Summary
يصف هذا البروتوكول مشرط التحميل الفلورسنت صبغة تقنية نقل الذي يقيس الاتصالات بين الخلايا من خلال القنوات الفجوة تقاطع. فجوة الاتصال بين الخلايا وصلي هو عملية الخلوية الرئيسية التي يتم من خلالها الحفاظ على توازن الأنسجة وتعطيل هذه الإشارات الخلوية له تأثيرات صحية سلبية.
Abstract
يصف هذا البروتوكول مشرط التحميل الفلورسنت نقل صبغة تقنية (SL-DT) الذي يقيس الاتصالات بين الخلايا من خلال القنوات تقاطع الفجوة، والتي هي عملية بين الخلايا الرئيسية التي يتم من خلالها الحفاظ على توازن الأنسجة. وقد تم ربط انقطاع الفجوة موصلي الاتصالات بين الخلايا (GJIC) من خلال المواد السامة والسموم والمخدرات، وما إلى ذلك العديد من الآثار السلبية على الصحة. وقد تم ربط العديد من الأمراض التي تصيب الإنسان مقرها الوراثية إلى حدوث طفرات في الجينات الفجوة تقاطع. تقنية SL-DT هو فحص وظيفي بسيط لتقييم في وقت واحد GJIC في عدد كبير من الخلايا. الفحص يشمل خلايا التحميل المسبق مع صبغة الفلورسنت ذلك عن طريق تشويش لفترة وجيزة في غشاء الخلية بشفرة مشرط من خلال مجموعة من الخلايا. ثم يسمح للصبغة الفلورسنت لاجتياز من خلال قنوات الفجوة تقاطع إلى الخلايا المجاورة لفترة معينة. ثم يتم إنهاء فحص بإضافة الفورمالين إلى الخلايا. انتشار فلووويتم تقييم صبغ rescent من خلال مجموعة من الخلايا مع مجهر epifluorescence ويتم تحليل الصور مع أي عدد من حزم البرامج المظهرية المتوفرة، بما في ذلك حزم البرمجيات الحرة وجدت في المجال العام. كما تم تكييف هذا الاختبار لفي الدراسات المجراة باستخدام شرائح الأنسجة من الأجهزة المختلفة من الحيوانات المعالجة. عموما، يمكن فحص SL-DT تخدم مجموعة واسعة من في المختبر الاحتياجات الدوائية والسمية، ويمكن أن يحتمل تكييفها لانشاء نظم إنتاجية عالية مع مضان الآلي التصوير المجهري والتحليل لتوضيح المزيد من العينات في وقت أقصر.
Introduction
ويتمثل الهدف العام من هذه الطريقة هو توفير تقنية بسيطة وشاملة وغير مكلفة نسبيا لتقييم السمية المحتملة للمركبات. هذا هو النهج في المختبر والتي يمكن استخدامها في خطوط الخلايا متعددة. يمكن القياسية مختبرات البيولوجيا الخلوية المزودة المجاهر epifluorescence إجراء البحوث باستخدام هذا الاختبار.
لقد كان لدينا المعرفة الأساسية من وظائف الخلية يعتمد بشكل كبير على اختبارات بيولوجية في المختبر، وأصبحت عنصرا أساسيا في تقييم السمية للأدوية، والملوثات البيئية، والملوثات الغذائية ولدت. للأسف، لا يوجد في المختبر النظام الأحيائي واحد التي يمكن أن تلبي شامل لمطالب لجميع التقييمات السمية. العديد من فحوصات المختبر تم تصميم والأمثل لتقييم وكذلك تقييم نقطة نهاية البيوكيميائية أو جزيئية محددة. وهذه في كثير من الأحيان جنبا إلى جنب في إنتاجية عالية شكلت لتعكس الاضطراب لمعين مسار نقل الإشارة، مثل مستقبلات هرمون الاستروجين مما يشير إلى 1. وكانت هذه الاستراتيجية ناجحة جدا، ولكن عددا كبيرا من مسارات نقل الإشارة المشاركة في التعبير الجيني يجعل مهمة اختيار مسار الإشارات المحددة لتقييم معقدة جدا. ويجري حاليا إعداد عالية البروتوكولات من خلال-وضع وتستخدم لقياس وقت واحد العديد من مسارات إشارات، الذي كان نهج واحد للتغلب على بعض أوجه القصور في المقايسات واحدة. ومع ذلك، فقد أدرجت ليس كل مسارات إشارات بنجاح إلى نهج أكثر شمولا، بالإضافة إلى مسارات الإشارات جديدة يجري باستمرار اكتشفت أن يزيد من تعقيد عملية التقييم هذه. استخدام الأرقام واسعة من النهج في المختبر، وخاصة من خلال ارتفاع-وضع أنظمة لتقييم السمية الشاملة هي أيضا مكلفة للغاية وغير مواتية لمعظم محقق واحد أدى المشاريع البحثية.
GJIC هو القصبات عمليةتسيطر htly تغيرات في التيار الكهربائي، وتركيز الكالسيوم، ودرجة الحموضة، والتوازن الأكسدة، التي تنظمها مسارات الإشارات بين الخلايا التنبيغ الرئيسية والتفاعل مع الغشاء والهيكل الخلوي البروتينات 2،3. وهكذا، وتثبيط GJIC يمكن أن تعكس أنواع مختلفة من الإجهاد الخلوية، وتعطل الوظائف الخلوية المختلفة، أو اضطرابات من مختلف مسارات نقل الإشارة. مقاربة أخرى للتغلب على استخدام محدودة اختبارات بيولوجية نقل الإشارة هو الاستفادة من الظواهر البيولوجية أن الكثير، إن لم يكن أكثر، والتضمين مسارات نقل الإشارة كذلك من قبل أنظمة الإشارات بين الخلايا التعاونية من خلال قنوات الفجوة تقاطع 4-8. على الرغم من أن أنظمة الإشارات بين الخلايا هي أيضا عديدة وتحت السيطرة مسار متعددة، إشارات بين الخلايا من خلال القنوات تقاطع الفجوة في النهاية وظيفة من القنوات التي يتم فتحها، مغلقة جزئيا أو مغلقة تماما. وهذا يوفر نقطة النهاية التي يمكن قياسها بسهولة باستخدام مختلففي أنظمة الأحيائي المختبر 7. وبالنظر إلى أن نقطة مجموعة التماثل الساكن من الأنسجة يتطلب فتح قنوات، وتحديد تأثير المركبات على الفجوة موصلي الاتصالات بين الخلايا (GJIC) هو نهج أكثر شمولا في تحديد الآثار السمية المحتملة للمركبات 4،8. في جوهرها، وهذه الظاهرة البيولوجية الهامة التي تلعب دورا محوريا في تنسيق متعددة الأحداث نقل الإشارة السيطرة على التعبير الجيني يسمح لتقييم واسعة من الآثار السمية. وهكذا، اختبارات بيولوجية التي تقيم GJIC هي نقطة انطلاق ممتازة لتقييم إمكانية السامة من المركبات.
وتستند هذه التقنيات الأكثر شمولا المستخدمة لتقييم GJIC على تحميلها مسبقا الخلايا مع التحقيق الفلورسنت ثم مراقبة هجرة الصبغة من خلية تحميل أو الخلايا إلى الخلايا المجاورة. وقد شملت التقنيات لتهيئة تحميلها على صبغ حقن مكروي 9، كشط تحميل 10، والميثيل استرات تحقيقات 11 10. بدلا من كشط أكثر الغازية، وطريقة مشرط تحميل هذا التقرير ينطوي على لفة لطيف من مشرط بشفرة الجولة من خلال أحادي الطبقة من الخلايا التي تقليل الضرر الغازية (الشكل 1). مزايا هذه التقنية هي تقييم السمية من مجموعة من الخلايا بدلا من الخلايا واحد من الفحص حقن مكروي. وعلاوة على ذلك، وبساطة هذا الاختبار يسمح للكشف السريع لوحات متعددة في وقت قصير في حين طرق استخدام التقنيات والأساليب التي تستخدم استرات الميثيل من تحقيقات الفلورسنت حقن مكروي بشكل ملحوظ أكثر استهلاكا للوقت وتتطلب أعلى بكثير مستوى المهارة.
رغم عدم وجود طريقة واحدة لتلبية جميع احتياجات دراسة GJIC. فحص SL-DT هو فحص بسيط وغير مكلفة إلى حد ما ومتعدد الاستعمالات التي يمكنتلبية العديد من احتياجات التقديرات الأولية من السميات من المركبات المختلفة. وتشمل المزايا الرئيسية: البساطة، لا حاجة خاصة للمعدات أو المهارات المطلوبة لأساليب أخرى مثل حقن مكروي، والانتعاش الفلورسنت بعد photobleaching من (FRAP) فحص وتفعيل المحلي الجزيئية فحوصات التحقيق الفلورسنت، والتقييم السريع والمتزامن لGJIC بشكل كبير عدد من الخلايا، يفضي إلى ارتفاع الإنتاجية انشاء مع مضان الآلي التصوير المجهري والتحليل، وكذلك قدرتها على التكيف للدراسات في الجسم الحي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وتمت الموافقة على بروتوكول لهذه الدراسة من قبل رعاية الحيوان واللجنة الاستفادة من المعاهد الوطنية للعلوم الصحية من اليابان، والتي هو فيها في الجسم الحي وقد أجريت التجارب، للتأكد من أن الفئران معاملة إنسانية وفيما يتعلق لتخفيف المعاناة.
1. SL-DT الأحيائي
- البذور 3 × 10 5 WB-F344 خلايا الظهارية كبد الفئران على 35 ملم لوحات ثقافة قطر التي تحتوي على النسور تعديل 5٪ مصل بقري جنيني المتوسطة بالاضافة الى ذلك، والثقافة الخلايا في حاضنة عند 37 درجة مئوية، و 100٪ الرطوبة النسبية (RH)، و 5٪ CO 2.
- ثقافة الخلايا حتى تصل إلى 100٪ التقاء (عادة 2 أيام) وإجراء العلاج التجريبي المطلوب من الخلايا كما هو موضح أدناه.
- إجراء التجارب الجرعة الاستجابة
- إضافة 10 ميكرولتر و 20 ميكرولتر من ملي حل الأوراق المالية 2 من فينانثرين في الأسيتونتريل٪ 100 و 4 ميكرولتر، 6 ميكرولتر، و 8 ميكرولتر من حل 20 ملي الأسهم من phenanthrene في 100٪ الأسيتونتريل إلى ثلاث لوحات من الخلايا التي تحتوي على 2 مل من متوسط النمو لكل وحدة تخزين إضافية من المحلول.
- إضافة 4 ميكرولتر، 6 ميكرولتر، 8 ميكرولتر، 10 ميكرولتر و 20 ميكرولتر من حل 100٪ من الأسيتونتريل إلى ثلاث لوحات من الخلايا التي تحتوي على 2 مل من متوسط النمو لكل وحدة تخزين إضافية تتمثل في حل الأسيتونتريل لتكون بمثابة السيطرة على السيارة.
- احتضان لوحات لمدة 15 دقيقة في حاضنة وضعت في 37 درجة مئوية، و 100٪ RH و 5٪ CO 2.
- انتقل إلى الخطوة 1.3.
- سلوك الوقت التجارب الاستجابة
- إضافة 7 ميكرولتر من ملي حل الأسهم 20 من فينانثرين في 100٪ الأسيتونتريل إلى ثلاث لوحات من الخلايا التي تحتوي على 2 مل من متوسط النمو للكل نقطة زمنية (أي، 0، 1، 2، 3، 4، 5، 10 دقيقة).
- إضافة 7 ميكرولتر من 100٪ الأسيتونتريل إلى ثلاث لوحات من الخلايا التي تحتوي على 2 مل من متوسط النمو لكل نقطة من الوقت لتكون بمثابة السيطرة على السيارة.
- احتضان لوحات في كل مرة ع المعينةoint في حاضنة عند 37 درجة مئوية، و 100٪ RH و 5٪ CO 2.
- انتقل إلى الخطوة 1.3.
- إجراء التجارب الانتعاش مرة
- إضافة 7 ميكرولتر من ملي حل الأسهم 20 من فينانثرين في 100٪ الأسيتونتريل إلى ثلاث لوحات من الخلايا التي تحتوي على 2 مل من متوسط النمو لمدة 15 دقيقة.
- إضافة 7 ميكرولتر من 100٪ الأسيتونتريل إلى ثلاث لوحات من الخلايا التي تحتوي على 2 مل من متوسط النمو لمدة 15 دقيقة لتكون بمثابة السيطرة على السيارة.
- صب المتوسطة التي تحتوي إما على فينانثرين أو الأسيتونتريل وشطف 3X مع كل 3 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS).
- إضافة 2 مل من متوسط النمو الطازج كل لوحة واحتضان لأوقات الانتعاش المطلوب (أي، 25، 35، 45، 60، 90، 120، 150، 180، 240، 360 دقيقة) في حاضنة عند 37 درجة مئوية، 100 ٪ RH و 5٪ CO 2.
- انتقل إلى الخطوة 1.3.
- تجارب آلية سير
- إضافة نقل الإشارة المانع، أي
- إضافة 5 ميكرولتر من 100٪ الأسيتونتريل إلى ثلاث لوحات من الخلايا التي تحتوي على 2 مل من متوسط النمو لمدة 15 دقيقة لتكون بمثابة السيطرة على السيارة.
- إضافة 7 ميكرولتر من ملي حل الأسهم 20 من فينانثرين في 100٪ الأسيتونتريل إلى ثلاث لوحات من الخلايا التي تحتوي على 2 مل من متوسط النمو بالإضافة إلى D609 لمدة 15 دقيقة إضافية.
- إضافة 7 ميكرولتر من 100٪ الأسيتونتريل إلى ثلاث لوحات من الخلايا التي تحتوي على 2 مل من متوسط النمو بالإضافة إلى 100٪ الأسيتونتريل لمدة 15 دقيقة إضافية لتكون بمثابة السيطرة على السيارة.
- انتقل إلى الخطوة 1.3.
- إجراء التجارب الجرعة الاستجابة
- تجاهل مستنبت إما عن طريق سكب بلطف المتوسط أو عن طريق الشفط فراغ.
ملاحظة: يجب التخلص من ثقافة المتوسط تحتوي على النفايات الخطرة بشكل مناسب. - شطف الخلايا ثلاث مرات مع كل 3 مل من برنامج تلفزيوني وإما صب أو نضح بين هذا وذاكن يشطف.
- ماصة 1 مل من 1 ملغ / مل لوسيفر صبغ أصفر يذوب في برنامج تلفزيوني (LY) في كل لوحة الخلية.
- التحميل المسبق الصبغة في الخلايا عن طريق المتداول بلطف # 20 الجراحية شفرة الصلب مع حافة مدورة من خلال مجموعة من الخلايا في ثلاث مناطق مختلفة من لوحة.
- تبدأ من خلال وضع مشرط عمودي (زاوية 90 درجة) و 5 ملم من حافة صفيحة الثقافة، ومن ثم لفة مشرط من هذه الزاوية العمودية إلى نحو زاوية من 15 درجة (انظر الشكل 1).
ملاحظة: ويتحقق ذلك عن طريق معسر مشرط بين السبابة والإبهام. استخدام الجاذبية للسماح للمشرط للذهاب بلطف من 90 درجة إلى 15 درجة موقف (كما شفرة دائرية تتحرك ببساطة على الخلايا). وهذه الحركة يترك خط المسافة البادئة ملحوظ بصريا.
- تبدأ من خلال وضع مشرط عمودي (زاوية 90 درجة) و 5 ملم من حافة صفيحة الثقافة، ومن ثم لفة مشرط من هذه الزاوية العمودية إلى نحو زاوية من 15 درجة (انظر الشكل 1).
- احتضان الخلايا مع الحل LY لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- صب أو نضح LY وشطف ثلاث مرات مع 3 مل من برنامج تلفزيوني لإزالة كافة extracellular صبغ للقضاء على مضان الخلفية خارج الخلية.
- إضافة 0.5 مل من 10٪ الفوسفات حل الفورمالين لإصلاح الخلايا.
ملاحظة: بعد تثبيت في الفورمالين، الهواء الجاف الخلايا وتخزينها في الظلام لمدة تصل إلى سنتين مع الحد الأدنى photobleaching من الصبغة LY. عند الاقتضاء، ترطيب مع 10٪ من محلول الفورمالين لتصور الجبهة صبغة الفلورسنت. - عرض الخلايا الثابتة باستخدام المجهر epifluorescence مجهزة مكعب مزدوج اللون لقمم الإثارة / انبعاث 428/536 نانومتر في التكبير من 200X. تنسيق بين جميع لوحات بحيث خط المسافة البادئة هو مواز للمجال الأفقي للرؤية.
ملاحظة: مكعب FITC مزدوج اللون يعمل بشكل جيد.- التقاط صورة مع كاميرا CCD والبرامج الداعمة.
- فتح البرامج الداعمة للكاميرا CCD واستخدام إعدادات التعرض للسيارات. استخدم زر "الاستيلاء" على اكتساب رقميا الصورة. حفظ الصورة على النحو ملفات .tif باستخدام زر "حفظ".
2. التكيف من SL-DT الفحص لأنسجة الكبد
- إزالة ما يقرب من سم شريحة 2 × 2 من الفص الأيسر من الكبد من 5 أسابيع من العمر، ذكر فيشر 344 الفئران باستخدام مقص تشريح ووضعه على البلاستيك تزن لوحة مغطاة الشاش الرطب 12.
- ماصة 0.5 مل من محلول برنامج تلفزيوني يحتوي على 1 ملغ / مل كل من إبليس لوحة صفراء ورودامين ديكستران (RD) على سطح شريحة الكبد في البلاستيك الوزن.
ملاحظة: RD هو الصبغة التي لا يمكن اجتياز قنوات تقاطع الفجوة وسيمثل الخلايا التي تم تحميلها. - جعل 3-5 شقوق حوالي 1 سم طويلة على سطح شريحة الكبد الذي يحتوي على محلول الصبغة في وزن اللوحة مع شفرة حادة ثم قم بإضافة صبغة إضافية كافية لملء الشقوق.
- احتضان النسيج لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة على البلاستيك وزن اللوحة.
- شطف ثلاث مرات مع 5 مل من برنامج تلفزيوني.
- إصلاح الأنسجة اوفهrnight في 30 مل من 10٪ الفوسفات الفورمالين في 50 مل أنبوب الطرد المركزي المخروطية في الظلام في درجة حرارة الغرفة.
- في اليوم التالي، وغسل الشرائح مع الماء، وتقليم الأنسجة حول شق مع مقص تشريح في 1 × 1 × 0.5 سم 3 شرائح ثم استخدام التقنيات القياسية لتضمين شرائح في البارافين (13).
- القسم شرائح عمودية على خط شق لبسمك 5 ميكرون وتخزين العينات في الظلام حتى جاهزة للتصوير باستخدام تقنيات باجتزاء قياسية مع 13 مشراح.
- استخدام المجهر epifluorescence مجهزة الكاميرا الرقمية CCD لتصور والتقاط الصور من الجبهات صبغة الفلورسنت وفقا للمادة 1.10 7.
3. تحديد مقدار GJIC
- قياس انتشار صبغة الفلورسنت باستخدام حزمة البرامج المظهرية (على سبيل المثال، يماغيج).
- انقر فوق علامة التبويب "ملف" ثم انقر فوق "فتح" لفتحالصورة المحفوظة.
- انقر على "أداة اليد الحر" في شريط تبويب أداة لتتبع الخطوط العريضة للجبهة صبغ.
- انقر فوق علامة التبويب "تحليل" ثم انقر فوق "القياس".
ملاحظة: هذا سيولد قيمة المنطقة في ورقة انتشار، والتي يمكن نسخها إلى برامج أخرى انتشار ورقة إذا رغبت في ذلك.
- باستخدام برنامج جداول البيانات، حساب جزء من التحكم (FOC) من خلال تقسيم المنطقة من انتشار الصبغة في لوحة التجريبية من منطقة سافر الصبغة في لوحة التحكم باستخدام المعادلة التالية:
وه = مجال انتشار الصبغة في الخلايا المعرضة للمتغير التجريبي، مثل الخلايا المعالجة بمادة كيميائية في جرعة أو زمنية محددة
وج = مجال انتشار الصبغة في السيطرة، والتي هي الخلايا تعامل مع السيارة المستخدمة لإذابة المواد الكيميائية ذات الاهتمام
ملاحظة: لتحديد تأثير السيارة،ومن شأن ه أن يكون مجال انتشار الصبغة في الخلايا المعالجة من قبل مركبة وشأن ج تكون المنطقة من انتشار الصبغة في الخلايا لم تعالج من قبل مركبة. أثر السيارة ويفضل أن يكون أقل من 10٪.
- التقاط صورة مع كاميرا CCD والبرامج الداعمة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وقد استخدم انقطاع GJIC على نطاق واسع والعلامات البيولوجية لتحديد المركبات السامة على المستويات جينية nongenotoxic السيطرة الجين الذي يؤدي الى تأثيرات صحية ضارة 14. على سبيل المثال، والهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات متعددة الحلقات والملوثات في كل مكان من البيئة ولكن تختلف في سميتها جينية بوصفها وظيفة من الهياكل الجزيئية من 15. وعادة ما يتم العثور على أقل متعددة الحلقات الوزن الجزيئي في تركيزات أعلى نسبيا من أعلى متعددة الحلقات الوزن الجزيئي في العديد من بيئات متنوعة مثل رواسب الأنهار الملوثة، لذلك من 15،16 دخان السجائر. فينانثرين مثال منخفض الوزن الجزيئي الهيئة العامة للإسكان التي تمتلك ثلاث حلقات البنزين مع جيب الزاوية تسمى منطقة الخليج. الرقم 2 هو عبارة عن سلسلة من الصور SL-DT من WB-F344 خلايا الظهارية كبد الفئران تعامل مع زيادة جرعة من فينانثرين. لاحظ انخفاضا في الهجرة سو صبغة الفلورسنت، لوسيفر الأصفر، مع جرعات متزايدة. يمكن تحديد مجالات الصور الممسوحة ضوئيا ككسر المراقبة (FOC). السيطرة على الشكل 2 وخلايا تعامل مع المذيب أن الهيئة العامة للإسكان تم حله في، وهي الأسيتونتريل. وعادة ما تتم التجارب SL-DT في مكررة أو ثلاث نسخ لكل محاكمة مع ما لا يقل عن ثلاث محاكمات مستقلة لكل معلمة التجريبية، والتي ستكون جرعة في هذه التجربة. ويمكن بعد ذلك القيم FOC أن متوسط، وتحليلها إحصائيا، ثم رسوم بيانية (انظر الشكل 3).
كما أجريت تجارب مماثلة بشكل روتيني لتحديد الوقت المناسب لتثبيط التي يسببها التسمم من GJIC، والفترة الزمنية اللازمة للتخلص من هذه تثبيط التي يسببها التسمم من GJIC بعد يتم نقل الخلايا إلى متوسطة خالية من السموم. ويبين الشكل 4 لكل من زمن الاستجابة والتعافي من تثبيط من فينانثرين (الفنيل ألانين). يمكن أيضا فحص SL-DT استخدامها لتحديد الآليات الكامنة التي السموم، والسموم dysregulate GJIC 4،16. يتم ذلك عن طريق الخلايا احتضان قبل مع مثبط الدوائية من مسار الإشارات المحددة قبل إضافة السم أو السم الذي dysregulates GJIC. إذا كانت سامة أو السم لم يعد dysregulates GJIC في وجود الأدوية المختارة التي كتل مسار الإشارات، ثم هذا المسار عازمة على أن تكون طريقا التنظيمي للGJIC، في حين أن هذه الممرات يمكن استبعاده اذا استمرت السم لdysregulate GJIC. يوضح الشكل (5) هذا المبدأ الذي 1-methylanthracene (1-MEA)، الهيئة العامة للإسكان آخر ثلاثة الحلقية التي تمنع GJIC، ولكن ليس في وجود D609، الذي هو المانع محددة إلى حد ما من فسفاتيديل محدد فسفوليباز C (PC-PLC). وهكذا، يحكم PC-PLC في مثل انزيم المرشح يشير تشارك في تثبيط الناجم 1-MEA-من GJIC. تم التحقق من صحة دور PC-PLC مع further التجريب 4،16. وعموما، فإن فحوصات SL-DT هي مواتية جدا لبدء عملية شبكات الإشارات رسم الخرائط المشاركة في الآليات لكيفية المواد السامة والسموم تمنع (dysregulate) GJIC. ويمكن أيضا أن هذا النهج أن تستخدم للكشف عن المنتجات الطبيعية التي يمكن أن تمنع مادة سامة أو السم من dysregulating GJIC. على سبيل المثال، ريسفيراترول، مضاد للأكسدة وجدت في تركيزات عالية في النبيذ والفول السوداني المنتجات الحمراء يمكن أن تمنع 1-الشرق الأوسط وأفريقيا من تثبيط GJIC (الشكل 6).
وقد تم تكييف الفحص SL-DT إلى شرائح الأنسجة من الحيوانات، ولاسيما في الكبد 17. حامض مشبع أوكتاني هو 8 الكربون المفلورة الأحماض الدهنية التي هي الملوثات البيئية المستمرة المعروف للحث على سرطان الكبد 12،17. باستخدام تقنية SL-DT تبين الأوكتاني لمنع GJIC في WB-F344rat نظام نموذجي الكبد في المختبر 18. في الجسم الحي المتابعة ديت الدراسةermined أن الأوكتاني أيضا تحول دون GJIC في كبد الجرذان F344 تعامل مع الأوكتاني، وبالتالي التحقق من صحة في المختبر نموذج النظام 12،17. الرقم 7 والصور الفلورسنت من هذه التجربة المتابعة تبين انتشار الصبغة في أنسجة الكبد في الفئران تعامل مع السيارة والأوكتاني.
الشكل 1: صورة الكرتون من الخطوة مشرط صبغ التحميل. كمثال على ذلك تبين أن عملية مشرط تحميل ينطوي على المتداول شفرة بدلا من تشريح أفقيا من خلال الخلايا لتقليل تلف الخلايا.
الشكل 2: التمثيلية الصور المجهرية الفلورسنت من الصبغة تنتشر من خلال تقاطعات الفجوة. وعولج WB-F344 كبد الفئران خلايا الظهارية لمدة 15 دقيقة مع فيالتجعيد جرعة من فينانثرين، وجدت الهيئة العامة للإسكان السائد في البيئة. شريط مقياس = 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: منحنى الاستجابة للجرعة من الخلايا الظهارية WB-F344 كبد الفئران المعالجة فينانثرين. تم حساب مجالات الصور SL-DT ثم ذكرت بأنه جزء من السيطرة، والتي كانت الخلايا المعالجة مع السيارة (الأسيتونتريل). كل نقطة البيانات هي في المتوسط من ثلاث تجارب مستقلة وأشرطة الخطأ والانحرافات المعيارية في حد الثقة 95٪ لكل جرعة بعد وقت التعرض 15 دقيقة. تم استخدام وظيفة اللوجستية أربعة المعلمة لتتناسب مع الخط من خلال نقاط البيانات. يرجى CLI CK هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل (4): مع مرور الوقت منحنى استجابة استعادة الخلايا الظهارية WB-F344 كبد الفئران المعالجة فينانثرين. بعد تثبيط كامل للGJIC بعد 10 دقيقة من التعرض، تم تحويل فينانثرين المتوسط تحتوي على (الفنيل ألانين) لPHE خالية المتوسطة ومن ثم تم رصد الخلايا لمدة التعافي من كبت. تم حساب مجالات الصور SL-DT ثم ذكرت بأنه جزء من السيطرة، والتي كانت الخلايا المعالجة مع السيارة (الأسيتونتريل). كل نقطة البيانات هي في المتوسط من ثلاث تجارب مستقلة وأشرطة الخطأ والانحرافات المعيارية في حد الثقة 95٪. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
her.within الصفحات = "1"> 
هو تثبيط GJIC بنسبة 1-methylanthracene تعتمد على فسفاتيديل محدد فسفوليباز C. 1-methylanthracene (1-MEA) هو الهيئة العامة للإسكان انتشارا وجدت في البيئة: الرقم 5. اللوحة اليسرى تمثل الخلايا تعامل مع السيارة (الأسيتونتريل، 0.35٪ ت / ت). وتمثل لوحة المتوسطة WB-F344 كبد الفئران الخلايا الظهارية المعالجة لمدة 15 دقيقة مع 70 ميكرومتر 1-الشرق الأوسط وأفريقيا. اللوحة اليمنى تمثل خلايا سابقة التجهيز لأول مرة لمدة 20 دقيقة مع 50 D609 ميكرومتر، وفسفاتيديل محدد فسفوليباز C المانع، تليها إضافة 70 ميكرومتر 1-الشرق الأوسط وأفريقيا لمدة 15 دقيقة إضافية. شريط مقياس = 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
281fig6.jpg "/>
الشكل 6: ريسفيراترول حالت دون تثبيط GJIC بنسبة 1-methylanthracene. اللوحة اليسرى تمثل الخلايا تعامل مع السيارة (الأسيتونتريل، 0.35٪ ت / ت). ريسفيراترول هو مضاد للأكسدة الموجودة في النبيذ والفول السوداني المنتجات الحمراء. وتمثل لوحة المتوسطة الخلايا المعالجة لمدة 15 دقيقة مع 70 ميكرومتر 1-الشرق الأوسط وأفريقيا. وتمثل اللوحة اليمنى خلايا سابقة التجهيز لأول مرة لمدة 20 دقيقة مع 50 ميكرومتر ريسفيراترول تليها إضافة 70 ميكرومتر 1-الشرق الأوسط وأفريقيا لمدة 15 دقيقة إضافية. شريط مقياس = 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 7: خارج الحي المقايسات SL-DT من GJIC في شرائح الكبد من الذكور F-344 الفئران. وتمثل اللوحة اليسرى شريحة من TISS الكبدرق من الفئران تعامل مع السيطرة على السيارة، ثنائي ميثيل سلفوكسيد، لمدة 24 ساعة. وتمثل اللوحة اليمنى شريحة من أنسجة الكبد من الفئران بعد تناوله داخل الصفاق من 100 ملغم / كغم حامض مشبع أوكتاني بعد 24 ساعة. الأوكتاني، الملوثات البيئية انتشارا، هو ورم تعزيز بيروكسية ناشر أن يدفع تضخم الكبد وأظهرت لمنع تقاطعات الفجوة باستخدام نموذج في المختبر. وقد تم شق تحميل الصبغة على شرائح الكبد من المركبات والحيوانات الأوكتاني المعالجة، ثم جرى ثابتة، وقلص ومقطوع. مستنسخة من منظور الصحة البيئية 12. شريط النطاق = 20 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
فحص SL-DT هي تقنية بسيطة وتنوعا في قياس GJIC، ولكن هناك العديد من المخاوف الحرجة التي يجب أخذها في الاعتبار في تصميم البروتوكولات التجريبية المناسبة. لقياس قوة من GJIC باستخدام فحص SL-DT يجب أن يكون هناك انتشار صبغ جيد للLY من خلال تقاطعات الفجوة من الخلايا. في الحد الأدنى، وينبغي اختيار الوقت المناسب للتأكد من أن الصبغة ينتشر من خلال ثمانية أو أكثر من صفوف من الخلايا من الخلايا مشرط تحميلها في كلا الاتجاهين. أيضا، لسهولة قياس المسافة التي الصبغة هاجر من الخلايا مشرط تحميل، حدد عامل التكبير الذي يؤكد انتشار صبغ لوحات تحكم يملأ 70-90٪ من مجال الرؤية. لWB-F344 خلايا الظهارية كبد الفئران، ثلاثة حضانة دقيقة مع الحل LY كافية للجبهة صبغ لتجاوز أربعة صفوف الخلية، والتكبير من 200X هو الأمثل. تزرع الخلايا على لوحات قطرها 35 مم، وهي قابلة للتعديل تماما لloadiنانوغرام الصبغة في الخلايا مع مشرط. ومع ذلك، فإن الخلايا يمكن زراعتها في الآبار الصغيرة، ولكن استخدام مشرط غير ممكن، لا سيما في 96 لوحات ثقافة جيدا. للآبار صغيرة، واستخدام حافة مستديرة ذات الرؤوس قطع صغيرة يمكن أن يصلح في البئر، ومرة أخرى، واستخدام إجراءات المتداول. هذا العمل المتداول هو خطوة حاسمة كما هو الغازية الحد الأدنى ويوفر خط نظيفة جدا التحميل الذي يمنع الخلايا من تمزق وخلق فجوة خالية من الخلايا كبيرة نموذجية من طريقة كشط الأصلي. بدلا من ذلك، إبرة الوخز بالإبر يمكن أن تستخدم فيها لمسة صغيرة من الإبرة يقوم بعمل لطيفة من صبغ تحميل في الخلايا.
خلية أنواع أخرى يمكن أن تستخدم في هذا الاختبار. ومع ذلك، واختيار الخلايا وفهم أدوار GJIC في نوع خلية معينة مهمة في صياغة الفرضيات المناسبة وتصميم التجارب. الخطوة الأولى والأكثر وضوحا هو تطوير الظروف ثقافة الخلية التي تقاطعات الفجوة الوظيفية هي اكسبريسالحوار الاقتصادي الاستراتيجي. في أنواع الخلايا المتمايزة جيدا، والتي تؤدي وظائف الأيض الخاصة، تقاطعات الفجوة عادة تلعب دورا في تنسيق المسارات الأيضية بين خلايا متجاورة. أنواع الخلايا المتمايزة جيدا محدودة، إن وجدت، والقدرات التكاثري والقنوات ربما تلعب دورا الأنسجة التمثيل الغذائي المحدد الذي غالبا ما يعتمد على التشكل وترتيب محدد من الخلايا. على سبيل المثال، myocytes القلب هي خلايا ممدود حيث تتماشى تقاطعات الفجوة في الغالب على أقراص مقحم، وبالتالي استخدام طريقة SL-DT يتطلب التوفيق بين الخلايا، الذي يمكن القيام به في طبق محززة. وبالتالي، يجب أن يتم الاعتبارات متأنية لكل نوع من الخلايا. دراسات مع مزارع الخلايا العصبية عادة غير متموجة، وتتطلب أيضا نقاط اتصال محددة، مما يجعل استخدام SL-DT فحوصات غير مناسب وبديل GJIC يجب أن تستخدم.
في أنواع الخلايا التكاثري، مثل الجذعية والخلايا الاولية في وقت مبكر، يلعب GJIC دورا أكثر أهميةفي تنسيق خلية اشارة الأحداث التي تتحكم في التعبير الجيني تنظيم الأحداث مولد للتفتل. في كبد الفئران خلايا الظهارية WB-F344 المستخدمة في هذا البروتوكول يندرج ضمن هذه الفئة. الجينات الفجوة تقاطع حاسمة خلال تنمية الأنسجة وصيانة 19-21. على الرغم من أن يتم التعبير عن قنوات الفجوة تقاطع وشكلت على جميع الأسطح غشاء الخلية البلازما وخلايا التكاثري هي حساسة جدا لعوامل النمو، التي تمنع GJIC. الاعتبارات الهامة لخلية أنواع التكاثري وعادة ما تكون موجهة أكثر إلى تكوين وسائل الإعلام. عوامل النمو وغالبا ما تكون في الزائدة، وخصوصا في وسط غير معروف تحتوي على الجنين المصل البقري، وربما تكون تقاطعات الفجوة الخلايا "في حالة مغلقة. أسهل طريقة لإنشاء GJIC في هذه الخلايا هو تقليل أو إزالة مستويات المصل لمدة 4 إلى 24 ساعة قبل التجريب، على الرغم من أن 24 ساعة ستكون طويلة جدا للخلايا مع عدم وجود مصل لأنها apoptose. الخلايا الظهارية WB-F344 الكبد المستخدمة في التجارب المعروضة في رورقته ليست حساسة بشكل مفرط إلى المصل دون الحاجة إلى خفض مستويات المصل. في المقابل، يجب أن التجارب باستخدام C10 الماوس خط الخلية يكون المصل أول حرم لإنشاء GJIC 22. على الرغم من أن مستويات المصل تختلف بين أنواع الخلايا اثنين، ومن المثير للاهتمام، وردت الخلايا C-10 بطريقة مماثلة جدا لأيزومرات الميثيل من أنثراسين 22،23.
وتشمل الاعتبارات الأخرى لتحقيق نتائج نوعية يجرون التجارب على جرعات غير السامة للخلايا. تحتاج إلى فحص المجهري مع النقيض المرحلة لتحديد معالم شكلية الصحية المتوقعة من نوع من الخلايا قبل وبعد العلاج الخلايا. للتأكد من أن آثار مجمع على وظيفة الفجوة تقاطع لا يرجع إلى استجابة السامة للخلايا العامة، وينبغي أن يتم فحوصات السمية الخلوية لكل مركب في نفس الوقت والجرعة المستخدمة في فحص SL-DT. إجراء التجارب لتحديد ما إذا كان تأثير مثبط للمركب على GJIC هو عكسها هو أيضا تجربة جيدة لسببين على الأقل. مومركبات الحادي اختبار عكسية تمنع GJIC، ولكن إذا لم يكن هناك انتعاش GJIC، ثم السمية الخلوية قد يكون من شأنه أن تكون هناك حاجة إلى عامل وإجراء مزيد من التجارب. ومع ذلك، إذا تم استعادة GJIC ثم جرعة وكان الوقت اختبار ربما لا السامة للخلايا. هناك آثار بيولوجية لتثبيط عكسها من GJIC. الآثار الصحية السلبية للكثير من المواد السامة والسموم البيئية والتي تنقلها الأغذية هي عملية عكسية. لذلك فهم هذه العودة إلى الوراء على المستوى الجزيئي هو المهم. إذا لم مركب معروف تمنع عكسية GJIC، ثم الآثار المترتبة على صحة الكائن الحي يمكن أن تكون مختلفة تماما عن معظم وكلاء آخرين ويجب أن يكون جزءا من حسابات المخاطر.
تحديد الجرعة والوقت الذي يتطلبه تثبيط GJIC هو عملية تكرارية. لتوفير الوقت والمال للوازم الثقافة والنهج الأفضل هو البدء بجرعة عالية، والتي تعتمد على الذوبان والوقت (عادة ساعة واحدة، حيث أن معظم تثبيطيحدث في أقل من 15 دقيقة)، ومن ثم تقليل الوقت والجرعة إلى النصف في عملية الحكيمة خطوة حتى يكون هناك أي تأثير. إذا لم يكن هناك تثبيط بجرعة عالية في ساعة واحدة، ثم انقر نقرا مزدوجا الفترة الزمنية في عملية الحكيمة خطوة. ويمكن أن يتم التجارب الأولية على لوحة واحدة. مرة واحدة يتم وضع تقديرات الوقت العامة وجرعات، ثم المزيد من دراسات دقيقة ويمكن تصميم بكفاءة مع أحجام العينات المناسبة لالتحليلات الإحصائية. يمكن للمرء ميزة التصميم التجريبي سيكون لاستخدام الجرعة والوقت التي تصل إلى 75-100٪ تثبيط. ومن الواضح أن التفسيرات النهائية للنتائج أن يكون عاملا من المعلمات أعلاه. ومع ذلك، من خلال تحديد أول التأثير البيولوجي، حتى لو كانت الجرعة والوقت قد لا تكون ذات صلة في الجسم الحي، ويمكن للجرعات أنشئت تلعب دورا في حالات التعرض المهني، أو إلى السكان العام تتعرض لعوامل أخرى تؤثر أيضا GJIC مع المضافات المحتملة أو تأثيرات تعاونية.
تثبيط Gلجنة الاستخبارات المشتركة من قبل معظم المركبات عادة لا متغير بدرجة كبيرة و2-3 مكررات (أن كل تكرار تكون لوحة الثقافة أو جيد) يكفي لتوليد جرعة والوقت منحنيات استجابة. ومع ذلك، إذا تقلب مرتفع ثم ستكون هناك حاجة إلى المزيد من مكررات للحصول على قيمة دقيقة لالمتغير التابع معينة من محاكمة مستقلة واحدة. وبطبيعة الحال، لا بد من القيام به لالتحليلات الإحصائية لا يقل عن ثلاث محاكمات مستقلة.
بساطة هذا الاختبار وتقييم أحجام كبيرة سكان الخلية هي ميزة للعديد من التطبيقات. وهذا مفيد بشكل خاص في العديد من التقييمات السمية. ومع ذلك، هناك قيود المقايسات SL-DT، والتي يمكن أن تعتمد على عدة عوامل. واحد هو ما إذا كان هذا الأسلوب هو مناسبة للخلايا التي تجري دراستها. أن هذا الاختبار لا تعمل بشكل جيد للخلايا التي لا تصل confluency عالية مع جهات الاتصال متفرقة في جميع أنحاء لوحة الثقافة أو جيدا. أن تشترك تقنيات بديلة، مثل حقن مكرويnsidered. بدلا من ذلك، وفحص SL-DT يمكن تعديلها. وقد حققت نجاحا في خلايا تحميل واحدة مع إبرة الوخز بالإبر، الأمر الذي يتطلب عمل التواء بسيط عند تحميل صبغ 7. ان انتشار صبغ يكون شعاعي في حالات أكثر متموجة أو غير متبلور من خلال زراعة الخلايا مع جهات الاتصال خلية متفرقة. ويوصى إضافة رودامين ديكستران (RD، 1 ملغ / مل) إلى محلول الصبغة LY للتجارب حيث تحديد الخلايا تحميل سيكون من الصعب بدون علامة (مثل RD). RD كبير جدا لاجتياز قنوات الفجوة مفترق طرق، وبالتالي تحديد التي تم تحميلها الخلايا. ويمكن أيضا أن تستخدم RD في كل SL-DT الفحص، ولكن مشرط يترك المسافة البادئة على الجزء السفلي من الطبق تحديد حيث يتم تحميل الخلايا. فحص SL-DT هو أيضا لا يفضي إلى قياس التغيرات في GJIC بين أنواع مختلفة من الخلايا مثل تحميل صبغ لن تميز بين أنواع الخلايا. مرة أخرى حقن مكروي هو الأسلوب المفضل، ولكن إبرة الوخز بالإبر طريقة ميجحزب التحرير يعمل أيضا إذا كان أحد يمكن أن تستهدف خلية معينة باستخدام المجهر.
الفحص التعاون الأيض هو طريقة أخرى لقياس GJIC. وكان هذا أسلوب واحد من أول الأحيائي موحد لGJIC 24. في هذا الاختبار، وكانت من النوع البري الهامستر الصيني خلايا V79 (6 ثيوغوانين حساسة) والخلايا المقاومة لل6 ثيوغوانين شارك في تربيتها بكثافة عالية في منها 6-ثيوغوانين (6-TG) الخلايا المقاومة لا استقلاب 6-TG لالمستقلب السام، مما يمنحها القدرة على مقاومة. شارك في الثقافة مع 6-TG الحساسة خلايا النتائج في نقل المستقلب السام من خلال تقاطعات الفجوة مما أدى إلى موت الخلايا حيث تثبيط النتائج GJIC في إنقاذ 6-TG الخلايا المقاومة عن طريق منع نقل السامة الأيض 6-TG من الخلايا الحساسة 6-TG. على الرغم من أن الاستفادة من هذا الاختبار هو أنه مينيملي، عائقا كبيرا هو أنه يتطلب أسبوع واحد لإكمال، الأمر الذي يجعل الجرعة والوقت واسعة التقييمات تعتمد من TOXIcants وكذلك الدراسات الميكانيكية، وما إلى ذلك غير عملي لتقييم الكثير من المواد الكيميائية.
فحص SL-DT لا يفضي إلى الدراسات الميكانيكية التي تحتاج إلى تتبع هجرة الأصباغ من خلال أنواع مختلفة من الخلايا، التي حقن مكروي هو الأسلوب المفضل. بدلا من ذلك، فإن الخلايا يمكن مسبقة مع استر الميثيل من الأصباغ الفلورية. تحميل الصبغة هي وظيفة من المونوأمينوأوكسيداز الميثيل داخل الخلية والذي يتحلل في صبغ محبة للدهون في شكله أكثر ماء، وبالتالي محاصرة الصبغة في الخلايا. هذا هو وسيلة أقل الغازية لتهيئة تحميلها على التحقيق الفلورسنت، ولكن الطريقة الأكثر شيوعا لقياس الاتصالات بين الخلايا حيث يتم مسبقة عن الخلايا عن طريق هذا الأسلوب هو فحص FRAP 11. ميزة FRAP هي مرة أخرى القدرة على تقييم تقاطعات الفجوة في زنازين انفرادية، والتي هي ممتازة للدراسات الميكانيكية. ولكن العيب من FRAP يكمن في: عدم القدرة على قياس السكان من الخلايا للتقييم السمية،الحاجة إلى cytometers المجاهر / ليزر متطورة ومكلفة جدا، والحاجة إلى الخبرة الفنية من ذوي المهارات العالية، هي الغازية باعتدال من الجذور الحرة التي تنتجها الليزر، ولا تؤدي إلى إنتاجية عالية.
وفي الآونة الأخيرة تم تطوير أسلوب آخر. تفعيل المحلي الجزيئي طريقة التحقيق فلوري (LAMP) 25، والتي تقوم على جيل جديد من fluorophores مثل الكومارين في قفص. على غرار فحص FRAP، مسبقة من جميع الخلايا مع الأصباغ التي تحتوي على استر الميثيل، ومع ذلك، تصبح هذه الأصباغ الفلورية على إضاءة موضعية اللاحقة ليزر مع جرعة صغيرة من الأشعة فوق البنفسجية، والتي ربما تنتج ROS أقل بكثير من FRAP. مرة أخرى، هذا الاختبار لديه نفس القيود المفروضة على فحص FRAP. التطورات الأخيرة الأخرى لقياس GJIC هي تقنيات تحميلها مسبقا والمظلة التي تضم أيضا استخدام الميثيل الأصباغ استر الفلورسنت. وتنطوي هذه التقنية تحميلها مسبقا تعليقالخلايا مسبقة مع التحقيق الفلورسنت جنبا إلى جنب مع نظرائهم تفريغها ومن ثم يتم مطلي، وسمحت لتشكيل أحادي الطبقة متموجة. انتشار للصباغة ويمكن بعد ذلك لاحظ مع مجهر epifluorescence 26. في مقايسة المظلة، ومضافين الخلايا مسبقة مع لجنة التحقيق الفلورسنت على أحادي الطبقة من الخلايا تفريغها، ولاحظت انتشار الصبغة مع مجهر epifluorescence 27. مرة أخرى، والتقنيات المذكورة أعلاه هي من الناحية الفنية أكثر تحديا للتحليل إنتاجية عالية، ويجب أن يكون مطلي على الفور في القريب التقاء وتتطلب فترة زمنية لإعادة المرتكز الخلايا.
وعموما، فإن فحص SL-DT هي تقنية غير مكلفة نسبيا، بسيطة ومتعددة الاستعمالات التي تستخدم المعدات، مثل حاضنات CO 2 خلية الثقافة، خزانات السلامة البيولوجية والمجهر epifluorescence، التي توجد عادة في معظم مختبرات زراعة الخلايا. مع الحد الأدنى من خبرة العديد من لوحات يمكن معالجتها في يوم واحد، والتي تفضي وأو فحص المركبات السمية فضلا عن المنتجات الطبيعية التي تمنع أو عكس آثار المواد السامة والسموم. أيضا، والتكيف مع هذا الاختبار لإنتاجية عالية يحلل باستخدام الروبوت، مع أنظمة التصوير مضان المجهري والتحليل الآلي سيكون لديها القدرة على فحص أعداد كبيرة من المواد السامة والسموم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| WB-F344 rat liver epithelial cells | From Drs. J. W. Grisham and M. S. Tsao of the University of North Carolina (Chapel Hill, NC) | none | Provided by Drs. J. W. Grisham and M. S. Tsao University of North Carolina-Chapel Hill-NC |
| 35 mm Culture Plates | Corning | 430165 | |
| 25 cm2 culture flasks | Corning | 430639 | |
| 75 cm2 culture flasks | Corning | 430641 | |
| D-medium, an Eagles modified medium | ThermoFisher/GIBCO | Formula No. 78-5470EF | |
| fetal bovine serum | ThermoFisher/GIBCO | 10437 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | ThermoFisher/GIBCO | 15050 | |
| phosphate buffered saline | homemade | see below for ingredient cat#'s | 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2PO4, 2 mM KH2PO4 |
| KCl | JT Baker - Mallinckrodt | 3040-01 | |
| NaCl | JT Baker - Mallinckrodt | 3624-05 | |
| Na2HPO4 | JT Baker - Mallinckrodt | 3819--01 | |
| KH2PO4 | JT Baker - Mallinckrodt | 3246-01 | |
| Lucifer Yellow CH, lithium salt | Sigma-Aldrich Chemical | L0259 | |
| rhodamine-dextran | Sigma-Aldrich Chemical | R9379 | |
| 1-methylanthracene | Sigma-Aldrich Chemical | ||
| phenanthrene | Sigma-Aldrich Chemical | P11409 | |
| resveratrol | Sigma-Aldrich Chemical | R5010 | |
| D609 | Tocris Bioscience | 1437 | |
| acetonitril | EMD | AX0145-1 | |
| 37% solution formaldehyde | JT Baker - Mallinckrodt | 2106-01 | |
| #20 surgical blade | Fine Science Tools Inc. | 10317-14 | |
| 50 ml conical sterile tubes | Thermo scientific | 339652 | |
| Nikon epifluorescence microscope | Nikon -Mager Scientific | Eclipse TE300 | |
| Nikon FITC dichroic cube | Nikon -Mager Scientific | 96107 | |
| CCD camera | Nikon -Mager Scientific | Nikon Cool Snap EZ CCD | |
| imaging system | Nikon -Mager Scientific | Nikon NIS-Elements F2.2 imaging system. | |
| ImageJ | National Institute of Health | http://imagej.nih.gov/ij/ |
References
- Rotroff, D. M., et al. Predictive endocrine testing in the 21st century using in vitro assays of estrogen receptor signaling responses. Environ.Sci.Technol. 48 (15), 8706-8716 (2014).
- Axelsen, L. N., Calloe, K., Holstein-Rathlou, N. H., Nielsen, M. S. Managing the complexity of communication: regulation of gap junctions by post-translational modification. Front Pharmacol. 4, 130 (2013).
- Nielsen, M. S., et al.
- Sovadinova, I., et al. Phosphatidylcholine specific PLC-induced dysregulation of gap junctions, a robust cellular response to environmental toxicants, and prevention by resveratrol in a rat liver cell model. PLoS.One. 10 (5), e0124454 (2015).
- Trosko, J. E., Chang, C. C. Biologically Based Methods for Cancer Risk Assessment. Travis, C. C. , Plenum Press. New York. 165-179 (1989).
- Trosko, J. E. Biomarkers and occupational health: progess and perspectives. Mendelsohn, M. D., Peeters, J. P., Normandy, M. J. , John Henry Press. Washington D.C. 264-274 (1995).
- Upham, B. L. Role of integrative signaling through gap junctions in toxicology. Curr.Protoc.Toxicol. 47, 2.18:2.18.1-2.18:2.18.18 (2011).
- Vinken, M., et al. Connexins and their channels in cell growth and cell death. Cell.Signal. 18 (5), 592-600 (2006).
- Browne, C. L., Wiley, H. S., Dumont, J. N. Oocyte-follicle cell gap junctions in Xenopus laevis and the effects of gonadotropin on their permeability. Science. 203 (4376), 182-183 (1979).
- El-Fouly, M. H., Trosko, J. E., Chang, C. C. Scrape-loading and dye transfer. A rapid and simple technique to study gap junctional intercellular communication. Exp.Cell Res. 168 (2), 422-430 (1987).
- Wade, M. H., Trosko, J. E., Schindler, M. A fluorescence photobleaching assay of gap junction-mediated communication between human cells. Science. 232 (4749), 525-528 (1986).
- Upham, B. L., et al. Structure-activity-dependent regulation of cell communication by perfluorinated fatty acids using in vivo and in vitro model systems. Environ. Health Perspect. 117 (4), 545-551 (2009).
- Paraffin Processing of Tissue. Protoplasma. , http://protocolsonline.com/histology/sample-preparation/paraffin-processing-of-tissue (2012).
- Trosko, J. E. Gap junctional intercellular communication as a biological "Rosetta stone" in understanding, in a systems biological manner, stem cell behavior, mechanisms of epigenetic toxicology, chemoprevention and chemotherapy. J. Membr. Biol. 218 (1-3), 93-100 (2007).
- Upham, B. L., Weis, L. M., Trosko, J. E. Modulated gap junctional intercellular communication as a biomarker of PAH epigenetic toxicity: structure-function relationship. Environ.Health Perspect. 106, 975-981 (1998).
- Upham, B. L., et al. Tumor promoting properties of a cigarette smoke prevalent polycyclic aromatic hydrocarbon as indicated by the inhibition of gap junctional intercellular communication via phosphatidylcholine-specific phospholipase. C. Cancer Sci. 99 (4), 696-705 (2008).
- Sai, K., Kanno, J., Hasegawa, R., Trosko, J. E., Inoue, T. Prevention of the down-regulation of gap junctional intercellular communication by green tea in the liver of mice fed pentachlorophenol. Carcinogenesis. 21 (9), 1671-1676 (2000).
- Upham, B. L., Deocampo, N. D., Wurl, B., Trosko, J. E. Inhibition of gap junctional intercellular communication by perfluorinated fatty acids is dependent on the chain length of the fluorinated tail. Int. J. Cancer. 78 (4), 491-495 (1998).
- Trosko, J. E., Tai, M. H. Infections and inflammation: Impacts on oncogenesis. Impacts on Oncogenesis. Contrib Microbiol. Dittmar, T., Zaenkar, K. S., Schmidt, A. , Karger. Basel. 45-65 (2006).
- Trosko, J. E. Human stem cells as targets for the aging and diseases of aging processes. Med. Hypotheses. 60 (3), 439-447 (2003).
- JE, T. rosko Stem Cells and Cancer. Dittmar, T., Zaenkar, K. , Nova Publishers. New York. 147-188 (2008).
- Osgood, R. S., et al. Polycyclic aromatic hydrocarbon-induced signaling events relevant to inflammation and tumorigenesis in lung cells are dependent on molecular structure. PLoS. One. 8 (6), e65150 (2014).
- Weis, L. M., Rummel, A. M., Masten, S. J., Trosko, J. E., Upham, B. L. Bay or baylike regions of polycyclic aromatic hydrocarbons were potent inhibitors of gap junctional intercellular communication. Environ.Health Perspect. 106 (1), 17-22 (1998).
- Yotti, L. P., Chang, C. C., Trosko, J. E. Elimination of metabolic cooperation in Chinese hamster cells by a tumor promoter. Science. 206 (4422), 1089-1091 (1979).
- Zhao, Y., et al. New caged coumarin fluorophores with extraordinary uncaging cross sections suitable for biological imaging applications. J. Am. Chem. Soc. 126 (14), 4653-4663 (2004).
- Goldberg, G. S., Bechberger, J. F., Naus, C. C. A pre-loading method of evaluating gap junctional communication by fluorescent dye transfer. Biotechniques. 18 (3), 490-497 (1995).
- Ziambaras, K., Lecanda, F., Steinberg, T. H., Civitelli, R. Cyclic stretch enhances gap junctional communication between osteoblastic cells. J.Bone Miner.Res. 13 (2), 218-228 (1998).
