Summary
In dieser Studie wurde ein Nano mikrofluidischen Strömungskammer wurde verwendet , um die Zuckungen Motilität von Xylella fastidiosa zu visualisieren und funktionell zu charakterisieren, ein Bakterium , das Pierce-Krankheit in Weinrebe verursacht.
Abstract
Xylella fastidiosa ist ein Gram-negative nicht-flagellated Bakterium , das eine Reihe von wirtschaftlich bedeutenden Pflanzenkrankheiten verursacht. Die Zuckungen Motilität bietet X. fastidiosa ein Mittel für den Ferninnerbetrieblichen Bewegung und Kolonisation, einen Beitrag zu Pathogenität in X. fastidiosa. Die Zuckungen Motilität von X. fastidiosa wird von Typ IV - Pili betrieben. Typ IV - Pili von Xylella fastidiosa werden durch Pilg geregelt, einem Chemotaxis - Regler in Pil-Chp Operon für Proteine kodiert , die mit Signaltransduktionswege beteiligt sind. Um die Rolle von Pilg im Zucken Motilität von X. aufzuklären fastidiosa, ein Pilg defizienten Mutante Xf ΔpilG und seinen komplementären Stamm XfΔpilG- C enthält nativen Pilg entwickelt. Ein mikrofluidischen Kammern mit einem Zeitraffer-Bildaufnahmesystem integriert wurde verwendet , Zucken Motilität in XfΔp zu beobachtenILG, XfΔpilG- C und seine Wildtyp - Stamm. Unter Verwendung dieses Aufzeichnungssystem ermöglicht es langfristige räumliche und zeitliche Beobachtungen der Aggregation, Migration einzelner Zellen und Populationen von Bakterien über Zucken Motilität. X. fastidiosa Wildtyp und komplementäre XfΔpilG- C - Stamm zeigte typische Zucken Motilität Eigenschaften direkt in den mikrofluidischen Strömungskammern beobachtet, während Mutante XfΔpliG die Zuckungen defizienten Phänotyp aufwiesen. Diese Studie zeigt , dass Pilg zur twitching Motilität von X. trägt fastidiosa. Die mikrofluidischen Strömungskammer für das Beobachten twitching Motilität als Mittel verwendet.
Introduction
Xylella fastidiosa ist ein Gram-negative nicht gegeißelt, pathogene Bakterium , das eine Reihe von wirtschaftlich wichtigen Pflanzenkrankheiten verursacht, einschließlich Pierce-Krankheit in Weinrebe (Vitis vinifera L.) 1,2, 3. Dieses Bakterium ist begrenzt auf den wasserführenden Xylem Schiffe. Die Infektion der Weinrebe bewirkt , dass die Blockade der Xylemgefäße und führt zu Wasserstress und Mangelernährung 3. Erfolgreiche Besiedelung hängt von der Fähigkeit des Bakteriums von der anfänglichen Stelle der Infektion mit dem Rest der Anlage 3 zu bewegen. Zucken Motilität ist ein Mittel der Flagellen-unabhängige Bakterien Bewegung durch die Erweiterung, Anhaftung und das Zurückziehen des polaren Typ IV - Pili 4 , die in X charakterisiert wurde fastidiosa 5,6,7.
Die Zuckungen Motilität wurde durch Laser - Pinzette und Rasterkraftmikroskopie (AFM) 8,9,10 beobachtet. Unter Verwendung dieser Techniken twitching Motilitäten von Typ - IV - Pili von N. erzeugt gonorrhoeae und P. aeruginosa wurden durch fl uorescently Kennzeichnung Pili charakterisiert und ihre Bewegungen mikroskopisch zu erfassen. Obwohl beide Verfahren die Haftkraft der einzelnen Bakterien detailliert sind, sind die Verfahren kompliziert und zeitraubend 9,10. Die Mikro fluidischen Kammern wurden verwendet , 5,6 Fern Migration von einzelnen Zellen sowie kleine Aggregate von Bakterienzellen zu beobachten. Diese Kammern wurden als mikrostrukturierte -Nano-Kanal in einer Platte gestaltet , integriert mit einem Zeitraffer-Bildaufnahmesystem 11,12,13,14. Micro fluidischen Kammer Geräte mehrere Vorteile für die Untersuchung der Bewegungsverhalten und Zell-Zell-Wechselwirkungen von Bakterien bieten: (i) es stellt eine integrierte Plattform mit Mehrkanal-Fähigkeiten; (Ii) kann es die Bewegungen und Aggregationen von einzelnen Zellen in den nanoskaligen Eigenschaften von Bakterien zu untersuchen; (Iii) es erlaubt die direkte microscopic Bildaufzeichnung von Bakterienzellen und Zeitraffer-Analyse, (iv) es bietet langfristige räumliche und zeitliche Beobachtungen einzelner und / oder Populationen von Bakterien in einer Mikro-Umgebung; (V) die Strömungsgeschwindigkeit des Kulturmediums in einen Kanal genau gesteuert werden kann, und (vi) nur ein sehr kleines Volumen (1 ml) des Kulturmediums wird für jedes Experiment erforderlich.
Vor kurzem hat die Mikro fluidischen Strömungssystem wurde das Verhalten von Bakterienzellen unter verschiedenen Mikroumgebungen 14,15,16 zu untersuchen , beschäftigt. Die Haftfestigkeit und die Oberflächenbefestigung von E. coli 15, X. fastidiosa 16 und Acidovorax citrulli 14 auf Glasoberflächen wurden unter Verwendung von Mikro fluidischen Kammern beurteilt. Die Aggregation und Biofilm - Bildung durch Typ IV - Pili von Acidovorax citrulli vermittelt wurden 14 analysiert. Ferner kann die Bewegung der A. citrulli beobachtet unter fl ow cie Bedingungen gezeigt , dass der Typ IV - Pili eine wichtige Rolle bei der Besiedlung spielen kann und von A. verbreiten citrulli in Xylemgefäße unter dem Splint fl ow Bedingungen. Die Zuckungen Motilitäten von Pseudomonas aeruginosa und X. fastidiosa Zellen wurden gegen einen Flüssigkeitsstrom in einer mikrofabrizierten Strömungskammer 5,6,17 erfolgreich beobachtet. Typ - IV - Pili - defizienten pilB und pilQ Mutanten von X. fastidiosa wurden 5,6,18 die Geschwindigkeit der Zucken Motilität unter den Strömungsbedingungen in Mikro fluidischen Geräten zu tiefgreifend verändern gefunden. Die Studien , die auf bakterielle Adhäsion und Motilität in Mikro fluidischen Vorrichtungen zeigten , dass die Mikro fluidischen Kammern sind besonders geeignet für die Analyse der Zuckungen Motilität und Migration von Pili-vermittelten Bakterien in vitro. Diese Ergebnisse erklären die Zuckungen-vermittelte Migration Mechanismus, der Zell-Zell-Bindung erleichtert, Aggregation und Kolonisierung innerhalbder Wirt, führen schließlich zu einer systemischen Infektion.
Pil-CHP - Operon von X. fastidiosa enthält Pilg, Pili, pilJ, pille, chpB und KWKK die Transduktion kodieren Signal 20 Pfade. Die Transchemorezeptoren binden chemische Reize in den periplasmatischen Domäne und aktivieren eine Signalkaskade in ihrem Cytoplasma-Teil, um schließlich bakterielle Zucken Motilität kontrollieren. Im Pil-CHP - Operon von X. fastidiosa, ein Phospho-Shuttle - Protein Pilg ist ein Homolog zu CheY. In E. coli und P. aeruginosa, ist CheY die Antwortregulator in Chemotaxis - Systeme , die 19, 21 mit den Geißeln Motorproteine interagieren. Obwohl die Beiträge des Pil-Chp Operon zu Virulenz in X. fastidiosa wurden kürzlich 20, die Rolle der Pilg in Chemotaxis - Operon in Reaktion auf die Umgebungssignale und geregelt / Motor Typ IV - Pili von X. sucht fastidiosa ist unclear. Um die Einsicht der Chemotaxis Regler Pilg in der Aktivität der Zucken Motilität von X. aufzuklären fastidiosa, einem Mikro fluidischen Kammer verwendet , um die Zuckungen Motilität von X. zu beurteilen fastidiosa. Die Pilg von X. fastidiosa wird durch den Vergleich der Phänotypen einer Deletionsmutante Xf ΔpliG, komplementären Stamm XfΔpliG -C und ihrem Wildtyp in vitro charakterisiert. Die Ergebnisse unterstreichen die Rolle der Pilg im Zucken Motilität von X. fastidiosa.
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Protocol
1. Der Peripheral Fringe von Bakterienkolonie
- Wachsen X. fastidiosa (Xf) Temecula Wildtyp 22, mutant Pilg Deletion Xf ΔpliG (unter Verwendung von zuvor beschriebenen Löschstrategie 23) und sein komplementäres XfΔpliG -C (unter Verwendung von zuvor Chromosoms basierte genetische Komplementierung Strategie 24 beschrieben) auf PD2 Medium Agarplatten 25 bei 28 ° C für 5-7 Tage.
- Autoklav Cellophan (1 x 1 cm 2) in Wasser bei 121 ° C (249 ° F) für 15 min. Pick-up ein Stück Zellophan, lassen Sie das Wasser durch das Berühren einer Ecke Zellophan auf einem leeren Petrischale, legen sorgfältig das Zellophan über 15% der Agar-Oberfläche und der Luft trocknen.
- Pick - up einzelne X. fastidiosa Kolonien mit sterilen Zahnstochern gerundet und Spot - Zellen aseptisch auf einem sterilisierten Blatt Cellophan auf die 15% der Agar - Oberfläche in den Agarplatten überlagert. Die Plattes bei 28 ° C für 2-3 Tage.
- Überprüfen Sie die Rand Morphologie der Kolonien ein Binokular mit einem 2X Objektiv und einem 10fach Augenlinse verwendet wird. Fotografieren Sie das periphere Rand um Kolonien.
2. Mikroskopie und Mikrofluidik Strömungskammern
- Fabrizieren Mikrofluidik - Vorrichtungen unter Verwendung photolithographischer Verfahren ähnlich den zuvor beschriebenen 5,18. Entwerfen vier parallele Kanäle mit computergestützten Design - Software auf dem Master - Silizium - Wafer unter Verwendung von Standard - Lithographieverfahren 26.
- Erstellen Sie die mikrofluidischen Kammern aus Silizium-Wafer-Master mit Polydimethylsiloxan (PDMS). Pour unpolymerisierten PDMS über dem Siliziumwafer Master und härten bei 60 ° C für 1 Stunde. Ziehen Sie die PDMS-Replik aus dem Wafer-Master und schneiden Sie die PDMS-Nachbildung mit einer Klinge in einem 22 mm x 40 mm als die gleiche Größe eines Deckglas ab.
- Setzen Sie die PDMS - Replik, ein Deckglas (22 x 40 mm 2), und eine Microscope Schieber (51 x 76 mm 2) an der Luft - Plasma bei 30 W für 2 min 27. Sandwich der PDMS Körper zwischen dem Deckglas und dem Glasmikroskop des Mikro fluidischen Kammer zu bauen.
- Bohren Sie ein Loch (5,5 mm Durchmesser) durch die PDMS an jedem Ende des gemusterten-Kanal. Schneiden Sie den Silikongummischlauch in 12-20 cm lang. Stecken Sie ein Ende des Silikongummischlauch (5,1 mm Außendurchmesser, 2,1 mm Innendurchmesser, 0,8 mm Wand) in jede Öffnung Ende der Kanäle des PDMS-Replik, und verschließen Sie diese mit unpolymerisierten PDMS bei 60 ° C für 1 Stunde.
- Schließen Sie das andere Ende des Schlauchs am stacheligen Ende der Kunststoff-Luer-Anschlüsse. Wickeln der zusammengebauten mikrofluidischen Kammern mit der Aluminiumfolie und autoklaviert werden sie für 20 min.
- Sammeln Bakterienzellen von X. fastidiosa Wildtyp, Mutante Xf ΔpliG und komplementäre XfΔpliG -C über Schaben, Einweg - Impf mit Loops aus PD2 Mediumplatten. Passen Sie die Zelldichtezu einer optischen Dichte von 0,05 in PD2 Brühe bei 600 nm wie zuvor beschrieben 23. Sammeln Sie die Bakterienzelllösung in eine 1 ml Spritze Gasdichte.
- Montieren Sie die Mikrofluidik-Vorrichtung auf einem inversen Mikroskop Bühne. Schließen Sie ein Einlassrohr zum 5 ml Gasdichte Spritze mit PD2 Brühe. Den 5 ml Spritze Gasdichte mit den Spritzenpumpen.
- Verbinden Sie den Abflussrohr in einen Abfallbehälter. Pflegen eine mittlere Strömungsgeschwindigkeit von 0,2 & mgr; l min -1 für 30 min zur Stabilisierung des Systems.
- Verbinden Seiteneinlaßrohre an eine 1 ml Spritze, die die Gasdichte Bakterienzelllösung enthält. Spülen Sie die bakterielle Zelllösung durch den Gummischlauch, bis der Kanal erreicht ist. Pflegen Sie eine mittlere Strömungsgeschwindigkeit von 0,2 & mgr; l min -1 für weitere 30 Minuten , um ungebundene Zellen aus der Kammer vor der Bildaufnahme zu spülen.
- Bringen Sie den Mikroskop Verschluss unter dem Feld angepasst Teil des Mikroskops das Licht zu steuern. Schließen Sie den Verschluss auf den Auslöser control System und eine Verbindung mit dem Computer das Rolltor-Steuerungssystems.
- Montieren Sie eine Digitalkamera an den Videoanschluss des Mikroskops und verbinden Sie es mit dem Computer. Führen Sie die Zeitraffer-Aufnahme-Software, wählen Sie die "Shutter" Funktion aus dem Menü, und erkennen automatisch die installierte Shutter als Standard in der Software-Verbindungen mit dem Verschluss mit der Software zu etablieren.
- Wählen Sie die "Digitalkamera" Funktion aus dem Menü des Zeitraffer-Aufnahme-Software, um automatisch die Digitalkamera als Standard-Capture-Gerät in der Software erkennen und die Kommunikation mit der Digitalkamera mit der Software.
- Suchen Sie die Bakterienzellen in einem der Kanäle 20x Phasenkontrast-Optik verwenden, schalten dann auf die 40-fach Objektivlinse vor der Bilderfassung.
- Führen Sie die Zeitraffer-Aufnahme-Software, wählen Sie die "Bildaufnahme" -Funktion Standardparameter aus dem Menü die Bilder aus dem Mikroskop zu erwerben.Dann öffnen Sie den "Acquire Zeitraffer-Funktion" und auf 30 sec 5,18,28 für die Dauer von 6-24 Stunden , je nach Experiment benötigt Zucken Motilität von X. das Zeitintervall zu beobachten fastidiosa 5,18,28. Klicken Sie auf "OK", um die Zeitraffer-Aufnahme zu starten. Klicken Sie auf "Stapelfunktion" aus dem Menü wählen Sie "Speichern unter" die Bilder im Zielordner auf dem Computer zu stapeln, nachdem die Aufnahme wird beendet.
- Für mehrere Kanäle, Zeitraffer-Bilder aus dem ersten Kanal erfassen alle 30 Sekunden für 6 Stunden. Bewegen der Objektivlinse des Mikroskops auf den nächsten Kanal der Zielzellen zu lokalisieren. Wiederholen Sie die Zeitraffer-Funktion wie oben beschrieben, Bilder in jedem der vier Kanäle sequentiell zu erfassen, wenn Experiment wird bis zu vier Kanäle nutzen. Fortsetzung der Zeitraffer-Bildaufnahme für so lange wie drei aufeinander folgenden Tagen. Alle Experimente wurden bei Raumtemperatur (23 ± 2 ° C) durchgeführt.
- Stellen Sie die Zeitraffer-Bilder in einVideodatei die Zeitrafferaufnahme Imaging-Software. Führen Sie Zeitraffer-Aufnahme-Software, klicken Sie auf "Stapelfunktion" aus dem Menü, und wählen Sie "Open-Stack-Funktion", um die gestapelten Dateien vom Computer öffnen.
- Starten Sie den "Make Movie" Funktion aus dem Stack-Modul, alle Bilder auswählen und das "AVI" Ausgabeformat auswählen. Klicken Sie auf "Speichern unter" auf dem Computer die Videodatei im Zielordner zu speichern.
- Wählen Sie die kompilierten Filme aus dem Zielordner auf dem Computer und spielen sie. Dann beobachten die Beweglichkeit der einzelnen Zellen durch die resultierende Visualisierung der Zucken Motilität Aktivität von Bakterienzellen in den erzeugten Videodateien.
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Representative Results
Das Vorhandensein einer peripheren Kolonie fringe indikativ für Typ IV - Pilus-vermittelten twitching Motilität wurde in den Kolonien von X. beobachtet fastidiosa Wildtyp und komplementäre Xf ΔpliG -C Stamm (Abbildung 1). Mutant XfΔpliG zeigen jedoch nicht Fransen um den Umfang der Kolonien (Abbildung 1). Zeitraffer-Bildgebung von Bakterienzellen in Nano mikrofluidischen Strömungskammern ergab , dass Zucken Motilität sowohl in Wildtyp X. beobachtet wurde fastidiosa und die komplementäre XfΔpliG -C (Supplemental V1, V3), während XfΔpilG mutierten Zellen zeigten keine Motilität während des gesamten Experiments (Supplemental V2) zucken. Die Zellen von mutierten XfΔpilG gebildet relativ kleine lose Aggregate in PD2 Brühe (Supplemental V2). Im Gegensatz dazu Zellen X. fastidiosa Wildtyp und komplementäre XfΔpilG- C d eveloped größere Aggregate in PD2 broth (Abbildung 2, (Supplemental V1, V3).
Abb . 1: Der periphere Rand der Bakterienkolonie Colony Marge Eigenschaften von X. fastidiosa von Wildtyp, Mutante Xf ΔpilG und komplementäre XfΔpilG- C auf PD2 Agar mit einem sterilisierten Bogen aus Zellophan bedeckt gewachsen. Mit Ausnahme der mutierten XfΔpilG zeigten alle Kolonien einen peripheren Rand, gibt den Typ IV Pili-vermittelte Zucken Motilität. Bilder wurden nach 5 Tagen Wachstum auf Kulturmedium aufgenommen. Vergrößerung bar, 0,5 mm. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Abbildung 2: Das Zucken Motilität von X. fastidiosa Zellen in Nano mikrofluidischen Strömungskammer. Die Zuckungen Motilität aller getesteten Stamm - Zellen wurde während 6 Tagen der Beobachtung aufgezeichnet. Die Bewertungen wurden von drei unabhängigen Videosegmente durchgeführt. Vergrößerung bar, 20 & mgr; m.
Hinweis: Die Zucken Motilität von X. fastidiosa Zellen wird durch Einzelzellbewegung über Glasflächen durch die Verlängerung, Anhaftung und das Zurückziehen des polaren Typ IV - Pili gekennzeichnet. Die einzelne Zelle in der Migration bevorzugt gegen einen Fluidstrom in einem mikrostrukturierten Strömungskammer beobachtet. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Ergänzende Abbildung 1: Ein Vierkanal - mikrofluidischen Strömungskammer. Jeder Kanal mit Medien in und Medien heraus Anschlüsse an jedem Ende. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Supplemental Film 1: Zucken Motilität. (Rechtsklick zum Download). Zucken von Wildtyp X. fastidiosa in einer mikrofluidischen Strömungskammer.
Supplemental Movie 2: Beeinträchtigte Twitching Beweglichkeit zu verbessern. (Klicken Sie auf der rechten herunterladen). Motilität von Xf Mutante. XfΔpilG beobachtet in amicrofluidic Strömungskammer.
Supplemental Movie 3: Zurückzucken Beweglichkeit zu verbessern . (Rechtsklick zum Download). Zucken Motilität von Xf komplementären Stamm. XfΔpilG-C beobachtet in einer mikrofluidischen Strömungskammer.
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Discussion
In dieser Studie charakterisierten wir das Bewegungsverhalten von X. fastidiosa Pilg Mutante Xf ΔpilG und seinen komplementären XfΔpilG- C - Stämme in neu mehrere parallel-Nano-Kanal Mikro fluidischen Kammern ausgelegt. Die neu entwickelten Mikro fluidischen Kammern können bis zu vier parallelen Kammern haben mit 100 & mgr; m Nanokanal in der Breite im Vergleich zu früheren Konstruktionen mit nur einem einzigen 50 & mgr; m breiten Kanal 18. Die verbesserte breiteren Nanokanal erleichtert die Einführung von Bakterienzellen mit der Medien, die fließt. Darüber hinaus ist diese Kammer Mikrofluidik 1) einfach zu bauen und zu montieren; 2) relativ preiswert; und 3) leicht anwendbar auf experimentellen Anforderungen variiert. Im Ergebnis ermöglicht diese Kammer-Konstruktion, die langfristige Beobachtung der Bewegungen der Bakterienzellen unter Sorten experimentellen Mikro.
Die Stabilisierung der Strömung der Ströme through der Mikro fluidischen Kanal ist der kritische Schritt eine intakte fließenden-micro fluidischen Mikroumgebung für die Beobachtung der Motilität der Bakterienzellen unter einer Vielzahl von experimentellen Umgebungen zu schaffen. Die Spülung von Mikro fluidischen Kammern und Verbindungsschläuche mit den Medien vor der Einführung von Bakterienzellen ist auch ein wichtiger Schritt, um die Strömung in der Kammer zu stabilisieren. Jedoch wird die hohe Geschwindigkeit der Strömung spülen die Bakterienzellen aus der Kammer ohne Zellen im Verlauf der Kammer zurückzuhalten. Die geeignete Geschwindigkeit der Medien durch die Mikro fluidischen Kanäle fließen muss angepasst werden, um eine Spritzenpumpe. Während der Experimente in dieser Studie wurde die fließt , durch die Pumpe bei 0,2 bis 1 & mgr; l min -1 für mindestens 30 min vor dem Einbringen der Bakterienzellen in den Kanal eingestellt und stabilisiert. Sobald die Zellen in die Mikro fluidischen Kanäle eingeführt wurden, fl das Medium ow wurde bei 0,2 & mgr; l m beibehaltenin - 1 für 30 bis 60 min , das System und entfernen nicht gebundenen Zellen zu stabilisieren. Es ist sehr wichtig, um den Fluss zu stabilisieren und den Hintergrund klar zu halten, um die Bewegung der Bakterienzellen zu beobachten. Die Bilder wurden alle 30 Sekunden zu kon fi rm die Zucken Motilität Aktivität der eingesetzten Zellen Aufrechterhaltung einer konstanten Strömungsgeschwindigkeit bei 0,2 & mgr; l min -1 erfasst. Wenn die Experimente , die die Sammlung der Bakterienzellen in der Kammer erforderlich ist , können die Zellen nach und nach herausgespült werden , indem die Strömungsraten von Medien 0,2 bis 110 & mgr; l min -1 zu erhöhen , indem die Spritze Pumpendrehzahl einzustellen.
Die Bakterienzellaktivitäten in den Mikro fluidischen Kammern wurden durch das inverse Mikroskop mit 40-facher Phasenkontrastoptik und Zeitraffer-Bilder mit einer Digitalkamera aufgenommen wurden bewertet, die von der Imaging-Software gesteuert wurde. Die Strömungsgeschwindigkeit und die Intervallzeit für die Bilderfassung kann entsprechend mit Experim eingestellt werdenental Anforderungen. Doch in den meisten Fällen Geschwindigkeit fließen für eine mittlere Fließgeschwindigkeit auf 0,2 & mgr; l min eingestellt -1 mit Zeitraffer-Bilder alle 30 Sekunden für die Pilus-vermittelten Bakterienzellen aufgezeichnet. In anderen Fällen, wenn das Medium Flussrate auf 0,1 & mgr; l min -1 erhöht wird , während des Verlaufs des Experiments wird das Verhalten der Bakterienzellen durch die Aufnahme von Bildern entsprechend alle 10 bis 15 Sekunden aufgezeichnet werden. Die Zeitraffer-Bilder wurden alle 30 Sekunden für die Dauer von 6-24 h genommen und als Quellbilder Dateien für jeden getesteten Stamm gespeichert. Die Videos wurden dann aus den Bildern 6 bis 8 Stunden von jedem Stamm genommen gefolgt, die in Zuckungen Motilitäten zwischen Mutante und Wildtyp-Kontrast Phänotypen gezeigt / ergänzen Stämme (Supplemental V1, V2, V3).
Die Bedeutung der Nano-Mikro-fluidischen Kammer-Geräte über makroskaligen Parallelplatten-Strömungskammern beinhaltet die direkte Untersuchung der Bewegungen und die Aggregationen von singenle Zellen von Bakterien. Zusätzlich zu den Low-Cost - 5 und niedrigen Reagenz und Probenvolumen Anforderungen, sind die Vorteile der Mikro fluidischen Kammern die Leichtigkeit der Konstruktion eines Strömungsmikro für die Bakterienkultur und genaue Kontrolle über die Fluidströmungsrate. Die mehreren parallelen Kanäle erlauben die Beobachtung der Differentialbakterienstämme in einem Versuchsaufbau, der für die Analyse kompatiblen Daten ermöglicht. Die Flagella-unabhängige twitching Motilität der Bakterien mit der polaren pili ist besonders geeignet für die Analyse in diesem Nanomikro fluidischen Kammer. Doch diese Mikro fluidischen Kammer ist weniger geeignet für die Flagellen-abhängige bakterielle Bewegung, bei der die Bewegung von Bakterien in der Regel zu schnell ist und zeigt zufällige Richtungen. Diese Einschränkung manchmal beeinträchtigt werden könnte , indem die mittlere Strömungsgeschwindigkeit auf 0,05 & mgr; l min -1 Einstellen und Ändern der Zeitraffer-Bildaufnahmerate bei jedem 1 bis 2 sec für 1 h bis Analyzie die Bewegungen der Flagellen-vermittelten Bakterien im nanoskaligen Umgebung.
Mikrofluidik - Kammer - Geräte hier verwendet wird , bieten eine direkte visuelle Beweise für die funktionelle Beurteilung der Pilg verantwortlich für Bewegungsverhalten in vitro. Darüber hinaus zeigt die Studie auch , dass Zell - Zell - Aggregation durch die Zuckungen Motilität für die Biofilmbildung von wesentlicher Bedeutung ist, Signal- und Pathogenität in X. fastidiosa. Visualisierung von Bakterien Motilität von mikrofluidischen Systemen bietet einen neuen Ansatz zu zucken Genfunktion Einbeziehung Verhalten in Bakterien zu untersuchen , die nicht leicht durch andere Testverfahren gemessen wird. Dieser Ansatz kann auch auf andere Bakteriensysteme angewendet werden. Die Mikrofluidik-Kammer-Geräte bieten ein Flusssystem für das physiologische Verhalten von Bakterienzellen zu charakterisieren, die mit Zell-Zell-Anhänge, Zellverbände, Bewegungsmuster und die Biofilmbildung.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.
Acknowledgments
Diese Studie wurde von der United States Department of Agriculture, Agricultural Research Service unterstützt. Handelsnamen oder kommerzielle Produkte in dieser Veröffentlichung sind der Bereitstellung von spezifischen Informationen ausschließlich für den genannten Zweck und Empfehlung oder Billigung nicht durch die United States Department of Agriculture implizieren. USDA ist eine Chancengleichheit Anbieter und Arbeitgeber.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biology materials | |||
| X. fastidiosa (Xf) Temecula wild type | Costa, H. S., et al., 2004 22 | ||
| pilG deletion mutant XfΔpliG | Shi, X. Y., et al., 2007 26 | ||
| pilG complementary strain XfΔpliG-C | Davis, M. J., et al. 1998 23 | ||
| Physical materials and equipment | |||
| Disposable inoculating loops | VWR international, Radnor, PA | #22-363-607 | quantitative procedures such as bacterial collection |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning Corporation | #0002709226 | Sylgard 184 silicone Elastomeric Kits |
| AmScope MD2000 digital camera | AmScope, Irvine, CA | SE305R-AZ-E | Image, video recording and measurement |
| Tubes line | Edgewood, NY | #T4300 | Connected to the syringe and microfluidic chamber |
| Plastic luer connectors | Edgewood, NY | Connected to the syringe and microfluidic chamber | |
| Syringe pumps | Pico Plus, Harvard Apparatus, MA | #702209 | The flow rate can be adjusted while the pump is running. |
| Syringes | Gastight, Hemilton Company, Reno, NV | #1005 | Provide the flowing broth |
| Inverted Olympus IMT-2 microscope | Olympus | IMT-2 FLuoro PHase | Image observation and recording |
| SPOT-RT digital camera | Diagnostic Instruments, Inc., MI | RT230 | Image, video recording and measurement |
| Microscope Shutter | The UNIBLITZ, US | #LS2T2 | Control camera’s exposure time |
| Microscope Shutter Control system | The UNIBLITZ, US | VCM-D1 | VCM-D1 Single Channel CE/UL/CSA Approved Shutter Driver |
| MetaMorph Image software | Universal Imaging Corp., PA | Real-time super-resolution image processing |
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