004 22 | ||
| pilG deletion mutant XfΔpliG | Shi, X. Y., et al., 2007 26 | ||
| pilG complementary strain XfΔpliG-C | Davis, M. J., et al. 1998 23 | ||
| Physical materials and equipment | |||
| Disposable inoculating loops | VWR international, Radnor, PA | #22-363-607 | quantitative procedures such as bacterial collection |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning Corporation | #0002709226 | Sylgard 184 silicone Elastomeric Kits |
| AmScope MD2000 digital camera | AmScope, Irvine, CA | SE305R-AZ-E | Image, video recording and measurement |
| Tubes line | Edgewood, NY | #T4300 | Connected to the syringe and microfluidic chamber |
| Plastic luer connectors | Edgewood, NY | Connected to the syringe and microfluidic chamber | |
| Syringe pumps | Pico Plus, Harvard Apparatus, MA | #702209 | The flow rate can be adjusted while the pump is running. |
| Syringes | Gastight, Hemilton Company, Reno, NV | #1005 | Provide the flowing broth |
| Inverted Olympus IMT-2 microscope | Olympus | IMT-2 FLuoro PHase | Image observation and recording |
| SPOT-RT digital camera | Diagnostic Instruments, Inc., MI | RT230 | Image, video recording and measurement |
| Microscope Shutter | The UNIBLITZ, US | #LS2T2 | Control camera’s exposure time |
| Microscope Shutter Control system | The UNIBLITZ, US | VCM-D1 | VCM-D1 Single Channel CE/UL/CSA Approved Shutter Driver |
| MetaMorph Image software | Universal Imaging Corp., PA | Real-time super-resolution image processing |
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