Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Визуализация подергивания моторики и характеристика о роли Published: April 8, 2016 doi: 10.3791/53816
Automatic Translation
1, 2
1Department of Plant Science, University of California, Davis, 2Agricultural Research Service, San Joaquin Valley Agricultural Sciences Center, United States Department of Agriculture

Summary

В этом исследовании, камера поток нано-Микрожидкостных был использован для визуализации и функционально характеризуют подергивания моторику Xylella fastidiosa, бактерии , которая вызывает болезнь Пирса в виноградной лозы.

Abstract

Xylella fastidiosa является грамотрицательная , не жгутиковых бактерия , которая вызывает ряд экономически важных заболеваний растений. Подергивания моторика обеспечивает X. fastidiosa средство для передвижения на дальние расстояния внутри растений и колонизации, способствуя к патогенности в X. fastidiosa. подергивание моторика X. fastidiosa работает по типу IV ворсинок. Тип IV Пили из Xylella fastidiosa регулируются pilG, регулятор хемотаксиса в Пиль-CHP белков , кодирующих оперон, которые участвуют в пути передачи сигналов. Для выяснения роли pilG в подергивания моторики X. Были разработаны fastidiosa, А pilG дефицитных мутант Xf ΔpilG и комплементарной штамм XfΔpilG- С , содержащей нативный pilG. Микрожидком камеры интегрированы с системой записи изображения в заданный промежуток времени был использован для наблюдения подергивания моторику в XfΔpIlg, XfΔpilG- C и его штамм дикого типа. С помощью этой системы записи, она позволяет долгосрочные временные и пространственные наблюдения агрегации, миграцию отдельных клеток и популяций бактерий через подергивания моторики. X. fastidiosa дикого типа и дополняют друг друга штамм XfΔpilG- C показали типичные характеристики подергивания моторики непосредственно наблюдаемые в микрофлюидальных проточных камерах, тогда как мутант XfΔpliG выставлены подергивание дефицитный фенотип. Это исследование показывает , что pilG способствует подергивание моторики X. fastidiosa. Камера Микрожидкостных потока используется в качестве средства для наблюдения подергивания перистальтику.

Introduction

Xylella fastidiosa является грамотрицательная не-жгутиковых, патогенный микроорганизм , который вызывает ряд экономически важных заболеваний сельскохозяйственных культур, в том числе болезни Пирса в виноградной лозы (Vitis винифера L.) 1,2, 3. Эта бактерия ограничена водопроводящие ксилемы судов. Заражение виноградной лозы вызывает закупорку сосудов ксилемы и приводит к водному стрессу и дефициту питательных веществ 3. Успешная колонизация зависит от способности бактерий , чтобы перейти от исходного места инфекции к остальной части растения 3. Подергивание моторику является средством жгутиков-независимого бактериального движения через расширение, привязанность и втягивании IV пилей полярный типа 4 , который был охарактеризован в X. fastidiosa 5,6,7.

Подергивания моторики наблюдается лазерным пинцетом и атомно - силовой микроскопии (AFM) 8,9,10. Используя эти методы, тКолдовская генерируется данные подвижности типа IV пилуса из N. гонореи и P. палочки характеризовались фл uorescently маркировки ворсинок и захвата их движения микроскопически. Хотя оба метода подробно сила адгезии отдельных бактерий, процедуры являются сложными и отнимает много времени 9,10. Микроэлементы uidic камеры FL использовались для наблюдения на дальние расстояния миграции отдельных клеток, а также небольшие агрегаты бактериальных клеток 5,6. Эти камеры были разработаны как микроизготовленном-нано-канал в пластине , интегрированной с покадровой системы записи изображения 11,12,13,14. Микро ф-л uidic устройства камеры имеют ряд преимуществ для изучения поведения движения и межклеточные взаимодействия бактерий: (I) она обеспечивает интегрированную платформу с несколькими возможностями канала; (Б) он может изучить движения и скопления одиночных клеток в наноразмерных особенностей бактерий; (III) она позволяет прямую мicroscopic записи изображения бактериальных клеток и анализа покадровой, (IV) она обеспечивает долгосрочные временные и пространственные наблюдения отдельных и / или популяций бактерий в микро-среде; (V) скорость потока культуральной среды в канале можно точно контролировать и (VI), только очень небольшой объем (1 мл) культуральной среды требуется для каждого эксперимента.

В последнее время , микро фл uidic потока система была использована для исследования поведения бактериальных клеток при различных микросреды 14,15,16. Адгезивность и прикрепление поверхность Е. палочка 15, X. fastidiosa 16 и Acidovorax citrulli 14 стеклянных поверхностей были оценены с использованием микро Fl uidic камеры. Формирование агрегации и био пленка опосредовано типа IV фимбрий из Acidovorax citrulli были проанализированы 14. Кроме того, движение А. citrulli наблюдается при потока сonditions показали , что тип IV фимбрии могут играть важную роль в колонизации и распространению А. citrulli в сосудах ксилемы при соке потока условиях. Подергивание синегнойной данные подвижности палочки и X. fastidiosa клетки успешно наблюдали против жидкости тока в камере 5,6,17 микроизготовленном потока. Тип IV пилуса дефицитный pilB и pilQ мутанты X. fastidiosa были найдены глубоко изменить скорость подергивание моторику при условиях потока в микро - фл uidic устройств 5,6,18. Исследования , проведенные на бактериальную адгезию и моторики в микро- фл uidic устройств показали , что микро - эт uidic камеры, особенно пригодны для анализа подергивание моторику и миграцию фимбрии-опосредованной бактерий в пробирке. Эти результаты объясняют подергивание-опосредованной механизм миграции, который облегчает прикрепление клеток-клеток, агрегации и колонизации в пределаххозяин, в конечном итоге привести к системной инфекции.

Пиль-Чп оперон X. fastidiosa содержит pilG, Пили, pilJ, пилюлю, chpB и chpC , которые кодируют сигнал путей передачи 20. Трансмембранные хеморецепторы связывают химические раздражители в периплазмической области и активировать сигнальный каскад в их цитоплазматической части, чтобы в конечном счете управлять бактериальной подергивания моторику. В Пиль-Chp оперона X. fastidiosa, A фосфо-шатл белок PilG является гомологом к Чей. У Е. палочки и P. палочка, Chey является регулятором ответ на хемотаксис систем , которые взаимодействуют с жгутиков моторных белков 19, 21. Несмотря на то, вклады оперона Пиль-Chp по отношению к вирулентности в X. fastidiosa были недавно рассмотрены 20, роль pilG в хемотаксиса оперона в ответ на внешние сигналы и регулируемой / двигателя тип IV фимбрий из X. fastidiosa является ункцииЛир. Для выяснения понимания регулятора хемотаксис pilG активности подергивание моторики X. fastidiosa, микро фл uidic камера используется для оценки подергивания моторику X. fastidiosa. PilG из X. fastidiosa характеризуется сравнением фенотипов делеционного мутанта Xf ΔpliG, комплементарный штамм XfΔpliG -С и его дикого типа в пробирке. Результаты свидетельствуют о роли pilG в подергивания моторики X. fastidiosa.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Периферийное Fringe Бактериального колонии

  1. Grow X. fastidiosa (Xf) Temecula дикого типа 22, pilG мутантом с делецией Xf ΔpliG ( с использованием ранее описанной стратегии удаления 23), и его комплементарный XfΔpliG -C ( с использованием ранее описанных хромосомный на основе стратегии генетической комплементации 24) на PD2 среда чашках с агаром 25 при 28 ° С в течение 5-7 дней.
  2. Автоклавы целлофан (1 х 1 см 2) в воде при температуре 121 ° С (249 ° F) в течение 15 мин. Возьмите одну часть целлофана, слить воду, касаясь одного угла целлофан на пустой чашке Петри, аккуратно положите целлофан более чем на 15% от поверхности агара и сухой воздух.
  3. Возьмите индивидуальную X. fastidiosa колонии стерильным скругленные зубочистки и пятно клетки асептически на стерилизованную лист целлофана , обложенных на 15% поверхности агара в чашках с агаром. Инкубируйте планшетс при 28 ° С в течение 2-3 дней.
  4. Осмотрите края морфологии колоний с использованием рассекает микроскоп с объективом 2X и 10X глазной линзы. Сфотографируйте периферическое бахрому вокруг колоний.

2. Микроскопия и микрожидком потока Камеры

  1. Изготовить микрофлюидальные устройства , использующие фото-литографических процедур , аналогичных тем , которые описаны ранее 5,18. Конструкция четыре параллельных каналов с разработки программного обеспечения с помощью компьютера на мастер - кремниевой подложке с использованием стандартных литографических методов 26.
  2. Создание Микрожидкостных камеры от мастера кремниевой пластины с полидиметилсилоксана (PDMS). Налейте Неполимеризованные PDMS над мастером кремниевой пластины и вылечить ее при температуре 60 ° С в течение 1 часа. Лупиться реплики PDMS от мастера пластин и отделка реплики PDMS с лезвием в 22 мм х 40 мм, как же размера покровного стекла.
  3. Выставляют реплики PDMS, покровным стеклом (22 х 40 мм 2), и microscОПЕ слайд (51 х 76 мм 2) воздушной плазмы при 30 Вт в течение 2 мин 27. Сэндвич тело PDMS между покровным стеклом и стекла микроскопа для создания микро- фл uidic камеру.
  4. Просверлите отверстие (диаметр 5,5 мм) через PDMS на каждом конце узорной-канала. Вырезать из силиконового каучука трубы в длинные 12-20 см. Вставьте один конец силиконовой резиновой трубки (5,1 мм наружный диаметр 2,1 мм, внутренний диаметр 0,8 мм стенки) в каждое из открытого конца каналов реплики PDMS, и запечатать его с неполимеризованных PDMS при 60 ° С в течение 1 часа.
  5. Подключите другой конец трубки к колючим концом пластиковых соединителей Luer. Обертка собранным микрожидкостных камеры с алюминиевой фольгой и автоклав их в течение 20 мин.
  6. Собирают клетки бактерий из X. fastidiosa дикого типа, мутант Xf ΔpliG, и дополняют друг друга XfΔpliG -С помощью соскоба, используя одноразовые инокуляции петли из pd2 средних пластин. Отрегулируйте плотность клетокдо оптической плотности от 0,05 при 600 нм в PD2 бульоне , как описано выше 23. Соберите раствор бактериальной клетки в газонепроницаемой шприц 1 мл.
  7. Установите микрожидкостных устройство на перевернутой столике микроскопа. Подсоедините впускную трубку к 5 мл шприц, содержащий газостойкие PD2 бульон. Установить 5 мл газостойкие шприц с шприцевые насосы.
  8. Соедините выходную трубку с резервуаром для отходов. Поддерживать среднюю скорость потока 0.2 мкл мин -1 в течение 30 мин , чтобы стабилизировать систему.
  9. Подключение бокового впускные трубы к 1 мл шприц, содержащий газонепроницаемы и раствор бактериальной клетки. Промыть раствор бактериальной клетки через резиновую трубку, пока канал не будет достигнут. Поддерживать среднюю скорость потока 0.2 мкл · мин -1 в течение еще ​​30 мин для того , чтобы промыть несвязанных клеток из камеры до начала захвата изображения.
  10. Установите микроскоп затвор под полем скорректированные части микроскопа, чтобы управлять светом. Подключите затвор к со затвораСистема и подключить управляете систему управления заслонкой к компьютеру.
  11. Установите цифровую камеру к видеопорту микроскопа и подключить его к компьютеру. Запустите программное обеспечение для записи замедленную, выберите функцию "затвора" из меню, и автоматически распознает установленную затвора по умолчанию в программном обеспечении для установления соединения с затвором с программным обеспечением.
  12. Выберите функцию "цифровой камеры" из меню программного обеспечения для записи в заданный промежуток времени автоматически распознавать цифровую камеру в качестве устройства захвата по умолчанию в программном обеспечении и установить связь с цифровой камерой с программным обеспечением.
  13. Найдите бактериальные клетки в одном из каналов с использованием 20x фазового контраста оптики, а затем переключиться на 40Х объектив перед захватом изображения.
  14. Запустите программное обеспечение для записи замедленную, выберите функцию "захвата изображений" с использованием параметров по умолчанию в меню для получения изображений с микроскопа.Затем откройте функцию "Приобретать времени покадровой" и установить интервал времени до 30 с 5,18,28 по продолжительности 6-24 ч в зависимости от опыта , необходимого для наблюдения дергается моторику X. fastidiosa 5,18,28. Нажмите кнопку "OK", чтобы начать запись замедленную. Нажмите кнопку "Функция Stack" из меню, выберите "Сохранить как", чтобы стек изображений в папке назначения на компьютере после окончания записи.
  15. При наличии нескольких каналов, захват покадровой изображения с первого канала каждые 30 сек в течение 6 часов. Переместить объектив микроскопа к следующему каналу, чтобы определить местонахождение клетки-мишени. Повторите функцию покадровой, как описано выше для захвата изображений в каждом из четырех каналов последовательно, если эксперимент настроен использовать четыре канала. Продолжить захват изображения замедленную тех пор, как три дня подряд. Все эксперименты проводили при комнатной температуре (23 ± 2 ° C).
  16. Компиляция покадровой изображения вВидеофайл с помощью программного обеспечения визуализации записи замедленную. Запустите программное обеспечение для записи в заданный промежуток времени, нажмите на кнопку "функцию Stack" из меню, и выберите "Открыть функцию стека", чтобы открыть сложенных файлы с компьютера.
  17. Запустить функцию "Сделать фильм" из модуля стека, выбирая все изображения и выбрать выходной формат «AVI». Нажмите кнопку "Сохранить как", чтобы сохранить видео файл в папке назначения на компьютере.
  18. Выберите скомпилированные фильмы из папки назначения на компьютере и воспроизводить их. Затем наблюдать моторику одиночных клеток через результирующей визуализации подергивание моторики активности клеток бактерий в сгенерированном видео файлов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Присутствие периферийной бахромы колонии указывающей тип IV пилей-опосредованной подергивание моторики, наблюдалась в колонии X. fastidiosa дикого типа и дополняют друг друга штамм Xf ΔpliG -C (Рисунок 1). Мутант XfΔpliG, однако, не проявляли бахромой по периметру колоний (Рисунок 1). Покадровый изображений бактериальных клеток в нано-Микрожидкостных проточных камерах показали , что подергивание моторики наблюдалось в обеих дикого типа X. fastidiosa и комплементарный XfΔpliG -C (Supplemental V1, V3), в то время как XfΔpilG мутантных клеток не проявляли подергивание моторику на протяжении всего эксперимента (Supplemental V2). Клетки мутанта XfΔpilG образуются сравнительно небольшие рыхлые агрегаты в PD2 бульоне (Supplemental V2). В противоположность этому , клетки X. fastidiosa дикого типа и дополняют друг друга XfΔpilG- C d eveloped более крупные агрегаты в PD2 бульоне (Рисунок 2, (Справочная V1, V3).

Рисунок 1
Рисунок 1:. Окружная бахрома бактериальной колонии колонии маржинальные характеристики X. fastidiosa от дикого типа, мутантной Xf ΔpilG и дополняют друг друга XfΔpilG- C выращивали на PD2 агар , покрытый стерилизованной лист целлофана. За исключением мутанта XfΔpilG все колонии проявляли периферическое бахрому, указывающий тип IV фимбриевый-опосредованной подергивания моторику. Фотографии были сделаны через 5 дней роста на культуральной среде. Увеличение бар, 0,5 мм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

_upload / 53816 / 53816fig2.jpg "/>
Рисунок 2: подергивание моторика X. fastidiosa клетки в проточную камеру нано-Микрожидкостных. подергивание моторику всех тестируемых клеток штамма регистрировали в течение 6 дней наблюдения. Оценки проводились с трех независимых сегментов видео. Увеличение бар, 20 мкм.
Примечание: подергивание моторику X. Клетки fastidiosa характеризуется одним движением клеток через стеклянные поверхности через расширения, привязанности и втягивании полярного типа IV ворсинок. Одна ячейка наблюдалась в миграции преимущественно против течения жидкости в камере микроизготовленном потока. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

6 / 53816supfig1.jpg "/>
Справочная Рисунок 1: четырехканальный камера Микрожидкостных потока. Каждый канал со средствами массовой информации в средствах массовой информации и выходных соединителей на каждом конце. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Справочная Фильм 1
Справочная Фильм 1: Подергивание моторику. (Щелкните правой кнопкой мыши , чтобы скачать). Подергивание X. fastidiosa дикого типа в камере микрожидком потока.

Справочная Фильм 2
Справочная Фильм 2: Нарушенная твитчинг моторики. (Щелкните правой кнопкой мыши , чтобы скачать). Подвижность Xf мутанта. XfΔpilG наблюдается в камере amicrofluidic потока.

Справочная Фильм 3
Справочная Фильм 3: Восстановленная подергивания моторику. (Щелкните правой кнопкой мыши , чтобы скачать). Подергивание моторику Xf дополнительного штамма. XfΔpilG-С наблюдается в камере микрожидком потока.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В данном исследовании мы характеризовали поведение движени X. fastidiosa PilG мутант Xf ΔpilG и его комплементарные штаммы XfΔpilG- C в новой конструкции с несколькими микро параллельно-нано-канал фл uidic камер. Недавно разработанная микро эт uidic камеры могут иметь до четырех параллельных камер с 100 мкм нано-канал шириной по сравнению с предыдущими конструкциями , только с одним 50 мкм широкий канал 18. Усовершенствованный шире нано-канал облегчает введение бактериальных клеток с перетекание средств массовой информации. Кроме того, эта микрофлюидики камера 1) проста для построения и сборки; 2) относительно недорого; и 3) легко применимы к различным экспериментальным требованиям. В результате, эта конструкция камеры позволяет долгосрочное наблюдение за движениями бактериальных клеток под сортами экспериментальной микросреду.

Стабилизацию поток токов throuГ.Х. микро фл uidic канал является важным шагом к созданию неповрежденный затекание микро фл uidic микросреду для наблюдения за моторикой бактериальных клеток при различных экспериментальных условиях. Промывка микро- фл uidic камер и соединительные трубки со средствами массовой информации до введения бактериальных клеток также является важным шагом на пути к стабилизации потока в камере. Тем не менее, высокая скорость потока будет вымывать бактериальных клеток из камеры без сохранения клеток в процессе камеры. Правильная скорость средств массовой информации, протекающих через микро-фл uidic каналов необходимо отрегулировать с помощью шприца. В ходе экспериментов в этом исследовании, протекающий был установлен и стабилизирована с помощью насоса на 0,2 до 1 мкл мин -1 в течение , по крайней мере за 30 мин до введения бактериальных клеток в канал. Как только клетки были введены в микро фл uidic каналов, среда потока поддерживали на уровне 0,2 мкл мв -1 в течение от 30 до 60 мин , чтобы стабилизировать систему и удалить nonattached клетки. Очень важно, чтобы стабилизировать поток и сохранить фон ясно для того, чтобы наблюдать движение бактериальных клеток. Изображения были захвачены каждые 30 сек до подтвер- Р.М. подергивания моторику активность введенных клеток , поддерживая постоянную скорость потока при 0,2 мкл мин -1. Если эксперименты требуют сбора бактериальных клеток в камере, клетки могут быть промыты путем постепенного увеличения скорости потока носителей от 0,2 до 110 мкл мин -1, регулируя скорость насоса шприца.

Деятельность бактериальной клетки в микро фл uidic камер были оценены с помощью инвертированного микроскопа с использованием 40х фазового контраста оптики и покадровой изображения, записанные с помощью цифровой камеры, которая находилась под контролем программного обеспечения визуализации. Скорость потока и временной интервал для захвата изображения может быть соответствующим образом скорректированы с experimСИХИЧЕСКОЕ требования. Тем не менее, в большинстве случаев, скорость потока при скорости потока среды устанавливается в 0,2 мкл мин -1 с покадровой изображения записываются каждые 30 сек для пилуса опосредованную бактериальных клеток. В других случаях , если среда скорость потока увеличивается до 0,1 мкл мин -1 в течение экспериментов, поведение бактериальных клеток будут записаны путем захвата изображений каждые 10 до 15 сек соответственно. Временные покадровой изображения были взяты каждые 30 сек на протяжении 6-24 ч и сохраняется в виде файлов исходных изображений для каждого тестируемого штамма. Видео затем были выполнены из снимков, сделанных с 6-8 ч от каждого штамма, который показанный контрастных фенотипов в подергивание между мутантным данные подвижности и дикого типа / дополнения штаммов (V1, Company, V2, V3).

Значение нано-микро фл uidic камеры устройства по макромасштабная плоскопараллельных потока камер включает в себя непосредственное изучение движений и скоплений поютле клетки бактерий. В дополнение к низкой стоимости 5 и требованиям низких реагентов и объема выборки, преимущества микро фл uidic камер являются простота построения потока микросреды для бактериальной культуры и точного контроля над флюид скорость потока. Множественные параллельные каналы позволяют исследовать дифференциальных бактериальных штаммов, в одной настройке эксперимента, который обеспечивает совместимые данные для анализа. Флагеллярной-независимый подергивание моторику бактерий с полярным пилей особенно хорошо подходит для анализа в этом нано-микро фл uidic камеры. Тем не менее, это микро фл uidic камера меньше подходит для жгутиков-зависимого бактериального движения, в котором движение бактерий, как правило, слишком быстро и проявляет случайные направления. Это ограничение иногда может быть поставлена ​​под угрозу путем регулирования скорости потока рабочей среды до 0,05 мкл мин -1 и изменения скорости захвата изображения замедленную на каждые 1 до 2 сек в течение 1 ч до AnalyZe движениях жгутиковых опосредованной бактерий в нано-масштабе среды.

Микрожидком устройства камеры , используемые здесь , обеспечивают прямое визуальное свидетельство для функциональной оценки PilG , ответственного за поведение движения в пробирке. Кроме того, это исследование также показывает , что клетка с агрегацией клеток через подергивания моторики имеет важное значение для формирования биопленок, сигнализации и патогенности в X. fastidiosa. Визуализация бактерий подергивание моторику с помощью микроканалов устройств обеспечивает новый подход к изучению функции генов с участием поведение у бактерий , которые не легко измерить с помощью других методов анализа. Такой подход может быть применен к другим бактериальных системах. Микрожидкостных устройства камеры обеспечивают систему подачи для характеристики физиологического поведения бактериальных клеток, связанных с вложениями межклеточных, клеточных скоплений, моделей движения и образования биопленки.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgments

Это исследование было поддержано Департаментом сельского хозяйства Соединенных Штатов, Службы сельскохозяйственных исследований. Торговые наименования или коммерческие продукты, в данной публикации упоминаются исключительно с целью предоставления конкретной информации и не подразумевает рекомендацию или одобрение со стороны Соединенных Штатов департамента сельского хозяйства. Министерство сельского хозяйства США равные возможности и работодателем.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Biology materials
X. fastidiosa (Xf) Temecula wild type Costa, H. S., et al., 2004 22
pilG deletion mutant XfΔpliG Shi, X. Y., et al., 2007 26
pilG complementary strain XfΔpliG-C  Davis, M. J., et al. 1998 23
Physical materials and equipment
Disposable inoculating loops VWR international, Radnor, PA #22-363-607 quantitative procedures such as bacterial collection
Polydimethylsiloxane (PDMS) Dow Corning Corporation #0002709226 Sylgard 184 silicone Elastomeric Kits
AmScope MD2000 digital camera AmScope, Irvine, CA SE305R-AZ-E Image, video recording and measurement 
Tubes line Edgewood, NY #T4300 Connected to the syringe and microfluidic chamber
Plastic luer connectors Edgewood, NY Connected to the syringe and microfluidic chamber
Syringe pumps Pico Plus, Harvard Apparatus, MA #702209 The flow rate can be adjusted while the pump is running.
Syringes Gastight, Hemilton Company, Reno, NV #1005 Provide the flowing broth
Inverted Olympus IMT-2 microscope Olympus IMT-2 FLuoro PHase Image observation and recording
SPOT-RT digital camera Diagnostic Instruments, Inc., MI RT230 Image, video recording and measurement
Microscope Shutter The UNIBLITZ, US #LS2T2 Control camera’s exposure time
Microscope Shutter Control system The UNIBLITZ, US VCM-D1 VCM-D1 Single Channel CE/UL/CSA Approved Shutter Driver
MetaMorph Image software Universal Imaging Corp., PA Real-time super-resolution image processing 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Purcell, A. H., Hopkins, D. L. Fastidious xylem-limited bacterial plant pathogens. Annu. Rev. Phytopathol. 34, 131-151 (1996).
  2. Purcell, A. H. Xylella fastidiosa, a regional problem or global threat. J. Plant Pathology. 79, 99-105 (1997).
  3. Hopkins, D. L. Xylella fastidiosa: Xylem-limited bacterial pathogen of plants. Annu. Rev. Phytopathol. 27, 271-290 (1989).
  4. Mattick, J. S. Type IV pili and twitching motility. Annu. Rev. Microbiol. 56, 289-314 (2002).
  5. Meng, Y., et al. Upstream migration of Xylella fastidiosa via pilus-driven twitching motility. J. Bacteriol. 187, 5560-5567 (2005).
  6. Li, Y., et al. Type I and type IV pili of Xylella fastidiosa affect twitching motility, biofilm formation and cell-cell aggregation. Microbiology. 153, 719-726 (2007).
  7. Simpson, A. J. G., et al. The genome sequence of the plant pathogen Xylella fastidiosa. Nature. 406, 151-157 (2000).
  8. Maier, B., Potter, L., So, M., Long, C. D., Seifert, H. S., Sheetz, M. P. Single pilus motor forces exceed 100 pN. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, 16012-16017 (2002).
  9. Touhami, A., Jericho, M. H., Boyd, J. M., Beveridge, T. J. Nanoscale characterization and determination of adhesion forces of Pseudomonas aeruginosa pili by using atomic force microscopy. J. Bacteriol. 188, 370-377 (2006).
  10. Skerker, J. M., Berg, H. C. Direct observation of extension and retraction of type IV pili. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98, 6901-6904 (2001).
  11. Brown, D. C., Larson, R. S. Improvements to parallel plate flow chambers to reduce reagent and cellular requirements. BMC Immunol. 2, 9 (2001).
  12. Thomas, W. E., Nilsson, L. M., Forero, M., Sokurenko, E. V., Vogel, V. Shear-dependent 'stick-and-roll' adhesion of type 1 fimbriated Escherichia coli. Mol. Microbiol. 53, 1545-1557 (2004).
  13. Thomas, W. E., Trintchina, E., Forero, M., Vogel, V., Sokurenko, E. V. Bacterial adhesion to target cells enhanced by shear force. Cell. 109, 913-923 (2002).
  14. Bahar, O., Fuente, D. L., Burdman, S. Assessing adhesion, biofilm formation and motility of Acidovorax citrulli using microfluidic flow chambers. FEMS Microbiol. Lett. 312, 33-39 (2010).
  15. Thomas, W. E. Using a laminar flow system to explain shear-enhanced bacterial adhesion. Proceedings of ICMM2005, Third International Conference on Microchannels and Mini-channels. Toronto, Ontario, Canada, , 751-759 (2005).
  16. Fuente, D. L., et al. Assessing adhesion forces of type I and type IV pili of Xylella fastidiosa bacteria by use of a microfluidic flow chamber. Appl. Environ. Microbiol. 73, 2690-2696 (2007).
  17. DeLange, P. A., Collins, T. L., Pierce, G. E., Robinson, J. B. PilJ localizes to cell poles and is required for type IV pilus extension in Pseudomonas aeruginosa. Curr Microbiol. 55, 389-395 (2007).
  18. Fuente, D. L., Burr, T. J., Hoch, H. C. Mutations in type I and type IV pilus biosynthetic genes affect twitching motility rates in Xylella fastidiosa. J. Bacteriol. 189, 7507-7510 (2007).
  19. Ferandez, A., Hawkins, A. C., Summerfield, D. T., Harwood, C. S. Cluster II che genes from Pseudomonas aeruginosa are required for an optimal chemotactic response. J. Bacteriol. 184, 4374-4383 (2002).
  20. Cursino, L., et al. Identification of an Operon, Pil-Chp, That Controls Twitching Motility and Virulence in Xylella fastidiosa. Mol. Plant Microbe Interact. 10, 1198-1206 (2011).
  21. Hazelbauer, G. L., Falke, J. J., Parkinson, J. S. Bacterial chemoreceptors: High-performance signaling in networked arrays. Trends Biochem. Sci. 33, 9-19 (2008).
  22. Costa, H. S., et al. Plant hosts of Xylella fastidiosa in and near southern California vineyards. Plant Dis. 88, 1255-1261 (2004).
  23. Shi, X. Y., Dumenyo, C. K., Hernandez-Martinez, R., Azad, H., Cooksey, D. A. Characterization of regulatory pathways in Xylella fastidiosa: genes and phenotypes controlled by algU. Appl. Environ. Microbiol. 73, 6748-6756 (2007).
  24. Matsumoto, A., Young, G. M., Igo, M. M. Chromosome-Based Genetic Complementation System for Xylella fastidiosa. Appl. Environ. Microbiol. 75, 1679-1687 (2009).
  25. Davis, M. J., Purcell, A. H., Thomson, S. V. Isolation Media for the Pierce's Disease Bacterium. Phytopathology. 70, 425-429 (1980).
  26. Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Soft lithography. Annu. Rev. Mater. Sci. 28, 153-184 (1998).
  27. Chaudhury, M. K., Whitesides, G. M. Direct measurement of interfacial interactions between semispherical lenses and flat sheets of poly-(dimethylsiloxane) and their chemical derivatives. Langmuir. 7, 1013-1025 (1991).
  28. Cruz, L. F., Parker, J. K., Cobine, P. A., De La Fuente, L. Calcium-enhanced twitching motility in Xylella fastidiosa is linked to a single PilY1 homolog. Appl. Environ. Microbiol. 80, 7176-7196 (2014).

Tags

Immunology выпуск 110, Дергаться моторику тип IV пилуса, Микрожидкостных проточная камера
Визуализация подергивания моторики и характеристика о роли<em&gt; PilG</em&gt; в<em&gt; Xylella fastidiosa</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shi, X., Lin, H. Visualization of… More

Shi, X., Lin, H. Visualization of Twitching Motility and Characterization of the Role of the PilG in Xylella fastidiosa. J. Vis. Exp. (110), e53816, doi:10.3791/53816 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter