Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Rolü seğirmesi Motilitesi görselleştirme ve Karakterizasyonu Published: April 8, 2016 doi: 10.3791/53816
Automatic Translation
1, 2
1Department of Plant Science, University of California, Davis, 2Agricultural Research Service, San Joaquin Valley Agricultural Sciences Center, United States Department of Agriculture

Summary

Bu çalışmada, nano-mikroakışkan akış odası görselleştirmek ve işlevsel Xylella fastidiosa, dedikodu olarak Pierce hastalığa neden olan bir bakterinin seğirmesi motilitesini karakterize etmek kullanılmıştır.

Abstract

Xylella fastidiosa bitkiler ekonomik açıdan önemli hastalıklara neden olan bir dizi, bir Gram-negatif olmayan kamçılı bir bakteridir. Seğirmesi motilitesi X sağlar fastidiosa uzun mesafe içi bitki hareketi ve kolonizasyonu için bir araç X patojenik doğru katkıda X'in fastidiosa. seğirmesi motilite fastidiosa tip IV pili tarafından işletilmektedir. Xylella fastidiosa ve Tip IV pili pilG, sinyal transdüksiyon geçiş yolları ile ilişkili olan Pil-Chp operon'u şifreleyen proteinler bir kemotaksis regülatörü tarafından düzenlenir. X'in seğirmesi motilitesinde pilG rollerini aydınlatmak için fastidiosa, bir pilG -açıklı mutant Xf ΔpilG ve yerli pilG içeren tamamlayıcı suşu XfΔpilG- C geliştirilmiştir. Time-lapse görüntü kayıt sistemi ile entegre bir mikroakışkan odaları XfΔp içinde seğirmesi hareketliliğini gözlemlemek için kullanılanILG, XfΔpilG- C ve vahşi tip süzün. Bu kayıt sistemi kullanarak, uzun vadeli mekansal ve zamansal toplama gözlemlerini, tek tek hücrelerin ve seğirmesi hareketlilik yoluyla bakteri popülasyonlarının göç izin verir. X Mutant XfΔpliG seğirmesi eksik fenotip sergilenen oysa fastidiosa yabani tip ve tamamlayıcı XfΔpilG- C suşu, doğrudan mikroakışkan akış gözlerinden gözlenen tipik seğirmesi motilite özellikleri gösterdi. Bu çalışma pilG X. seğirmesi hareketliliğin artmasını göstermektedir fastidiosa. mikroakışkan akış odası seğirmesi hareketliliği gözlemlemek için bir araç olarak kullanılmaktadır.

Introduction

Xylella fastidiosa Grapevine Pierce hastalığı (Vitis vinifera L.), 1,2, 3 dahil olmak üzere ekonomik olarak önemli bitkisel hastalıkların bir dizi neden olan bir Gram-negatif olmayan kamçılı, patojen bir bakteridir. Bu bakteri su ileten ksilem sınırlıdır gemiler. Asmanın Enfeksiyon ksilem gemi ve su stresi sonuçları ve beslenme yetersizlikleri 3 tıkanmasına neden olur. Başarılı kolonizasyon tesisi 3 geri kalanına enfeksiyon ilk siteden taşımak için bakterinin yeteneğine bağlıdır. X özelliği olan polar tip IV Pili 4 uzatılması, bağlanma ve geri çekme yoluyla flagellar bağımsız bakteriyel hareketi için bir araç motilitesini olan seğirmesi fastidiosa 5,6,7.

Seğirmesi motilite lazer cımbız ve atomik kuvvet mikroskobu (AFM) 8,9,10 tarafından gözlenmiştir. Bu teknikler kullanılarak, twitching motiliteler N. tip IV pilus tarafından oluşturulan gonorrhoeae ve S. aeruginosa fl uorescently etiketleme pili ve mikroskopik hareketlerini yakalayarak ile karakterize edildi. Her iki yöntem bireysel bakterilerin yapışkan kuvveti ayrıntılı olmasına rağmen, prosedürler karmaşık ve zaman 9,10 alıcıdır. Mikro fl uidic odalar uzun mesafe, tek tek hücrelerin göçünü ve bakteri hücreleri 5,6 küçük agregalar gözlemlemek için kullanılmıştır. Bu odalar bir time-lapse görüntü kayıt sistemi 11,12,13,14 ile entegre bir tabak içinde bir microfabricated-nano-kanal olarak dizayn edilmiştir. Mikro uidic odacık cihazlar bakteri hareketi davranışı ve hücre-hücre etkileşimleri incelemek için çeşitli avantajlar sunar fl: (i) bir çok kanallı yetenekleri ile entegre bir platform sağlar; (Ii) hareketler ve bakteri nano ölçekli özellikleri tek hücre toplamlar inceleyebilirsiniz; (Iii) doğrudan m sağlarbakteriyel hücrelerin ve zaman atlamalı analizi icroscopic görüntü kaydı, (iv) bir mikro-ortamda bakterilerin tek tek ve / veya popülasyonlarının uzun süreli mekansal ve zamansal gözlemler sağlar; (V) bir kanalda kültür ortamının akış hızı hassas bir şekilde kontrol edilebilir ve kültür ortamında (vi) sadece çok küçük bir hacmi (1 mi), her bir deney için gereklidir.

Son zamanlarda, mikro fl uidic akış sistemi çeşitli mikroçevrelerde 14,15,16 altında bakteri hücrelerinin davranışlarını araştırmak için istihdam edilmiştir. Yapışkanlık ve E. yüzey eki E. coli, 15 X fastidiosa 16 ve Acidovorax cam yüzeylere 14 mikro fl uidic odaları kullanılarak değerlendirildi citrulli. Acidovorax citrulli tipi IV pili aracılığıyla toplama ve biyo fi lm oluşumu 14 analiz edildi. A. Ayrıca, hareket citrulli akış c altında gözlenenşartlarından Tip IV pili kolonizasyon önemli roller oynayabileceğini göstermiştir ve A. yayıldı sap akış koşulları altında ksilem damarlarında citrulli. Pseudomonas aeruginosa ve X'in seğirmesi motiliteler fastidiosa hücreleri başarılı bir şekilde mikrofabrike akış odasının 5,6,17 bir akışkan akımına karşı gözlendi. Tip IV pilus X. pilB ve pilQ mutantlar yoksun fastidiosa derinden mikro fl uidic cihazlar 5,6,18 içinde akış koşulları altında motilite seğirmesi hızını değiştirmek için bulunmuştur. Mikro fl uidic cihazlarda bakteri yapışma ve motilitesi üzerinde yapılan çalışmalar, mikro fl uidic odaları in vitro pili aracılı bakterilerin seğirmesi motilitesini ve göç analizi için özellikle uygun olduğunu göstermiştir. Bu sonuçlar hücre-hücre eki, agregasyonu ve kolonizasyonu içinde kolaylaştırır seğirmesi aracılı göç mekanizmasını açıklamakEv sahibi, sonuçta sistemik enfeksiyona yol.

X. Pil-Chp operon fastidiosa kodlamak sinyal iletimi 20 yolaklarıyla pilG, pili, pilJ, hap, chpB ve chpC içerir. transmembran kemoreseptörlerin periplazmik etki kimyasal uyaranlara bağlamak ve sonuçta bakteriyel seğirmesi hareketliliğini kontrol etme sitoplazmik kısmı bir sinyal kaskad etkinleştirin. X'in Pil-Chp operonunda fastidiosa, fosfo-geçiş proteini PilG Chey bir homologudur. E. E. coli ve P. aeruginosa, Chey kamçı motor proteinlerin 19, 21 ile etkileşim kemotaksis sistemlerinde yanıt düzenleyicisidir. X'de virülansına doğru Pil-Chp operon katkıları olmasına rağmen fastidiosa çevresel sinyallere yanıt olarak ve X'in ayarlı / motor tip IV Pili için, en son kemotaksis operonunda pilG rolü 20 incelenmiştir fastidiosa unc olduğunulear. X'in seğirmesi hareketlilik aktivitesindeki kemotaksis regülatör pilG bir fikir aydınlatmak için fastidiosa, mikro fl uidic odası X'in seğirmesi motilitesini değerlendirmek için kullanılır fastidiosa. X fastidiosa ve pilG bir silme mutantı Xf ΔpliG tamamlayıcı suşu XfΔpliG C ve in vitro olarak vahşi tip fenotipleri karşılaştırılması ile karakterize edilir. Sonuçlar X'in seğirmesi motilite pilG rolünü vurgulamak fastidiosa.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Bakteriyel Colony Periferik Fringe

  1. X büyümek fastidiosa (Xf) Temecula yabani tip 22, pilG silme mutant PD2 orta agar plakaları 25 ° 28 ° üzerinde (daha önce kromozom tabanlı genetik tamamlama stratejisi 24 tarif kullanarak) (daha önce açıklanan silme stratejisi 23 kullanarak) Xf ΔpliG ve onun tamamlayıcı XfΔpliG -C 5-7 gün bekletilmiştir.
  2. 15 dakika boyunca 121 ° C'de (249 ° F) su içinde Otoklav selofan (1 x 1 cm2). , Selofan tek parça Pick up boş bir Petri kabı selofan bir köşesini dokunarak su tahliye dikkatle agar yüzeyi ve kuru hava% 15 üzerinde selofan yatıyordu.
  3. Bireysel X Pick up aseptik agar plakaları agar yüzeyinin% 15 üst üste selofan bir sterilize levha üzerine yuvarlak kürdan ve spot hücreler steril ile fastidiosa koloniler. plaka inkübe2-3 gün 28 ° C 'de s.
  4. 2X objektif lens ile diseksiyon mikroskobu ve 10X oküler lens kullanarak kolonilerin kenar morfolojisi inceleyin. kolonilerin etrafında çevresel saçak fotoğraf.

2. Mikroskopi ve mikroakışkan Akış Odaları

  1. Benzer fotoğraf litografik prosedürler kullanılarak Üretiyor mikroakışkan cihazlar önceden 5,18 nitelendirdi. Standart taşbaskı yöntemler 26 kullanarak ana silikon gofret bilgisayar destekli tasarım yazılımı ile dört paralel kanal tasarlayın.
  2. polidimetilsiloksan (PDMS) ile silikon gofret ustadan mikroakışkan odaları oluşturun. silikon gofret ana üzerinde unpolymerized PDMS dökün ve 1 saat 60 ° C'de onu tedavi. gofret PDMS kopya soyulabilir ve bir cam lamel aynı boyutu olarak 22 mm x 40 mm bir bıçak ile PDMS çoğaltma kırpın.
  3. PDMS çoğaltma bir cam lamel (22 x 40 mm2) ve Microsc Açığa2 dakika 27 30 W hava plazmaya ope slayt (51 x 76 mm 2). Sandviç cam lamel ve mikro fl uidic odasını oluşturmak için cam mikroskop arasında PDMS gövde.
  4. desenli kanal her bir ucunda PDMS bir delik (5.5 mm çap) delin. 12-20 cm uzunluğunda içine silikon kauçuk tüp kesti. PDMS yineleme kanalların her biri açılış ucuna silikon kauçuk hortumun bir ucu (dış çapı 5,1 mm, iç çap 2.1 mm, 0.8 mm duvar) ekleyin ve 1 saat boyunca 60 ° C'de polimerize edilmemiş PDMS ile kapatın.
  5. plastik luer konnektörleri dikenli sonuna kadar boru başka ucunu. Alüminyum folyo ile monte mikroakışkan odaları sarın ve 20 dakika boyunca her otoklav.
  6. X bakteriler hücreleri toplayın kazıma yoluyla fastidiosa yabani tip mutant Xf ΔpliG ve tamamlayıcı XfΔpliG -C, tek aşılamak kullanarak PD2 orta plakalar döngüler. Hücre yoğunluğunu ayarlayınPD2 suyu 600 nm'de 0.05 bir optik yoğunluğa kadar daha önce tarif edildiği gibi 23. 1 ml gaz geçirmez şırınga içine bakteriyel hücre çözeltisi toplayın.
  7. ters bir mikroskop sahnede mikroakışkan cihaz monte edin. PD2 suyu içeren 5 ml gaz geçirmez şırınga bir giriş borusunu bağlayın. şırınga pompaları ile 5 ml Gaz Geçirmez şırınga takın.
  8. Bir atık haznesine çıkış borusunu bağlayın. 0.2 ul dk orta akış hızını korumak -1 30 dakika sistemini stabilize etmek için.
  9. bakteriyel hücre çözeltisi ihtiva eden bir 1 ml'lik gaz geçirmez şırınga ile yandan giriş tüpleri bağlayın. Kanal ulaşılana kadar kauçuk tüp aracılığıyla bakteriyel hücre çözümü yıkayın. Bölmeden önce, görüntü yakalama, bağlanmamış hücreleri temizlemek için 0.2 ul dk'lık bir araç akış hızı -1 30 dakika boyunca muhafaza edilir.
  10. ışık kontrol etmek mikroskop alan düzeltilmiş bölümü altında mikroskop deklanşör monte edin. deklanşör co deklanşör bağlayınntrol sistemi ve bilgisayara kapı kontrol sistemini bağlayın.
  11. mikroskop video portuna dijital bir kamera monte ve bilgisayara bağlayın. Menüden "deklanşör" işlevini seçin, time-lapse kayıt yazılımını çalıştırın ve yazılım ile çekim bağlantı kurmak için yazılımda otomatik olarak varsayılan olarak yüklenir deklanşör tanır.
  12. yazılım otomatik olarak varsayılan yakalama aygıtı olarak dijital fotoğraf makinesi tanımak ve yazılım ile dijital kamera ile iletişim kurmak için time-lapse kayıt yazılımı menüden "dijital fotoğraf makinesi" işlevini seçin.
  13. 20X faz-kontrast optikler kullanılarak kanalların birinde bakteri hücreleri bulup görüntü yakalama önce 40X objektif lens geçin.
  14. mikroskop görüntüleri elde etmek için menüden varsayılan parametreleri kullanarak "görüntü elde etme" işlevini seçin, time-lapse kayıt yazılımı çalıştırın.Sonra, "time-lapse Edinme" fonksiyonunu açın ve 6-24 saat X'in seğirmesi hareketliliğini gözlemlemek için gerekli deney bağlı süresince 30 sn 5,18,28 zaman aralığını ayarlamak fastidiosa 5,18,28. time-lapse kayıt başlatmak için "Tamam" a tıklayın. seçmek kayıt bittikten sonra bilgisayardaki hedef klasördeki görüntüleri yığını "farklı kaydet" menüden "Yığın fonksiyonunu" tıklayın.
  15. birden fazla kanal için, 6 saat boyunca birinci kanaldan her 30 saniye zaman atlamalı çekim. hedef hücreleri bulmak için bir sonraki kanala mikroskop objektif lens taşıyın. Deney dört kanal kullanmak üzere ayarlanmış ise dört kanal sırayla her görüntü yakalamak için yukarıda anlatıldığı gibi zaman atlamalı fonksiyonunu tekrarlayın. sürece üç ardışık gün boyunca zaman atlamalı görüntü yakalama devam edin. Bütün deneyler oda sıcaklığında (23 ± 2 ° C) gerçekleştirilmiştir.
  16. Bir içine zaman atlamalı görüntüleri derlemektime-lapse kayıt görüntüleme yazılımı kullanarak video dosyası. Run time-lapse kayıt yazılımı, menüden "Yığın işlevi" tıklatın ve bilgisayardan yığılmış dosyaları açmak için "openstack işlevini" seçeneğini seçin.
  17. tüm görüntüleri seçip "AVI" çıkış biçimi seçerek, yığın modülünden "filmi olun" fonksiyonunu başlatın. bilgisayardaki Hedef klasördeki video dosyasını saklamak için "farklı kaydet" seçeneğini tıklayın.
  18. bilgisayardaki hedef klasörün derlenen film seçin ve onları oynatmak. Sonra, oluşturulan video dosyaları bakteri hücrelerinin seğirmesi motilite aktivitesinin ortaya çıkan görselleştirme yoluyla tek hücre hareketliliğini gözlemlemek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Tip IV pilus-aracılı seğirmesi hareketlilik gösteren bir çevresel koloni saçak varlığı, X kolonileri gözlendi fastidiosa yabani tip ve tamamlayıcı Xf ΔpliG -C suşu (Şekil 1). Mutant XfΔpliG Ancak koloni çevresi etrafında bir saçak (Şekil 1) sergilemedi. Nano-mikroakışkan akış odalarına bakteri hücrelerinin Time-lapse görüntüleme seğirmesi motilite hem vahşi tip X gözlendi ortaya fastidiosa ve tamamlayıcı XfΔpliG -C (Yan V1, V3) XfΔpilG mutant hücreler ise deneyi (Yan V2) boyunca motilite seğirmesi sergilemedi. Mutant XfΔpilG Hücreleri PD2 suyu (Yan V2) nispeten küçük gevşek agrega kurdu. X'in aksine, hücrelerin fastidiosa yabani tip ve tamamlayıcı XfΔpilG- Cı D PD2 suyu eveloped büyük agrega (Şekil 2, (İlave V1, V3).

Şekil 1
Şekil 1:. X'in bakteri kolonisi periferik saçak Koloni marj özellikleri vahşi tip mutant Xf ΔpilG, ve tamamlayıcı XfΔpilG- C fastidiosa selofan steril bir tabaka ile kaplı PD2 agarı üzerinde büyümüş. Mutant XfΔpilG hariç olmak üzere, tüm koloniler tip IV pilus-aracılı seğirmesi motilite gösteren bir çevresel saçak sergilemiştir. Resimlerde kültür ortamı üzerinde büyüme, 5 gün sonra alınmıştır. Büyütme bar, 0.5 mm. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

_upload / 53816 / 53816fig2.jpg "/>
Şekil 2: X'in seğirmesi motilitesi Nano-mikroakışkan akış odasında fastidiosa hücreleri. test edilen tüm suş hücrelerinin seğirmesi motilite gözlem 6 gün boyunca kaydedildi. değerlendirmeler üç bağımsız video segmentlerinden yapılmıştır. Büyütme bar, 20 mikron.
Not: X'in seğirmesi motilitesini fastidiosa hücreleri kutup tip IV pili uzatılması, eki ve geri çekme yoluyla cam yüzeyleri boyunca tek hücre hareketi ile karakterize edilir. Tek hücre bir microfabricated akış odasında bir sıvı akımına karşı tercihli göç gözlenmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

6 / 53816supfig1.jpg "/>
Yan Şekil 1: Dört kanal mikroakışkan akış odası. Her iki ucunda medya ve medya dışarı konnektörleri ile her kanal. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Ek Film 1
Ek Film 1: motilite seğirmesi. (Sağ indirmek için tıklayın). Yabani tip X fastidiosa seğirmesi mikroakışkan akış odasında.

Ek Film 2
Ek Film 2: Bozulmuş twitching motilite. (Sağ indirmek için tıklayın). Motilite Xf mutant. XfΔpilG amicrofluidic akış odasının gözlenen.

Ek Film 3
Ek Film 3: seğirmesi motilite restore. (Sağ indirmek için tıklayın). Xf tamamlayıcı gerginlik hareketliliğini seğirmesi. XfΔpilG-Cı mikroakışkan akış odasının gözlenen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu çalışmada, biz X'in hareket davranışını karakterize fastidiosa PilG mutant Xf ΔpilG ve yeni tasarlanmış çoklu paralel nano-kanal mikro fl uidic odalarında tamamlayıcı XfΔpilG- C suşları. Yeni tasarlanan mikro fl uidic odaları tek bir 50 mikron genişliğinde kanal 18 ile daha önceki tasarımlara göre genişliği 100 mikron nano-kanal ile en fazla dört paralel odaları olabilir. geliştirilmiş geniş nano-kanal medyanın akan bakteri hücrelerinin giriş kolaylaştırır. Buna ek olarak, bu mikroflüidik odası oluşturmak ve monte etmek için), basit, 1'dir; 2) nispeten ucuz; ve 3) deneysel şartları değişen kolayca uygulanabilir. Bunun bir sonucu olarak, bu odacık tasarım çeşitleri altında bakteriyel hücrelerin hareketleri uzun süreli gözlem deney mikro-izin verir.

akımların Throu akışını stabilizegh mikro fl uidic kanal deneysel ortamlarda çeşitli altında bakteri hücrelerinin hareketlilik gözlem için sağlam bir akan mikro fl uidic mikro oluşturmak için kritik bir adımdır. önce bakteri hücrelerinin tanıtımına medya ile mikro fl uidic odaları kızarma ve bağlantı hortumu da odasında akışını dengelemek için önemli bir adımdır. Bununla birlikte, akış hızlı odasının sırasında hücrelerin tespit odacığın dışına bakteri hücreleri floş olacaktır. Mikro fl uidic kanaldan akan ortam doğru hızı, bir şırınga pompası kullanılarak ayarlanması gerekmektedir. Bu çalışmada, deney boyunca, akan ayarlandı ve min -1 en az 30 dakika boyunca önceden kanala bakteriyel hücreler tanıtmak için 0.2 ila 1 ul pompa ile stabilize edilmiştir. Hücreler mikro fl uidic kanal içine Bir kez, orta akış 0.2 ul m tutulmuştur-1 30 ila 60 dk sistemi istikrara kavuşturmak ve nonattached hücreleri çıkarmak için. Akışını dengelemek ve bakteri hücrelerinin hareketini gözlemlemek için net bir arka plan tutmak çok önemlidir. Görüntüler fi rma 0.2 ul dk -1 sabit bir akış hızını koruyarak tanıtıldı hücrelerin seğirmesi motilite aktivitesini aleyhte her 30 saniyede ele geçirildi. Deneyler odasında bakteri hücrelerinin toplanması gerekiyorsa, hücreler yavaş yavaş şırınga pompası hızını ayarlayarak 0.2 ul dk 110 -1 medyanın akış oranlarını artırarak dışarı atılabilir.

Mikro fl uidic odalarında bakteri hücre faaliyetleri 40X faz-kontrast optik ve görüntüleme yazılımı tarafından kontrol edilen dijital kamera ile kaydedilmiş time-lapse görüntüleri kullanılarak ters mikroskop aracılığıyla değerlendirildi. akış hızı ve görüntü yakalamak için zaman aralığı experim buna göre ayarlanabilirental gereksinimleri. Bir araç akış hızı 0.2 ul dakika olarak ayarlanır -1 zaman atlamalı görüntüler pilus aracılı bakteri hücreleri için 30 saniye kaydedildi ile Bununla birlikte, çoğu durumda, hız akar. Orta akış oranı 0.1 ul dk artar, diğer durumlarda, -1 deney boyunca, bakteriyel hücrelerin davranışı, her 10-15 saniye buna uygun yakalama görüntüleri kaydedilecektir. Time-lapse görüntüleri 6-24 saat süresince her 30 saniyede alınır ve her test suşu için bir kaynak görüntü dosyaları olarak kaydedildi. videolar daha sonra mutant ve yabani tip arasındaki motiliteler seğirmesi kontrast fenotipleri gösterilen her bir suş, 6-8 saat alınan görüntülerden uyulmuş / suşları (İlave V1, V2, V3) tamamlamaktadır.

macroscale paralel plaka akış odaları üzerinde nano mikro fl uidic odacıklı cihazlarda önemi hareketlerinin doğrudan muayene ve şarkı arasında toplamlar içerenBakterilerin Le hücreleri. Düşük maliyetli 5 ve düşük reaktif ve numune hacmi gereksinimlerine ek olarak, mikro fl uidic odaları avantajları bakteriyel kültür ve fl uid akış oranı üzerinden doğru kontrolü için bir akış mikroçevresinin inşaat kolaylığı vardır. Birden fazla paralel kanal analizi için uyumlu veri sağlayan tek bir deney kurulumunda farklı bakteri suşlarının gözlem izin verir. polar Pili olan bakterilerin flagella bağımsız seğirmesi motilite, bu nano mikro FL uidic odası içinde analizi için özel olarak uygundur. Bununla birlikte, bu mikro fl uidic odası bakteri hareketi genellikle çok hızlı ve rasgele yön gösteren olan flagellar-bağımlı bakteri hareketi için daha az uygundur. Bu sınırlama, bazen analı için 1 saat süreyle her 1 sn 2 en time-lapse görüntü yakalama hızı 0.05 ul dk orta akış hızı ayarlanarak -1 ve değiştirerek tehlikeye gireceğiNano-ölçekli bir ortamda flagellar aracılı bakteri hareketlerini ze.

Burada kullanılan mikroakışkan odası cihazları in vitro hareket davranışlarından sorumlu PilG fonksiyonel değerlendirme için doğrudan görsel kanıtlar sunmaktadır. Ayrıca, bu çalışmada da seğirmesi hareketlilik yoluyla hücre toplama hücre X. sinyalizasyon ve patojenite, biyofilm oluşumu için gerekli olduğunu ortaya koymaktadır fastidiosa. mikroakışkan cihazlar tarafından motilite seğirmesi bakterilerin Görselleştirme kolayca diğer tahlil yöntemleri ile ölçülmez bakterilerde davranışı içeren gen fonksiyonunu incelemek için yeni bir yaklaşım sunuyor. Bu yaklaşım, diğer bakteriyel sistemlere uygulanabilir. Mikroakışkan odası cihazları hücre-hücre ekleri, hücre toplamalardan, hareket desenleri ve biyofilm oluşumu ile ilişkili bakteri hücrelerinin fizyolojik davranışları tanımlamak için bir akış sistemi sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.

Acknowledgments

Bu çalışma ABD Tarım Dairesi, Tarımsal Araştırma Servisi tarafından desteklenmiştir. Bu yayındaki ticari adlar veya ticari ürünler belirli bilgi vermek amacıyla sadece belirtilen ve ABD Tarım Bakanlığı tarafından tavsiye veya onaylandığı anlamına gelmez. USDA bir fırsat eşitliği sağlayıcı ve işverendir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Biology materials
X. fastidiosa (Xf) Temecula wild type Costa, H. S., et al., 2004 22
pilG deletion mutant XfΔpliG Shi, X. Y., et al., 2007 26
pilG complementary strain XfΔpliG-C  Davis, M. J., et al. 1998 23
Physical materials and equipment
Disposable inoculating loops VWR international, Radnor, PA #22-363-607 quantitative procedures such as bacterial collection
Polydimethylsiloxane (PDMS) Dow Corning Corporation #0002709226 Sylgard 184 silicone Elastomeric Kits
AmScope MD2000 digital camera AmScope, Irvine, CA SE305R-AZ-E Image, video recording and measurement 
Tubes line Edgewood, NY #T4300 Connected to the syringe and microfluidic chamber
Plastic luer connectors Edgewood, NY Connected to the syringe and microfluidic chamber
Syringe pumps Pico Plus, Harvard Apparatus, MA #702209 The flow rate can be adjusted while the pump is running.
Syringes Gastight, Hemilton Company, Reno, NV #1005 Provide the flowing broth
Inverted Olympus IMT-2 microscope Olympus IMT-2 FLuoro PHase Image observation and recording
SPOT-RT digital camera Diagnostic Instruments, Inc., MI RT230 Image, video recording and measurement
Microscope Shutter The UNIBLITZ, US #LS2T2 Control camera’s exposure time
Microscope Shutter Control system The UNIBLITZ, US VCM-D1 VCM-D1 Single Channel CE/UL/CSA Approved Shutter Driver
MetaMorph Image software Universal Imaging Corp., PA Real-time super-resolution image processing 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Purcell, A. H., Hopkins, D. L. Fastidious xylem-limited bacterial plant pathogens. Annu. Rev. Phytopathol. 34, 131-151 (1996).
  2. Purcell, A. H. Xylella fastidiosa, a regional problem or global threat. J. Plant Pathology. 79, 99-105 (1997).
  3. Hopkins, D. L. Xylella fastidiosa: Xylem-limited bacterial pathogen of plants. Annu. Rev. Phytopathol. 27, 271-290 (1989).
  4. Mattick, J. S. Type IV pili and twitching motility. Annu. Rev. Microbiol. 56, 289-314 (2002).
  5. Meng, Y., et al. Upstream migration of Xylella fastidiosa via pilus-driven twitching motility. J. Bacteriol. 187, 5560-5567 (2005).
  6. Li, Y., et al. Type I and type IV pili of Xylella fastidiosa affect twitching motility, biofilm formation and cell-cell aggregation. Microbiology. 153, 719-726 (2007).
  7. Simpson, A. J. G., et al. The genome sequence of the plant pathogen Xylella fastidiosa. Nature. 406, 151-157 (2000).
  8. Maier, B., Potter, L., So, M., Long, C. D., Seifert, H. S., Sheetz, M. P. Single pilus motor forces exceed 100 pN. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, 16012-16017 (2002).
  9. Touhami, A., Jericho, M. H., Boyd, J. M., Beveridge, T. J. Nanoscale characterization and determination of adhesion forces of Pseudomonas aeruginosa pili by using atomic force microscopy. J. Bacteriol. 188, 370-377 (2006).
  10. Skerker, J. M., Berg, H. C. Direct observation of extension and retraction of type IV pili. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98, 6901-6904 (2001).
  11. Brown, D. C., Larson, R. S. Improvements to parallel plate flow chambers to reduce reagent and cellular requirements. BMC Immunol. 2, 9 (2001).
  12. Thomas, W. E., Nilsson, L. M., Forero, M., Sokurenko, E. V., Vogel, V. Shear-dependent 'stick-and-roll' adhesion of type 1 fimbriated Escherichia coli. Mol. Microbiol. 53, 1545-1557 (2004).
  13. Thomas, W. E., Trintchina, E., Forero, M., Vogel, V., Sokurenko, E. V. Bacterial adhesion to target cells enhanced by shear force. Cell. 109, 913-923 (2002).
  14. Bahar, O., Fuente, D. L., Burdman, S. Assessing adhesion, biofilm formation and motility of Acidovorax citrulli using microfluidic flow chambers. FEMS Microbiol. Lett. 312, 33-39 (2010).
  15. Thomas, W. E. Using a laminar flow system to explain shear-enhanced bacterial adhesion. Proceedings of ICMM2005, Third International Conference on Microchannels and Mini-channels. Toronto, Ontario, Canada, , 751-759 (2005).
  16. Fuente, D. L., et al. Assessing adhesion forces of type I and type IV pili of Xylella fastidiosa bacteria by use of a microfluidic flow chamber. Appl. Environ. Microbiol. 73, 2690-2696 (2007).
  17. DeLange, P. A., Collins, T. L., Pierce, G. E., Robinson, J. B. PilJ localizes to cell poles and is required for type IV pilus extension in Pseudomonas aeruginosa. Curr Microbiol. 55, 389-395 (2007).
  18. Fuente, D. L., Burr, T. J., Hoch, H. C. Mutations in type I and type IV pilus biosynthetic genes affect twitching motility rates in Xylella fastidiosa. J. Bacteriol. 189, 7507-7510 (2007).
  19. Ferandez, A., Hawkins, A. C., Summerfield, D. T., Harwood, C. S. Cluster II che genes from Pseudomonas aeruginosa are required for an optimal chemotactic response. J. Bacteriol. 184, 4374-4383 (2002).
  20. Cursino, L., et al. Identification of an Operon, Pil-Chp, That Controls Twitching Motility and Virulence in Xylella fastidiosa. Mol. Plant Microbe Interact. 10, 1198-1206 (2011).
  21. Hazelbauer, G. L., Falke, J. J., Parkinson, J. S. Bacterial chemoreceptors: High-performance signaling in networked arrays. Trends Biochem. Sci. 33, 9-19 (2008).
  22. Costa, H. S., et al. Plant hosts of Xylella fastidiosa in and near southern California vineyards. Plant Dis. 88, 1255-1261 (2004).
  23. Shi, X. Y., Dumenyo, C. K., Hernandez-Martinez, R., Azad, H., Cooksey, D. A. Characterization of regulatory pathways in Xylella fastidiosa: genes and phenotypes controlled by algU. Appl. Environ. Microbiol. 73, 6748-6756 (2007).
  24. Matsumoto, A., Young, G. M., Igo, M. M. Chromosome-Based Genetic Complementation System for Xylella fastidiosa. Appl. Environ. Microbiol. 75, 1679-1687 (2009).
  25. Davis, M. J., Purcell, A. H., Thomson, S. V. Isolation Media for the Pierce's Disease Bacterium. Phytopathology. 70, 425-429 (1980).
  26. Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Soft lithography. Annu. Rev. Mater. Sci. 28, 153-184 (1998).
  27. Chaudhury, M. K., Whitesides, G. M. Direct measurement of interfacial interactions between semispherical lenses and flat sheets of poly-(dimethylsiloxane) and their chemical derivatives. Langmuir. 7, 1013-1025 (1991).
  28. Cruz, L. F., Parker, J. K., Cobine, P. A., De La Fuente, L. Calcium-enhanced twitching motility in Xylella fastidiosa is linked to a single PilY1 homolog. Appl. Environ. Microbiol. 80, 7176-7196 (2014).

Tags

İmmünoloji Sayı 110, Hareketliliği seğirme tip IV pilus, Mikroakışkan akış odası
Rolü seğirmesi Motilitesi görselleştirme ve Karakterizasyonu<em&gt; PilG</em&gt; &#39;de<em&gt; Xylella fastidiosa</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shi, X., Lin, H. Visualization of… More

Shi, X., Lin, H. Visualization of Twitching Motility and Characterization of the Role of the PilG in Xylella fastidiosa. J. Vis. Exp. (110), e53816, doi:10.3791/53816 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter